ES2206443T3 - Procedimiento para producir peptidos. - Google Patents

Procedimiento para producir peptidos.

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ES2206443T3 ES92307577T ES92307577T ES2206443T3 ES 2206443 T3 ES2206443 T3 ES 2206443T3 ES 92307577 T ES92307577 T ES 92307577T ES 92307577 T ES92307577 T ES 92307577T ES 2206443 T3 ES2206443 T3 ES 2206443T3
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Yuji Suzuki
Kazuhiro Ohsuye
Takehiro Oshima
Seiko Onai
Koji Magota
Shoji Tanaka
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Abstract

UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE UN PEPTIDO (PEPTIDO OBJETO) QUE COMPRENDE: A) EL CULTIVO DE CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS CON UN PLASMIDO CAPAZ DE EXPRESAR UN GEN QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINA DE FUSION REPRESENTADA EN LA SIGUIENTE FORMULA: A-L-B EN DONDE, B ES UN PEPTIDO OBJETO, A ES UN PEPTIDO PROTECTOR FORMADO POR DE 90 A 200 RESIDUOS DE AMINOACIDOS Y L ES UN PEPTIDO DE ENLACE SITUADO ENTRE EL C TERMINAL DE DICHO PEPTIDO PROTECTOR Y EL N TERMINAL DE DICHO PEPTIDO OBJETO Y SELECCIONADO DE TAL FORMA QUE SE TRATE LA PROTEINA DE FUSION CON UN ENZIMA O UNA SUBSTANCIA QUIMICA, SE SEPARA EL PEPTIDO OBJETO MENCIONADO ANTERIORMENTE Y SE SELECCIONAN DICHOS PEPTIDOS PROTECTOR Y DE ENLACE PARA QUE EL PUNTO ISOELECTRICO DE LA PROTEINA DE FUSION COMPLETA A-L-B ESTE COMPRENDIDA EN LA GAMA DE 4,9-6,9; B) LA OBTENCION DE UNA FRACCION INSOLUBLE QUE COMPRENDE CUERPOS DE INCLUSION MEDIANTE LA HOMOGENEIZACION DE LAS CELULAS CULTIVADAS DE DICHO CUERPO TRANSFORMANTE; C) LA SOLUBILIZACION DE UNA PROTEINA DE FUSION EN DICHOS CUERPOS DE INCLUSION MEDIANTE EL TRATAMIENTO DE DICHA FRACCION INSOLUBLE CON EL AGENTE SOLUBILIZANTE; Y D) LA DISOCIACION DEL ENLACE PEPTIDO ENTRE EL C TERMINAL DEL RESIDUO DEL AMINOACIDO DE ENLACE Y EL N TERMINAL DEL PEPTIDO OBJETO DE DICHA PROTEINA DE FUSION SOLUBILIZADA PARA LIBERAR DICHO PEPTIDO OBJETO DEL RESTO DE LOS PEPTIDOS, SEGUIDA POR LA PURIFICACION DE DICHO PEPTIDO OBJETO. LA PRESENTE INVENCION PUEDE EXPRESAR UN PEPTIDO OBJETO EN UNA CANTIDAD GRANDE Y ACUMULAR DICHO PEPTIDO OBJETO EN LAS CELULAS HUESPED EN FORMA DE CUERPOS DE INCLUSION.

Description

Procedimiento para producir péptidos.
El presente invento se refiere a un método para producir péptidos o sus precursores (normalmente referidos como los "péptidos diana" en el presente texto) como proteínas de fusión.
Se han hecho hasta ahora numerosos esfuerzos para producir péptidos o proteínas fisiológicamente activos en microorganismos tales como Escherichia coli usando tecnología de ADN recombinante. En tales casos, cuando péptidos cortos que tienen pesos moleculares relativamente inferiores son producidos mediante sistemas de expresión directos usando microorganismos tales como Escherichia coli, el péptido corto acaba siendo rápidamente descompuesto dentro del microorganismo.
Para inhibir esta degradación, se usa un método en el que, después de producir los péptidos diana en la forma de proteínas de fusión con otras proteínas o polipéptidos (referidos aquí como los péptidos protectores), se realiza un tratamiento químico o enzimático para liberar específicamente los péptidos diana a partir de las proteínas de fusión, seguido de una separación y purificación.
Un método conocido para liberar el péptido diana a partir de la proteína de fusión, en casos en que las moléculas del péptido diana no contienen un residuo de metionina, comprende producir una proteína de fusión en la que el residuo de metionina se introduce en el aminoácido en posición C-terminal de un péptido de unión entre el péptido protector y el péptido diana, seguido del corte del residuo de metionina mediante tratamiento con bromuro de cianógeno (CNBr) para liberar el péptido diana (Science, 198, 1059 (1977), Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 106 (1978).
Donde la molécula del péptido diana no contiene ningún residuo de arginina o lisina, después de producir una proteína de fusión en la que un residuo de arginina o un residuo de lisina es introducido en el aminoácido en la posición C-terminal de un péptido de unión entre un péptido protector y el péptido diana, un método usado para liberar el péptido diana comprende el tratamiento con tripsina que corta específicamente en el extremo C de residuos de arginina o lisina (Nature, 285, 456 (1980), o tratamiento con lisil endopeptidasa (proteasa I de Achromobacter) que corta específicamente en el extremo C de un residuo de lisina.
Un fragmento proteico que se origina en el microorganismo hospedante usado en la producción es usado comúnmente como el péptido protector para producir la proteína de fusión. Se usa un polipéptido de un tamaño adecuado (longitud) desde el extremo N (región amino terminal) de una proteína expresada en grandes cantidades en las células de los microorganismo hospedantes, y se sabe que la longitud de ese polipéptido tiene una influencia considerable sobre la productividad de la proteína de fusión.
Por ejemplo, aunque se podría esperar mejorar la productividad reduciendo el tamaño (acortando la longitud) de la región del péptido protector, para aumentar la proporción relativa de proteína diana con respecto a dicha proteína de fusión, la reducción de dicha región del péptido protector no siempre de hecho, mejora la productividad del péptido diana. Por ejemplo, cuando la insulina fue producida en Escherichia coli como una proteína de fusión, aunque la productividad de la insulina aumentó cuando la \beta-galactosidasa fue usada como el péptido protector y el tamaño de la porción de \beta-galactosidasa fue reducida, se sabe también que la productividad de la insulina disminuyó con una reducción adicional del tamaño (Gene, 29, 251, 1984).
Cuando se produce un péptido diana como una porción de una proteína de fusión, no hay ninguna teoría establecida acerca de cómo de largo debería ser el péptido protector pese a que el tamaño del péptido protector está íntimamente relacionado con la estabilidad de la proteína de fusión dentro del microorganismo. En general, las proteínas de fusión estables forman cuerpos de inclusión insolubles en las células hospedantes. En otras palabras, para producir una gran cantidad de proteína de fusión es ventajoso formar cuerpos de inclusión en las células hospedantes.
Sin embargo, dependiendo del caso particular, cuando el número de cuerpos de inclusión expresados por célula es aumentado, los cuerpos de inclusión causan daño a las células, dando como resultando una inhibición del crecimiento celular que puede disminuir la productividad de los cuerpos de inclusión por volumen de cultivo. Aunque el mecanismo de formación de cuerpos de inclusión en microorganismos está descrito en detalle en el artículo publicado por Catherine (Biotechnology, 7, 1141 (1989)), numerosos factores están implicados en la formación de cuerpos de inclusión y no hay ninguna teoría establecida en la actualidad. Tampoco hay ningún método establecido para la producción a una escala industrial para expresar una proteína de fusión como cuerpos de inclusión estables en microorganismos.
Hay numerosos documentos de métodos en los que la calcitonina humana es producida como una proteína de fusión en Escherichia coli. Por ejemplo, Bennett y otros documentaron un método para producir el precursor de calcitonina humano (hCT-Gly) expresando una proteína de fusión de la cloranfenicol acetiltransferasa y el precursor de calcitonina humano (hCT-Gly) (JP-A-60/501391).
Sin embargo, este método tiene un nivel bajo de eficacia con sólo 1,1-2,0 mg de precursor de calcitonina humano obtenido a partir de 44 mg de proteína de fusión.
\newpage
El documento de patente europea de estos autores EP-A-281418 (que corresponde a JP-A-1/010999) describe un método eficaz para producir péptidos diana en E. coli que usan una proteína de fusión de la \beta-galactosidasa de E. coli y el péptido diana (específicamente el precursor de calcitonina humano hCT-Gly-Lys-Lys-Arg). La proteína de fusión A-L-B contiene el péptido diana B, un residuo aminoacídico L de unión, preferiblemente lisina, arginina, ácido glutámico o metionina, y un polipéptido protector A "asociado" que es la secuencia de la \beta-galactosidasa. La proteína de fusión se expresa como cuerpos de inclusión que se obtienen como una fracción insoluble después de afectar las células cultivadas, solubilizarlas y luego tratarlas con endoproteasa u otro agente químico adecuado para liberar el péptido diana de la proteína de fusión.
En otra de las descripciones de los autores que se refiere a la producción de calcitonina humana, después de solubilizar la proteína de fusión (como se describe anteriormente) con urea, el precursor de calcitonina humano (hCT-Gly-Lys-Lys-Arg) fue liberado de la proteína de fusión con la proteasa V8, el hCT-Gly fue obtenido eliminando el péptido Lys-Lys-Arg de la porción C-terminal del precursor de calcitonina humano usando carboxipeptidasa B, y la calcitonina humana madura amidada en el C-terminal fué obtenida con gran rendimiento usando la enzima de amidación del C-terminal de Xenopus laevis (JP-A-2/190193).
Sin embargo, hay aún una necesidad para un método eficaz para producir péptidos.
El presente invento pretende proporcionar un nuevo método para producir péptidos, tales como péptidos fisiológicamente activos o precursores de los mismos, preferiblemente en grandes cantidades.
Como un resultado de los inventores del presente invento que estudian los medios para solucionar los objetos anteriormente mencionados, se verificó experimentalmente por primera vez que para mejorar la productividad de proteínas de fusión en células de Escherichia coli, la selección de un punto isoeléctrico de la proteína de fusión dentro del intervalo de pI 4,9 a pI 6,9 puede mejorar la estabilidad y la productividad de dicha proteína de fusión. Además, hallazgos completamente nuevos fueron obtenidos, en los que los objetos anteriormente mencionados se solucionan regulando el número de aminoácidos que tienen una carga dentro del péptido de unión (residuos aminoacídicos básicos o ácidos) para ajustar el punto isoeléctrico de la proteína de fusión dentro de un intervalo de pI 4,9 a pI 6,9.
Los aspectos del presente invento están expuestos en las reivindicaciones independientes 1 a 10.
El invento se refiere a la producción de un péptido diana seleccionado de entre calcitonina, precursor de calcitonina, péptido natriurético (NP), factor de crecimiento celular y hormona paratiroidea, que comprende
(a) cultivar células hospedantes transformadas con el vector capaces de expresar un gen que codifica para una proteína de fusión representable mediante la fórmula
A-L-B
en la que
B es el péptido diana;
A es un péptido protector, siendo un fragmento N-terminal de 90 a 210 aminoácidos de la \beta-galactosidasa de E. coli, y L un péptido de unión entre el extremo C del péptido protector y el extremo N del péptido diana,
siendo seleccionado el péptido de unión L de modo que la proteína diana se separe cuando la proteína de fusión se trate con una sustancia química predeterminada tal como una enzima;
(b) homogeinizar las células hospedantes cultivadas para obtener una fracción insoluble que comprende cuerpos de inclusión;
(c) solubilizar la proteína de fusión en los cuerpos de inclusión tratando la fracción insoluble con agentes solubilizantes, y
(d) escindir el enlace peptídico entre el residuo aminoacídico terminado en C del péptido de unión y el extremo N del péptido diana para liberar el péptido diana.
Los autores proponen seleccionar el péptido de unión L de modo que dé a la proteína de fusión un punto isoeléctrico en el intervalo de 4,9 a 6,9. Los autores encuentran que esto puede mejorar la productividad.
En un primer aspecto (reivindicación 1) el péptido de unión L es toda o parte de la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 1 y contiene de 3 a 8 residuos de arginina.
Un segundo aspecto (reivindicación 10) especifica que el péptido de unión L, seleccionado de modo que logre el punto isoeléctrico especificado en la proteína de fusión, no es un único residuo de lisina, arginina, ácido glutámico o metionina como se sugiere en el documento de patente europea de los autores EP-A-281418.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 indica la secuencia de nucleótidos de una porción del gen de resistencia a tetraciclina de las posiciones nucleotídicas 403-495 dentro del plásmido pBR322, la secuencia de aminoácidos correspondiente y las porciones que codifican para cada péptido de unión. Esta secuencia de nucleótidos se indica en SEQ ID NO 1.
La Fig. 2 indica un proceso para la construcción de plásmidos pG97S4DhCT (G) R10 y pG97S4DhCT (G) R6.
La Fig. 3 indica un proceso para la construcción del plásmido pG97S4DhCT (G) R8.
La Fig. 4 indica un proceso para la construcción de plásmidos pG97S4DhCT (G) R1-R5.
La Fig. 5 indica las secuencias de nucleótidos de R1 a R5 que son ADN codificantes para las porciones del péptido de unión. Estas secuencias están también indicadas en la SEQ ID NOS 2 a 9.
La Fig. 6 indica la secuencia de aminoácidos de cada péptido de unión.
La Fig. 7 es una fotografía de una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS que indica los estados de expresión de las proteínas de fusión de cada uno de los plásmidos de expresión.
La Fig. 8 indica los resultados de la cromatografía líquida de alto rendimiento de la calcitonina humana obtenida mediante un método del presente invento.
La Fig. 9 indica la secuencia de aminoácidos de CNP-22, la secuencia de nucleótidos que codifica para ello, y los cebadores de PCR para la inserción de sitios de enzimas de restricción en ambos extremos.
La Fig. 10 indica un proceso para la construcción del plásmido pG97S4DhCNP-22.
La Fig. 11 indica un péptido de unión para ajustar el punto isoeléctrico de una proteína de fusión y una secuencia de oligonucleótidos que codifica para ella.
La Fig. 12 indica un proceso para la construcción de los plásmidos pG97S4DhCNP-22R3-2 y pG97S4DhCNP-22R5-2.
La Fig. 13 indica un proceso para la construcción del plásmido pG97S4DhCNP-22R5-3.
La Fig. 14 es una fotografía de una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS que indica un resultado comparando las cantidades de proteínas de fusión expresadas para las que los puntos isoeléctricos han sido ajustados.
La Fig. 15 indica el perfil de elución de la proteína de fusión antes de la liberación del hCNP-22 en cromatografía líquida de alto rendimiento.
La Fig. 16 indica el perfil de elución de la proteína de fusión después de la liberación del hCNP-22 en cromatografía líquida de alto rendimiento.
El método del presente invento es aplicable para la producción de las proteínas de fusión de péptidos diana fisiológicamente activos y particularmente a su producción vía cuerpos de inclusión. Además de la calcitonina humana explicada en detalle en la presente especificación, ejemplos de tales péptido incluyen calcitoninas no humanas y precursores de las mismas, péptidos natriuréticos (NP) tales como el péptido natriurético atrial, péptido natriurético cerebral o el péptido natriurético de tipo C, factores de crecimiento celular y hormona paratiroidea (PTH).
Los péptidos protectores particularmente preferidos son los péptidos que consisten de los aminoácidos 1 a 97 del N- terminal de la \beta-galactosidasa de Escherichia coli. Es aún más preferido el uso de péptidos en los que el residuo de cisteína está sustituido por un residuo de serina en péptidos que consisten de estos 97 residuos aminoacídicos. Adicionalmente, es más preferible usar un péptido en el que el residuo de cisteína se reemplaza por un residuo de serina en un péptido que consiste de los anteriormente mencionados 97 residuos aminoacídicos, y por otra parte, cuatro residuos de ácido glutámico son reemplazados por residuos de ácido aspártico.
El presente invento se caracteriza por la producción del péptido diana en la forma de una proteína de fusión que tiene un punto isoeléctrico entre 4,9 y 6,9. En este caso, el punto isoeléctrico de la proteína de fusión puede determinarse de la siguiente manera a partir de la secuencia de aminoácidos. Un método adecuado para calcular el punto isoeléctrico está de acuerdo con el método descrito en Trends in Analytical Chemistry, Vol. 5, Nº. 4, pp. 82-83 (1986). Por ejemplo, el programa de estimación de puntos isoeléctricos DNASIS (Hitachi) preparado basado en este método puede ser usado.
Para regular el punto isoeléctrico de la proteína de fusión dentro del intervalo anteriormente mencionado, los residuos aminoacídicos del péptido protector y/o el péptido de unión tienen que estar regulados, puesto que los aminoácidos del péptido diana no puede ser alterados. Un péptido natural o porción de tal péptido que dé el punto isoeléctrico anteriormente mencionado puede ser seleccionado para que el péptido protector y/o péptido de unión formen el péptido de fusión con el péptido diana. Otro método implica la regulación del punto isoeléctrico de la proteína de fusión mediante la sustitución, eliminación o adición de residuos aminoácidicos de péptidos naturales o porciones de esos péptidos.
La adición o eliminiación de aminoácidos ácidos tales como los residuos de ácido aspártico y de ácido glutámico, la adición o eliminación de aminoácidos básicos tales como los residuos de arginina y de lisina, la sustitución de otro aminoácido por otros tales aminoácidos, o combinaciones de tales manipulaciones de aminoácidos pueden ser usadas para esta regulación.
Como se menciona anteriormente, la regulación del punto isoeléctrico de la proteína de fusión se realiza con el péptido de unión.
Un péptido o una porción del mismo que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos de 403 a 495 del gen de resistencia a tetraciclina derivado de pBR322 puede ser usado para este tipo de péptidos. Como se indica en la Fig. 1 y la SEQ ID NO 1, esta región génica puede codificar para 10 residuos de arginina de entre 33 residuos aminoacídicos, y usando las diversas porciones en esta región, diversos péptidos de unión puede obtenerse conteniendo diferentes números de residuos de arginina. En este caso, es preferible usar una porción que contenga 1 o más, preferiblemente 3 o más y particularmente preferible de 3 a 8 residuos de arginina.
Para liberar un péptido diana de una proteína de fusión, es necesario que un residuo aminoacídico que pueda ser cortado enzimática o químicamente esté presente en el C-terminal del péptido de unión. Ejemplos de tales residuos aminoacídicos que pueden son utilizables incluyen el residuo arginina o el residuo lisina (cortado por tripsina), un residuo de lisina (cortado por lisil endopeptidasa), residuo glutamina (cortado por la proteasa V8), y residuo metionina (cortado con bromuro de cianógeno).
Sigue ahora una explicación de la producción de un plásmido que expresa una proteína de fusión, tomando un ejemplo en el que el péptido diana es el precursor de la calcitonina humana.
El plásmido pG97S4DhCT (G) se usa como un plásmido de inicio para construir plásmidos de expresión para un precursor de calcitonina humano expresado que comprende la secuencia aminoacídica de la calcitonina humana y un residuo de glicina añadido a su extremo C en forma de proteínas de fusión que contiene varios sitios de unión.
En este plásmido, (a) el gen estructural (\beta-gal97S4D) que codifica para un péptido protector que consiste de 97 aminoácidos del N-terminal de la \beta-galactosidasa de Escherichia coli, en la que el residuo de cisteína ahí contenido está sustituido por un residuo de serina, y cuatro residuos de ácido glutámico están sustituidos por residuos de ácido aspártico, y (b) un gen estructural del precursor de la calcitonina humano, están unidos vía los sitios de reconocimiento EcoRI y XhoI como se indica en la Fig.2. El gen estructural que codifica para esta proteína de fusión está bajo el control del promotor lac. Por otra parte, este plásmido contiene un gen para un marcador de selección.
Este plásmido se deriva del plásmido pG97SHPCTLE (G) descrito en el documento de patente JP-A-2/190193.
La Escherichia coli W3110 que contiene el plásmido pG97S4DhCT(G) anteriormente mencionado fue depositada en el Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, como Escherichia coli SBM323, el 8 de Agosto de 1991 basado en las provisiones del tratado de Budapest, y dado el FERM BP-3503.
Una proteína de fusión codificada por el plásmido pG97S4DhCT (G) comprende un péptido protector que consiste de 97 aminoácidos del extremo N de la \beta-galactosidasa, en el que el residuo de cisteína ahí contenido está sustituido por un residuo de serina, y 4 residuos de ácido glutámico están sustituidos por residuos de ácido aspártico, y el precurosr de la calcitonina humano anteriormente mencionado. Su expresión es estremadamente baja, y su punto isoeléctrico es 4,43. Así, para expresar diversas proteínas de fusión por encima de un amplio intervalo de puntos isoeléctricos, secuencias de ADN que codifican para los péptidos de unión que tienen diversos residuos aminoacídicos básicos son insertadas entre el gen de la \beta-galactosidasa anteriormente mencionada y el precursor de calcitonina humano usando el sitio EcoRI-XhoI.
Es conveniente usar como péptido de unión un péptido que comprenda 33 aminoácidos y capaces de ser codificados por un gen derivado del gen de resistencia a tetraciclina de las posiciones nucleotídicas 86-1273 en el plásmido pBR322, o una porción de dicho péptido. Diez residuos de arginina se distribuyen en esta región peptídica, y usando porciones adecuadas para el péptido de unión, se pueden obtener proteínas de fusión que tengan diversos puntos isoeléctricos.
Los péptidos de unión obtenidos de esta región junto con las secuencias de nucleótidos que codifican para tales péptidos de unión se indican en la Fig. 1. Los genes que codifican para estos péptidos se obtienen por digestión del plásmido pBR322 con una enzima de restricción adecuada, o por síntesis química de acuerdo con un método comúnmente usado. Estos péptidos de unión R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{8} y R_{10} contienen 1, 3, 4, 5, 6, 8 y 10 residuos de arginina, respectivamente. Los plásmidos de expresión en los que un gen que clona para uno de estos péptidos de unión es insertado en el sitio EcoRI-XhoI en el plásmido pG97S4DhCT (G) anteriormente mencionado son referidos como pG97S4DhCT (G) R1, pG97S4DhCT (G) R3, pG97S4DhCT (G) R4, pG97S4DhCT (G) R5, pG97S4DhCT (G) R6, pG97S4DhCT (G) R8 y pG97S4DhCT (G) R10.
Además, las cepas de Escherichia coli W3110 obtenidas mediante la transformación con el plásmido de inicio anteriormente mencionado y estos plásmidos referidos como W3110/pG97S4DhCT (G), W3110/pG97S4DhCT (G) R1, W3110/pG97S4DhCT (G) R3, W3110/pG97S4DhCT (G) R4, W3110/pG97S4DhCT (G) R5, W3110/pG97S4DhCT (G) R6, W3110/pG97S4DhCT (G) R8 y W3110/pG97S4DhCT (G) R10.
Los siguientes resultados se obtienen cuando los puntos isoeléctricos de las proteínas de fusión producidas por estos microorganismos son calculados:
W3110/pG97S4DhCT (G), (el número de residuos de arginina en la región de unión = 0); punto isoeléctrico = 4,43,
W3110/pG97S4DhCT (G) R1, (el número de residuos de arginina en la región de unión = 1); punto isoeléctrico = 4,70,
W3110/pG97S4DhCT (G) R3, (el número de residuos de arginina en la región de unión = 3); punto isoeléctrico = 4,90,
W3110/pG97S4DhCT (G) R4, (el número de residuos de arginina en la región de unión = 4); punto isoeléctrico = 5,80,
W3110/pG97S4DhCT (G) R5, (el número de residuos de arginina en la región de unión =5); punto isoeléctrico = 5,91,
W3110/pG97S4DhCT (G) R6, (el número de residuos de arginina en la región de unión =6); punto isoeléctrico = 6,01,
W3110/pG97S4DhCT (G) R8, (el número de residuos de arginina en la región de unión =8); punto isoeléctrico = 6,83, y
W3110/pG97S4DhCT (G) R10, (el número de residuos de arginina en la región de unión =10); punto isoeléctrico = 7,85.
Las cepas de Escherichia coli transformantes que producen la proteína de fusión anteriormente mencionadas y que tiene un punto isoeléctrico desde 4,43 hasta 7,85 fueron cultivadas, y analizadas con respecto a la cantidad de proteína de fusión producida por número de células mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. La cepa W3110/pG97S4DhCT (G) que tiene un punto isoeléctrico de 4,43 y la cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R1 que tiene un punto isoeléctrico de 4,70 produjeron sólo una pequeña cantidad de proteína de fusión. Se verificó también que las otras cepas produjeron una gran cantidad de proteína de fusión como cuerpos de inclusión en células bacterianas. Así, se indicó mediante estos resultados que si el punto isoeléctrico de la proteína de fusión está en la proximidad de 4,5-4,7, tanto la productividad de la proteína de fusión como la cantidad de cuerpos de inclusión producidos son bajas.
Por otra parte, aunque la productividad de proteína de fusión por número de células en el caso de la cepa W3110/
pG97S4DhCT (G) R10 que tiene un punto isoeléctrico de 7,85 fue aproximadamente equivalente a aquella de las otras cepas bacterianas, se verificó que la concentración bacteriana final durante el cultivo fue sólo la mitad de la de otras cepas. Se cree que, aunque la capacidad para formar proteínas de fusión por número de células aumento con el punto isoeléctrico débilmente alcalino de la proteína de fusión (pI 7,5) la inhibición del crecimiento celular tuvo lugar debido a la rápida formación de cuerpos de inclusión, o debido al punto isoeléctrico de la proteína de fusión que es débilmente alcalino, resultando así en una ausencia de aumento en la concentración bacteriana final.
Basado en los resultados anteriores, se verificó por primera vez por los inventores del presente invento que para producir la proteína de fusión tanto establemente como en una gran cantidad dentro de las células de Escherichi coli en la forma de cuerpos de inclusión, es importante que el punto isoeléctrico de la proteína de fusión esté dentro del pI ácido entre 4,9 y 6,9.
Después, los autores realizaron una separación y purificación del precursor de calcitonina humano (hCT-Gly) a partir de cuerpos de inclusión de la proteína de fusión del precursor de calcitonina humano en Escherichia coli en la manera descrita anteriormente. Por otra parte, se verificó que la calcitonina humana que tiene el C-terminal amidado puede ser producida eficazmente usando una enzima de amidación derivada de Xenopus laevis.
Lo siguiente proporciona otro ejemplo del presente invento para la construcción de un plásmido que exprese una proteína de fusión tomando como un ejemplo el caso en el que el péptido diana es el péptido natriurético-22 humano de tipo C (para ser abreviado como CNP-22) (SEQ ID NO.10). El plásmido pG97S4DhCNP-22 fue usado como un plásmido de inicio para la construcción de plásmidos de expresión para expresar CNP-22 humano (que comprende 22 aminoácidos) como proteínas de fusión que contengan diversos sitios de unión.
En este plásmido, (a) el gen estructura (\betagal97S4D) que codifica para un péptido protector que consiste de 97 aminoácidos del extremo N de Escherichia coli \beta-galactosidasa en el que un residuo de cisteína ahí contenido se sustituye por un residuo de serina y cuatro residuos de ácido glutámico son sustituidos por residuos de ácido aspártico, y (b) el gen estructural del CNP-22 humano, están unidos vía los sitios de reconocimiento EcoRI y XhoI como se indica en al Fig. 10. El gen estructural que codifica para esta proteína de fusión está bajo el control del promotor lac. Por otra parte, este plásmido contiene un marcador para la resistencia a tetraciclina.
En la construcción del plásmido de expresión pG97S4DhCNP-22, un gen estructural CNP-22 humano y el plásmido pUCCNP1 usado para la preparación de dicho gen se describe en el documento de patente JP-A-4/139199.
Además, el plásmido pG97S4DhCT (GRRR) usado como un plásmido que codifica para un péptido protector es esencialmente idéntico al plásmido anteriormente mencionado pG97S4DhCT (G).
El punto isoeléctrico de la proteína de fusión codificada por el plásmido pG97S4DhCNP-22 es 4,56. Desde el punto de vista que el punto isoeléctrico de la proteína de fusión para una alta expresión de proteína de fusión indicada anteriormente es preferible dentro del intervalo de pI = 4,9 a pI = 6,9, no se puede esperar la producción de una gran cantidad de proteína de fusión. Como tal, se llevó a cabo un estudio en el que los genes del péptido de unión, que codifican para diversos aminoácidos básicos, fueron insertados en la región EcoRI-XhoI entre el gen de la \beta-galactosidasa anteriormente mencionado y el gen CNP humano para los propósitos de diseñar diversas proteínas de fusión que tengan puntos isoeléctricos desde 4,9 a 6,9 y que expresen una gran cantidad de dichas proteínas de fusión en Escherichia coli.
Estos péptidos de unión pueden ser producidos usando métodos en los que genes que codifican para aminoácidos básicos son diseñados artificialmente y luego sintetizados químicamente.
La Fig. 11 indica el diseño de genes de péptidos de unión que codifican para aminoácidos básicos y las secuencias génicas químicamente sintetizadas. Estos péptidos de unión, R3-2 (SEQ ID Nos 13 y 14), R5-2 (SEQ ID Nos 15 y 16), y R5-3 (SEQ ID Nos 17 y 18) contienen 3, 5 y 5 residuos de arginina respectivamente. Los plásmidos de expresión en los que los genes que codifican para estos péptidos de unión han sido insertados en la región EcoRI-XhoI en el anteriormente mencionado pG97S4DhCNP-22 son referidos como pG97S4DhCNP-22R3-2, pG97S4DhCNP-22R5-2 y pG97S4DhCNP-22R5-3, respectivamente.
Además, las cepas de Escherichia coli W3110 obtenidas mediante transformación con los plásmidos de inicio anteriormente mencionados y estos plásmidos son referidos como W3110/ pG97S4DhCNP-22, W3110/ pG97S4DhCNP-22R3-2, W3110/ pG97S4DhCNP-22R5-2, y W3110/ pG97S4DhCNP-22R3-2R5-3, respectivamente.
Los siguientes resultados se obtienen cuando los puntos isoeléctricos de las proteínas de fusión producidas por estos microorganismos son calculados:
W3110/ pG97S4DhCNP-22 (el número de residuos de arginina en la región de unión = 0); punto isoeléctrico
= 4,56,
W3110/ pG97S4DhCNP-22R3-2 (el número de residuos de arginina en la región de unión = 3); punto isoeléctrico = 4,95,
W3110/ pG97S4DhCNP-22R5-2 (el número de residuos de arginina en la región de unión = 5); punto isoeléctrico = 6,22, y
W3110/ pG97S4DhCNP-22R5-3 (el número de residuos de arginina en la región de unión = 5); punto isoeléctrico = 5,59.
Cuando las cepas de Escherichia coli que producen la proteína de fusión anteriormente mencionada que tienen puntos isoeléctricos desde pI 4,56 hasta pI 6,22 fueron cultivadas, y analizadas con respecto a la cantidad de proteína de fusión producida por número de células mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, aunque la cantidad de proteína de fusión producida por la cepa W3110/pG97S4DhCNP-22 (punto isoeléctrico de la proteína de fusión = 4,56) no fue tan alta, en el caso de esas cepas que demostraron puntos isoeléctricos de proteínas de fusión desde pI 4,95 a pI 6,22, se verificó que la cantidad de proteína de fusión expresada fue grande en comparación con la cepa W3110/pG97S4DhCNP-22.
En particular, estuvo claro que una gran cantidad de proteína de fusión fue expresada por la cepa W3110/
pG97S4DhCNP-22R5-2 proporcionando un punto isoeléctrico de 5,59 y la cepa W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3 proporcionando un punto isoeléctrico de 6,22 en comparación con la cepa W3110/pG97S4DhCNP-22 (véase Fig. 14). Así, el caso del CNP-22 humano también indicó que el procesamiento con el punto isoeléctrico de la proteína de fusión dentro del intervalo de pI 4,9-6,9 dio como resultado una productividad mejorada de la proteína de fusión.
Por otra parte, los autores verificaron que el CNP-22 humano de los cuerpos de inclusión de las proteínas de fusión producidas en Escherichia coli en esta manera es liberado eficazmente usando proteasa V8 dando como resultado una producción eficaz del CNP-22 humano, indicando de ese modo la utilidad de las técnicas actuales.
Ejemplos
Los siguientes Ejemplos proporcionan una explicación detallada de realizaciones.
Ejemplo 1 Construcción de un vector de expresión
Un plásmido de expresión que expresa una proteína de fusión que tiene de 1 a 10 residuos de arginina en la región del péptido de unión se construyó en la manera descrita a continuación.
(A) Construcción del pG97S4DhCT (G) R10
El procedimiento descrito a continuación fue realizado para insertar un gen que codifica para los aminoácidos de la región R10 indicada en la Fig. 1 dentro del péptido de unión que codifica para la región entre un gen de \beta-gal 97S4D (péptido que consiste en 97 aminoácidos del N-terminal de la \beta-galactosidasa en la que un residuo de cisteína está sustituido por un residuo de serina y cuatro residuos de ácido glutámico están sustituidos por residuos de ácido aspártico) y un gen de hCT(G) (precursor de la calcitonina humano que tiene 1 residuo de glicina en el C-terminal). Un proceso de construcción para pG97S4DhCT (G) R10 se indica en la Fig. 2.
Lo primero de todo, el plásmido pBR322 fue digerido con enzimas de restricción para aislar la región R10 dentro del gen de resistencia a tetraciclina de pBR322. Se digirieron 150 \mug de pBR322 con 200 unidades de cada una de las enzimas BamHI y Eco47III durante 60 minutos a 37ºC en 300 \mul de tampón Superior (Tris/HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM y ditiotreitol 1 mM abreviado como DTT).
Después de la reacción, 30 \mul de una disolución de teñido (azul de bromofenol 0,25%, xileno cianol 0,25%, sacarosa 40%) fue añadida a la mezcla de reacción, y se realizó una electroforesis en gel de agarosa 1,5% (disolución tampón TAE; Tris-ácido acético 40 mM pH 8,0, EDTA 2 mM, 120 V, 2 horas). Después de la electroforesis, el gel fue sumergido en 0,5 \mug/ml de disolución de bromuro de etidio, el fragmento BamHI-Eco47III de 119 pb fue recortado del gel.
El recorte del gel se colocó entonces en un tubo de diálisis que contenía tampón TAE y se sometió a electroforesis (120 V, 30 minutos) para eluir el fragmento de ADN de 119 pb del gel. La disolución en el tubo de diálisis se recogió entonces mediante tratamiento con fenol, tratamiento con cloroformo y precipitación con etanol de acuerdo con los métodos usados comúnmente, y el precipitado con etanol fue disuelto en 40 \mul de tampón TE (Tris/HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM). 2,5 \mul de tampón Med concentrado 10 veces (Tris/HCl pH 7,5, 100 mM, NaCl 500 mM, MgCl_{2} 100 mM y DTT 10 mM) y 10 unidades de la enzima HaeIII fueron añadidos a 20 \mul de esta disolución que contenía el fragmento de ADN BamHI-Eco47III (119 pb), y se digirió durante 2 horas a 37ºC. Después de la adición de la disolución de teñido, se llevó a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida 15% (tampón TBE; tampón Tris-ácido bórico 89 mM pH 8,0, EDTA 2 mM, 120 V, 90 minutos).
Y luego el gel fue teñido en una disolución de bromuro de etidio, y la banda del fragmento de ADN HaeIII-Eco47III (89 pb) fue recortada del gel. Este gel recortado fue cortado en finos trozos y se dejó reposar durante 12 horas a 37ºC en 200 \mul de tampón de elución de ADN (acetato amónico 0,5 M, EDTA 1 mM pH 8,0). El tratamiento con fenol, el tratamiento con cloroformo y la precipitación con etanol fueron luego realizados de acuerdo con los métodos comúnmente usados, y el precipitado con etanol fue disuelto en 5 \mul de tampón TE (Tris/HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM).
Después, se digirieron 5 \mug del plásmido pG97S4DhCT (G) durante 2 horas a 37ºC en 50 \mul de tampón TA (Tris/ácido acético 33 mM pH 7,9, acetato de magnesio 10 mM, DTT 0,5 mM, acetato potásico 66 mM, albúmina de suero bovino 0,01%) con 30 unidades de la enzima EcoRI. Por otra parte, 1 \mul de dNTP 25 mM que consisten de dATP, dGTP, dCTP y dTTP y 4 unidades de ADN polimerasa T4 fueron añadidos a esta disolución de reacción para rellener los extremos cohesivos durante 5 minutos a 37ºC. Después de la reacción, el tratamiento con fenol, el tratamiento con cloroformo y la precipitación con etanol fueron realizados de acuerdo con los métodos usados comúnmente, y el precipitado con etanol fue disuelto en 10 \mul de tampón TE.
Cinco \mul de pG97S4DhCT (G) digerido con la enzima EcoRI y de extremos romos y 5 \mul del fragmento de ADN HaeIII-Eco47III (89 pb) fueron mezclados, y la reacción de ligación fue llevada a cabo durante 12 horas a 16ºC con un equipo de ligación de ADN (Takara Shuzo). La mezcla de ligación fue usada para transformar la cepa W3110 de Escherichia coli de acuerdo con los métodos comúnmente usados, y se obtuvieron transformantes resistentes a tetraciclina. La estructura del plásmido fue confirmada mediante el análisis con enzimas de restricción con las enzimas BspHI y BglII, y uno de los transformantes que llevaba una estructura deseada fue denominado cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R10.
(B) Construcción de pG97S4DhCT (G) R6
El procedimiento descrito a continuación fue realizado para insertar un gen que codifica para los aminoácidos de la región R6 indicada en la Fig. 1 dentro del péptido de unión que codifica entre el gen de \beta-gal 97S4D. La construcción de pG97S4DhCT (G) R6 se muestra en la Fig. 2.
El pBR322 fue digerido con enzimas de restricción para aislar la región R6 dentro del gen de resistencia a tetraciclina de pBR322. 150 \mug de pBR322 fueron digeridos con 200 unidades de cada enzima BamHI y Eco47III durante 60 minutos a 37ºC en 300 \mul de tampón Superior (Tris/HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM y DTT 1 mM). Después de la reacción, se añadieron 30 \mul de una disolución de teñido (azul de bromofenol 0,25%, xileno cianol 0,25%, sacarosa 40%) a la mezcla de reacción, y la mezcla de reacción fue usada para la electroforesis en gel de agarosa 1,5% (disolución tampón TAE; Tris-ácido acético 40 mM pH 8,0, EDTA 2 mM, 120 V, 2 horas).
Después de la electroforesis en gel, el gel fue teñido en 0,5 \mug/ml de una disolución de bromuro de etidio, y la banda del fragmento de ADN BamHI-Eco47III (119 pb) fue recortada del gel. El gel recortado fue luego colocado en un tubo de diálisis que contenía tampón TAE y sometido a electroforesis (120 V, 30 minutos) para eluir el fragmento de ADN de 119 pb del gel. La disolución en el tubo de diálisis fue entonces recogida seguida de tratamiento con fenol, tratamiento con cloroformo y precipitación con etanol de acuerdo con los métodos usados comúnmente, y el precipitado con etanol fue disuelto en 40 \mul del tampón TE (Tris/HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM).
2,5 \mul de tampón TA concentrado 10 veces (Tris/HCl 330 mM pH 7,9, acetato magnésico 100 mM, DTT 5 mM, acetato potásico 660 mM y albúmina de suero bovino) y 10 unidades de BanI fueron añadidas a 20 \mul de esta disolución que contenía el fragmento BamHI-Eco47III (119 pb) e incubado durante 2 horas a 37ºC. Adicionalmente 1 \mul de dNTP 25 mM y 4 unidades de ADN polimerasa T4 fueron añadidos para rellenar los extremos cohesivos durante 5 minutos a 37ºC. Después de la adición de 2,5 \mul de disolución de teñido a la mezcla de reacción, se llevó a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida 15% (tampón TBE; tampón Tris-ácido bórico 89 mM pH 8,0, EDTA 2 mM, 120 V, 90 minutos).
Después de la electroforesis, el gel fue teñido en disolución de bromuro de etidio, y la banda del fragmento HaeIII-Eco47III (56 pb) fue recortada del gel. Este gel recortado fue cortado en finos trozos y dejado reposar durante 12 horas a 37ºC en 200 \mul de tampón de elución de ADN (acetato amóonico 0,5 M, EDTA 1 mM pH 8,0). Tratamiento con fenol, tratamiento con cloroformo y precipitación con etanol fueron luego realizados de acuerdo con métodos usados comúnmente, y el precipitado con etanol fue disuelto en 5 \mul del tampón TE (Tris/HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM).
5 \mug del plásmido pG97S4DhCT (G) fueron digeridos con 30 unidades de EcoRI durante 2 horas a 37ºC en 50 \mul de tampón TA. Por otra parte, 1 \mul de dNTP 25 mM y 4 unidades de ADN polimerasa T4, fueron añadidos a esta disolución de reacción para rellenar los extremos cohesivos durante 5 minutos a 37ºC. Después de la reacción, el tratamiento con fenol, el tratamiento con cloroformo y la precipitación con etanol fueron realizados de acuerdo con los métodos usados comúnmente, y el precipitado con etanol fue disuelto en 10 \mul de tampón TE.
5 \mul de pG97S4DhCT (G) digerido con EcoRI y de extremos romos y 5 \mul del fragmento BanI-Eco47III (56 pb) fueron mezclados, y la reacción de ligación fue realizada durante 12 horas a 16ºC con un equipo de ligación de ADN (Takara Shuzo). La mezcla de reacción fue usada para transformar la cepa W3110 de Escherichia coli de acuerdo con los métodos usados comúnmente, y se obtuvieron transformantes resistentes a tetraciclina. La estructura del plásmido se confirmó mediante análisis de enzimas de restricción con BspHI y BglII, y uno de los transformantes que llevaba la estructura deseada fue denominado W3110/pG97S4DhCT (G) R6.
(C) Construcción de pG97S4DhCT (G) R8
El procedimiento descrito a continuación fue realizado para insertar un gen que codifica para los aminoácidos de la región R8 indicada en al Fig. 1 en la región que codifica para el péptido de unión entre el gen \beta-gal 97S4D y un gen hCT (G). la construcción de pG97S4DhCT (G) R8 está indicada en la Fig. 3.
Se prepararon tres tubos colocando 10 \mul pG97S4DhCT (G) R10 dentro de cada tubo que contenía 50 \mul de tampón Superior. 20 unidades de BbeI y BglII, BbeI y EcoRV, y BglII y EcoRV fueron añadidas respectivamente en los tres tubos. Después de dejar reaccionar durante 2 horas a 37ºC, se realizó una electroforesis en gel de agarosa 1,5%, y las bandas Bbe-BglII (84 pb), BbeI-EcoRV (353 pb) y BglII-EcoRV (2,7 Kb) y fueron recortadas del gel, y se llevó a cabo una electroforesis.
El tratamiento con fenol, el tratamiento con cloroformo y la precipitación con etanol fueron luego realizadas de acuerdo con los métodos usados comúnmente, después de lo que el precipitado con etanol fue disuelto en 5 \mul de tampón TE. Los tres fragmentos de ADN obtenidos de esta manera fueron mezclados y ligados durante 12 horas a 16ºC usando un equipo de ligación de ADN. La mezcla de ligación fue usada para transformar la cepa W3110 de Escherichia coli de acuerdo con métodos usados comúnmente, y se obtuvieron transformantes resistentes a tetraciclina. La estructura del plásmido fue confirmada mediante análisis de enzimas de restricción, y uno de los transformantes fue llamado cepa W3110/ pG97S4DhCT (G) R8 de E. coli.
(D) Construcción de pG97S4DhCT (G) R1, pG97S4DhCT (G) R3, pG97S4DhCT (G) R4 y pG97S4DhCT (G) R5
El procedimiento descrito a continuación fue realizado para insertar genes que codifican para los aminoácidos de las regiones R1, R3, R4 ó R5 indicadas en la Fig. 1 en la región codificante para el péptido de unión entre un gen \beta-gal 97S4D y un gen hCT (G).
La construcción de pG97S4DhCT (G) R1, pG97S4DhCT (G) R3, pG97S4DhCT (G) R4 y pG97S4DhCT (G) R5 se indica en la Fig. 4.
25 \mug de pG97S4DhCT (G) fueron digeridos con 30 unidades de la enzima XhoI, y con la enzima EcoRI en 50 \mul de tampón superior durante 2 horas a 37ºC. Después de la reacción, se realizó una electroforesis en gel de agarosa 1% y el fragmento de ADN fue aislado a partir del gel mediante electroforesis. 100 pmoles de cada uno de este fragmento de ADN y el oligonucleótido químicamente sintetizado indicado en la Fig. 5 fueron mezclados y ligados. La mezcla de ligación fue usada para transformar la cepa W3110 de Escherichia coli de acuerdo con un método usado comúnmente, y se obtuvieron transformantes resistentes a tetraciclina.
Después de analizar el plásmido de la cepa transformada mediante electroforesis en gel tras el corte con enzimas de restricción, se obtuvieron cepas W3110/ pG97S4DhCT (G) R1, cepas W3110/pG97S4DhCT (G) R3, cepas W3110/pG97S4DhCT (G) R4 y cepas W3110/pG97S4DhCT (G) R5.
Como se indica anteriormente, se construyeron 7 tipos de plásmidos en los que una porción de un gen resistente a tetraciclina fue insertada en el sitio de corte EcoRI o el sitio de corte EcoRI-XhoI de pG97S4DhCT (G). Puesto que estos genes insertados contienen desde 1 a un máximo de 10 codones correspondientes al aminoácido básico arginina, las cargas difieren entre las proteínas quiméricas que dan así como resultado la producción de proteínas de fusión que tienen diferentes puntos isoeléctricos. Las estructuras de las proteínas de fusión producidas están indicadas en la Fig.6.
Ejemplo 2 Expresión de la proteína de fusión hCT (G)
Para examinar la relación entre los puntos isoeléctricos de las proteínas de fusión producidas en microorganismos y su productividad, los microorganismos fueron cultivados y la productividad de la proteína de fusión por número de células se determinó usando electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.
Los microorganismos preparados fueron cultivados en un frasco durante 12 horas a 37ºC en 500 ml de medio SB (glicerina 0,5%, extracto de levadura 2,4%, triptona 1,2%, hidrógeno fosfato de potasio 100 mM pH 7,5 y tetraciclina (10 \mug/ml)). Después del cultivo, se midió la turbidez del caldo de cultivo con un espectrofotómetro (D.O._{660}), y se eliminó caldo de cultivo de modo que el valor de [valor D.O._{660} x volúmen de cultivo (ml)] llegara a ser 5, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 12000 rpm para separar las células microbianas.
1 ml de tampón de muestra con SDS (Tris-HCl 63 mM pH 6,8, glicerina 10%, SDS 10%, 2-mercaptoetanol 5% y 12,5 mg/L de azul de bromofenol) fue añadido al precipitado celular seguido del calentamiento durante 5 minutos a 95ºC para obtener la muestra para electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida 16%-SDS (TEFCO) usando 5 \mul de la muestra anteriormente mencionada bajo las condiciones de 18 mA durante 90 minutos. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con una disolución de teñido (ácido acético 10%, metanol 40% y 2 g/L de azul brillante de Coomassie R-250) y se comparó la productividad por número de células de la proteína de fusión hCT (G) producida por cada cepa. Los resultados de la electroforesis se indican en la Fig. 7.
Como queda claro a partir de la Fig. 7, la cepa W3110/ pG97S4DhCT (G) que proporciona un punto isoeléctrico de 4,43 produjo sólo una cantidad extremadamente pequeña de proteína de fusión, mientras que la cepa W3110/ pG97S4DhCT (G) R1 que proporciona un punto isoeléctrico de 4,70 sólo produjo una pequeña cantidad de proteína de fusión. Quedó también claro que las otras cepas produjeron una gran cantidad de proteína de fusión en las células. Así, estos resultados indicaron que la productividad de proteína de fusión así como la cantidad de sus cuerpos de inclusión que se forman se vuelve baja cuando el punto isoeléctrico de la proteína de fusión está en las proximidades de 4,5-4,7.
Después, se llevó a cabo un estudio sobre la productividad de la proteína de fusión y la eficacia a la que el hCT (G) se libera de la proteína de fusión usando proteasa V8 bajo condiciones de cultivo de cultivos de gran volumen realizando cultivos de gran volumen y una producción en tanques de cultivo de 30 litros usando cepas W3110/ pG97S4DhCT (G) R3, cepas W3110/pG97S4DhCT (G) R4, cepas W3110/pG97S4DhCT (G) R5 y cepas W3110/pG97S4DhCT (G) R6, W3110/pG97S4DhCT (G) R8 y cepas W3110/pG97S4DhCT (G) R10.
Ejemplo 3 Productividad de proteínas de fusión bajo condiciones de cultivos de gran volumen y liberación de hCT (G) de proteínas de fusión usando la proteasa V8
El siguiente experimento fue llevado a cabo para estudiar la productividad de las proteínas de fusión bajo condiciones de cultivo de grandes volúmenes y la eficacia de liberación de hCT (G) de diversas proteínas de fusión hCT (G) por la proteasa V8.
Seis cepas de alta expresión (W3110/pG97S4DhCT (G) R3, W3110/pG97S4DhCT (G) R4, W3110/pG97S4DhCT (G) R5, W3110/pG97S4DhCT (G) R6, W3110/pG97S4DhCT (G) R8 y W3110/pG97S4DhCT (G) R10), en que la formación de cuerpos de inclusión fue observada en frascos de cultivo usando el medio SB anteriormente mencionado, fueron cultivadas en tanques de cultivo de 30 litros.
El medio que contenía 4 g/L de extracto de levadura, 4 g/L de dihidrógeno fosfato de potasio, 4 g/L de hidrógeno fosfato de dipotasio, 2,7 g/L de hidrógeno fosfato de sodio, 1,2 g/L de sulfato amónico, 0,2 g/L de cloruro amónico, 2,0 g/L de L-metionina, 2,0 g/L de MgSO_{4}\cdot7H_{2}0, 40 mg/L de FeSO_{4} \cdot7H_{2}0, 40 mg/L de CaCl_{2}\cdot2H_{2}0, 10 mg/L de AlCl_{3}\cdot6H_{2}O, 4 mg/L de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 2 mg/L de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 mg/L de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 1,0 mg/L de CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,5 mg/L de H_{3}BO_{3} y 10 mg/L de MnSO_{4}\cdotnH_{2}O, usando glucosa (2%) para la fuente de carbono en la fase inicial de cultivo, y usando glicerina (8%) como la fuente de carbono después del consumo de glucosa. Los resultados de la concentración bacteriana lograda finalmente se indican en la Tabla 1.
TABLA 1
Cepa Concentración bacteriana Cantidad de cuerpos de Cantidad total de cuerpos de
final (D.O._{660}) (a) inclusión por bacteria inclusión (valor relativo)
(valor relativo) (a x b)
W3110/pG97S4D 53 116 6148
CT (G) R10
W3110/pG97S4Dh 120 113 13560
CT (G) R8
W3110/pG97S4Dh 110 106 11660
CT (G) R6
W3110/pG97S4Dh 105 100 10500
CT (G) R5
W3110/pG97S4Dh 94 100 9400
CT (G) R4
W3110/pG97S4Dh 106 96 10176
CT (G) R3
Como queda claro a partir de la Tabla 1, la cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R10 demostró un crecimiento extraordinariamente bajo en comparación con las otras cepas, alcanzando una concentración bacteriana final lograda aproximadamente de sólo la mitad que la de las otras cepas. Además, aunque el punto isoeléctrico de la proteína de fusión producida por la cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R10 fue ligeramente alcalino a 7,85, y que hubo un aumento en la productividad de la proteína de fusión por célula, tal vez debido a la rápida formación de cuerpos de inclusión o siendo el punto isoeléctrico de la proteína de fusión ligeramente alcalino, el crecimiento celular fue inhibido lo que dio como resultado una baja concentración celular.
Así, basado en los resultados de estos estudios, se verificó por primera vez por los inventores del presente invento que para producir proteínas de fusión como cuerpos de inclusión en Escherichia coli tanto establemente como en grandes cantidades, es importante mantener el punto isoeléctrico de la proteína de fusión en la región ácida entre 4,9 y 6,9. Además, después de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y el teñido de proteínas, la cantidad de proteínas de fusión producidas x por las células fue determinado con un escáner para geles. Esos resultados se indican en la Tabla 1 como la cantidad de cuerpos de inclusión por célula (valor relativo).
Cuando la cantidad de proteína de fusión por célula fue tomada de modo que fuera 100 para la cepa W3110/
pG97S4DhCT (G) R4, cada una de las cepas produjo 96-116 inclusiones. La cantidad total de los cuerpos de inclusión por cultivo líquido fue de 6.148 para la cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R10 y 13560 para la cepa W3110/
pG97S4DhCT (G) R8, indicando una diferencia de casi un factor de 2. Aunque la cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R8 demostró la mayor cantidad total de cuerpos de inclusión por caldo de cultivo, una reacción de corte tuvo lugar por la proteasa V8 de la proteína de fusión durante la producción de hCT, estando la eficacia de la reacción de corte por proteasa v8 de la proteína de fusión íntimamente comprometida con el rendimiento del proceso de producción.
Como tal, se llevó a cabo un estudio de la eficacia de la reacción de corte por la proteasa V8 usando los cuerpos de inclusión obtenidos. Después del cultivo usando los tanques de cultivo de 30 litros anteriormente mencionados, 1000 ml de caldo de cultivo se eliminaron seguido de homogenización de las células usando un homogenizador de alta presión (Manton Gaulin Laboratory Homogenizer 15M-8TA) a 600 kg/cm^{2}. El precipitado que contenía los cuerpos de inclusión fue recogido por centrifugación durante 30 minutos a 7000 rpm. Después de la adición de agua desionizada a la fracción precipitada para hacer la cantidad de la fracción igual al volumen inicial, la suspensión se centrifugó de nuevo para lavar el precipitado.
Después de repetir el procedimiento de lavado una vez más, el precipitado obtenido finalmente fue resuspendido con agua desionizada de modo que el valor de D.O._{660} fue de 800, y se usó en la reacción de corte por la proteasa V8 como se describe a continuación. Después de eliminar 0,6 ml de suspensión, añadir 75 \mul de Tris-HCl 1 M (pH 8,0), 540 mg de urea y 185 \mul de DTT 100 mM a esta suspensión, y dejar reposar durante 10 minutos a 30ºC, se añadió agua desionizada para llevar el volumen final a 3,7 ml. Después de precalentar durante 10 minutos a 30ºC, se añadieron 7 \mul de proteasa V8 (1 mg/ml) y se dejó reaccionar durante 1 hora.
Una determinación cuantitativa del hCT (G) cortado se realizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) usando una columna empaquetada YMC A-302 (0,46 cm x 15 cm, Yamamura Chemical Research). Se realizó una elución con un gradiente de concentración lineal usando ácido trifluoroacético (TFA) y TFA 0,1%/acetonitrilo 50%. Como resultado, se verificó que la eficacia de corte de hcT (G) de la proteína de fusión se diferenció mucho dependiendo de la proteína de fusión hCT (G).
La cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R4 demostró la eficacia de corte máxima de 97%, mientras que la cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R5 demostró la eficacia de corte mínima de 7%. No hubo correlación en absoluto entre esta eficacia de corte y la concentración final bacteriana. Además, no se observó correlación para el número de residuos aminoacídicos básicos del péptido de unión insertado en la proteína de fusión. Por el contrario, la eficacia de corte se cree que está influenciada por la secuencia de aminoácidos de la región del sitio de reconocimiento del corte para la proteasa V8. En cualquier caso, como la cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R4 demostró la mayor cantidad de recuperación de hCT (G), la conversión del precursor de calcitonina humano a calcitonina humana por una enzima de amidación fue realizada usando esta cepa bacteriana.
Ejemplo 4 Purificación del precursor hCT (G) y la conversión a calcitonina humana por una enzima de amidación
Después de cultivar la cepa W3110/pG97S4DhCT (G) R4 en un tanque de cultivo de 20 litros de la manera descrita anteriormente, una suspensión de cuerpos de inclusión de la proteína de fusión fue obtenida de acuerdo al método descrito anteriormente. Después de eliminar 0,6 ml de esta suspensión de cuerpos de inclusión, añadiendo 750 \mul de Tris-HCl 1 M (pH 8,0), 75 \mul de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 5,4 g de urea y 17 mg de DTT y dejar reposar durante 10 minutos, se añadió agua desionizada para llevar el volumen final a 37 ml. Después, se añadieron 40 \mul de proteasa V8 (1 mg/ml) para tratar la suspensión durante 90 minutos a 37ºC.
Después de diluir la disolución de reacción por un factor de 2 con agua desionizada, se añadió ácido acético después de dejar reposar durante 30 minutos para llevar el pH a 4,6. El \beta-gal97S4D del péptido protector precipitó como resultado de disminuir el pH a 4,6 mientras que el hCT (G) quedó en la fracción sobrenadante. La fracción sobrenadante se separó por centrifugación durante 15 minutos después de lo que se aplicó esta fracción sobrenadante a una columna de Sefarosa SP (Tosoh) equilibrada con acetato amónico 10 mM (pH 4,6) seguido por una columna de cromatografía. El hCT (G) se eluyó en etapas con acetato amónico 40 mM (pH 6,5). Aproximadamente 0,4 g de hCT (G) fueron obtenidos por litro de líquido de cultivo.
La calcitonina humana fue capaz de ser producida con una buena eficacia haciendo reaccionar el hCT (G) obtenido de la manera anterior con una enzima de amidación de acuerdo con el método descrito en el documento de patente JP-A-2/190193.
Después de la reacción de amidación, se realizó una cromatografía líquida de alto rendimiento usando una columna empaquetada A-301 YMC (Yamamura Chemical Research), resultados que se indican en la Fig. 8. Bajo estas condiciones de elución se eluye la calcitonina humana a un tiempo de retención de 9,7 minutos, y como queda claro a partir de esta figura, es posible obtener calcitonina humana que tenga una pureza elevada con un rendimiento extremadamente elevado.
Ejemplo 5 Preparación del gen CNP-22 humano
Un gen que codifica para el CNP-22 humano, en el que un residuo de ácido glutámico, el sitio de corte de la proteasa V8, se añade al N-terminal, fue preparado como se indica a continuación usando una amplificación de ADN in vitro (PCR).
El plásmido pUCCNP1 se usó para el molde de ADN. 1,57 \mug de pUCCNP1 fueron digeridos durante 60 minutos a 37ºC en 157 \mul de tampón K (Tris/HCl 20 mM pH 8,5, KCl 100 mM y ditiotreitol 1mM abreviado como DTT) con 12 unidades de EcoRI para cortar el plásmido. El tratamiento con fenol, el tratamiento con 2-butanol y la precipitación con etanol fueron realizados sobre la disolución de reacción de acuerdo con los métodos usados comúnmente, y el fragmento de ADN digerido con EcoRI fue disuelto en 157 \mul de tampón TE (Tris/HCl 10 mM pH 8,0 y EDTA 1 mM).
Los diseños de los cebadores usados para la reacción de PCR se indican en la Fig. 9. El cebador 1 (SEQ ID No 11) fue diseñado de modo que un residuo de ácido glutámico que se corta por la proteasa V8 se añade al N-terminal del CNP-22 humano, y los sitios de corte de las enzimas de restricción EcoRI y XhoI son proporcionados mas corriente arriba, mientras que el cebador 2 (SEQ ID NO 12) fue diseñado de modo que un sitio de corte de la enzima de restricción SalI es proporcionado inmediatamente después del gen de CNP-22 humano. Estos cebadores fueron sintetizados usando un sintetizador de ADN (Applied Biosystems, Model 380A). Después de la síntesis, se realizó una electroforesis usando un gel de poliacrilamida 20% que contiene urea 8 M y los fragmentos de ADN de una longitud correspondiente a los cebadores fueron liberados para producir cada uno de los cebadores.
Después de dejar 10 ng de pUCCNP1 cortado con la enzima EcoRI anteriormente mencionada y 100 \mul de disolución de reacción (Tris/HCl 10 mM pH 8,3, 50 mM KCl, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina 0,1% y 200 \muM de cada uno de dGTP, dATP, dTTP y dCTP) que contenía los cebadores (1 pmol de cada) que reposara durante 5 minutos a 95ºC, las disoluciónes fueron enfriadas rápidamente con hielo. 0,5 unidades de ADN polimerasa Taq (Ampli-Taq, Takara Shuzo) fueron luego añadidas mediante la adición de aceite mineral para llevar a cabo la reacción de PCR usando un reactor térmico (Hybaid).
La reacción de PCR se repitió durante 30 ciclos, con un único ciclo que consistía de reacciones consecutivas que consistían de desnaturalización térmica (92ºC, 1 minuto), acoplamiento (55ºC, 2 minutos) y elongación de ADN (72ºC, 3 minutos). La reacción de elongación de ADN del ciclo final fue realizada adicionalmente durante unos 7 minutos adicionales. Después de la reacción, tras la adición del tampón TE para llevar a un volumen de 400 \mul, el volumen entero fue colocado en un tubo SUPREC-02 (Takara Shuzo) y centrifugado durante 8 minutos a 2.000 G. El filtrado se eliminó y el tampón TE fue de nuevo añadido para llevar la cantidad de líquido hasta 400 \mul. El procedimiento de centrifugación fue luego realizado de nuevo de la misma manera. La disolución de la reacción de PCR sobrante en la copa de filtro fue llevada a un volumen de 40 \mul con tampón TE.
5 \mul de tampón Superior concentrado 10 veces (Tris/HCl pH 7,5 100 mM, NaCl 1 M, MgCl_{2} 100 mM y DTT 10 mM), 36 unidades de enzima EcoRI y 60 unidades de enzima SalI fueron añadidas a los 40 \mul de mezcla de reacción de PCR. Después de llevar el volumen total de 50 \mul con agua, la reacción se dejó proceder durante 60 minutos a 37ºC. Después de la reacción, se realizaron un tratamiento con fenol, un tratamiento con 2-butanol y una precipitacion con etanol, y el precipitado fue disuelto finalmente en tampón TE para preparar el gen CNP-22 humano que tiene extremos cohesivos EcoRI y SalI en ambos extremos del gen.
Ejemplo 6- (a)
Construcción del plásmido de expresión pG97S4DhCNP-22
El producto de PCR del gen CNP-22 indicado en la Fig. 10 se insertó en el plásmido pG97S4DhCT (GRRR) que contenía el gen \beta-gal97S4D (péptido que consistía de 97 aminoácidos del N-terminal de la \beta-galactosidasa, en el que el residuo de cisteína se sustituye por un residuo de serina, y cuatro residuos de ácido glutámico son sustituidos por residuos de ácido aspártico). Ese proceso de construcción se describe a continuación.
10 \mug de pG97S4DhCT (GRRR) fueron digeridos con 36 unidades de EcoRI y 60 unidades de SalI en 70 \mul de tampón Superior durante 6 minutos a 37ºC. Después de la reacción, se realizó una electroforesis en gel de agarosa 1,0% de acuerdo con los métodos usados comúnmente, y una banda del fragmento EcoRI-SalI de 3,2 Kb fue recortada del gel. El fragmento de ADN en el trozo de gel se extrajo usando un tubo de microcentrifuga SUPREC-01 (Takara Shuzo) seguido de purificación mediante tratamiento con fenol, tratamiento con cloroformo y precipitación con etanol.
Después, 5 \mul de cada uno de este fragmento de ADN EcoRI-SalI y el fragmento génico de CNP-22 humano producto de PCR (fragmento de ADN EcoRI-SalI) fue mezclado, y ligado con un equipo de ligación de ADN (Takara Shuzo). La mezcla de ligación fue usada para transformar la cepa W3110 de Escherichia coli, y uno de los transformantes fue denominado cepa pG97S4DhCNP-22.
Ejemplo 6- (b)
Construcción del plásmido de expresión pG97S4DhCNP-22R3-2 y pG97S4DhCNP-22R5-2
El siguiente procedimiento fue realizado para insertar un gen de péptido de unión que codifica para la secuencia de aminoácidos de R3-2 ó R5-2 indicada en la Fig.11 dentro de la región codificante para el péptido de unión entre el gen \beta-gal197S4D y el gen CNP-22 humano. La construcción de pG97S4DhCNP-22R3-2 y pG97S4DhCNP-22R5-2 se indica en la Fig. 12.
3 \mug de pG97S4DhCNP-22 fueron digeridos con 10 unidades de cada enzima EcoRI y XhoI durante 2 horas a 37ºC en 50 \mul de tampón Superior. Después de la reacción, se realizó una electroforesis en gel de agarosa 1% y un fragmento de ADN de 3,2 kb fue aislado del gel mediante electroelución. Se realizó una ligación sobre este fragmento de ADN y 20 pmoles de un oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica para las secuencias R3-2 y R5-2 usando un equipo de ligación (Takara Shuzo). La mezcla de ligación fue usada para transformar la cepa W3110 de Escherichia coli. Después del aislamiento del plásmido de la cepa transformada resistente a tetraciclina, se realizó un análisis estructural del plásmido usando enzimas de restricción para obtener la diana W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2 y W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2.
\newpage
Ejemplo 6-(c)
Construcción de pG97S4DhCNP-22R5-3
El siguiente procedimiento fue realizado para insertar un gen que codifica para un péptido de unión para la secuencia de aminoácidos de R5-3 indicada en la Fig. 11 en el plásmido pG97S4DhCNP-22. La construcción de pG97S4DhCNP-22R5-3 se indica en la Fig. 13.
3 \mug de pG97S4DhCNP-22 fueron digeridos con 10 unidades de enzima Eco RI durante 2 horas a 37ºC en 50 \mul de tampón Superior. Después de la digestión, se añadieron 0,5 unidades de fosfatasa alcalina para defosforilar el extremo 5' terminal durante 1 hora a 37ºC. Y luego, se realizó el tratamiento con fenol para inactivar la fosfatasa alcalina. Se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa 1%, y el fragmento de ADN de 3,2 kb fue aislado del gel mediante electroforesis. Después, 3 \mug de oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica para la secuencia de aminoácidos de R5-3 fue tratada con 20 unidades de polinucleótido quinasa T4 en 100 \mul de disolución de reacción de polinucleótido kinasa T4 (Tris/HCl 50 mM pH 8,0, MgCl_{2} 10 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM y ATP 1 mM) para fosforilar el extremo 5' durante 1 hora a 37ºC.
La ligación fue luego realizada sobre 2 \mul de este oligonucleótido fosforilado y el anteriormente mencionado pG97S4DhCNP-22 cortado con EcoRI, tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación fue usada para transformar la cepa W3110 de Escherichia coli, y se obtuvieron transformantes resistentes a tetraciclina. Los plásmidos fueron analizados mediante enzimas de restricción, y se obtuvo W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3.
Ejemplo 7 Expresión de la proteína de fusión CNP-22 humana
Para examinar la relación entre los puntos isoeléctricos de las proteínas de fusión expresadas en células microbianas y la productividad, se cultivaron microorganismos y la productividad de proteínas de fusión por número de células fue investigada usando una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.
Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas en frascos durante 12 horas a 37ºC en 500 ml de medio NuI (0,4 g/L de extracto de levadura, 4 g/L de dihidrógeno fosfato de potasio, 4 g/L de hidrógeno fosfato de dipotasio, 2,7 g/L de hidrógeno fosfato de disodio, 1,2 g/L de sulfato amónico, 0,2 g/L de cloruro amónico, glicerina 0,8%, 2 g/L de sulfato de magnesio y 10 mg/L de tetraciclina).
Después del cultivo, se midió la turbidez (D.O._{660}) del caldo de cultivo con un espectrofotómetro y el caldo de cultivo se ajustó para que el valor de (valor D.O._{660}x volumen de cultivo (ml)) llegara a ser 5, y se llevó a cabo una centrifugación durante 5 minutos a 12000 rpm para separar las células microbianas. Se añadió 1 ml de tampón de muestra-SDS (Tris/HCl 63 mM pH 6,8, glicerina 10%, SDS 10%, 2-mercaptoetanol 5% y 12,5 mg/L de azul de bromofenol) a este precipitado celular y se calentó durante 5 minutos a 95ºC para obtener las muestras para electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.
La electroforesis en gel de poliacrilamida 15%-SDS (TEFCO) fue realizada usando 5 \mul de la muestra anteriormente mencionada bajo las condiciones de 18 mA durante 90 minutos. Después de la electroforesis, el gel se tiñó en una disolución de teñido (ácido acético 10%, metanol 40% y 2 g/L de azul brillante de Coomassie R-250) y la productividad por célula de proteína de fusión CNP-22 humana producida en cada cepa fue comparada. Los resultados de la electroforesis están indicados en la Fig.14.
Como se indica en la Fig. 14, está claro que cuando la cepa W3110/pG97S4DhCNP-22 que proporciona un punto isoeléctrico de 4,56 se compara con las otras cepas (W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2 que proporciona un punto isoeléctrico de 4,95, W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 que proporciona un punto isoeléctrico de 6,22 yW3110/
pG97S4DhCNP-22R5-3 que proporciona un punto isoeléctrico de 5,59), las cepas W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2, W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 y W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3 demostraron una productividad mayor de proteína de fusión que la cepa W3110/pG97S4DhCNP-22.
Se indicó en particular que las cepas W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 y W3110/pG97S4DhCNP-22R5-3 expresaron una gran cantidad de proteína de fusión. Así, se verificó en este Ejemplo así como que el ajuste del punto isoeléctrico de la proteína de fusión dentro del intervalo de 4,9-6,9 da como resultado una productividad aumentada de proteína de fusión.
Ejemplo 8 Liberación del CNP-22 humano de la proteína de fusión por la proteasa V8
El siguiente experimento fue llevado a cabo para examinar la eficacia de liberación de CNP-22 humano de proteína de fusión usando la proteasa V8.
\newpage
Después de cultivar las cepas W3110/pG97S4DhCNP-22R3-2, W3110/pG97S4DhCNP-22R5-2 y W3110/
pG97S4DhCNP-22R5-3 en el medio Nul anteriormente mencionado, se recogieron 400 ml del caldo de cultivo y se homogeneizó mediante un homogenizador de alta presión (Manton Gaulin Laboratory Homogenizer 15M-8TA) a 600 Kg/cm^{2}.
Un precipitado que contenía los cuerpos de inclusión fue recogido mediante centrifugación durante 30 minutos a 7000 rpm. 400 ml de tampón A (Tris/HCl 50 mM pH 8,0, EDTA 2 mM y Triton X-100 1%) fueron añadidos a la fracción precipitada resultante, y el precipitado se lavó mediante centrifugación de nuevo después de resuspenderlo. Este procedimiento de precipitación fue realizado dos veces usando un tampón A y una vez usando agua desionizada. Después de resuspender el precipitado finalmente obtenido en agua desionizada de modo que el valor de D.O._{660} se volviera 20, se cortó la proteína de fusión mediante la proteasa V8 usando el método indicado a continuación.
6 \mul de Tris/HCl 1 M (pH 8,0), 0,6 \mul de EDTA 0,5 mM, 36 mg de urea y 3 \mul de DTT 1 M fueron añadidos a 60 \mul de la suspensión de cuerpos de inclusión y luego se dejó reposar durante 10 minutos. Después de reposar, se añadió agua desionizada para llevar el volumen final a 300 \mul. Se añadió entonces 1 \mul de proteasa V8 (1 mg/ml) y se dejó proceder una reacción de corte durante 1 hora a 30ºC. La determinación cuantitativa del CNP-22 humano cortado de la proteína de fusión fue realizada mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) usando un columna empaquetada A-302 YMC ( 2,46 cm x 15 cm, Yamaura Chemical Research).
La disolución de reacción de la proteasa V8 se diluyó por un factor de 20 con urea 2 M y una disolución de ácido acético 6% seguido por análisis de HPLC usando 20 \mul de esa disolución diluida. Se realizó una elución por HPLC con un gradiente de concentración lineal usando ácido trifluoro-acético (TFA) 0,1%, FA 0,1% y acetonitrilo 50%. Los patrones de elución antes y después del corte de la proteína de fusión \beta-gal97S4DhCNP-22R5-3 por la proteasa V8 se indican en la Fig. 15 y Fig. 16, respectivamente. Como queda claro a partir de las Figs. 15 y 16, un pico que apareció de la proteína de fusión digerida con la proteasa V8 fue coincidente con el del CNP-22 humano estándar, indicando así que el CNP-22 humano se libera específicamente de la proteína de fusión.
La liberación del CNP-22 humano también tuvo lugar eficazmente en \beta-gal97S4DhCNP-22R5-2 y \beta-
gal97S4DhCNP-22R3-2, con picos que se identificó que emparejaban con el CNP-22 humano estándar. La eficacia de liberación del CNP-22 humano cortado bajo las condiciones anteriormente mencionadas fue de 99% para \beta-gal97S4DhCNP-22R3-2 y 92% para \beta-gal97S4DhCNP-22R5-3.
Basados en los resultados descritos anteriormente, se verificó no sólo en el ejemplo de la calcitonina humana previamente documentada por los inventores del presente invento, sino también en este Ejemplo así como, que en la producción de CNP-22 humano, se puede producir CNP-22 humano en gran cantidad alterando la carga de los aminoácidos de la región del péptido de unión de modo que el punto isoeléctrico de la proteína de fusión se encuentre dentro del intervalo de 4,9-6,9, y también que el CNP-22 se libere específicamente de la proteína de fusión producida en una gran cantidad en la manera anterior usando la proteasa V8.
En el presente trabajo, se verificó por primera vez por los presentes inventores que la proteína de fusión puede producirse en grandes cantidades de la forma de cuerpos de inclusión dentro de células microbianas diseñando la proteína de fusión de modo que su punto isoeléctrico esté en el lado ácido, permitiendo de ese modo la producción de una gran cantidad de proteína de fusión que contiene el péptido diana.
Así, un elevado nivel de productividad de proteína de fusión que contiene la proteína diana puede obtenerse cultivando grandes volúmenes usando células hospedantes obtenidas en el presente método, permitiendo de ese modo que ésto sea usado adecuadamente en la producción de péptidos activos fisiológicamente a una escala industrial.
Además, se estableció un método en el que después de cultivar en gran volumen usando células hospedantes obtenidas usando la técnica actual, el precursor de la calcitonina humano o CNP-22 humano se libera y purifica de la proteína de fusión. Adicionalmente, se demostró que el precursor de la calcitonina humano fue convertido a calcitonina madura a gran escala, usando una enzima amidante.
SEQ ID NO: 1
LONGITUD DE SECUENCIA: 99
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico con la proteína correspondiente
TIPO DE HEBRA: doble
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA:
FUENTE: plásmido pBR322
SECUENCIA
1
SEQ ID NO: 2
LONGITUD DE SECUENCIA: 30
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCTCGGG CTCGCCACTT CGGGCTCATC 
\hfill
30
SEQ ID NO: 3
LONGITUD DE SECUENCIA: 30
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCGAGATGAG CCCGAAGTGG CGAGCCCGAG 
\hfill
30
SEQ ID NO: 4
LONGITUD DE SECUENCIA: 21
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCCGCCT ATATCGCCGA C 
\hfill
21
SEQ ID NO: 5
LONGITUD DE SECUENCIA: 21
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCGAGTCGGC GATATAGGCG G 
\hfill
21
SEQ ID NO: 6
LONGITUD DE SECUENCIA: 27
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGC 
\hfill
27
SEQ ID NO: 7
LONGITUD DE SECUENCIA: 27
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCGAGCCTGT GGCGCCGGTG ATGCCGG 
\hfill
27
SEQ ID NO: 8
LONGITUD DE SECUENCIA: 39
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCCGCCT ATATCGCCGA CATCACCGAT GGGGAAGAC 
\hfill
39
SEQ ID NO: 9
LONGITUD DE SECUENCIA: 39
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCGAGTCTTC CCCATCGGTG ATGTCGGCGA TATAGGCGG 
\hfill
39
SEQ ID NO: 10
LONGITUD DE SECUENCIA: 69
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico con la proteína correspondiente
TIPO DE HEBRA: doble
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA:
FUENTE: plásmido pUCCNP1
SECUENCIA
2
SEQ ID NO: 11
LONGITUD DE SECUENCIA: 31
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TAAGAATTCC TCGAGGGCTT GTCCAAGGGC T 
\hfill
31
SEQ ID NO: 12
LONGITUD DE SECUENCIA: 30
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\newpage
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TAAGTCGACT TAACATCCCA GGCCGCCGCT 
\hfill
30
SEQ ID NO: 13
LONGITUD DE SECUENCIA: 21
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCCGGCG CCGAGAGTTC C 
\hfill
21
SEQ ID NO: 14
LONGITUD DE SECUENCIA: 21
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCGAGGAACT CTCGGCGCCG G 
\hfill
21
SEQ ID NO: 15
LONGITUD DE SECUENCIA: 36
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCCGGCG CCATCACCGG CGCCACCGAG AGTTCC 
\hfill
36
SEQ ID NO: 16
LONGITUD DE SECUENCIA: 36
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCGAGGAACT CTCGGTGGCG CCGGTGATGG CGCCGG 
\hfill
36
SEQ ID NO: 17
LONGITUD DE SECUENCIA: 21
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTTCGACG CCGTCGCCGA G 
\hfill
21
SEQ ID NO: 18
LONGITUD DE SECUENCIA: 21
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE HEBRA: única
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATTCTCGGC GACGGCGTCG A 
\hfill
21

Claims (9)

1. Un proceso para la producción de un péptido diana seleccionado de entre calcitonina, precursor de calcitonina, péptido natriurético (NP), factor de crecimiento celular y hormona paratiroidea, que comprende:
(a) cultivar células hospedantes transformadas con vector capaces de expresar un gen que codifica para una proteína de fusión representable mediante la fórmula
A-L-B
en la que
B es el péptido diana;
A es un péptido protector, siendo un fragmento terminado en N de 90 a 210 aminoácidos de la \beta-galactosidasa de E. coli, y L es un péptido de unión entre el extremo C del péptido protector y el extremo N del péptido diana,
siendo el péptido de unión L una porción de la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID No:1 que contiene de 3 a 8 residuos de arginina, seleccionados de modo que la proteína diana se separe cuando la proteína de fusión se trate con una sustancia química predeterminada tal como una enzima, y dando la proteína de fusión entera un punto isoeléctrico en el intervalo de 4,9- 6,9;
(b) homogeneizar las células hospedantes cultivadas para obtener una fracción insoluble que comprende cuerpos de inclusión;
(c) solubilizar la proteína de fusión en los cuerpos de inclusión tratando la fracción insoluble con un agente solubilizante; y,
(d) escindir el enlace peptídico entre el residuo aminoacídico terminado en C del péptido de unión y el extremo N del péptido diana para liberar el péptido diana.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido de unión está codificado por una parte de la secuencia de nucleótidos de 403 a 495 del gen de resistencia a tetraciclina de pBR322.
3. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el péptido diana es calcitonina humana.
4. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido diana es el péptido natriurético atrial, el péptido natriurético cerebral o el péptido natriurético tipo C (CNP).
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el péptido diana es CNP-22.
6. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células hospedantes son E.coli.
7. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el péptido protector consiste en los aminoácidos 1 a 97 del extremo N de la \beta-galactosidasa.
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que en dicho fragmento del péptido protector del extremo N de la \beta-galactosidasa, residuos de serina reemplazan a los residuos de cisteína y los residuos de ácido aspártico reemplazan a cuatro residuos de ácido glutámico.
9. Un proceso para la producción de un péptido diana seleccionado de entre calcitonina, precursor de calcitonina, péptido natriurético (NP), factor de crecimiento celular y hormona paratiroidea, que comprende:
(a) cultivar células hospedantes transformadas con vector capaces de expresar un gen que codifica para una proteína de fusión representable mediante la fórmula
A-L-B
en la que
B es el péptido diana;
A es un péptido protector, siendo un fragmento terminado en N de 90 a 210 aminoácidos de la \beta-galactosidasa de E.coli, y L es un péptido de unión entre el extremo C del péptido protector y el extremo N del péptido diana,
siendo el péptido de unión L seleccionado en primer lugar de modo que la proteína diana se separe cuando la proteína de fusión se trate con una sustancia química predeterminada tal como una enzima, y en segundo lugar de modo que la proteína de fusión entera dé un punto isoeléctrico en el intervalo 4,9-6,9;
(b) homogeneizar las células hospedantes cultivadas para obtener una fracción insoluble que comprenda cuerpos de inclusión;
(c) solubilizar la proteína de fusión en los cuerpos de inclusión tratando la fracción insoluble con un agente solubilizante, y
(d) escindir el enlace peptídico entre el residuo aminoacídico terminado en C del péptido de unión y el extremo N del péptido diana para liberar el péptido diana,
pero excluyendo procesos en los que el péptido de unión es un solo residuo de lisina, arginina, ácido glutámico o metionina, que es escindido en la etapa (d).
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