KR970065554A - 프로세싱 효소를 사용한 키메라 단백질의 절단 방법 - Google Patents

프로세싱 효소를 사용한 키메라 단백질의 절단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 목적 단백질을 포함하는 키메라 단백지로서, 프로세싱 효과에 의해 용이하게 개열되고, 효율 좋게 목적 단백질을 회수할 수 있도록 한 화학식 (1)의 키메라 단백질을 제공하는 것이다.
A-L-B (1)
상기 식에서, A는 보호 펩티드이고; B는 목적 펩티드이고; L은 링커 펩티드로서, 그 C-말단 부분에 X1 및 X2은 임의의 아미노산인 X1-X2-(Pro, Lys 또는 Arg)-Arg 서열을 가지고, N-말단에 His가 풍부한 부분을 가진다.

Description

프로세싱 효소를 사용한 키메라 단백질의 절단 방법
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 합성 hProPTH(1-84) 유전자제조에 사용한 합성 올리고모의 서열을 나타낸다. 제2도는 합성 hProPTH(1-84) 유전자의 제조방법을 나타낸다. 제3도는 플라스미스 pG210S (S/X)의 제조방법을 나타내는 도면이다. 제4도는 키메라 단백질 βGal-139S(FM) PPH84를 발현하는 플라스미드 pGP#19의 제조방법을 나타낸다. 제5도는 키메라 단백질 βGal-139S(FM) PPH34를 발현하는 플라스미드 pGP#19PPH34의 제조방법을 나타내는 도면이다. 제6도는 키메라 단백질 βGal-117SPPH34 및 βGal-117SnHPPH34을 발현하는 플라스미드 pG117SPPH34와 pG117SnHPPH34의 제조방법의 전반부분을 나타내는 도면이다(n=1내지 6), 제7도는 키메라 단백질 βGal-117SPPH34 및 βGal-117SnHPPH34를 발현하는 플라스미드 pG117SPPH34와 pG117SnHPPH34의 제조방법의 후반부분을 나타내는 도면이다(n=1 내지 6), 제8도는 포리히드티딘 링커{(His)4-Pro-Gly}n{n=1 내지 6)이 키메라 단백질이 생산량에 미치는 영향을 조사한 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 도면이다, 제9도는 Kex 2-660에 의한 hPTH(1-34)의 절단 수출 효율에 미치는 포리히스티딘 링커{(His)4-Pro-Gly}n{n=1 내지 6)의 영향을 나타내는 도면이다. 제10도는 Kex 2-660에 의한 hPTH(1-34)의 절단 수출 효율에 미치는 Kex 2 프로테아제의 인식부위 P3의 아미노산의 영향을 나타낸 도면이다, 제11도는 Kex 2-660에 의한 hPTH(1-34)의 절단 수출 효율에 주는 Kex 2 프로테아제의 인식부위 P4의 아미노산의 영향을 나타낸 도면이다, 제12도는 βGal-117KS4HRHPH34 유전자의 발현 벡터pGKSPH34의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다, 제13도는 플라스미드 pG210ShCT(G)의 제조방법을 나타내는 도면이다, 제14도는 HGLP-1(7-37) 유전자(DNA (1))제조용 합성올리고 뉴클레오티드의 염기서열 및 pGKSPH34를 주형으로하는 PCR 용 프라이머의 염기서열을 나타낸다, 제15도는 플라스미드 pG117S4HGP의 제조과정을 나타낸다, 제16도는 hGLP-1의 정제의 프로파일이고, A는 Kex 2 반응후, B는 산성침전 상등액, C는 양이온 교환 칼럼후, D는 저압 역상 칼럼후의 결과를 나타낸다.

Claims (17)

  1. 화학식 (1)의 키메라 단백질.
    A-L-B(1)
    상기 식에서 A는 펩티드이고; B는 목적 펩티드이고; L은 링커 펩티드로서, 그 C-말단부분에 X1 및 X2은 임의의 아미노산인 X1-X2-(Pro, Lys 또는 Arg)-Arg 서열을 가지고, N-말단에 His가 풍부한 부분을 가진다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 N-말단에 His가 풍부한 부분이 n이 1 내지 6인 〔(His)4-Pro-Gly〕n서열을 갖는 키메라 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 N-말단부분의 아미노산 서열과 상기 C-말단부분의 아미노산 서열과의 사이에 1 내지 5개의 임의의 아미노산이 존재하는 키메라 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 Arg, Lys 또는 His이고, X2가 His 또는 Phe인 키메라 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, A가 아미노산 서열; Pro-Arg, Arg-Arg 또는 Lys-Arg를 함유하지 않는 폴리펩티드인 키메라 단백질.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, A가 아미노산 서열; Pro-Arg, Arg-Arg 또는 Lys-Arg를 함유는 폴리펩티드인경우, A 중에 상기 아미노산 서열을 함유하지 않도록 상기 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있는 키메라 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, A 가 220 아미노산 잔기 이하의 폴리펩티드인 키메라 단백질.
  8. 제7항에 있어서, A가 대장균 유래의 β-가락토시다제의 N-말단측의 1위치의아미노산으로부터 97위치, 117위치 또는 139위치의 아미노산까지의 펩티드인 키메라 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, A 중의 시스테인 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 키메라 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 다른 아미노산이 세린 잔기인 키메라 단백질.
  11. 제1항에 있어서, B가 사람부갑상선 호르몬 또는 그 유도체인 키메라 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 사람부갑상선 호르몬 유도체가, 천연의 사람부갑상선 호르몬으 N- 말단의 1위치또는 3위치의 아미노산 잔기로부터, 31위치, 34위치, 37위치, 38위치 또는 84위치의 아미노산 잔기까지의 배열을 갖는 단편, 또는 이들의 C-말단에 Cly를 부가한 단편인 키메라 단백질.
  13. 제1항에 있어서, B 가 GLIP-1 또는 그 유도체인 키메라 단백질.
  14. 키메라 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 숙주세포를 형질 전환하여, 수득된 형질 전환체를 배양하고, 상기 배양물로부터 상기 키메라 단백질을 채취함을 특징으로 하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 단백질의 제조방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 단백질에 프로세싱 효소를 작용시켜 링커 펩티드(L)의 C-말단과 목적 펩티드(B)의 N-말단 사이의 펩티드 결합을 절단하고, 목적 펩티드(B)를 수득하는 것을 특징으로 하는, 목적 펩티드 (B)의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기의 프로세싱 효소가 Kex 2프로테아제, 푸린(Furin), 전구체 변환효소 1/3(PC1/3)또는 전구체 변환효소 2(PC2)이거나, 이들의 유도체인 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 한 항에 있어서, 목적 펩티드(B)를 수득할 경우 등전점 침전처리를 사용함을 특징으로 하는 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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