DE69732583T2

DE69732583T2 - Verfahren zur Spaltung eines chimeren Proteins mittels eines 'processing'-Enzyms

Info

Publication number: DE69732583T2
Application number: DE69732583T
Authority: DE
Inventors: Yuji Ashikaga-shi Suzuki; Koji Takatsuki-shi Magota; Toyofumi Ibaraki-shi Masuda
Original assignee: Daiichi Suntory Pharma Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 1996-03-04
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2017-03-05
Also published as: EP0794255A3; CN1167155A; DE69732583D1; AU734397B2; AU1503697A; CA2198966C; ATE290088T1; US5891671A; JPH09296000A; KR100468268B1; KR970065554A; DK0794255T3; CA2198966A1; TW480270B; EP0794255B1; CN1216901C; JP3925982B2; EP0794255A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein chimeres Protein, das als Substrat für die Herstellung eines physiologisch aktiven Peptids oder eines Vorläufers davon dient, und ein Verfahren zur Erzeugung des physiologisch aktiven Peptids oder dessen Vorläufers. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung des physiologisch aktiven Peptids von dem chimeren Protein zur Reinigung des physiologisch aktiven Peptids.
Eine Anzahl von Peptidherstellungsverfahren unter Verwendung der Expression eines chimeren Proteins sind ausprobiert worden. In diesem Fall wird eine chemische oder enzymatische Spaltung für die Abtrennung eines Zielpeptids verwendet. Die Enzyme, die in diesem Verfahren verwendet werden, beinhalten Lysyl-Endopeptidase (Achromobacter Protease I) für die spezifische Spaltung der Peptidbindung an der C-terminalen Seite eines Lysinrests und Staphylococcus Protease V8 für die spezifische Abspaltung der C-terminalen Seite einer Glutaminsäure. Chemische Verfahren beinhalten die Abspaltung eines Asparaginrests durch salpetrige Säure und Abspaltung eines Methioninrests durch CNBr.
Für die chemischen Verfahren ist die Modifikation des Zielpeptids nicht vermeidbar, was die Abtrennung des Zielpeptids von verschiedenen Analogen bei der Reinigung des Zielpeptids nach der Spaltung notwendig macht. Andererseits ist die Spezifizität bei der enzymatischen Spaltung hoch, und die Spaltung wird unter relativ moderaten Bedingungen durchgeführt, was die Reinigung des Zielpeptids erleichtert. Da jedoch die Tatsache, ob Enzyme verwendbar sind oder nicht, von der Aminosäuresequenz des Zielpeptids abhängt, können existierende Proteasen nicht immer verwendet werden, was zu einem Bedarf an universellen Spaltungsenzymen führt.
Wenn ein Peptidhormon oder ein Vorläufer davon in einem Organismus erzeugt wird, wird ein Vorläuferpolypeptid für das Peptid spezifisch durch ein Enzym (ein Verarbeitungsenzym, "processing enzyme") abgespalten. Beispiele für solche Enzyme, die auf dem Gebiet bekannt sind, beinhalten ein Prohormonenzym 1/3 (PC1/3), ein Prohormonenzym 2 (PC2) und Furin. Die Kex2-Protease, die bei der Produktion eines α-gepaarten Faktors von Saccharomyces cerevisiae wirkt, ist ebenfalls eine Art der obigen Enzyme. Wenn diese Verarbeitungsenzyme für das Ausschneiden eines Zielpeptids aus dem chimeren Protein verwendet werden, wird erwartet, daß das Peptidhormon nicht beschädigt wird, und die Verarbeitungsenzyme sind auf eine Vielzahl von Peptiden anwendbar. Daher war die Entwicklung solcher Produktionsverfahren auf dem Gebiet wünschenswert.
Die gegenwärtigen Erfinder haben über ein Verfahren berichtet, das die Bereitstellung eines Polypeptids, abgeleitet von E. coli β-Galactosidase, als Schutzpeptid umfaßt, das Auswählen eines geeigneten Linkerpeptids und die effiziente Produktion eines chimeren Protein mit einem Zielpeptid als einen unlöslichen Einschlußkörper (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 5-328992). Dieses chimere Protein ist mit einem Modifikationsmittel löslich gemacht, wie z.B. Harnstoff, und wird als Substrat für Verarbeitungsenzyme verwendet.
Nicht veröffentlichter Stand der Technik
Andererseits haben die gegenwärtigen Erfinder ein Verfahren offenbart, worin die Kex2-Protease, abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, ein membrangebundenes Enzym, als lösliches Enzym erzeugt wird (ein sekretorisches Kex2-Derivat), und zwar indem das Gen verändert wird (europäische Patentanmeldung, die die Priorität von JP-8-73217 und JP-8-352580 beansprucht; Titel "Process for Producing Secretory Kex2 Derivate"). In der Beschreibung, von der eine Kopie hiermit eingereicht wird, wird kein Design eines chimeren Proteins als Substrat bei der Verwendung dieses Enzyms als Verarbeitungsenzym genannt.
Die Entwicklung eines Verfahrens für den Entwurf und die Erzeugung eines chimeren Proteins, das effizient als Einschlußkörper in Escherichia coli (E. coli) unter Kulturbedingungen in großem Umfang erzeugt werden kann und unter Bedingungen einfach löslich gemacht werden kann, die es einem Verarbeitungsenzym ermöglichen, effektiv zu wirken, und ein Verfahren zum Entwurf und Erzeugung einer Aminosäuresequenz in der Nachbarschaft der Spaltungsstelle, um es einem Zielpeptid zu ermöglichen, von dem chimeren Protein durch ein Verarbeitungsenzym in effizienter Weise gespalten zu werden, waren auf dem Gebiet erwünscht. Weiterhin wurde die Entwicklung eines vielfältig anwendbaren Verfahrens zur Reinigung des erzeugten physiologisch aktiven Peptids zu einer Reinheit von nicht weniger als 99% ebenfalls auf dem Gebiet erwünscht.
Das allgemeine Ziel ist hier die Bereitstellung neuer und nützlicher Verfahren und Materialien für den Entwurf und die Erzeugung eines chimeren Proteins, das als Substrat bei der Erzeugung eines physiologisch aktiven Peptids dient, unter Verwendung eines Verarbeitungsenzyms, wie zum Beispiel einem sekretorischen Kex2-Derivat, und die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung des Peptids.
Die gegenwärtigen Erfinder haben Studien im Hinblick auf die obigen Punkte durchgeführt und im Ergebnis zum ersten Mal das Folgende klargestellt:

1) Insertion einer Sequenz, die reich an His ist, z.B. einem Linkerpeptid enthaltend {(His)₄-Pro-Gly}_n (n = 1 bis 6), in ein chimeres Protein kann zu einer erhöhten Produktion und zusätzlich einer erhöhten Löslichkeit unter Bedingungen für die Reaktion des chimeren Proteins mit einem Verarbeitungsenzym, wie z.B. einem sekretorischen Kex2-Derivat, führen.
2) Eine Anforderung an ein hoch reaktives Substrat ist diejenige, daß die Aminosäuresequenz X₁-X₂-(Lys/Arg/Pro)-Arg, worin X₁ vorzugsweise Lys, Arg oder His und X₂ vorzugsweise His oder Phe bedeutet, als Aminosäuresequenz in dem Linker an der Stelle verwendet wird, auf die das Verarbeitungsenzym wirkt.
3) Nach der Reaktion ermöglicht eine Reihe von Schritten die Verlagerung des pHs der Reaktionslösung zum sauren hin, Verdünnung der Lösung zur Erniedrigung der Konzentration des denaturierenden Mittels, damit die meisten der Komponenten, außer dem Zielpeptid, präzipitiert werden können, gefolgt von einer Zentrifugation oder Druckfiltration, daß 95% oder mehr des Zielpeptids in dem Überstand gewonnen werden können und die weitere Verwendung zum Beispiel einer Kationenaustauschchromatografie, einer Niedrigdruck-Umkehrphasenchromatografie, einer Umkehrphasen-HPLC und ähnlichem, entweder allein oder vorzugsweise in Kombination ermöglicht, daß das Zielpeptid zu hoher Reinheit mit hohem Gewinn gereinigt werden kann.

So wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein chimeres Protein bereitgestellt, repräsentiert durch die folgende Formel: A-L-B worin
A ein Schutzpeptid repräsentiert;
B repräsentiert ein Zielpeptid; und
L repräsentiert ein Linkerpeptid mit der Sequenz X₁-X₂-(Pro, Lys oder Arg)-Arg in seinem C-terminalen Bereich, worin X₁ und X₂ jede Aminosäure darstellen, und einer Domäne, die reich an His ist, in einem N-terminalen Bereich, wobei die an His reiche Domäne im N-terminalen Bereich die folgende Sequenz aufweist: [(His)₄-Pro-Gly]_n, worin n 1 bis 6 bedeutet. weiterhin bedeutet X₁ vorzugsweise Arg, Lys oder His, und X₂ bedeutet His oder Phe. Jede denkbaren 1–5 Aminosäuren können zwischen der Aminosäuresequenz des N-terminalen Bereichs und der des C-terminalen Bereichs vorliegen.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung des obigen chimeren Proteins bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte: Transformieren eines Expressionsvektors, enthaltend DNA, die das chimere Protein kodiert, in eine Wirtszelle; Kultivieren der resultierenden Transformanten und Ernten des chimeren Proteins aus der Kultur.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung des obigen Zielpeptids (B) bereitgestellt, wobei man einem Verarbeitungsenzym ermöglicht, auf das obige chimere Protein zu wirken, um eine Peptidbindung zwischen dem C-terminalen Ende des Linkerpeptids (L) und dem N-terminalen Ende des Zielpeptids (B) zum Erhalt des Zielpeptids (B) zu spalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt der obige Prozeß die folgenden Schritte: Transformieren eines Vektors, der ein Gen, kodierend ein chimeres Protein, exprimieren kann in eine Wirtszelle; Kultivieren des resultierenden Transformanten; Aufbrechen des Transformanten zur Bereitstellung einer unlöslichen Fraktion eines Einschlußkörpers; Behandlung der unlöslichen Fraktion mit einem Mittel zum Löslichmachen, um ein chimeres Protein in den Einschlußkörpern löslich zu machen; Spaltung einer Peptidbindung zwischen dem C-terminalen Ende des Linkeraminosäurerests des löslich gemachten chimeren Proteins und dem N-terminalen Ende des Zielpeptids durch ein Verarbeitungsenzym, wie z.B. eines sekretorisches Kex2-Derivat, um das Zielpeptid abzutrennen, und Reinigen des Zielpeptids durch Präzipitation, Kationenaustauschchromatografie, Niedrigdruck-Umkehrchromatografie und Umkehrphasen-HPLC.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 illustriert die Sequenz eines synthetischen Oligomers, das bei der Herstellung eines synthetischen hProPTH (1-84) Gens verwendet wurde.
2 ist ein Diagramm, das die Herstellung eines synthetischen hProPTH (1-84) Gens darstellt.
3 ist ein Diagramm, das die Herstellung eines Plasmids pG210S (S/X) darstellt, worin Plac einen Promotor für ein Lactoseoperon von E. coli darstellt und Ttrp einen Abschwächungsterminator für TrpE von E. coli darstellt.
4 ist ein Diagramm, das die Herstellung eines Plasmids pGP#19 darstellt, das ein chimeres Protein βGal-139S(FM)PPH84 exprimieren kann.
5 ist ein Diagramm, das die Herstellung eines Plasmids pGP#19PPH34 darstellt, das ein chimeres Protein βGal-139S(FM)PPH34 exprimieren kann.
6 ist ein Diagramm, das die erste Hälfte eines Verfahrens zur Erzeugung der Plasmide pG117SPPH34 und pG117SnHPPH34 darstellt, die die chimeren Proteine βGal-117SPPH34 und βGal-117SnHPPH34 (n = 1 bis 6) exprimieren können, worin pG97SPPH34- und pG97SnHPPH34-Plasmide durch Substitution des Primers S04 durch den Primer S05 hergestellt wurden und pG139SPPH34 und pG139SnHPPH34 durch Substitution des Primers S06 durch den Primer S05 hergestellt wurden.
7 ist ein Diagramm, das die zweite Hälfte eines Verfahrens zur Erzeugung der Plasmide pG117SPPH34 und pG117SnHPPH34 darstellt, die die chimeren Proteine βGal-117SPPH34 und βGal-117SnHPPH34 (n = 1 bis 6) exprimieren können, worin pG97SPPH34- und pG97SnHPPH34-Plasmide durch Substitution des Primers S04 durch den Primer S05 hergestellt wurden und pG139SPPH34 und pG139SnHPPH34 durch Substitution des Primers S06 durch den Primer S05 hergestellt wurden.
8 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse von SDS-PAGE darstellt, wodurch der Einfluß eines Oligohistidinlinkers {(His)₄-Pro-Gly}_n in = 1 bis 6) auf die Produktivität eines chimeren Proteins untersucht wurde, worin 4H darstellt, daß die Anzahl von Histidinresten 4 ist, d.h. n = 1.
9 ist ein Diagramm, das den Einfluß eines Polyhistidinlinkers {(His)₄-Pro-Gly}_n in = 1 bis 6) auf die Wirksamkeit der Spaltung von hPTH (1-34) durch Kex2-660 darstellt, wobei die Abszisse den relativen kcat-Wert darstellt, wobei der kcat-Wert von βGal-117SPPH34 als 1 angenommen wird.
10 ist ein Diagramm, das den Einfluß einer Aminosäure an der Kex2-Proteaseerkennungsstelle P3 auf die Wirksamkeit der Spaltung von hPTH (1-34) durch Kex2-660 darstellt, wobei die Aminosäure an der Stelle P4 auf einen Valinrest immobilisiert wurde, wobei die Aminosäure an der Stelle P3 substituiert wird, wobei die Abszisse den relativen kcat-Wert darstellt, wobei der kcat-Wert von βGal-117S4HVKPH34 als 1 angenommen wird.
11 ist ein Diagramm, das den Einfluß einer Aminosäure an der Kex2-Proteaseerkennungsstelle P4 auf die Wirksamkeit der Spaltung von hPTH (1-34) durch Kex2-660 darstellt, wobei die Aminosäure an der Stelle P3 auf einen Histidinrest immobilisiert wurde, wobei die Aminosäure an der Stelle P4 substituiert wird, wobei die Abszisse den relativen kcat-Wert darstellt, wobei der kcat-Wert von βGal-117S4HVKPH34 als 1 angenommen wird.
12 ist ein typisches Diagramm, das die Struktur eines Expressionsvektors pGKSPH34 für ein βGal-117KS4HRHPH34 Gen darstellt, worin βGal-117KS ein Peptid ist mit einem Argininrest an der Position 14 von βGal-117S, der durch einen Lysinrest substituiert wurde.
13 ist ein Diagramm, das die Herstellung eines Plasmids pG210ShCT(G) darstellt.
14 zeigt Nukleotidsequenzen synthetischer Oligonukleotide für die Konstruktion des hGLP-1 (7-37) Gens (DNA (11)) und Nukleotidsequenzen für PCR-Primer unter Verwendung von pGKSPH34 als Matrize.
15 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion das Plasmids pG117S4HGP.
16 zeigt Profile einer Reinigung von hGLP-1, worin A das Ergebnis einer Probe nach einer Reaktion mit Kex2 darstellt, B zeigt ein Ergebnis auf einem Überstand einer Säurepräzipitation, C zeigt ein Ergebnis aus einer Probe nach einer Kationenaustausch-Säulenchromatografie und D zeigt ein Ergebnis für eine Probe nach einer Niedrigdruck-Umkehrphasen-Säulenchromatografie. Peak 1 zeigt hGLP-1 (7-37), Peak 2 zeigt hGLP-1, Peak 3 zeigt ein Schutzpeptid und Peak 4 zeigt ein chimeres Protein.
Detaillierte Beschreibung
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das obige chimere Protein, umfassend ein Schutzpeptid, einen Linker und ein physiologisch aktives Peptid (ein Zielpeptid) durch ein Verarbeitungsenzym zur Erzeugung eines physiologisch aktiven Peptids gespalten werden. Beispiele für solche Peptide beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf menschliches Parathyroidhormon (hPTH (1-84)) und Derivate davon (hPTH (1-34), hPTH (1-37) und hPTH (1-38)), andere Derivate von menschlichen Parathyroidhormonen (hPTH (1-31) Gly, hPTH (1-34) Gly, hPTH (1-37) Gly, hPTH (1-38) Gly, hPTH (3-84), hPTH (3-34), hPTH (3-37) und hPTH (3-38)), Zellwachstumsfaktoren, Calcitonin und Vorläufer davon, Glucagon-ähnliches Peptid 1 (GLP-1) und Derivate davon (GLP-1 (1-37), GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36) NH₂ und ähnliche).
Hier verwendbare Verarbeitungsenzyme beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Kex2-Protease, Furin, Prohormonkonvertase 1 (PC1) oder Prohormonkonvertase 2 (PC2) oder Derivate davon. Bei der vorliegenden Erfindung werden sekretorische Kex2-Derivate, hergestellt durch Entfernung des C-terminalen hydrophoben Bereichs der Kex2-Protease besonders bevorzugt.
Das Schutzpeptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Peptid mit einer Größe von nicht mehr als 220 Aminosäuren. Ein Peptid mit 90 bis 210 Aminosäuren, beginnend von der Position 1 des N-terminalen Endes von E. coli β-Galactosidase wird zum Beispiel bevorzugt. Noch bevorzugter ist ein Peptid mit den Aminosäuren 1–97, 1–117 oder 1–139 an dem N-terminalen Ende von E. coli β-Galactosidase. Die obigen Peptide, bei denen der Cysteinrest durch einen Serinrest ersetzt wurde, werden noch weiter bevorzugt. Die obigen Peptide, bei denen der Argininrest an der Position 14 durch einen Lysinrest substituiert wird, werden besonders bevorzugt. Weiterhin bevorzugt enthält das Schutzpeptid nicht eine Sequenz, die durch ein Verarbeitungsenzym erkennbar ist, zum Beispiel Pro-Arg, Arg-Arg oder Lys-Arg. Wenn die Erkennungssequenz in dem Schutzpeptid enthalten ist, kann die Substitution von mindestens einer Aminosäure in der obigen Erkennungssequenz durch eine andere Aminosäure, so daß die Sequenz durch das Verarbeitungsenzym nicht mehr erkannt werden kann, die Spaltung durch das Verarbeitungsenzym verhindern.
Die Linkeraminosäure zur Verbesserung der Löslichkeit des chimeren Proteins ist vorzugsweise hydrophil. Einige Zielpeptide führen zu einer Veränderung der Ladung des chimeren Proteins, was zu einer erniedrigten Produktivität des Einschlußkörpers führt. Die hydrophile Aminosäure ist vorzugsweise ein Histidinrest mit einer Puffereigenschaft um den physiologischen pH (neutral) in Bakterien, die eine Stelle zur Erzeugung von Einschlußkörpern sind. weiterhin ist die Insertion der Sequenz Pro-Gly nach Denaturierung und Löslichmachung vom Standpunkt der Abschwächung der sekundären Struktur des Linkerbreichs bevorzugt. Um mit einer Vielzahl physiologisch aktiver Peptide umgehen zu können, wird ein synthetisches DNA-Fragment, kodierend (His)₄-Pro-Gly, bereitgestellt und in geeigneter Weise in Duplikat in ein DNA-Fragment inseriert, das ein Schutzpeptid kodiert, zum Entwurf eines Linkers von {(His)₄-Pro-Gly}_n, worin n = 1 bis 6. Die Sequenz des N-terminalen Bereichs dieses Linkers wird hiernach als "LN" bezeichnet.
Weiterhin haben die gegenwärtigen Erfinder zum ersten Mal klargestellt, daß bei einem Kex2-Proteasederivat (sekretorisches Kex2-Derivat), abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, das in Masse erzeugbar wird, wenn ein chimeres Protein als Substrat verwendet wird, eine Aminosäure in der Nachbarschaft der Kex2-Proteaseerkennungsstelle (Lys/Arg/Pro)-Arg ebenfalls die Aktivität deutlich beeinflußt. Insbesondere haben sie klargestellt, daß in dem Fall, daß die Aminosäuresequenz, die am C-terminalen Ende des Linkers lokalisiert ist, X₁-X₂-(Lys/Arg/Pro)-Arg ist, worin X₁ und X₂ jede Aminosäure repräsentieren, unter der Voraussetzung, daß X₁ Arg, Lys oder His ist und X₂ His oder Phe ist, die Aktivität des sekretorischen Kex2-Derivats maximal wird. Die Sequenz des C-terminalen Bereichs dieses Linkers wird hiernach als "LC" bezeichnet.
Das durch das chimere Proteinverfahren erzeugte und ausgeschnittene Peptid kann durch verschiedene Verfahren gereinigt werden. In diesem Fall hat sich erwiesen, daß durch die Verwendung des obigen chimeren Proteins das chimere Protein unumgesetzt verbleiben kann, und daß das Schutzpeptid und die Unreinheiten, abgeleitet von E. coli, in effizienter Weise durch einfache Präzipitationsverfahren entfernbar sind. Spezifisch wurde festgestellt, daß nach der Reaktion mit dem sekretorischen Kex2-Derivat die Verlagerung des pHs ins schwach saure, gefolgt von einer Verdünnung der Reaktionslösung zur Erniedrigung der Konzentration des Denaturierungsmittels, ermöglicht, daß nicht nur die meisten der von E. coli abgeleiteten Unreinheiten sondern auch nicht weniger als 95% des unumgesetzt verbliebenen chimeren Proteins und die Schutzpeptide in das Präzipitat übertragen werden, was es ermöglicht, daß nicht weniger als 95% des Zielpeptids im Überstand verbleibt und eine klare Flüssigkeit, enthaltend das Zielpeptid, einfach durch Zentrifugation oder Druckfiltration erhalten werden kann.
Nach einer pH-Einstellung oder ähnlichem wurde der Überstand direkt durch einen Kationenaustauschchromatografen zur Adsorption des Zielpeptids geführt, das Zielpeptid wurde dann eluiert, indem man sich einer Veränderung in der Salzkonzentration oder einer pH-Veränderung bediente, das Eluat wurde durch eine Niedrigdruck-Umkehrphasenchromatografie geführt, um das Zielpeptid zu adsorbieren, das dann eluiert wurde, indem man sich einer Konzentrationsveränderung eines organischen Lösungsmittels bediente, gefolgt von einer Konzentration des Eluats. Nach Erniedrigung der Konzentration des organischen Lösungsmittels wurde das Eluat einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen, eine Abtrennung und Fraktionierung wurde durchgeführt, indem man sich einer Veränderung der Konzentration des organischen Lösungsmittels bediente, um ein hochreines Zielpeptid zu ergeben.
Die vorliegende Erfindung wird beispielsweise anhand des menschlichen Parathyroidhormonderivats hPTH (1-34) als Zielpeptid beschrieben.
Ein βGal-210SPPH84 Expressionsplasmid pG210ShProPTH wurde hergestellt, indem synthetische DNA-Oligomere zusammen ligiert wurden, um ein hPTH (1-84) Gen herzustellen, und das so hergestellte Gen durch ein Plasmid pG210ShCt[G] zu substituieren, in der Region, kodierend hCT[G] (3). Dort wurde ein pG117SHPPH34 hergestellt, worin ein Translationsstopkodon durch ein Kodon substituiert war, kodierend eine Aminosäure (Val) lokalisiert an der Position 35 vom N-terminalen Ende eines hPTH (1-84) Gens, und ein Gen kodierend βGal-117S (ein Peptid mit den Aminosäuren 1–117 auf der N-terminalen Seite der E. coli β-Galactosidase, wobei der Cysteinrest durch einen Serinrest ersetzt ist) wurde durch ein Gen ersetzt kodierend für βGal-210S (ein Peptid mit den Aminosäuren 1–210 auf der N-terminalen Seite von E. coli β-Galactosidase, wobei die Cysteinreste durch die Serinreste ersetzt wurden (6 und 7)).
pG139SHPPH34 oder pG97SHPPH34 können auf dieselbe Weise wie oben beschrieben hergestellt werden, außer daß ein Gen, kodierend βGal-139S, oder ein Gen, kodierend βGal-97S, anstelle von βGal-210S inseriert wird.
In diesen Plasmiden sind die Strukturgene, die jeweils βGal-97S, βGal-117S und βGal-139S kodieren, mit einem Strukturgen von hPTH (1-34) über ein Linkerpeptid Phe-Met-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg verbunden und das Strukturgen, kodierend dieses chimere Protein, befindet sich unter der Kontrolle eines lac-Promotors. Weiterhin enthält dieses Plasmid einen Tetracyclin-resistenten Genmarker.
βGal-97SPPH34 hatte eine niedrige Produktivität, obwohl es in einer Harnstofflösung eine hohe Löslichkeit aufwies. Andererseits war die Löslichkeit unter Bedingungen für eine Reaktion mit dem sekretorischen Kex2-Derivat für βGal-117SPPH34 und βGal-139SPPH34 trotz hoher Produktivität so niedrig, daß die Verwendung einer größeren Menge des sekretorischen Kex2-Derivats für das Ausschneiden des hPTH (1-34) aus dem chimeren Protein notwendig war. Aus diesem Grund wurde ein Linker LN, der hydrophil ist, eine Puffereigenschaft um den pH 7 (neutral) ausübt und Aminosäuren umfaßt, die die Bildung einer Sekundärstruktur des chimeren Proteins inhibieren können, zwischen das Schutzpeptid und den Linker Met-Ser-Val-Lys-Lys-Arg inseriert, um ein chimeres Protein mit einer hohen Produktivität und hohen Löslichkeit in einer Harnstofflösung bereitzustellen.
Ein Peptid mit der Sequenz {(His)₄-Pro-Gly}_n, worin n = 1 bis 6, wurde als LN verwendet. {(His)₄-Pro-Gly}_n, worin n = 1 bis 6, wird durch Synthese eines DNA-Fragments eingeführt, kodierend (His)₄-Pro-Gly oder {(His)₄-Pro-Gly}₂, und das DNA-Fragment wurde in den 3'-terminalen Bereich eines DNA-Fragments inseriert, kodierend das Schutzpeptid in einem geeigneten molaren Verhältnis. So kann ein Gen hergestellt werden, das ein chimeres Protein kodiert, umfassend ein Linkerpeptid, enthaltend ein oder eine Vielzahl der obigen Aminosäuresequenzen.
Ein Gen mit einem DNA-Fragment, inseriert in einem Umkehrzustand, wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt und ausgeschlossen. Der E. coli Stamm M25 wurde mit Plasmiden transformiert, kodierend chimere Proteine, um die Produktivität der chimeren Proteine zu überprüfen (8). Im Ergebnis wurde festgestellt, daß im Fall der Schutzpeptide βGal-97S und βGal-139S n = 3, eine hohe Produktivität des chimeren Proteins bereitstellte, während im Fall des Schutzpeptids βGal-117S n = 1 bis 6, eine hohe Produktivität des chimeren Proteins bereitstellte. Einschlußkörper dieser chimeren Proteine wurden einem Zellaufschluß und Zentrifugation zum Durchführen von Waschen und Abtrennung unterzogen, mit Harnstoff löslich gemacht, verdünnt und für eine Reaktion mit Kex2-660 (9) verwendet.
Im Ergebnis wurde festgestellt, daß die Einführung von {(His)₄-Pro-Gly}_n, worin n = 1 bis 6, die Sensibilität aller chimeren Proteine gegenüber Kex2-660 erhöhte. Dementsprechend wurden für das chimere Protein für die Herstellung von hPTH (1-34) βGal-117S4HPPH34, umfassend βGal-117S als Schutzpeptid und (His)₄-Pro-Gly als Linkerpeptid LN angenommen, wobei die Produktivität des chimeren Proteins, die Reaktivität mit Kex2-660 und die Größe des Schutzpeptids mit in die Betrachtung einbezogen wurden.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß bei dem Entwurf eines chimeren Proteins zum Ausschneiden eines physiologisch aktiven Peptids durch ein sekretorisches Kex2-Derivat die Insertion eines Peptids von {(His)₄-Pro-Gly}_n, worin n = 1 bis 6, für die Verbesserung von nicht nur der Produktivität in E. coli sondern auch der Lösungsfähigkeit unter Bedingungen für eine Reaktion mit einem sekretorischen Kex2-Derivat geeignet ist.
In dem vorliegenden Verfahren sollte das sekretorische Kex2-Derivat in einer Menge von ungefähr 1:1.000 in Bezug auf das molare Verhältnis des chimeren Proteins verwendet werden und besetzt dadurch den Hauptteil der Kosten der Rohmaterialien für die Herstellung. Daher hat dies das Design eines chimeren Proteins nötig gemacht, das einfacher durch das sekretorische Kex2-Derivat abgespalten werden kann. Eine Prosequenz Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg von einem Vorläufer zu einem humanen Parathyroidhormon wurde für die sekretorische Kex2-Derivaterkennungsstelle von βGal-117S4HPPH34 verwendet. Ob diese Sequenz für die Abspaltung durch das sekretorische Kex2-Derivat jedoch am besten geeignet ist oder nicht, war unbekannt, und es besteht die Möglichkeit, daß wie bei vielen anderen Proteasen die Optimierung zu einer weiter erhöhten Spaltungseffizienz führt. Da hPTH (1-34) mit der Erkennungsstelle an seiner C-terminalen Seite verbunden ist, kann die Substitution der Aminosäure nicht durchgeführt werden, während die Sequenz an der N-terminalen Seite frei gewählt werden kann, soweit keine Erkennungsstelle neu erzeugt wird. Dementsprechend wurde ein Versuch gemacht, die P3-Stelle (X₂) des chimeren Proteins als Substrat zu jeder Aminosäure umzuwandeln. Es wurden Studien an 18 Aminosäuresequenzen wie dargestellt in 10 durchgeführt. Im Ergebnis wurde festgestellt, daß die Einführung von His oder Phe in X₂ ermöglicht, daß hPTH (1-34) aus dem chimeren Protein mit verbesserter Effizienz ausgeschnitten werden kann.
Danach wurden Studien im Hinblick auf die P4-Stelle durchgeführt unter Verwendung von den in 11 dargestellten 20 Aminosäuresequenzen mit His, was keine signifikante Nebenreaktion zeigte, immobilisiert auf X₂. Im Ergebnis wurde festgestellt, daß die Einführung von Arg, Lys oder His in X₁ ermöglicht, daß hPTH (1-34) aus dem chimeren Protein mit höherer Effizienz ausgeschnitten werden kann. Arg-His-Lys-Arg, das die höchste Spaltungseffizienz anbot, wurde als LC gewählt.
Im Verlauf der vorliegenden Studien wurde weiterhin festgestellt, daß die Peptidbindung an der C-terminalen Seite der Sequenz Arg-Arg, vorliegend an den Positionen 13 und 14 von βGal-117S, durch ein sekretorisches Kex2-Derivat gespalten wird, und dementsprechend wird in dem darauffolgenden Reinigungsschritt durch Präzipitation mit einer Säure das resultierende βGal (1-14) in der Überstandsfraktion wiedergewonnen, wobei hPTH (1-34) ebenfalls darin gewonnen wird. Daher wurde Lys für Arg 14 substituiert, um die Spaltung zu inhibieren, was die Erzeugung von βGal (1-14) verhinderte.
Basierend auf den obigen Ergebnissen wurde für das chimere Protein für die Erzeugung von hPTH (1-34) βGal-117S (βGal-117KS), wobei Arg 14 durch Lys substituiert war, als Schutzpeptid angenommen, und ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz Pro-His-His-His-His-Pro-Gly-Gly-Arg-Pro-Ser-Arg-His-Lys-Arg wurde als Linkerpeptid angenommen.
Die gegenwärtigen Erfinder exprimierten das chimere Protein βGal-117KS4HRHPH34, das so entworfen worden war, in E. coli, und der resultierende Einschlußkörper wurde gewaschen, wiedergewonnen, löslich gemacht und für eine Reaktion mit einem sekretorischen Kex2-Derivat verwendet, gefolgt von Studien an einem Reinigungsverfahren. Im Ergebnis konnte eine Peptid, enthaltend von E. coli abgeleitete Unreinheiten, chimeres Protein, das nicht umgesetzt worden war, und Schutzpeptid unter Verwendung eines Phänomens präzipitiert werden, wobei eine pH-Verlagerung von neutral zur schwach sauren Seite eine deutliche Erniedrigung in der Löslichkeit auslöste, d.h. die Verlagerung des pHs von 7,8 bis 8,2, einem optimalen pH für eine Reaktion mit einem sekretorischen Kex2-Derivat, zu 6,2 bis 6,5.
Weiterhin ermöglichte die Erniedrigung der Konzentration des Denaturierungsmittels (Harnstoff) durch Verdünnung, daß die meisten Unreinheiten ausgefällt wurden. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation oder Druckfiltration entfernt, um hPTH (1-34) im Überstand effizient wiederzuge winnen. Der Überstand wurde auf einen pH von 5,0 eingestellt und durch eine Kationenaustauschchromatografie (z.B. PorosHS, SP Toyopearl) geführt, um hPTH (1-34) zu adsorbieren, gefolgt von einer Elution mit 0,3 bis 0,4 M NaCl. Essigsäure wurde dem Eluat zugefügt, dann wurde die gemischte Lösung durch eine Niedrigdruck-Umkehrphasenchromatografie (z.B. PorosR2, SokenODS-W) geführt, um hPTH (1-34) zu adsorbieren, gefolgt von einer Elution mit ungefähr 30% Acetonitril, um Unreinheiten zu entfernen, die die Konzentration in negativer Weise beeinflussen, und einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen.
Das in dem Eluat enthaltene Acetonitril wurde bei reduziertem Druck abdestilliert, und der Rest wurde durch einen 0,22 μm Filter gefiltert, durch eine Umkehrphasen-HPLC (z.B. InertsiliPrepODS, TSK-ODS-120T) geführt, um hPTH (1-34) zu adsorbieren und durch Gradientenelution von Acetonitril fraktioniert. Eine hochreine Fraktion wurde gesammelt. So wurde hPTH (1-34) mit einer Reinheit von 99,5% unter Gewinnung von 40 bis 70% fraktioniert. Die obigen Ergebnisse zeigen, daß diese Gewinnung die höchste unter denen auf dem Gebiet berichteten ist, was die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung unterstreicht.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, obwohl sie nicht auf diese Beispiele begrenzt sein soll.
Zu Beginn werden das Plasmid und E. coli, die als Materialien für die vorliegende Erfindung verwendet wurden, sowie die zugrundeliegenden experimentellen Verfahren, die für jedes Beispiel gleich sind, beschrieben.
Plasmid
Ein Plasmid pG210ShCT[G] ist ein Plasmid, das unter der Kontrolle eines Promotors des E. coli Lactoseoperons (ein lac-Promotor) ein chimeres Protein exprimieren kann, umfassend ein Peptid der Aminosäuren 1–210 auf der N-terminalen Seite von β-Galactosidase, wobei 76 Cys, 122 Cys und 154 Cys durch Ser substituiert sind, d.h. βGal-210S, und hCT[G] (ein Peptid von menschlichem Calcitonin mit einem Glycinrest, der zu dem C-terminalen Ende der Aminosäure 32 zugefügt wurde) gebunden an βGal-210S durch einen Glutaminsäurerest.
Es wurde durch Ligation eines DNA-Fragments hergestellt, umfassend ein Gen, kodierend einen Teil von βGal-210S, wobei das DNA-Fragment durch Verdau von pGHα210(Ser)rop^– mit den Restriktionsenzymen PvuII und EcoRI hergestellt wurde, mit einem DNA-Fragment, umfassend einen Vektor hergestellt durch Verdau von pG97S4DhCT[G] mit den Restriktionsenzymen PvuII und EcoRI (13). Ein Verfahren zur Herstellung von pGHα210(Ser)rop^– ist in der japanischen geprüften Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 6-87788 offenbart, und der E. coli Stamm W3110, enthaltend das Plasmid pG97S4DhCT[G], wurde als "Escherichia coli SBM 323" bezeichnet und als Ferm BP-3503 bei dem Institute of Bioscience und Human Technology Agency of Industrial Science und Technology, Ministry of International Trade & Industry am 8. August 1991 hinterlegt.
Die Einführung eines DNA-Bereichs, kodierend ein Zielpeptid, als ein EcoRI-SalI DNA-Fragment in das Plasmid pG210ShCT[G] unter Ausrichtung des Leserahmens ermöglicht die Expression eines chimeren Proteins mit βGal-210S. Das Plasmid wurde zum Klonieren eines synthetischen menschlichen Parathyroidhormons (hProPTH (1-84)) Gens verwendet und als Material für die Herstellung eines Plasmids pGP#19 (3).
Escherichia coli (Ε. coli)
Der E. coli Stamm JM109 wurde als kompetente Zelle von Toyobo Co., Ltd. erstanden und für die Herstellung eines Plasmids verwendet. Der E. coli Stamm M25 (W3110)ompT: Sugimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 153, 753–759, 1988) wurde bei der Expression eines chimeren Proteins verwendet.
Medium
Die folgenden Medien wurden für die Kultivierung von E. coli verwendet.
SB-Medium: 0,5% (G/V) Glycerin, 2,4% (G/V) Hefeextrakt, 1,2% (G/V) Trypton, 0,1 M Kaliumhydrogenphosphatpuffer (pH 7,5).
NU1 synthetisches Medium: 0,4% (G/V) Hefeextrakt, 0,4% (G/V) K₂HPO₄, 0,4% (G/V) KH₂PO₄, 0,27% (G/V) Na₂HPO₄, 1,2% (G/V) (NH₄)₂SO₄, 0,02% (G/V) NH₄Cl, 0,3% (G/V) L-Methionin, 0,2% (G/V) MgSO₄·7H₂O, 40 mg/l FeSO₄·7H₂O, 40 mg/l CaCl₂·2H₂O, 10 mg/l AlCl₃·6H₂O, 10 mg/l CoCl₂·6H₂O, 2 mg/l ZnSO₄·7H₂O, 2 mg/l Na₂MO₄·2H₂O, 1 mg/l CuCl₂·2H₂O, 0,5 mg/l H₃BO₃ und 10 mg/l MnSO₄·nH₂O.
Grundlegende experimentelle Verfahren
In den Beispielen wurde das folgende experimentelle Verfahren verwendet, wenn nicht anders angegeben.
DNA-Primer wurden mit einer automatischen Synthesevorrichtung synthetisiert (Modell 320 A, hergestellt von Applied Biosystems) und zwar durch das Phosphoamidit-Verfahren. Die DNA-Sequenz wurde durch das Dideoxy-Verfahren bestimmt.
Die DNA-Spaltung wurde durch eine Reaktion durchgeführt, wobei ein Restriktionsenzym (Menge: 3- bis 10-fach), wie vom Lieferanten angegeben, für 1 Std. verwendet wurde. Die Struktur des Plasmids wurde unter Verwendung von 0,5 bis 1 μg DNA in 20 μl einer Reaktionslösung analysiert, und die Herstellung von DNA wurde unter Verwendung von 3 bis 10 μg DNA in 50 bis 100 μl einer Reaktionslösung durchgeführt. Die Reaktionstemperatur, der Reaktionspuffer und andere Bedingungen waren wie vom Lieferanten angegeben.
Eine Probe für die Elektrophorese auf Agarosegel wurde durch Zugabe von 0,2 Volumen eines Farbstoffs (eine 15%ige (G/V) wäßrige Ficoll-Lösung, enthaltend 0,25% (G/V) Bromphenolblau) zu der Reaktionslösung hergestellt. TAE-Puffer (40 mM Tris/Essigsäure, 2 mM EDTA) wurde als Puffer für eine Elektrophorese auf Agarosegel verwendet. Für die Strukturanalyse eines Plasmids wurde eine Elektrophorese bei 100 V für 1 Std. unter Verwendung von Mupid-2 (hergestellt von Cosmo-Bio Co., Ltd.) durchgeführt, und für die Herstellung von DNA wurde die Elektrophorese auf einem horizontalen Gel (20 cm × 15 cm × 0,7 cm) bei 150 V für 4 Std. oder bei 35 V für 13 Std. durchgeführt. Das Gel wurde mit einer wäßrigen Ethidiumbromidlösung (0,5 μg/ml) für 20 Min. gefärbt und mit UV-Licht zum Nachweis einer DNA-Bande bestrahlt. Die Agarosegelkonzentration betrug 1,0% oder 2,0% (G/V) abhängig von der Größe des zu fraktionierenden DNA-Fragments.
DNA in dem Agarosegel wurde aus dem Agarosegel extrahiert, indem das Gel in einem Dialyseschlauch plaziert wurde, gefüllt mit 0,1 × TAE-Puffer, und durch Anlegung einer Spannung zur Durchführung der Elution. Die DNA-Lösung wurde mit Phenol und Chloroform behandelt und einer Präzipitation mit Ethanol zur Reinigung der DNA unterzogen.
Das Ligieren wurde durch Zugabe von 10 Einheiten T4 DNA-Ligase zu 30 μl einer Reaktionslösung (67 mM Tris/HCL (pH 7,5), 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP), enthaltend 0,05 bis 1 μg eines DNA-Fragments, durchgeführt und indem man der Reaktion ein Fortschreiten bei 16°C für 12 bis 18 Std. ermöglichte oder unter Verwendung eines TAKARA Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.).
Der E. coli Stamm JM109 wurde wie angegeben vom Lieferanten transformiert, der E. coli Stamm M25 wurde durch das Calciumchlorid-Verfahren transformiert, und der transformierte Stamm wurde selektiert, indem man sich der Arzneimittelresistenz bediente (Tetracyclin).
Eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(SDS-PAGE)-Probe wurde hergestellt, indem dieselbe Menge des SDS-Probenpuffers (63 mM Tris/HCl (pH 6,8), 10% (G/V) Glycerin, 10% (G/V) SDS und 10 μg/ml Bromphenolblau) zugefügt wurde und Kochen der Mischung für 3 Min. Die Elektrophorese wurde auf 16%igem (G/V) SDS-PAGE mini (TEFCO) Gel bei 20 mA pro Stück Gel für 70 Min. durchgeführt, und das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue G gefärbt.
hPTH (1-34) wurde quantitativ bestimmt, indem zunächst eine Lösung, enthaltend hPTH (1-34), einer 10- bis 20-fachen Verdünnung mit einem Probenpuffer (1 M Acetat/2 M Harnstoff) unterzogen wurde, die verdünnte Lösung zum Erhalt eines Überstands zentrifugiert wurde, woraufhin der Überstand einer HPLC (LC10A, hergestellt von Shimadzu Seisakusho Ltd.) unterzogen wurde, an die eine YMC-ODS-A302 Säule (d 4,6 mm × 150 mm) (hergestellt von K. K. Yamamura Kagaku Kenkyujo) angebunden war, Durchführung der Entwicklung unter Verwendung von Flüssigkeit A (0,1% (V/V) Trifluoressigsäure (TFA)/10% (V/V) Acetonitril) und Flüssigkeit B (0,094% (V/V) TFA/50% (V/V Acetonitril) mit dem Gradienten B 40%→80%/20 Min. und Vergleich des Bereichs eines hPTH (1-34) Peaks, nachgewiesen durch Bestimmung der Absorption bei 214 nm, mit einem Peakbereich von Standard hPTH (1-34) mit einer bekannten Konzentration.
Eine andere grundlegende Genmanipulation wurde gemäß einem in Molecular Cloning (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)) beschriebenen Verfahren durchgeführt, falls nicht anders angegeben.
Beispiel 1: Herstellung des hProPTH (1-84) Gens
Wie in 1 dargestellt, wurde das hProPTH (1-84) Gen als 14 unterteilte Fragmente von U1 bis U7 (SEQ ID NO: 1 bis 7) und L1 bis L7 (SEQ ID NO: 8 bis 14) synthetisiert.
Diese Fragmente wurden wie unten beschrieben zur Herstellung des hProPTH (1-84) Gens (2) ligiert.
Zunächst wurden ungefähr 1 μg DNA-Fragmente U1 (SEQ ID NO: 1) und ungefähr 1 μg DNA-Fragmente L7 (SEQ ID NO: 14) in 15 μl einer Phosphorylierungslösung (50 mM Tris/HCL (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT), enthaltend 16 Einheiten einer T4-Polynukleotidkinase und 0,5 nM (1 MBq oder mehr) [γ-³²P]dATP bei 37°C für 15 Min. umgesetzt. 5 μl einer Phosphorylierungslösung, enthaltend 5 mM ATP wurde hinzugefügt, und man ließ die Reaktion bei 37°C 45 Min. fortschreiten. Dasselbe Verfahren wurde für eine Kombination von U2 (SEQ ID NO: 2) mit L6 (SEQ ID NO: 13), eine Kombination von U3 (SEQ ID NO: 3) mit L5 (SEQ ID NO: 12), eine Kombination von U4 (SEQ ID NO: 4) mit L4 (SEQ ID NO: 11), eine Kombination von U5 (SEQ ID NO: 5) mit L3 (SEQ ID NO: 10), eine Kombination von U6 (SEQ ID NO: 6) mit L2 (SEQ ID NO: 9) und eine Kombination von U7 (SEQ ID NO: 7) mit L1 (SEQ ID NO: 8) wiederholt.
Die obigen 7 Reaktionslösungen wurden kombiniert und die resultierende Mischung wurde einer Präzipitation mit Ethanol zur Gewinnung von DNA unterzogen, die dann in 80 μl 100 mM Tris/HCL (pH 7,6), 6,5 mM MgCl₂ und 300 mM NaCl gelöst wurde. Man ließ ein 40 μl Aliquot bei 95°C 5 Min. stehen, und die Temperatur wurde dann auf 43°C über eine Zeitspanne von 30 Min. vermindert. Das ganze wurde dann auf Eis gekühlt, 40 μl Ligationsflüssigkeit B (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde zugefügt, und man ließ die Mischung 15 Min. bei 26°C stehen.
Diese Probe wurde auf einem 5%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch behandelt. Nach der Elektrophorese wurde ein ligiertes DNA-Fragment durch Autoradiografie nachgewiesen. Ein DNA-Fragment, korrespondierend zu ungefähr 280 bp, wurde aus dem Gel extrahiert und dann durch ein konventionelles Verfahren gereinigt.
Beispiel 2: Herstellung des βGal-139S(FM)PPH84 Expressionsplasmids pGP#19
Das ungefähr 280 bp DNA-Fragment, enthaltend ein synthetisches hProPTH (1-84), wies eine Restriktionsenzym-EcoRI-Stelle am 5'-terminalen Ende und eine Restriktionsenzym-SalI-Stelle am 3'-terminalen Ende auf. Die Klonierung des hProPTH (1-84) Gens wurde durch Insertion des EcoRI/SalI DNA-Fragments in die EcoRI/SalI-Stelle von pG210ShCT[G] durchgeführt.
Nachdem pG210ShCT[G] mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SalI verdaut worden war, wurde ein ungefähr 3,5 kb DNA-Fragment, enthaltend den Vektoranteil, hergestellt. Dieses Fragment wurde mit dem ungefähr 280 bp DNA-Fragment von hProPTH (1-84), hergestellt in Beispiel 1, ligiert, um pG210ShProPTH (3) herzustellen. pG210ShProPTH wurde in den E. coli Stamm JM109 zur Herstellung von JM109 [pG210ShProPTH] transformiert.
Weiterhin wurden die Linker KM091 (SEQ ID NO: 15) und KM092 (SEQ ID NO: 16) in die Restriktionsenzym-XhoI/EcoRI-Stelle von pG210ShProPTH inseriert, um das Plasmid pG210S (S/X) (3) herzustellen. Der obige Linker hat Restriktionsenzym-XhoI- und -EcoRI-Stellen an den jeweiligen beiden Enden und eine SacI-Stelle dazwischen.
pG210S (S/X) wurde mit den Restriktionsenzymen SacI und XhoI verdaut, und ein DNA-Bereich kodierend βGal-210S wurde spezifisch unter Verwendung des Deletionskits für Kilo-Sequenz (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) deletiert. Die Enden wurden unter Verwendung eines Klenow-Fragments repariert, gefolgt von einer Selbstligation, um das Plasmid pGP#19 herzustel len, kodierend ein chimeres Protein βGal-139S(FM)PPH84 mit βGal-139S und hProPTH (1-84) durch Phe-Met daran gebunden (4). Der E. coli Stamm JM109, mit pGP#19 darin eingeführt, wurde als "JM109[pGP#19]" bezeichnet.
Beispiel 3: Herstellung des βGal-117SmHPPH34 Expressionsplasmids pG117SmHPPH34
In diesem Beispiel wird die Herstellung des βGal-117SmHPPH34 Expressionsplasmids pG117SmHPPH34 beispielhaft beschrieben, und das βGal-97SmHPPH34 Expressionsplasmid pG97SmHPPH34 oder das βGal-139SmHPPH34 Expressionsplasmid pG139SmHPPH34 können unter Verwendung von βGal-97S oder βGal-139S anstelle von βGal-117S hergestellt werden.
1) Herstellung von pGP#19PPH34
pGP#19PPH34 wurde wie folgt hergestellt. Ein DNA-Fragment von hPTH (1-84), wobei das Kodon GTT von 35 Val zu dem Translationsstopkodon TAA umgewandelt wurde, wurde durch PCR unter Verwendung von pGP#19 als Matrize und S01 (SEQ ID NO: 17) und S02 (SEQ ID NO: 18) als Primer vervielfältigt. Ein Restriktionsenzym-AatII-SalI-DNA-Fragment wurde durch ein konventionelles Verfahren isoliert und gereinigt, gefolgt von einem Austausch mit einem Bereich, korrespondierend zu pGP#19 zur Herstellung von pGP#19PPH34 (5).
2) Herstellung von pGP117SPPH34
Die Amplifikation wurde durch PCR unter Verwendung von pG210 (S/X) als Matrize und S03 (SEQ ID NO: 19) und S05 (SEQ ID NO: 20) als Primer durchgeführt, gefolgt von einem Verdau mit Restriktionsenzymen PvuI und SmaI zur Herstellung eines DNA-Fragments. Weiterhin wurde die Amplifikation durch PCR unter Verwendung von pGP#19PPH34 als Matrize und S07 (SEQ ID NO: 21) und S02 als Primer, gefolgt von einem Verdau mit den Restriktionsenzymen SalI und SmaI zur Herstellung eines anderen DNA-Fragments durchgeführt. Die obigen beiden DNA-Fragmente und ein Restriktionsenzym-PvuI-SalI-DNA-Fragment, enthaltend einen Replikationsursprung für pGP#19PPH34, wurden unter Verwendung von T4-Ligase zur Herstellung von pGP117SPPH34 zusammen ligiert (6 und 7).
3) Herstellung von pGP117SmPPH34 (m = 4 oder 8)
pG117SmHPPH34 (m = 4 oder 8) wurde hergestellt durch Insertion der Linker S08 (SEQ ID NO: 22) und S09 (SEQ ID NO: 23), kodierend (His)₄-Pro-Gly, und der Linker S10 (SEQ ID NO: 24) und S11 (SEQ ID NO: 25), kodierend {(His)₄-Pro-Gly}₂, in die Restriktionsenzym-SmaI-Stelle von pG117SPPH34. In diesem Zusammenhang sollte festgehalten werden, daß ein Plasmid (m = 12, 16 oder 24) hergestellt werden kann, in dem die Länge der Linker variiert wird (6 und 7).
Weiterhin wurde pG117S4KPPH34 hergestellt, indem die Linker S12 (SEQ ID NO: 26) und S13 (SEQ ID NO: 27), kodierend (Lys)₄-Pro-Gly, in die Restriktionsenzym-SmaI-Stelle von pG117SPPH34 inseriert wurden. Ähnlich können pG97S4kPPH34 und pG139S4kPPH34 hergestellt werden.
Die Zahl und Ausrichtung der inserierten Linker wurde durch Bestimmung der DNA-Sequenz nach Herstellung der Plasmide bestätigt und chimere Proteine, die in diesem Beispiel hergestellt wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
In der Tabelle bedeutet H einen Histidinrest, K einen Lysinrest und die Zahl, die mit H oder K verbunden ist, bedeutet die Anzahl der Aminosäuren.
Beispiel 4: Herstellung eines chimeren Proteins hPTH (1-34)
Die Produktivität der in Tabelle 1 aufgeführten chimeren Proteine wurde unter Verwendung von SDS-PAGE überprüft.
16 Plasmide, die ein Gen, kodierend ein chimeres Protein wie in Tabelle 1 aufgeführt enthielten, wurden jeweils in den E. coli Stamm JM109 eingeführt. Die transformierten Zellen wurden in einem Teströhrchen kultiviert, enthaltend 2 ml SB-Medium bei 37°C unter Schütteln für 16 Std., gefolgt von einer Verdünnung mit physiologischer Salzlösung zu einer Kulturtrübheit (OD 660) von 10. Eine gleiche Menge eines SDS-Probenpuffers wurde zu 100 μl der Suspension zugefügt und die Mischung wurde 3 Min. gekocht. 10 μl des Überstands wurden einer SDS-PAGE unterzogen, um die Menge des chimeren Proteins, das pro Bakterium erzeugt worden war, zu vergleichen.
Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Wie sich aus 8 ergibt, variierte die Menge von exprimiertem chimeren Protein abhängig von der β-Galactosidasederivat/Zahl der Histidinrestkombination. Spezifisch konnte für βGal-97S eine hohe Produktivität in dem Fall erhalten werden von {(His)₄-Pro-Gly}_n, worin n = 2 oder 3; für βGal-117S konnte eine hohe Produktivität in dem Fall erhalten werden von {(His)₄-Pro-Gly}_n, worin n = 1, 2, 3, 4 und 6; und für βGal-139S konnte eine hohe Produktivität erhalten werden in dem Fall von {(His)₄-Pro-Gly}_n, worin n = 2 und 3. Insbesondere führte für die Derivate von βGal-117S die Einführung von {(His)₄-Pro-Gly}_n, worin n = 1 bis 6, zu einer deutlich erhöhten Menge des exprimierten chimeren Proteins, und in diesem Fall war die Menge des exprimierten chimeren Proteins größer als im Fall einer einfachen Veränderung der Ladung durch den Lysinrest.
Beispiel 5: Spaltung von hPTH (1-34) von dem chimeren Protein
Für die hochproduktiven chimeren Proteine (βGal-37SmHPPH34 (m = 12), βGal-117SmHPPH34 (m = 0, 4, 8, 12, 16 und 24) und βGal-139SmHPPH34 (m = 0 und 12 mit m = 0 als Kontrolle) wurde zur Untersuchung ihrer Eignung als Substrat für Kex2-660 der Einschlußkörper des chimeren Proteins gewonnen, in 8 M Harnstoff gelöst und verdünnt, um eine Reaktionszusammensetzung zu ergeben (20 mM Tris/HCL (pH 8,2), 100 mM NaCl, 3,0 M Harnstoff, 2,0 mM CaCl₂, 8 mg/ml chimeres Protein). Kex2-660 wurde dann zu einer Endkonzentration von 20 kU/ml zur Spaltung von hPTH (1-34) zugefügt. 90% oder mehr von βGal-117SPPH34 als Kontrolle wurden unter diesen Bedingungen für 1 Std. ausgeschnitten.
In 9 wurde die Reaktivität jedes Derivats mit Kex2-660 im Hinblick auf das Verhältnis von kcat zu pG117SPPH34 ausgedrückt. Die quantitative Bestimmung von hPTH (1-34) wurde gemäß dem in den obigen "grundlegenden experimentellen Verfahren" beschriebenen Verfahren durchgeführt. Im Ergebnis wurde festgestellt, daß in allen Fällen die Einführung von {(His)₄-Pro-Gly}_n, mit n = 1 bis 6, weiter zu einer verbesserten Reaktivität mit Kex2-660 führte.
Insbesondere wurde für βGal-117S4HPPH34 festgestellt, daß die Einführung von einem (His)₄-Pro-Gly Linker zu einer verbesserten Produktion des chimeren Proteins und Reaktivität mit Kex2-660 führt und zusätzlich eine Löslichkeit von nicht weniger als 15 g/l unter Kex2-Reaktionsbedingungen liefert, d.h. zu einer Verbesserung der Löslichkeit gegenüber der Löslichkeit von βGal-139SPPH34 (8 g/l) beitrug.
Beispiel 6: Massenproduktion von hPTH (1-34)
Um das chimere Protein βGal-117S4HPPH34 in Masse zu produzieren, von dem festgestellt worden war, daß es mit hoher Produktivität exprimiert wurde und daß es als Substrat für Kex2-660 geeignet war, wurde das Plasmid pG117S4HPPH34, enthaltend ein Gen, das dieses chimere Protein kodierte, in den E. coli Stamm M25 (W3110/ompT) transformiert, um den Stamm M25[pG117S4HPPH34] herzustellen. Der Stamm M25[pG117S4HPPH34] wurde unter Verwendung eines Mediums (2% (G/V) Hefeextrakt, 1% (G/V) Trypton, 1,2% (G/V) K₂HPO₄, 0,3% (G/V) KH₂PO₄, und 0,5% (G/V) Glycerin), enthalten in einem 20 l Kulturtank, bei 37°C kultiviert.
Wenn die Zellkonzentration bei OD660 = 1,0 erreichte, wurde IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid) zu einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt, gefolgt von weiterer Kultivierung, bis die Zellkonzentration OD660 = 12 erreichte. Die Zellen wurden geerntet, in TE (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA (pH 8,0)) suspendiert. Die Suspension wurde einer Hochdruckhomogenisierung (Manton-Gaulin) unterzogen, um die Zellen aufzubrechen. Das Homogenat wurde zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten, das das chimere Protein enthielt, das dann mit TE und deionisiertem Wasser gewaschen wurde. Ungefähr 100 g der Einschlußkörper, enthaltend chimeres Protein; wurden aus 20 l Kultur erhalten. Zu 250 ml der Suspension des Einschlusses (160 g/l) wurden 100 ml 1 M Tris/HCL (pH 8,2), 50 ml 5 M NaCl, 500 ml deionisiertes Wasser und 900 g Harnstoff zugefügt, und die Mischung wurde 30 Min. in einer thermostatischen Kammer, die für 30 Min. bei 30°C gehalten wurde, zur Lösung der Komponenten gerührt, mit angewärmtem deionisiertem Wasser verdünnt und bei 30°C auf 5 l gebracht.
50 ml einer 250 mM CaCl₂-Lösung wurden unter Rühren langsam zugefügt, und Kex2-660 wurde auf 20 kU/ml zugefügt. 2 Std. nach der Zugabe von Kex2-660 (prozentuale Spaltung: nicht weniger als 90%) wurde der pH durch Zugabe von Essigsäure auf 6,4 eingestellt, gefolgt von einer zweifachen Verdünnung mit deionisiertem Wasser, um das chimere Protein, das nicht umgesetzt worden war, und das Schutzpeptid zu koagulieren und zu sedimentieren. Eine Zentrifugation wurde durchgeführt, um einen Überstand zu erhalten, der hPTH (1-34) enthielt. Der Überstand wurde auf pH 5,0 durch Zugabe von Essigsäure eingestellt und durch eine Kationenaustauschharz-(SP Toyopearl)-Säule geführt, äquilibriert mit 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0), um hPTH (1-34) zu adsorbieren, gefolgt von einer Elution von hPTH (1-34) mit 0,4 M NaCl.
Essigsäure wurde zu einer Endkonzentration von 3% zugefügt, und man führte die Mischung durch eine Niedrigdruck-Umkehrphasensäule (SokenODS-W), äquilibriert mit 3% (V/V) Essigsäure, um hPTH (1-34) zu adsorbieren, gefolgt von einer Elution von hPTH (1-34) mit einer 30%igen (V/V) Acetonitrillösung, enthaltend 3% (V/V) Essigsäure. Das Acetonitril wurde bei reduziertem Druck entfernt und der Rest durch einen 0,22 μm Membranfilter gefiltert und auf einer Umkehrphasen-HPLC präparativen Säule (TSKgelODS120T Φ 55 × 600) gereinigt. In diesem Fall wurde die Elution unter Verwendung von Acetonitril mit einem linearen Dichtegradienten durchgeführt (A: 5% (V/V) Essigsäure/10% (V/V) Acetonitril; B: 5% (V/V) Essigsäure/40% (V/V) Acetonitril; %B = 20%→80%/60 Min.) mit einer Flußrate von 40 ml/Min.. Die Gewinnung von hPTH (1-34) für jeden Schritt wurde in Tabelle 2 eingetragen.
Tabelle 2 Gewinnung von hPTH (1-34)
Beispiel 7: Substitution von Aminosäuren an der Kex2-660-Erkennungsstelle P3 des chimeren Proteins
Um Aminosäuren an der P3-Stelle (Lys) in andere Aminosäuren umzuwandeln, wurden Oligonukleotide S14–S18 (SEQ ID NO: 28 bis 32) mit einem Kodon, korrespondierend zu der P3-Stelle, die umgewandelt werden sollte, synthetisiert und ein DNA-Fragment wurde durch PCR unter Verwendung dieser Oligonukleotide und S02 (SEQ ID NO: 18) als Primer und pG117S4HPPH34 als Matrize synthetisiert. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde durch Ethanolpräzipitation gereinigt, durch StuI und SalI gespalten und auf 2,0% (G/V) Agarosegel elektrophoretisch behandelt, um ein Ziel 0,4 Kbp StuI-SalI-Fragment zu reinigen.
Dieses DNA-Fragment wurde mit einem DNA-Fragment ligiert, kodierend einen β-Galactosidasebereich von pG117S4HPPH34, der durch Verdau mit StuΙ und SalI hergestellt worden war und durch Durchführung einer Reinigung auf dieselbe Weise wie gerade oben beschrieben im Zusammenhang mit dem Ziel-StuI-SalI-DNA-Fragment. Nach Abschluß der Ligierungsreaktion wurde die Ligationsmischung verwendet, um den E. coli Stamm JM109 zu transformieren. Für alle Kombinationen wurden 10 Tetracyclin-resistente Klone erhalten, und Plasmide aus den Klonen wurden durch DNA-Sequenzierung zum Erhalt gewünschter Expressionsvektoren analysiert.
Das heißt, es wurde ein Expressionsvektor pG117S4HVXPH34 für ein chimeres Protein βGal-117S4HVXPH34 mit einer Aminosäuresequenz hergestellt, worin die Kex2-660 Erkennungsstelle Ser-Val-Lys-Lys-Arg eines chimeren Proteins, kodierend pG117S4HPPH34, mit Ser-Val-X-Lys-Arg substituiert worden war, worin X = Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, Phe, Tyr, Trp, His oder Pro.
Um die Reaktivität jedes chimeren Proteins mit Kex2-660 zu untersuchen, wurde jeder Klon in 50 ml eines SB-Mediums kultiviert, und nachdem die Zellkonzentration OD660 = 1,0 erreicht hatte, wurde die Expression durch IPTG induziert, gefolgt von einer Kultivierung für zusätzliche 4 Std.. Danach wurden die Zellen geerntet, mit einem TE-Puffer gewaschen, suspendiert, aufgebrochen und zentrifugiert, um Einschlußkörper herzustellen. Die Einschlußkörper wurden mit 1% (G/V) Triton X100, enthaltend 10 mM EDTA, und TE gewaschen, um gereinigte Einschlußkörper herzustellen. 90% oder mehr des Peptidbestandteils, enthalten in den Einschlußkörpern, waren das beabsichtigte Protein. 20 μl 1 M Tris/HCL (pH 8,2), 20 μl 5 M NaCl und 300 μl 10 M Harnstoff wurden zugefügt und in einer Suspension von jedem chimeren Proteineinschlußkörper gelöst, woraufhin die Mischungen mit 650 μl deionisiertem Wasser verdünnt und in einer thermostatischen Kammer für 10 Min. bei 30°C gehalten wurde, dann wurden 10 μl einer 250 mM CaCl₂-Lösung zugefügt, und Kex2-660 wurde zu einer Konzentration von 20 kU/ml zugefügt.
90% oder mehr βGal-117SPPH34 als Kontrolle wurden unter diesen Bedingungen für 1 Std. ausgeschnitten. hPTH (1-34), das erzeugt worden war, wurde quantitativ durch HPLC unter Verwendung der obigen ODS-Säule bestimmt. Die Reaktivität von jedem Derivat mit Kex2-660 wurde im Hinblick auf das Verhältnis von kcat zu pG117S4HPPH34 ausgedrückt (10). Es wurde festgestellt, daß die Spaltungseffizienz von hPTH (1-34) durch Kex2-660 verbessert ist, wenn X = Phe oder His, während wenn X = Pro im wesentlichen kein hPTH (1-34) durch Kex2-660 ausgeschnitten wird.
Beispiel 8: Substitution der Aminosäuren an der Kex2-660 Erkennungsstelle P4 des chimeren Proteins
Basierend auf den Ergebnissen von Beispiel 7 und der Tatsache, daß die Menge des Nebenprodukts zum Zeitpunkt der Spaltung gering ist, wurde ein chimeres Protein mit einem Histidinrest an der P3-Stelle, βGal-117S4HVHPH34, als chimeres Protein für die Erzeugung von hPTH (1-34) gewählt, und es wurde ein Versuch unternommen, die Aminosäuren an der P4-Stelle zur weiteren Verbesserung der Reaktivität mit Kex2-660 zu substituieren. Die Oligonukleotide S19 bis S24 (SEQ ID NO: 33 bis 38) wurden synthetisiert, und ein DNA-Fragment mit einer darin eingefügten Mutation wurde durch PCR unter Verwendung der obigen Oligonukleotide und S02 als Primer und pG117S4HVHPPH34 als Matrize synthetisiert.
Das Verfahren gemäß Beispiel 7 wurde wiederholt, um einen Expressionsvektor pG117S4HXHPH34 für ein chimeres Protein βGal-117S4HXHPH34 herzustellen, mit einer Struktur, worin die Kex2-660 Erkennungsstelle Ser-Val-His-Lys-Arg des chimeren Proteins durch Ser-X-His-Lys-Arg ersetzt worden war, worin X = Gly, Ala, Leu, Ile, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, Cys, Met, Phe, Tyr, Trp, His, Pro oder Val.
Die Empfindlichkeit gegenüber Kex2-660 wurde unter Verwendung der chimeren Proteine als Substrat unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 6 bewertet. Im Ergebnis wurde festgestellt, daß wenn X = Lys oder Arg, dann die Effizienz der Spaltung von hPTH (1-34) durch Kex2-660 verbessert ist, während für den Fall, in dem X eine saure Aminosäure ist (Asp oder Glu), im wesentlichen kein hPTH (1-34) durch Kex2-660 ausgeschnitten wurde (11). So wurde es zum ersten Mal deutlich, daß die Kex2-660-Protease einen Argininrest an der P1-Stelle benötigt und eine starke basische Aminosäure oder einen Prolinrest an der P2-Stelle, und daß sie gleichzeitig einen Histidin- oder Phenylalaninrest an der P3-Stelle und eine stark basische Aminosäure an der P4-Stelle bevorzugt, und daß die Gegenwart eines Prolinrests an der P3-Stelle oder die Gegenwart einer sauren Aminosäure an der P4-Stelle zu einer deutlich erniedrigten chimeren Proteinspaltungsaktivität führt.
Beispiel 9: Entfernung von Kex2-660-gespaltenen Stellen von dem Schutzpeptid
Die Kex2-660-Spaltungsreaktionen in Beispielen 7 und 8 wurden mit dem Zeitverlauf durch HPLC verfolgt. Im Ergebnis wurde festgestellt, daß eine Peptidbindung an der C-terminalen Seite der Sequenz Arg-Arg an den Positionen 13 und 14 des Schutzpeptids βGal-117S gespalten wurde. Daher wurde erwartet, daß das resultierende βGal (1-14) zum Zeitpunkt der Reinigung von hPTH (1-34) durch Präzipitation mit einer Säure enthalten ist. Dementsprechend wurde ein Versuch unternommen, 14 Arg durch Lys zu ersetzen, um die Spaltung durch Kex2-660 zu inhibieren, wodurch die Produktion von βGal (1-14) inhibiert wird.
Ein Plasmid pKGSPH34 (12), kodierend ein chimeres Protein (βGal-117KS4HRHPH34), worin 14 Arg durch Lys ersetzt war, wurde wie folgt hergestellt. Zunächst wurde ein DNA-Fragment, worin eine Mutation eingeführt worden war, AseI-RK, durch PCR unter Verwendung eines Oligonukleotids S25 (SEQ ID NO: 39) und S26 (SEQ ID NO: 40) als Primer und pG117S4HRHPH34 als Matrize synthetisiert. Ähnlich wurde ein DNA-Fragment, RK-BglII, unter Verwendung eines Oligonukleotids S27 (SEQ ID NO: 41) und S28 (SEQ ID NO: 42) als Primer hergestellt.
Jedes DNA-Fragment wurde gereinigt, und ungefähr 1 ng von jedem der gereinigten DNA-Fragmente wurde gewogen, die gewogenen Fragmente wurden vermischt, eine PCR wurde viermal in Abwesenheit von Primern durchgeführt, um ein AseI-BglII Fragment mit einer darin eingefügten Mutation zu synthetisieren. Die Oligonukleotide S25 und S28 wurden zugefügt und die PCR wurde fortgesetzt, um das Fragment zu amplifizieren. Das Fragment wurde durch Ethanolpräzipitation gereinigt, durch AseI und BglII gespalten, elektrophoretisch auf einem 2,0%igen (G/V) Agarosegel behandelt, um ein Ziel 0,35 kbp Fragment herzustellen. Ein AseI/SphI (1,8 kbp) Fragment und ein SphI/BglII (1,4 kbp) Fragment von pG117S4HRHPH34 wurde elektrophoretisch auf einem 1,0%igen (G/V) Agarosegel zur Reinigung dieser Fragmente behandelt.
Die obigen drei Fragmente wurden miteinander ligiert und die Ligationsmischung wurde verwendet, um den E. coli Stamm JM109 zu transformieren. Tetracyclin-resistente Klone wurden erhalten und Plasmide, durch das Alkali-Lyse-Verfahren hergestellt, wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert. Ein Zielklon wurde selektiert, der ein Plasmid pGKSPH34 aufwies, enthaltend ein Gen, worin eine DNA-Sequenz CGG, kodierend 14 Arg des Schutzpeptids, durch AAG substituiert worden war. Die Einschlußkörper der chimeren Proteine wurden auf dieselbe weise wie in Beispiel 5 erhalten. Sie wurden mit Kex2-660 umgesetzt. Im Ergebnis wurde festgestellt, daß die obige Substitution im wesentlichen vollständig die Spaltung des Schutzpeptids inhibierte und dadurch die Last, die dem Reinigungsverfahren auferlegt wurde, erleichterte.
Beispiel 10: Massenproduktion des chimeren Proteins βGal-117KS4HRHPH34 und Erzeugung von hPTH (1-34)
In dem Beispiel wurden die Produktion des chimeren Proteins βGal-117KS4HRHPH34 unter Kulturbedingungen in großem Maßstab, wobei dieses chimere Protein als am besten geeignet als Substrat für Kex2-660 auf dem Teströhrchenniveau betrachtet worden war, die Spaltung durch Kex2-660-Protease und die Reinigung von hPTH (1-34) durchgeführt.
pGKSPH34 wurde verwendet, um den E. coli Stamm M25 zu Tetracyclin-Resistenz zu transformieren, um Tetracyclin-resistente Stämme zu ernten, gefolgt von der Herstellung eines Produktionsstamms M25[pGKSPH34]. Der Stamm M25[pGKSPH34] wurde im großen Maßstab in einem NU1-Synthesemedium, enthaltend 2% (G/V) Glucose, kultiviert.
Nach dem Verbrauch der Glucose wurde Glycerin als Kohlenstoffquelle zugegeben, und die Kultivierung wurde 24 Std. unter Einstellung des pHs auf 7,0 durchgeführt. Die endgültige Zellkonzentration betrug 150 bis 200 OD. Dieses chimere Protein wurde stabil unter Kulturbedingungen in großem Maßstab erzeugt, und es wurde keine signifikante Inhibition des Wachstums der E. coli Wirtszellen beobachtet trotz des hohen Niveaus der Expression. Die Menge der erzeugten Einschlußkörper betrug ungefähr 5 g/l. Nach Aufbrechen der Zellen wurden unlösliche Stoffe mit TE und mit deionisiertem Wasser gewaschen, um einen gereinigten Einschlußkörper herzustellen.
Der Einschlußkörper wurde mit Harnstoff löslich gemacht und verdünnt, um eine Reaktionslösungszusammensetzung von 20 mM Tris//HCl (pH 8,2), 50 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, 2,7 M Harnstoff und 8,0 mg/ml chimerem Protein zu ergeben. Bei einer Reaktionstemperatur von 30°C wurde Kex2-660 zu einer Konzentration von 5 kU/ml zur Spaltung von hPTH (1-34) von dem chimeren Protein zugefügt, und die Produktion von hPTH (1-34) wurde quantitativ bestimmt. Im Ergebnis erreichte 30 Min. nach Beginn der Reaktion die prozentuale Spaltung 90% oder mehr, und die Menge von Kex2-660 war auf 1/4 vermindert im Vergleich mit βGal-117S4HPH34. Nach Abschluß der Reaktion wurde hPTH (1-34) auf dieselbe Weise wie in Beispiel 5 gereinigt. Die Wiedergewinnung im Reinigungsverfahren war im wesentlichen dieselbe wie die in Beispiel 5.
Beispiel 11: Herstellung eines βGal-117S4HGP Produktionsplasmids, pG117S4HGP
Ein Plasmid, das ein chimeres Protein (βGal-117S4HGP) erzeugt, enthaltend ein menschliches Glucagon-ähnliches Peptid I (hGLP-1 (7-37)), pG117S4HGP, wurde gemäß dem folgenden Verfahren konstruiert. Zunächst wurden vier DNAS, dargestellt in 14(a) (GLP-1 (SEQ ID NO: 43), GLP-2 (SEQ ID NO: 44), GLP-3 (SEQ ID NO: 45) und GLP-4 (SEQ ID NO: 46), synthetisiert. Diese DNAs wurden am 5'-terminalen Ende mit der T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert, miteinander vermischt und verklebt, um ein hGLP-1 (7-37) Gen (DNA (I)) herzustellen. Andererseits wurden zwei synthetische DNAS (117S4H SphI Primer (SEQ ID NO: 47) und 117S4H BglII Primer (SEQ ID NO: 48)), dargestellt in 14(b) als Primer für die PCR verwendet, und die PCR wurde unter Verwendung von pGKSPH34 als Matrize durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit BglII und SphI verdaut, um ein DNA-Fragment mit BglII und SphI klebrigen Enden herzustellen (DNA (II)).
Dann wurde pGKSPH34 mit BglII und SalI verdaut und auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisch behandelt, um ein größeres DNA-Fragment (DNA (III)) aus dem Gel zu gewinnen. DNA (I), DNA (II) und DNA (III), die so erhalten worden waren, wurden unter Verwendung der T4 DNA-Ligase zur Herstellung von pG117S4HGP ligiert (15).
Beispiel 12: Erzeugung von dem chimeren Protein βGal-117S4HGP
Der E. coli Stamm W3110M25 mit dem oben hergestellten pG117S4HGP wurde in einem Medium kultiviert, enthaltend 1,5% Glucose, 4 g/l K₂HPO₄, 4 g/l KH₂PO₄, 2,7 g/l Na₂HPO₄, 0,2 g/l NH₄Cl, 1,2 g/l (NH₄)₂SO₄, 4 g/l Hefeextrakt, 2 g/l L-Methionin, 2 g/l MgSO₄·7H₂O, 40 mg/l CaCl₂·2H₂O, 40 mg/l FeSO₄·7H₂O, 10 mg/l MnSO₄·nH₂O, 10 mg/l AlCl₃·H₂O, 4 mg/l CoCl₂·6H₂O, 2 mg/l ZnSO₄·7H₂O, 2 mg/l Na₂MoO₄·2H₂O, 1 mg/l CuCl₂·2H₂O, 0,5 mg/l H₃BO₄ und 10 mg/l Tetracyclin unter Bedingungen von 32°C und pH 7,0. Nach dem Verbrauch von Glucose wurde Glycerin als Kohlenstoffquelle verwendet, und die Kultur wurde für zusätzliche 8 Std. bei 37°C fortgesetzt, um Einschlußkörper von βGal-117S4HGP im Bakterium zu erzeugen. Nach Abschluß der Kultivierung wurde die Kultur dann durch einen Manton-Gaulin-Homogenisator (Modell 15M-8TA, hergestellt von Manton-Gaulin) bei 600 kg/cm² homogenisiert und zentrifugiert (CEPA-Zentrifuge), um eine Präzipitatfraktion zu gewinnen. Das Präzipitat wurde in einem Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) in einer entsprechenden Menge zu der der Kultur suspendiert, wieder durch Zentrifugation gewonnen und in deionisiertem Wasser in einer gleichen Menge zu der der Kultur suspendiert. Danach wurde wiederum eine Zentrifugation durchgeführt, um das Präzipitat zu gewinnen, das dann in deionisiertem Wasser in einer gleichen Menge zu der des Präzipitats suspendiert und in dem darauffolgenden Verfahren verwendet wurde.
Beispiel 13: Spaltung von hGLP-1 (7-37) von dem chimeren Protein
Der in Beispiel 12 hergestellte chimere Proteineinschlußkörper wurde gewonnen, in 8 M Harnstoff gelöst und verdünnt, um eine Reaktionszusammensetzung (20 mM Tris/HCl (pH 8,2), 100 mM NaCl, 3,0 M Harnstoff, 2,0 mM CaCl₂, 8 mg/ml chimeres Protein) zu ergeben. Kex2-660 wurde dann zu einer Endkonzentration von 10.000 U/ml zur Spaltung von hGLP-1 (7-37) zugefügt. 90% oder mehr von βGal-117S4HGP als Kontrolle wurde unter diesen Bedingungen für 1 Std. gespalten.
Beispiel 14: Fraktionierung von hGLP-1 (7-37) (16, Tabelle 3)
Um das chimere Protein βGal-117S4HGP in Masse zu produzieren, von dem gezeigt wurde, daß es mit hoher Produktivität exprimiert wird und als Substrat für Kex2-660 geeignet ist, wurde das Plasmid pG117S4HGP, kodierend dieses chimere Protein, in den E. coli Stamm M25 (W3110(ompT) transformiert, gefolgt von einer Kultivierung in einem 20 l Kulturbehälter. Das Medium umfaßte 20 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Bactotripton, 12 g/l K₂HPO₄, 3 g/l KH₂PO₄ und 5 g/l Glycerin. Wenn die Zellkonzentration OD660 = 1,0 erreichte, wurde IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid) zu einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt. Ein Antischaummittel (DISFOAM CC-222, hergestellt von Nippon Oils & Fats Co., Ltd.) wurde verwendet. Die Kultivierung wurde bei 37°C fortgesetzt, bis die Zellkonzentration OD660 = 12 erreichte. Die Zellen wurden geerntet und in TE (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA (pH 8,0)) suspendiert. Die Suspension wurde einer Hochdruckhomogenisierung (Manton-Gaulin) unterzogen, um die Zellen aufzubrechen. Das Homogenat wurde zentrifugiert, um ein Präzipitat, enthaltend chimeres Protein, zu erhalten, das dann mit TE und deionisiertem Wasser gewaschen wurde. Ungefähr 100 g Einschlußkörper, enthaltend chimeres Protein, wurden aus 20 l Kultur erhalten. Zu 250 ml der Suspension des Einschlusses (160 g/l) wurden 100 ml 1 M Tris/HCl (pH 8,2), 50 ml 5 M NaCl, 500 ml deionisiertes Wasser und 900 g Harnstoff zugefügt, und die Mischung wurde 30 Min. in einer thermostatischen Kammer geführt, die bei 30°C gehalten wurde, um die Komponenten zu lösen, verdünnt mit warmem deionisiertem Wasser und bei 30°C auf 5 l gebracht. 50 ml einer 250 mM CaCl₂-Lösung wurde langsam unter Rühren zugefügt, und Kex2-660 wurde auf 20.000 U/ml (ungefähr 4,0 mg/l) zugefügt. 2 Std. nach der Zugabe von Kex2-660 (prozentuale Spaltung: nicht weniger als 90%) wurde der pH durch Zugabe von Essigsäure auf 6,4 eingestellt, gefolgt von einer zweifachen Verdünnung mit deionisiertem Wasser zur Koagulation und Sedimentation des chimeren Proteins, das nicht umgesetzt worden war, sowie des Schutzpeptids. Eine Zentrifugation wurde durchgeführt, um einen Überstand zu erhalten, der hGLP-1 (7-37) enthielt. Der Überstand wurde auf pH 5,0 durch Zugabe von Essigsäure eingestellt und durch ein Kationenaustauschharz-(SP Toyopearl)-Säule geführt, die mit einem 2 M Harnstoff/10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) äquilibriert worden war, um hGLP-1 (7-37) zu adsorbieren, gefolgt von einem Waschen mit einem 2 M Harnstoff/10 mM Natriumacetatpuffer (pH 6,2) und einer Elution von hGLP-1 (7-37) mit einem Natriumchlorid-Dichtegradienten von 0 M bis 300 mM. Essigsäure wurde zunächst in das Fraktionsrohr plaziert, um eine Endkonzentration von 3% zu ergeben, was die Koagulation von hGLP-1 (7-37) verhinderte. Eine Fraktion, die hGLP-1 (7-37) enthielt, wurde gesammelt und durch eine Niedrigdruck-Umkehrphasensäule (Soken ODS-W) geführt, äquilibriert mit 5% Essigsäure, um hGLP-1 (7-37) zu adsorbieren, gefolgt von einer Elution von hGLP-1 (7-37) mit einer 50%igen Acetonitrillösung, enthaltend 5% Essigsäure. Das Acetonitril wurde bei reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde durch einen 0,22 μm Membranfilter gefiltert und lyophilisiert.
Die quantitative Bestimmung von hGLP-1 (7-37) wird im Detail beschrieben. Eine Lösung, enthaltend hGLP-1 (7-37), die einer 10- bis 20-fachen Verdünnung mit einem Probenpuffer (1 M Acetat/2 M Harnstoff) unterzogen wurde, wurde zum Erhalt eines Überstand zentrifugiert. Der Überstand wird dann auf eine HPLC (LC10A, hergestellt von Shimadzu Seisakusho Ltd.) aufgebracht, an die YMC-C8-A302 (4,6 mm I. D. × 150 mm) Säule (hergestellt von K. K. Yamamura Kagaku Kenkyujo) angebunden worden war, gefolgt von einer Entwicklung von 10 bis 20 μl des Überstands unter Verwendung von Flüssigkeit A (0,1% TFA/10% Acetonitril) und Flüssigkeit B (0,094% TFA/60% Acetonitril) mit dem Gradienten B 40%→80%/20 Min.. Die Menge von hGLP-1 (7-37) wird aus dem Verhältnis des Peakbereichs für hGLP-1 (7-37) zu dem Peakbereich für ein Standard-hGLP-1 (7-37) mit einer bekannten Konzentration bestimmt, wobei die Peaks durch eine Bestimmung der Absorption bei 220 nm nachgewiesen werden. Die Gewinnung ist in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 2 Gewinnung von hGLP-1 (7-37)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Chimeres Protein, repräsentiert durch die folgende Formel: A-L-B worin A ein Schutzpeptid repräsentiert; B repräsentiert ein Zielpeptid; und L repräsentiert ein Linkerpeptid mit der Sequenz X₁-X₂-(Pro, Lys oder Arg)-Arg in seinem C-terminalen Bereich, worin X₁ und X₂ jede Aminosäure darstellen, und einer Domäne, die reich an His ist, in einem N-terminalen Bereich, wobei die an His reiche Domäne im N-terminalen Bereich die folgende Sequenz aufweist: [(His)₄-Pro-Gly]_n, worin n 1 bis 6 bedeutet.
Chimeres Protein gemäß Anspruch 1, worin beliebige 1 bis 5 Aminosäuren zwischen der Aminosäuresequenz im N-terminalen Bereich und der Aminosäuresequenz im C-terminalen Bereich existieren.
Chimeres Protein gemäß Anspruch 1 oder 2, worin X₁ Arg, Lys oder His und X₂ His oder Phe bedeutet.
Chimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin A ein Polypeptid bedeutet, das nicht die folgende Aminosäuresequenz enthält: Pro-Arg, Arg-Arg und Lys-Arg.
Chimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin, wenn A ein Polypeptid bedeutet, das die Aminosäuresequenz Pro-Arg, Arg-Arg oder Lys-Arg enthält, mindestens eine Aminosäure in der Aminosäuresequenz mit einer anderen Aminosäure substituiert wurde, so daß A diese Aminosäuresequenz nicht enthält.
Chimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin A ein Polypeptid von nicht mehr als 220 Aminosäureresten darstellt.
Chimeres Protein gemäß Anspruch 6, worin A ein Peptid von Aminosäuren 1–97, 1–117 oder 1–139 der N-terminalen Seite der von E. coli abgeleiteten β-Galactosidase bedeutet.
Chimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin alle Cysteinreste in A mit einer anderen Aminosäure substituiert wurden.
Chimeres Protein gemäß Anspruch 8, wobei die andere Aminosäure ein Serinrest ist.
Chimeres Protein gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin B ein menschliches Parathyroidhormon oder ein Derivat davon bedeutet.
Chimeres Protein gemäß Anspruch 10, wobei das menschliche Parathyroidhormonderivat ein Fragment umfaßt, umfassend Aminosäurereste von 1 oder 3 bis 31, 34, 37, 38 oder 84 im N-terminalen Ende eines natürlich auftretenden menschlichen Parathyroidhormons, oder ein Fragment, umfassend diese Aminosäurereste, wobei weiterhin Gly dem C-terminalen Ende zugefügt wurde.
Chimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin B GLP-1 oder ein Derivat davon bedeutet.
Verfahren zur Erzeugung des chimeren Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend die Schritte der Transformation eines Expressionsvektors, enthaltend DNA, codierend das chimere Protein in eine Wirtszelle; Kultivieren der resultierenden Transformanten und Ernten des chimeren Proteins aus der Kultur.
Verfahren zur Erzeugung eines Zielpeptids (B), wobei ein Verarbeitungsenzym an dem chimeren Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 wirken kann, um eine Peptidbindung zwischen dem C-terminalen Ende des Linkerpeptids (L) und dem N-terminalen Ende des Zielpeptids (B) zum Erhalt des Zielpeptids (B) spalten kann.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das Verarbeitungsenzym ein Mitglied ist, gewählt aus der Kex2-Protease, Furin, einer Prohormonkonvertase 1/3 (PC1/3), einer Prohormonkonvertase 2 (PC2) und Derivaten dieser Verarbeitungsenzyme.
Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei das Zielpeptid (B) durch isoelektrische Präzipitation gewonnen wird.