FI91883C - Menetelmä hirudiinin vaikutusta omaavan polypeptidin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä hirudiinin vaikutusta omaavan polypeptidin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI91883C FI91883C FI853056A FI853056A FI91883C FI 91883 C FI91883 C FI 91883C FI 853056 A FI853056 A FI 853056A FI 853056 A FI853056 A FI 853056A FI 91883 C FI91883 C FI 91883C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ctt
- gaa
- acg
- tgc
- ctg
- Prior art date
Links
- 0 CC(C)*1C*CC1 Chemical compound CC(C)*1C*CC1 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Seal Device For Vehicle (AREA)
- Extrusion Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
Description
91883
Menetelma hirudiinin vaikutusta omaavan polypeptidin val-mistamiseksi
Hirudiini on iilimadosta saatu polypeptidi, jolla 5 on spesifinen antitrombiinivaikutus ja joka toimii antiko-agulanttina.
Nyt keksittiin, ettå hirudiinin vaikutusta omaavia polypeptideja voidaan valmistaa geeniteknisesti.
Keksinto koskee nåin olien menetelmaa hirudiinin 10 vaikutusta omaavan polypeptidin valmistamiseksi, jolla on
yleinen kaava I
5 10 (X) ^-X'-C-Tyr-D-Asp-Cys-E-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-15 20 25 15 -Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys- 30 35 40 -Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-F-G-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-45 50 55 -Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-20 60 65
-H-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-(Z) 0-OH
(I) jossa m = 0 - 50, 25 n = 0 - 100 ja X ja X1 ovat geneettisesti koodittavien aminohappojen sa-moja tai erilaisia jaannoksia, C on Thr, Val, Ile, Leu tai Phe, D on Thr, 30 E on Thr, F on Gly, G on Glu, H on Glu, ja Z on geneettisesti koodittavien aminohappojen samoja tai 35 erilaisia jaannoksia, lukuunottamatta polypeptideja, 2 91885 joissa a) X1 ja C kumpikin on Val, tai b) X1 on Ile ja C on Thr, tai c) N-terminaaliset aminohapot asemaan 10 saakka puuttuvat.
5 Keksinnon mukaiselle menetelmalle on tunnusomaista, etta ekspressioplasmidiin liitetåan geeni, joka koodittaa kaavan I mukaista polypeptidia, jolloin yksi tai useampi muista aminohapoista jaa pois tai voidaan korvata toisella (toisilla) geneettisesti koodittavalla (koodittavilla) 10 aminohapo(i)11a.
Uudet polypeptidit merkitåån seuraavassa myos "hi-rudiiniksi".
Tarvittu geeni voidaan syntetisoida tunnettujen menetelmien mukaisesti kemiallisesti, eristaa genomista ja 15 valmistaa tai eristaa indusoiduista soluista tunnetuilla menetelmillå mRNA ja saada tasta cDNA.
Edullinen tapa on valmistus cDNA:n kautta ja ennen kaikkea kemiallinen synteesi, erityisesti fosfiittimene-telmån mukaan. Edullinen on edelleen sellaisen geenin syn-20 teesi, joka koodittaa kaavan I polypeptidia, jossa m on 1 ja n on nolla, X on Met tai Arg, C on Thr ja G on Glu.
Erityisen edullinen on toteutusmuoto, jossa valmis-tetaan kaavan I mukaisia polypeptideja, joissa m on 1, X on Met tai Arg, C, D ja E ovat Thr, F on Gly, G ja H ovat 25 Glu ja n on nolla. Tahan edullinen DNA-sekvenssi I on esi-tetty selitysosan lopussa ja se toimii seuraavassa keksinnon havainnollistajana.
Geneettinen koodi on kuten tunnettua degeneroitunut s.o. etta vain kahta aminohappoa koodittaa yksi ainoa nuk-·: 30 leotidijakso, kun taas muiden 18 geneettisesti koodittavan aminohappon osalta on 2-6 koodittavaa triplettiå. Nåin muodostuneista muuntelumahdollisuuksista eivåt eri lajien isåntasolut sitapaitsi aina kayta samoja. Niinpa geenien synteesisså on maårattoman paljon kodonimahdollisuuksia.
Il 3 91S83
Nyt havaittiin, etta DNA-sekvenssi I, joka koodit-taa koko aminohapposekvenssiå, seka sekvenssin I syntee-sisså kaytettavat DNA-osasekvenssit II A ja II B ovat eri-tyisen edullisia hirudiinin erityisen edullisen muodon 5 geeniteknologiseen synteesiin. DNA-sekvenssin I kooditta-van saikeen 5'-pååsså on hantana DNA-sekvenssi, joka vas-taa restriktioendonukleaasia Xbal, koodittavan saikeen 3'-paasså sitavastoin on hantana yksisåikeinen sekvenssi, joka vastaa restriktioentsyymiå Sal I. Nåmå molemmat eri-10 laiset tunnistusjaksot takaavat DNA:n kiinnittymisen plas-midiin toivottuun jårjestykseen. (On tosin myos mahdollis-ta valita samat tunnistusjaksot ja plasmidi-DNA:n karakte-risoinnin jalkeen vastaavien restriktio- tai DNA-sekvens-sianalyysien avulla tai ilmentamallå suorittaa vastaava 15 valinta).
Naiden tunnistusjaksojen ja aminohapposekvenssin kodonien valissa on koodittavan saikeen 5'-paåsså kodoni metioniini-aminohapolle (joka on DNA-sekvenssissa I nume-roitu 0:11a). Vaihtoehtoisena talle voi olla esisekvenssi 20 (niinitetaan myos signaali- tai leader-jaksoksi) bakteeri-tai muusta isannalle spesifisesta proteiinista (katsausar-tikkeli: Perlman ja Halvorson, J. Mol. Biol. 167 (1983), 391), joka aikaansaa halutun polypeptidin erittymisen sy-toplasmasta ja joka tasså eritysprosessissa lohkaistaan 25 pois isåntasolussa luonnollisesti esiintyvån signaalipep- tidaasin avulla. Koodittavan saikeen paassa seuraa sitten taman keksinnon mukaisesti glutamiinia koodittavaa trip-lettia lopetuskodoni tai edullisesti - kuten DNA-sekvenssissa I on esitetty - kaksi lopetustriplettia. Naiden , 30 lopetuskodonien ja hantana olevan Sall-paån valiin DNA-sekvenssiin I on lisaksi liitetty nukleotidisekvenssi, joka vastaa restriktioentsyymia Sst I.
Sisainen ainutlaatuinen katkaisupaikka restriktio-entsyymille Bam HI (kodonissa 30/31) mahdollistaa kahden 35 geenifragmentin HIR-I ja HIR-II (katso DNA-sekvenssi II) 4 91683 subkloonauksen, jotka voidaan liittaa hyvin tutkittuihin kloonausvektoreihin, kuten pBR 322, pUC 8 tai pUC 12. Lisaksi geeniin liitettiin joukko muit ainutlaatuisia rest-riktioentsyymien tunnistusjaksoja, jotka toisaalta luovat 5 paasyn hirudiinin osasekvensseihin ja toisaalta sallivat muunnosten suorittamisen (taulukko 1):
Taulukko 1
Restriktio- katkaisu nukleotidin nro jalkeen 10 entsyymi (koodittava saie)
Rsa I1 8
Acc I 12
Hinf I 27
Xho II1 57 15 Fnu 4 HI 71
Hae III 73
Bst NI 75
Hph I 117
Rsa I2 137 20 Κρη I 139
Taq I 172
Xho II2 178
Dde I 184
Mbo II 186 25 Sst I 210 <i ainutlaatuinen osasekvenssin HIR-I suhteen 2 ainutlaatuinen osasekvenssin HIR-II suhteen DNA-sekvenssi I voidaan rakentaa 14 oligonukleoti-; 30 dista, joiden pituus on 25-35 nukleotidia (katso DNA-sek venssi II) , syntetisoimalla nåmå ensin kemiallisesti ja sitten sitomalla 4-6 nukleotidia entsymaattisesti "tahmei-den paiden" kautta.
DNA-sekvenssissa I otettiin myos huomioon, etta 35 niiden aminohappojen suhteen, joita useat kodonit voivat 5 91S83 koodittaa, nåma eivat ole samanarvoisia, vaan osoittavat pikemminkin kulloisessakin isantåsolussa kuten E. colissa erilaisia etusijoja. Edelleen våhennettiin palindromisia jaksoja pienimpåan mahdolliseen maaraan.
5 DNA-sekvenssin I geenirakenne saadaan siis helposti suhteellisen pienistå rakenneosista, se mahdollistaa kah-den geenifragmentin subkloonauksen hyvin tunnetuissa vek-toreissa ja sallii niiden yhdistymisen yhdistelmageeniksi seka mahdollisesti niiden muuttamisen.
10 Aina synteettisen geenin liittamisen jalkeen kloo- nausvektoriin ilmentyy haluttu peptidi, jolla on hirudii-nin aminohapposekvenssi, valittomåsti (DNA-sekvenssi IC) tai fuusioproteiinin muodossa bakteeriproteiinin, kuten β-galaktosidaasin, kanssa tai osasekvensseinå naista. Fuu-15 sioproteiinit voidaan sitten pilkkoa tunnetulla tavalla kemiallisesti tai entsymaattisesti. Jos esimerkiksi sek-venssin I O-asemassa on aminohappo metioniini (DNA-sekvenssi IA), voidaan kemiallinen pilkkominen suorittaa bro-misyaanilla, jos tassa asemassa on aminohappo arginiini 20 (DNA-sekvenssi IB) , voidaan entsymaattinen pilkkominen suorittaa trypsiinilla.
Taulukossa 2 on esitetty edullisia aminohapposek-venssien muunnoksia, joissa m ja n ovat nollia:
Taulukko 2 25
ABCDEFGH
a) Ile Thr Thr Thr Thr Gly Glu Glu b) Ile - Thr Thr Thr Gly Glu Glu c) Ile - Thr Thr Ile Gly Glu Glu 3 0 d) Ile - Thr Thr Thr Gly Glu Pro e) Ile - Thr Thr Ile Gly Glu Pro f) Thr - Thr Gly - Glu g) Thr Thr Thr Gly - Glu , 51883
O
Nåma muunnokset on mahdollista toteuttaa synteetti-sen geenin muodostamisen jalkeen DNA-tasolla helposti vaihtainalla vastaava geenifagmentti de-novo-syntetisoitui-hin DNA-sekvensseihin kayttamallå vastaavia restriktioent-5 syymien katkaisupaikkoja.
Esimerkkina aminohapposekvenssin muunnoksesta mai-nittakoon (tunnettu) kaavan I mukainen polypeptidi, jossa m on 1, X ja C ovat Val, D ja E ovat Thr, F on Gly, G ja H ovat Glu ja n on nollaa. Tama muunnos voidaan helposti to-10 teuttaa DNA-tasolla restriktioentsyymia Acc I vastaavaa katkaisupaikkaa kåyttaen.
Synteettisten geenien tai geenifragmenttien liitta-minen kloonausvektoreihin, esimerkiksi kaupallisiin plas-mideihin pUC 8, pUC 12 ja pBR 322 tai muihin yleisesti 15 saataviin plasmideihin, kuten ptac 11 ja pKK 177,3, tapah-tuu sinansa tunnetulla tavalla. Kemiallisesti syntetisoid-ut geenit voidaan myos ensin varustaa sopivilla kemialli-sesti syntetisoiduilla saatelyalueilla, jotka mahdollista-vat proteiinien ilmentymisen. Tassa suhteessa voidaan vii-20 tata Maniatiksen oppikirjaan (Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982). Nain saadun hybridi-plasmidin transforxnaatio sopivaan isåntaorganismiin, edul-lisesti E. coliin, on myos sinånså tunnettua ja edellå mainitussa oppikirjassa perusteellisesti kuvattu. Ilmenty-25 vien proteiinien talteenotto ja puhdistus voi tapahtua sinansa tunnetulla menetelmalla.
Keksinnon mukaisesti saadut geenifragmentit HIR-I ja HIR-II, naillå muodostetut hybridiplasmidit ja trans-formoidut isantaorganismit ovat uusia ja kuuluvat taman 30 keksinnon piiriin. Sama koskee DNA-sekvenssistå I muunnet-tuja uusia DNA-sekvensseja. Keksinnon totetusmuotoja on esitetty patenttivaatimuksissa.
Seuraavissa esimerkeissa selvitetaan viela muutamia keksinnon toteutusmuotoja yksityiskohtaisesti, joista alan 35 ammattimiehelle ovat lukuisia mahdollisia muutoksia ja yh- il O 1 C C 7 / i ϋΟό 7 distelmiå mahdollisia. Prosenttiluvut perustuvat tasså painoon, jos muuta ei ole esitetty.
Esimerkit 1. Yksisåikeisten oligonukleotidien kemiallinen 5 synteesi
Koodittavan såikeen nukleotidit 1-32 kåsittåvåå geenirakenneosaa la kåytetåån esimerkkinå geenirakenneosi-en synteesin kuvauksessa. Tunnettujen menetelmien mukaan (M.J. Gait et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 1081-1096) 10 sidotaan 3'-påassa oleva nukleotidi, tassa tapauksessa siis tymidiini (nukleotidi nro 32), piihappogeeliin ((R)FrACT0SIL, Firma Merck) 3' -hydroksiryhmån kautta kova-lenttisesti. Taman aikaansaamiseksi piihappogeeli saate-taan ensin reagoimaan 3-(trietoksisilyyli)propyyliamiinin 15 kanssa, jolloin syntyy Si-O-Si-sidos etanolilohkaisun kautta. Tymidiini sekoitetaan 3'-0-sukkinoyyli-5'-dimetok-sitrityylieetterinå paranitrofenolin ja Ν,Ν'-disyklohek-syylikarbodi-imidin lasnaollessa modifioidun kantajan kanssa, jollon sukkinoyyliryhman vapaa karboksiryhma asy-20 loi propyyliaminoryhman aminojåånnoksen.
Seuraavissa synteesivaiheissa kaytetaan emaskompo-nentteja 5'-0-dimetoksitrityyli-nukleosidi-3'-fosforiha-pokemonometyyliesteri-dialkyyliamidina tai -kloridina, jolloin adeniini esiintyy N6-bentsoyyli-sidoksena, sy-25 tosiini N^bentsoyyli-sidoksena, guaniini N2-isobutyryyli- sidoksena ja tymiini, joka ei sisållå aminoryhmåå, ilman suojaryhmåå.
50 mg polymeerikantajaa, joka sisåltåå 2 μιηοΐ tymi-diiniå sitoutuneena, kåsitellåån sen jålkeen seuraavilla 30 aineilla: a) nitrometaani, b) kyllåstetty sinkkibromidiliuos nitrometaanissa, jossa on 1 % vettå, c) metanoli, 35 d) tetrahydrofuraani, 91883.
8 e) asetonitriili, f) 40 μιηοΐ vastaavaa nukleosidifosfiittia ja 200 μιηοΐ tet-ratsolia 0,5 ml:ssa vedetdntå asetonitriiliå (5 minuut-tia) , 5 g) 20 % asetanhydridia tetrahydrofuraanissa, mukana 40 % lutidiinia ja 10 % dimetyyliaminopyridiiniå (2 minuut-tia) , h) tetrahydrofuraani, i) tetrahydrofuraani, jossa 20 % vettå ja 40 % lutidiinia, 10 j) 3 % jodia kollidiini/vesi/tetrahydrofuraanissa, jonka tilavuussuhde on 5:4:1, k) tetrahydrofuraani ja l) metanoli.
"Fosfiitilla" ymmarretaan tassa deoksiriboosi-3'-15 monofosforihapoke-monometyyliesteria, jolloin kolmasva- lenssi on taytetty kloorilla tai tertiaarisella aminoryh-mSllS, esimerkiksi morfoliinitahteella.
Yksittaisten synteesivaiheiden saannot voidaan jos-kus maarittaa detritylointireaktion b) jålkeen spektrofo-20 tometrisesti mittaamalla dimetoksitrityylikationin absorp- tio aallonpituudella 496 nm.
Oligonukleotidin paattyneen synteesin jålkeen loh-kaistaan oligomeerin metyylifosfaattisuojaryhmåt p-tiok-resolin ja trietyyliamiinin avulla.
25 Lopuksi erotetaan oligonukleotidi kiinteåstå kanta- jasta 3 tuntia keståvållå ammoniakkikåsittelyllå. 2 - 3 -påivåinen oligomeerien kåsittely konsentroidulla ammoni-akilla lohkaisee emåsten aminosuojaryhmåt kvantitatiivi-sesti. Nåin saatu raakatuote puhdistetaan korkeapainenes-30 tekromatografialla (HPLC) tai polyakryyliamidigeelielekt- roforeesilla.
Aivan vastaavasti syntetisoidaan my5s muut geenira-kenneosat Ib-IIh, joiden nukleotidijårjestys ilmenee DNA-sekvenssistå II.
Il 91883 9
2. Yksisaikeisten oligonukleotiaien entsymaattinen sitominen geenifragmentteihin HIR-I ja HIR-II
5'-pååsså olevien oligonukleotidin fosforyloimisek-si kåsiteltiin 1 nmol kutakin oligonukleotidia Ib - le 5 5 nmol:11a adenosiinitrifosfaattia 4 yksikon kanssa T4-po-lynukleotidikinaasia 20 jul:ssa 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH
7,6), 10 mM magnesiumkloridia ja 10 mM ditiotreitolia (DTT) 30 minuuttia 37 °C:ssa. Entsyymin aktiivisuus pois-tetaan kuumentamalla viisi minuuttia 95 °C:ssa. Oligonuk-10 leotideja la, If, Ila ja Uh, jotka DNA-sekvensseissa IIA ja IIB muodostavat håntåsekvenssin, ei fosforyloida. Tama estaa seuraavassa sitomisreaktiossa suurempien alafrag-menttien muodostumisen koska ne vastaavat DNA-sekvenssiå IIA tai IIB.
15 Oligonukleotidit Ia-If sidotaan seuraavasti ala- fragmenttiin HIR-I: 1 mmol kutakin oligonukleotidia la ja If seka Ib:n, Ic:n, Id:n ja Ie:n 5'-fosfaattia liuotetaan yhdesså 45 μΐ-.aan puskuria, joka sisaltaa 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM magnesiumkloridia, 25 mM kaliumkloridia ja 20 10 mM DTT. DNA-sekvenssin IIA mukaisen oligonukleotidin lampokasittelemiseksi kuumennetaan oligonukleotidin liuos-ta 2 minuuttia 95 °C:ssa ja jaahdytetaan sitten hitaasti (2-3 tuntia) 20 °C:seen. Entsymaattista sitomista vårten lisataan sitten 2 μΐ 0,1 M DTT, 8 μΐ 2,5 mM adenosiinit-25 rifosfaattia (pH 7) sekå 5 μΐ T4-DNA-ligaasia (2000 yksik-kda) ja inkuboidaan 16 tuntia 22 °C:ssa.
Vastaavalla tavalla fosforyloidaan oligonukleotidit Ilb - lig ja sidotaan sitten oligonukleotidien Ila ja Uh kanssa yhteen alafragmentiksi HIR-II.
30 Geenifragmenttien HIR-I ja HIR-II puhdistus tapah- tuu geelielektroforeesilla 10 %:lla polyakryyliamidigee-lilla (ilman urean lisaysta, 20 x 40 cm, 1 mm paksu) , jos-sa merkkiaineena toimii ØX 174 DNA (Fa. BRL), katkaistuna Hinf I:11a, tai pBR 322, katkaistuna Hae III:11a.
10 91583
3. Hybridiplasmidien valmistus, jotka sisaltåvåt geenifragmentit HIR-I ja HIR-II
a) Geenifragmentin HIR-I liittåminen pUC 12:een
Kaupallisesti saatava plasmidi pUC 12 avataan tun- 5 netulla tavalla restriktioendonukleaaseilla Xba I ja Barn HI valmistajan ohjeiden mukaan. Sulatussakka erotetaan 5 %:lla polyakryyliamidigeelillå elektroforeesilla tunnetul-la tavalla ja palaset tehdaån nåkyviksi vårjaamallå eti-diumbromidilla tai radioaktiivisesti merkitsemalla ("Nick-10 Translation" Maniatiksen mukaan, mainitussa paikassa). Plasmidivyohykkeet leikataan irti akryyliamidigeelistå ja erotetaan polyakryyliamidista elektroforeettisesti. Sula-tussakan erotus voi tapahtua myos 2 %:lla alhaalla sula-valla agaroosigeelillå (kuten esimerkisså 5a) on kuvattu).
15 1 Mg plasmidia ligatoidaan sitten 10 ng:n kanssa geenifragmentilla HIR-I, joka fosforyloitiin ensin, kuten esimerkisså 2 on kuvattu, yon yli 16 °C:ssa. Saadaan kuvan 1 mukainen hybridiplasmidi.
b) Geenifragmentin HIR-II liittåminen pUC 8:aan 20 Samalla tavalla kuin kohdassa a) katkaistaan kau pallisesti saatava plasmidi pUC 8 Bam HI:11a ja Sal I:llå ja liitetaan geenifragmenttiin HIR-II, joka ensin esimerkisså 2 kuvatulla tavalla fosforyloitiin. Saadaan kuvan 2 mukainen hybridiplasmidi.
25 4. Taydellisen geenin synteesi ja liittåminen plas- midiin a) Transformaatio ja monistaminen
Nain saadut hybridiplasmidit transformoidaan E. coliin. Tata vårten tehdaan E. coli-kanta K 12 kelpaavaksi 30 kasittelemalla 70 mM:lla kalsiumkloridiliuosta ja sekoite-taan hybridiplasmidisuspension kanssa 10 mM Tris-HCl-pus-kurissa (pH 7,5), joka on 10 mM kalsiumkloridin suhteen. Transformoidut kannat seulotaan kuten tavallisesti kayttM-en hyvaksi plasmidin avulla valittyvåå antibiootin vastus-35 tuskykya tai herkkyytta ja hybridivektorit monistetaan.
li 91883 11
Solujen kuolettamisen jålkeen eristetaan hybridi-plasmidit, katkaistaan alunperin paikalle asetetuilla res-triktioentsyymeillå ja geenifragmentil HIR-I ja HIR-II eristetaan geelielektroforeesilla.
5 b) Geenifragmenttien yhdiståminen
Monistamalla saadut alafragmentit HIR-I ja HIR-II yhdistetaan esimerkisså 2 kuvatulla tavalla (låmpokåsitte-ly 60 °C:ssa) entsymaattisesti ja nåin saatu synteettinen geeni viedåån DNA-sekvenssin I kanssa kloonausvektoriin 10 pUC 12. Saadaan kuvion 3 mukainen hybridiplasmidi.
c) Geenin valmistaminen [Val1, Val2] -hirudiinia vårten
Kuvion 3 mukaisesta plasmidista saadaan, kuten esimerkisså 5a on kuvattu, AccI-Sall-påtkå (nukleotidi 13-15 212), joka sitten voidaan seuraavan adaptorin avulla 5' CT AGA ATG GTT GTA T 3' 3' T TAC CAA CAT ATA 5'
Xbal Accl 20 ligatoida plasmidiin pUC 12, joka ensin avattiin Xbal:llå ja Sall:llå.
d) Geenin valmistaminen taulukon 2 muunnosta a) vårten ' 25 Tåmån aikaansaamiseksi syntetisoidaan seuraava DNA- sekvenssi: G lu Phe Met Ile Thr Thr 5' GG G AA TTC ATG ATC ACA ACG T 3'
CC CTT AAG TAC TAG TGT TGC ATA
. 30 Smal Accl Tåma sekvenssi voidaan siirtåå Smal-AccI-adaptorina restriktioentsyymeillå Smal ja Accl avattuun DNA:han kuvion 3 mukaiseen plasmidiin.
35 e) Geenin valmistaminen taulukon 2 muunnosta b) vårten 91883 12
Ensin syntetisoidaan seuraava DNA-sekvenssi Glu Phe Met Ile Thr 5' GG G AA TTC ATG ATC ACG T 3'
CC CTT AAG TAC TAG TGC ATA
5 Smal Accl
Tama ACA-tripletin suhteen lyhennetty DNA-sekvenssi muodostetaan kuten kohdassa d) on kuvattu.
f) Geenin valmistus taulukon 2 muunnosta c) vårten 10 Lahdetaan DNA-sekvenssista kuten kohdassa e) on kuvattu (muunnos b) taulukossa 2). Pilkotaan Acclrllå ja Sall:11a, jolloin saadaan kaksi fragmenttia, jotka eriste-taan. AccI-Sall-(hirudiini)-fragmentti katkaistaan entsyy-milla HinfI ja suurempi saaduista fragmenteista eriste-15 taan. Tama fragmentti AccI-Sall:11a avattu jaannosplasmi-di-DNA ja synteettinen DNA-sekvenssi
Thr Asp Cys Ile 5' AT ACT GAC TGC ATC G 3'
2 0 TGA CTG ACG TAG CTT A
Accl HinfI
ligatoidaan samassa astiassa. Saatu hybridiplasmidi koo-dittaa taulukon 2 muunnosta c).
25 g) Geenin valmistaminen taulukon 2 muunosta d) vår ten
Lahdetaan taas DNA-sekvenssista kuten edella kohdassa e) on kuvattu (joka siis koodittaa taulukon 2 muunnosta b), joka katkaistaan Accl:llå ja Sallrlla. AccI-30 Sall-(hirudiini)-fragmentin annetaan kuitenkin reagoida Taql:n ja Ddel:n kanssa ja nain lohkaistu fragmentti kor-vataan synteettisella DNA-sekvenssillå 91883 13
Glu Pro Ile 5' C G AA CCG ATC CC 3'
TT GGC TAG GGA CT TaqI Dde I
5 Tålla tavalla muunnettu AccI-Sall-(hirudiini)-fragmentti yhdistetåån nyt jåånnosplasmidi-DNA:n kanssa. Saatu plasmidi koodittaa taulukon 2 muunosta d).
h) Geenin valmistaminen taulukon 2 muunnosta g) 10 vårten
Kuvion 2 mukaisesta hybridiplasmidista eristetåån BamHI-Sall-(hirudiini)-fragmentti ja katkaistaan sen jål-keen Kpnl:llå. Suurempi kahdesta syntyneestå fragmentista eristetåån ja ligatoidaan synteettisen DNA-sekvenssin 15 kanssa
Ser Asp Gly Lys Asn Gin Cys Val
5' GA TCC GAC G AA AAG AAC CAG TGC GTT
G CTG CTT TTC TTG GTC ACG C AA
BamHI
20
Thr Gly Glu Gly 5' ACT GGC GAA GGT AC 3'
TGA CCG CTT C Κρη I
25 Ligaatiotuote sidotaan nyt Xbal-BamHI-(hirudiini)- fragmenttiin, joka on eristetty kuvion 1 mukaisesta plas-midi-DNA:sta, ja - kuten kohdassa 4b) on kuvattu - viedåån pUC 12:een. Saadaan hybridiplasmidi, joka koodittaa taulukon 2 muunnosta g).
30 i) Geenin valmistus taulukon 2 muunnosta f) vårten DNA:sta, joka koodittaa taulukon 2 muunnosta g), eristetåån Xbal-Sall-(hirudiini)-fragmentti ja annetaan reagoida Hinflin kanssa. Suurempi kahdesta syntyneestå fragmentista ligatoidaan sitten synteettisen DNA-sekvens- 35 sin 91883 14
Arg Met Thr Tyr Asp Cys Thr 5' CT AGA ATG ACG TAT GAC TGC ACT G 3'
T TAC TGC ATA CTG ACG TGA CTT A
Xbal Hinf I
5 kanssa ja ligaatiotuote liitetåån Xbal:11a ja Sall:11a avattuun plasmidiin pUC 12. Hybridiplasmidi koodittaa tau-lukon 2 muunnosta f).
j) Muiden muunnosten valmistaminen 10 Esimerkkeinå muista mahdollisista muunnoksista esi- tettåkoon seuraavat: DNA-sekvenssit jotka koodittavat taulukon 2 muun-noksia c) ja d), sisaltåvåt BamHI-tunnistuspaikan, joka vastaa asemaa 97 bp DNA-sekvenssisså I. Kayttåmållå hyvak-15 si tata katkaisukohtaa voidaan nyt molempien muunnosten edella kuvatut AccIBamHI- tai BamHI-Sall-osasekvenssit sitoa yhteen halutulla tavalla.
Kaikki nåma muunnokset voidaan, kuten DNA-sekvens-sille I on kuvattu, siirtaa E. coliin ja ilmentåå.
20 5. Hybridiplasmidien muodostaminen ilmentamåan DNA-
sekvensseja IA, IB ja IC
a) DNA-sekvenssin IC liittaminen pKK 177,3:een (suorailmentaminen) lllmaisuplasmidi pKK 177,3 (plasmidi ptac 11, Amman et 25 al., Gene 25 (1983) 167, jossa Eco RI-tunnistuspaikkaan on synteettisesti liitetty sekvenssi, joka sisaltaa Sal I-katkaisupaikan) avataan restriktioentsyymeilla Eco RI ja Sal I. Kuvion 3 mukaisesta plasmidista saadaan DNA-sek-venssi IC seuraavasti. Katkaistaan plasmidi ensin restrik-. 30 tioentsyymilla Sal I, sitten entsyymilla Acc I ja sitten erotetaan pieni Acc I Sal I -fragmentti geelielektroforee-silla 2 %:lla alhaalla sulavalla agaroosigeelilla plasmi-divyohykkeesta, jolloin DNA saadaan talteen liuottamalla geeli korotetussa låmpotilassa (valmistajan ohjeiden mu-35 kaan). Tåmå DNA-fragmentti voidaan seuraavan adaptorin avulla 91883 15 5' AATTC ATG ACG T 3' 3' G TAC TGC ATA 5'
Eco RI Acc I
5 muuttaa DNA-sekvenssiksi IC.
Ligatoimalla leikattu plasmidi pKK 177,3 geenin IC kanssa saadaan aikaan hybridiplasmidi, jossa ilmaisu- tai saatelyalueen kiinnitys on tapahtunut. Sopivan induktorin lisååmisen jålkeen, kuten isopropyyli-B-tiogalaktopyrano-10 sidi (IPTG) muodostuu mRNA, joka johtaa sellaisen me-tionyyli-polypeptidin ilmentymiseen, joka vastaa DNA-sek-venssiå IC.
b) Hirudiini-geenien IA tai IB liittåminen ilmaisu-plasmidiin pCK-5196 (fuusiokonstruktio)
15 Ilmaisuplasmidi pCK-5196 (kuvio 4) on plasmidin pAT
153 (Twigg ja Sherrat) johdannainen, joka pAT 153 taas on suuren kopioluvun omaava plasmidin pBR 322 johdannainen.
Se sisaltaa tunnetun Lac UV5 -promoottorin, jossa on tun-nettu β-galaktosidaasin sekvenssi nukleotidiin nro 1554 20 saakka (vastaa aminohappoa 518:Trp), tetR-geenin (Hind III pBR 322:sta) ja ampR-geenin (Aha III asemassa 3231 pBR 322:ssa) terminaattorin valissa. Taman vektorin lisåtunto-merkki on β-galaktosidaasisekvenssin ja terminaattorisek-venssin valiin liitetty, tunnetusta plasmidista pUC 13 25 peraisin oleva polylinkkerisekvenssi lac UV5-promoottorin transkriptio sujuu tetR-geenia vastaan.
Tama plasmidi sisaltaa β-galaktosidaasin aminoha-possa 518 polylinkkeriosan Xba I-Bam ΗΙ-Sma I-Sst I plasmidista pUC 13, joka toimii eukaryoottisten geenien kloo-; 30 nauspaikkana. Plasmidi CK-5196 avataan restriktioentsyy-mien Xba I ja Sst I avulla ja ligatoidaan DNA-sekvenssin IA kanssa, joka voidaan eriståM kuvion 3 mukaisesta plasmidista Xba I-SSt I -sulatuksella. Saadaan kuvion 5 mukai-nen hybridiplasmidi, joka sisaltaa lac UV5 -saatelyalueen 35 takana kodonit β-galaktosidaasin 518 ensimmaiselle aminoh- 16 91S83 apolle ja lopuksi kodonit Ser-Arg-Met-(hirudiini 1-64)-: Ile.
Samalla tavalla voidaan saada kuvion 6 mukainen hybridiplasmidi, joka sisaltaa plasmidissa pCK-5196 inser-5 tion DNA-sekvenssin IB kanssa, jossa kuitenkin nyt pide-taan aminohappoa 1 (treoniini) vårten olevaa kodonia pa-rempana kuin kodonia arginiinia vårten. DNA-sekvenssi IB saadaan kuvion 3 mukaisesta plasmidista, jolloin tåmå kat-kaistaan restriktioentsyymeillå Sst I ja Acc I ja ligatoi-10 daan seuraavalla adaptorilla: 5' CT AGA CGT ACG T 3' 3' T GCA TGC ATA 5'
Xba I Acc I
15 6. Hybridiplasmidin transformaatio
Kelvolliset E. coli-solut transformoidaan 0,1 - 1 μg:lla hybridiplasmidia, joka sisaltaa sekvenssin I tai IA, IB tai IC ja ne maljataan tac-plasmidin tapauksessa 20 ampisilliinia sisaltaville agar-agar-levyille, pCK-5196- hybridiplasmidin tapauksessa tetrasykliinia sisaltaville agar-agar-levyille. Lopuksi voidaan tunnistaa kloonit, jotka sisaltavat oikein integroituneet hirudiini-sekvens-sit vastaavissa plasmideissa, DNA-pikatestilla (Maniatis, 25 mainitussa paikassa).
7. Hirudiinin vaikutusta omaavien polypeptidien ilmentyminen
Mainitun tac-hybridiplasmidin transformaation jal-keen E. coliin ilmentyy polypeptidi, jossa on hirudiini-: 30 aminohapposekvenssin ulkopuolella aminopåassa vielå yksi liså-metionyyliryhmå, joka kuitenkin voidaan eliminoida bromisyaanilohkaisulla. Sitåvastoin saadaan E. colin transformaation jålkeen kuvion 5 tai kuvion 6 mukaisella hybridiplasmidilla B-galaktosidaasin 518 aminohapon ja 35 hirudiinin fuusioproteiini, jotka osat ovat muodostaneet 17 91 S83 silian toistensa kanssa yli sekvenssien Ser-Arg-Met tai Ser—Arg-Arg kautta. Nåmå fuusioproteiinit voidaan pilkkoa bromisyaanilla tai trypsiinillå hirudiiniksi ja β-galak-tosidaasiksi.
5 8. Viimeistely ja puhdistaminen
Toivottuun optiseen tiheyteen viljellyt bakteeri-kannat inkuboidaan sopivan induktorin kanssa, esimerkiksi IPTG, riittåvån kauan, esimerkiksi 2 tuntia. Lopuksi solut kuoletetaan 0,1 %:lla kresolilla ja 0,1 mM:lla bentsyy-10 lisulfonyylifluoridilla.
Sentrifugoinnin tai suodatuksen jålkeen solumassa siirretåån puskuriliuokseen (50 mM Tris, 50 mM EDTA, pH
7,5) ja erotetaan mekaanisesti, esimerkiksi French-Presse-tai ^DYNO-myllyllå (Fa. Willy Bachofer, Basel), jolla liu-15 kenemattomat aineosat sentrifugoidaan pois. Ylåpuolella olevasta nesteestå puhdistetaan hirudiinia sisåltåvå pro-teiini tavallisella menetelmållå. Sopivia ovat ioninvaih-to-, adsorptio-, geelisuodatuspylvååt tai affiniteettikro-matografia trombiini- tai vasta-ainepylvåillå. Natriumdo-20 dekyylisulfaatti-akryyliamidigeelillå tai HPLC-analytii- kalla seurataan tuotteen rikastusta ja puhtautta. Fuusioproteiinit, joissa on B-galaktosidaasi-osa, voidaan osoit-taa jo hajotettujen bakteerien raakauutteessa johtuen nii-den erilaisesta ajosuhtautumisesta verrattuna β-galak-25 tosidaasiin (1-518). Geeniteknologisesti tuotetun hirudii- nin tunnistus tapahtuu vertaamalla iilimadosta eristet-tyyn, autenttiseen aineeseen tai sellaisten kokeiden avul-la, jotka perustuvat hirudiinin veren hyytymistå ehkåise-viin ominaisuuksiin.
DNA-sekvenssi I
18 91883
Tripletti nro 0 1 2 3 4 5
Aminohappo Met Thr Tyr Thr Asp Cys
Nukleotidi nro 1 10 20
5 Kood. såie 5’ CT AGA AT3 ACG TAT ACT GAC TGC
Ei kood. saie 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 30 40 50
ACT G AA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC
10 TGA CTT AGA CCA GTC TIG GAC ACG GAC ACG
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn 60 70 80
G AA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC
CTT CCT AGA TIG C AA ACG CCG GTC CCA TIG
15 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys 90 100 110
AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT GAA AAG
ITT ACG TAG GAA CCT AGG CTG CCA CTT TTC
36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 2 0 Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro 120 130 140
AAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCG
TIG GTC ACG C AA TGA CCG CTT CCA TGG GGC
46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe __ 150 160 170
AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC
' TTT GGC GTC AGA GTA TIG CTG CCG CTG AAG
56 57 58 59 60 61 62 63 64
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin Stp 180 190 200
GAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAA
30 CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT
Stp i 210 TAG AGC TCG 3’ ATC TCG AGC AGC T 5' 35 DNA-sekvenssi ΙΑ: 19 91 883
O
Met (Aminohapot 1-64) 5 1 5 205 210 5' CT AGA ATG (Nukleotidit 9-200) TAA TAG AGC T 3' 3' T TAC (komplemen. nukl.) ATT TAC 5'
Xbal SstI
10 DNA-sekvenssi IB: 0
Arg (Aminohapot 1-64) 1 5 205 210 15 5' CT AGA CGT (Nukleotidit 9-200) TAA TAG AGC T 3' 3' T TAC (komplemen. nukl.) ATT ATC 5'
Xbal SstI
DNA-sekvenssi IC: 20 0
Met (Aminohapot 1-64) 205 210 5' AA TTC ATG (Nukleotidit 9-200) TAA TAG AGC TCG 3' • 25 G TAC (komplemen. nukl.) ATT ATC TCG AGC AGC T 5'
EcoRI Sall 91883 20 o o o o EH <
o O O O
o O O « Eh CM O O Eh « « Eh « Eh o o O <1-1 m o o o Eh < m
Eh < Eh « Ό oo o O
o o o o o o
< E-ι M
£> O O O O
Eh < O O « Eh
< EH M Eh < O O
Eh « O Φ oo moo moo min
O O O Eh « O O
(Il h < Eh O O O O
M ~ -— æ o o „ ▲
Eh < O O O O < k· E
C Eh O < Eh OOO O
^T<Eh ^ C— Eh < rø « Ψ _ « Eh * _ . r_, O O O Eh « Eh
< < Eh .· Eh « O
O O ” O O O O
M - Λ .
\r Eh X) ^ .
_ ^ O X Eh< O O Eh < j. O O < Eh Eh «
7 ψ O o « Eh O O
Ω3 - H m ^ 7- æ
Eh < Eh « O O
O O O O EH < 2 O Eh < O Eh < O <C Eh ΓΊ m vo Ό cn g . : sn » s s · gr Φ Ό -H O O O O M Eh < £> -H 1(¾ · i < ^ -P cn T3 0) 0 0 “ % ^ S Eh < «Eh « Eh < Λ 0 I ^ g < g ^ g S O O -Ή «Eh O O «ΕΗ
.. Q 23 tf W
DNA-sekvenssi IIB (HIR-II) 21 91883 5 4-II a--
Nukleotidi nro 100 110
Kood. saie 5' GA TCC GAC GGT GAA AAG
Ei-kood. siiie 3’ BamHI G CTG CCA CTT TTC
4-II b- io -Z1 a-p 4-n c- 120 130 mo
AAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCG
TTG GTC ACG CAA TGA CCG CTT CCA TGG GGC
-II b-► 4-II d-:- 15 -il c-► ◄-Ile- 150 160 170
AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC
TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG
-II d-► 4-II f- 2° -II e-► 4-II g- 180 190 200
GAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAA
CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT
-II f-ft. 4--Uh-- ‘25 -II g-* 210 TAG AGC TCG Sal I 3’ ATC TCG AGC AGC T 5’ -II h->
Claims (8)
1. Menetelma hirudiinin vaikutusta omaavan poly-peptidin valmistamiseksi, jolla on yleinen kaava I 5 5 10 (X) ^-X'-C-Tyr-D-Asp-Cys-E-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-15 20 25 -Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-30 35 40
10 -Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-F-G-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu- 45 50 55 -Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-60 65 -H-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-(Z) n-0H 15 (I) jossa m = 0 - 50, n = 0 - 100 ja X ja X1 ovat geneettisesti koodittavien aminohappojen sa-20 moja tai erilaisia jaannoksia, C on Thr, Val, Ile, Leu tai Phe, D on Thr, E on Thr, F on Gly, 25. on Glu, H on Glu, ja Z on geneettisesti koodittavien aminohappojen samoja tai erilaisia jaannoksia, lukuunottamatta polypeptideja, joissa 30 a) X1 ja C kumpikin on Val, tai b) X1 on Ile ja C on Thr, tai c) N-terminaaliset aminohapot asemaan 10 saakka puuttuvat, tunnettu siita, ettå ekspressioplasmidiin liitetåån geeni, joka koodittaa kaavan I mukaista poly- 35 peptidia, jolloin yksi tai useampi muista aminohapoista 91883 jaa pois tai voidaan korvata toisella (toisilla) geneet-tisesti koodittavalla (koodittavilla) aminohapo(i)11a.
2. AAC CAG TGC GTT ACT GGC G AA GGT ACC CCG TTG GTC ACG C AA TGA CCG CTT CCA TGG GGC 150 160 170 AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC - 2 5 TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG 180 190 200 G AA GAG ATC CCT GAG G AA TAC CTT CAG TAA CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG G AA GTC ATT 30 210 TAG AGC TCG 3' ATC TCG AGC AGC T 5' , 91B83 IIA nukleotidin numero 10 20 koodaava såie 5' CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC 5 ei-koodaava saie 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG 30 40 50 ACT GAA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG 10 60 70 80 GAA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC CTT CCT AGA TTG C AA ACG CCG GTC CCA TTG 15 90 AAA TGC ATC CTT G 3' TTT ACG TAG GAA CCT AG 5' ja IIB 20 nukleotidin numero 100 110 koodaava saie 5' GA TCC GAC GGT GAA AAG ei-koodaava saie 2' G CTG CCA CTT TTC 25 120 130 140 AAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCG TTG GTC ACG C AA TGA CCG CTT CCA TGG GGC 150 160 170
30 AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG 180 190 200 GAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAA
35 CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT li 210
91 S83 TAG AGC TCG 3’ ATC TCG AGC AGC T 5' .
2. TTG GTC ACG C AA TGA CCG CTT CCA TGG GGC 150 160 170 AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG 30 180 190 200 G AA GAG ATC CCT GAG G AA TAC CTT CAG TAA CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG G AA GTC ATT 35 210 TAG AGC T 3' ATC 5', 91 883 IC nukleotidin numero 1 10 20 koodaava saie 5' AA TTC ATG ACG TAT ACT GAC TGC 5 ei-koodaava saie 3' G TAC TGC ATA TGA CTG ACG 30 40 50 ACT G AA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG 10 60 70 80 G AA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC CTT CCT AGA TTG C AA ACG CCG GTC CCA TTG 15 90 100 110 AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT G AA AAG TTT ACG TAG G AA CCT AGG CTG CCA CTT TTC 120 130 140
2. AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT G AA AAG TTT ACG TAG G AA CCT AGG CTG CCA CTT TTC 120 130 140 AAC CAG TGC GTT ACT GGC G AA GGT ACC CCG
2. G AA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC CTT CCT AGA TTG C AA ACG CCG GTC CCA TTG 90 100 110 AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT G AA AAG • 25 TTT ACG TAG G AA CCT AGG CTG CCA CTT TTC 120 130 140 AAC CAG TGC GTT ACT GGC G AA GGT ACC CCG TTG GTC ACG C AA TGA CCG CTT CCA TGG GGC 30 150 160 170 AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG 35 180 190 200 G AA GAG ATC CCT GAG G AA TAC CTT CAG TAA CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG G AA GTC ATT 91883 210 TAG AG C T 3' TAC 5' ;
2. TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG 60 70 80 G AA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC CTT CCT AGA TTG C AA ACG CCG GTC CCA TTG 25 90 100 110 AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT G AA AAG TTT ACG TAG G AA CCT AGG CTG CCA CTT TTC ,, 30 120 130 140 AAC CAG TGC GTT ACT GGC G AA GGT ACC CCG TTG GTC ACG C AA TGA CCG CTT CCA TGG GGC 150 160 170
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå kaytetaan geeniå, jonka ei- 5 koodittava såie hybridisoituu kaavan I mukaista polypep-tidia koodittavan geenin koodittavan såikeen kanssa.
3. AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG (i
91 S 8 3 180 190 200 G AA GAG ATC CCT GAG G AA TAC CTT CAG TAA CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATC G AA GTC ATT 5 210 TAG AGC TCG 3' ATC TCG AGC AGC T 5' , IA 10 nukleotidin numero 1 10 20 koodaava saie 5' CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC ei-koodaava saie 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG 15 30 40 50 ACT G AA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG 60 70 80
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelma, tunnettu siitå, ettå geeni syntetisoidaan kemial-lisesti, edullisesti fosfiittimenetelmån mukaan, tai ent- 10 symaattisesti mRNA:n kautta.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelma, tunnettu siitå, ettå geeni sisåltåå kar-boksipåån aminohapon kodoniin liittyneinå kaksi lopetusko-donia.
5 IB nukleotidin numero 1 10 20 koodaava saie 5' CT AGA CGT ACG TAT ACT GAC TGC ei-koodaava saie 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG 10 30 40 50 ACT G AA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG 15 60 70 80 G AA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC CTT CCT AGA TTG C AA ACG CCG GTC CCA TTG 90 100 110
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me- netelmå, tunnettu siitå, ettå geeni vastaa DNA-sekvenssiå I: nukleotidin numero 1 10 20 2. koodaava såie 5' CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC ei-koodaava såie 3' T TAC TGC ATA TGA CTG ACG 30 40 50 ACT G AA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC • 25 TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG 60 70 80 G AA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC CTT CCT AGA TTG C AA ACG CCG GTC CCA TTG 30 90 100 110 AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT G AA AAG TTT ACG TAG G AA CCT AGG CTG CCA CTT TTC 35 120 130 140 AAC CAG TGC GTT ACT GGC G AA GGT ACC CCG TTG GTC ACG C AA TGA CCG CTT CCA TGG GGC 91883 150 160 170 AAA C CG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG 5 180 190 200 G AA GAG ATC CCT GAG G AA TAC CTT CAG TAA CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG G AA GTC ATT 210
10 TAG AGC TCG 3' ATC TCG AGC AGC T 57 .
6. DNA-sekvenssit I nukleotidin numero 1 10 20 15 koodaava saie 57 CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC ei-koodaava saie 37 T TAC TGC ATA TGA CTG ACG 30 40 50 ACT G AA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC
7. Fuusiopeptidi, tunnettu siita, etta se slsaitaa patenttivaatimuksen 1 mukaisen polypeptidln ja bakteeriosan, joka sisaitaa β-galaktosidaasin aminohap-posekvenssin kokonaan tai osittain.
8. Hybridiplasmidi, jolla transformoidaan baktee-10 risoluja, tunnettu siita, etta se sisaitaa DNA-sekvenssin, joka koodittaa kaavan I mukaista polypepti-dia. 91883
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843429430 DE3429430A1 (de) | 1984-08-10 | 1984-08-10 | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3429430 | 1984-08-10 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI853056A0 FI853056A0 (fi) | 1985-08-08 |
| FI853056L FI853056L (fi) | 1986-02-11 |
| FI91883B FI91883B (fi) | 1994-05-13 |
| FI91883C true FI91883C (fi) | 1994-08-25 |
Family
ID=6242746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI853056A FI91883C (fi) | 1984-08-10 | 1985-08-08 | Menetelmä hirudiinin vaikutusta omaavan polypeptidin valmistamiseksi |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0171024B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0811073B2 (fi) |
| KR (1) | KR930009337B1 (fi) |
| AT (1) | ATE67245T1 (fi) |
| AU (1) | AU584628B2 (fi) |
| CA (1) | CA1341124C (fi) |
| DE (2) | DE3429430A1 (fi) |
| DK (1) | DK175337B1 (fi) |
| ES (1) | ES8605040A1 (fi) |
| FI (1) | FI91883C (fi) |
| GR (1) | GR851962B (fi) |
| HU (1) | HU206135B (fi) |
| IE (1) | IE58485B1 (fi) |
| IL (1) | IL76059A (fi) |
| NO (1) | NO177434C (fi) |
| NZ (1) | NZ213049A (fi) |
| PT (1) | PT80930B (fi) |
| ZA (1) | ZA856026B (fi) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| EP0209061B1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-01-12 | Hoechst Aktiengesellschaft | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-01-22 | Ciba Geigy Ag | Thrombin inhibitors |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| GB2188322A (en) * | 1986-03-26 | 1987-09-30 | Bayer Ag | Aprotinin and analogues thereof produced by a recombinant host |
| GB2188933A (en) * | 1986-04-10 | 1987-10-14 | Bayer Ag | Expression vectors for production of polypeptides, method for enhanced expression of polypeptides, hosts containing the expression vectors, products manufactured thereby |
| FR2607516B2 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-12-22 | Transgene Sa | Vecteurs perfectionnes d'expression d'un variant de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| FR2607517B2 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-12-22 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| GB2199582A (en) * | 1987-01-07 | 1988-07-13 | Bayer Ag | Analogues of pancreatic secretory trypsin inhibitor |
| US5032573A (en) * | 1987-03-23 | 1991-07-16 | Bayer Aktiengesellschaft | Homologs of aprotinin produced from a recombinant host, process, expression vector and recombinant host therefor and pharmaceutical use thereof |
| US5192745A (en) * | 1987-05-21 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
| US5236898A (en) * | 1987-05-21 | 1993-08-17 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
| GB8723662D0 (en) * | 1987-10-08 | 1987-11-11 | British Bio Technology | Synthetic gene |
| GB8723661D0 (en) * | 1987-10-08 | 1987-11-11 | British Bio Technology | Synthetic gene |
| US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| FR2628429B1 (fr) * | 1988-03-08 | 1990-12-28 | Transgene Sa | Variants de l'hirudine, leurs utilisations et les procedes pour les obtenir |
| DE3819079A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
| US5167960A (en) * | 1988-08-03 | 1992-12-01 | New England Deaconess Hospital Corporation | Hirudin-coated biocompatible substance |
| US5112615A (en) * | 1988-08-03 | 1992-05-12 | New England Deaconess Hospital Corporation | Soluble hirudin conjugates |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| US5192747A (en) * | 1989-10-03 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| GB9010552D0 (en) * | 1990-05-10 | 1990-07-04 | Erba Carlo Spa | Method for the recombinant production of hirudins and novel hirudins |
| US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| US5972648A (en) * | 1993-09-28 | 1999-10-26 | Japan Energy Corporation | Hirudin analogs, methods of manufacture thereof and anticoagulant compositions having these as active ingredients |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| DE19529997C1 (de) | 1995-08-16 | 1997-04-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen |
| DE19543737A1 (de) * | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
| DE19544233A1 (de) | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur Nutzung des Hefe-ADH II-Promotorsystems zur biotechnologischen Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten |
| DE19607239A1 (de) | 1996-02-27 | 1997-08-28 | Behringwerke Ag | Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Hirudin und Verfahren zu deren Herstellung |
| DE19944870A1 (de) * | 1999-09-18 | 2001-03-29 | Aventis Pharma Gmbh | Signalsequenzen zur Herstellung von Leu-Hirudin über Sekretion durch E. coli in das Kulturmedium |
| DE10149678A1 (de) | 2001-10-09 | 2009-03-12 | Novel Science International Gmbh | Organische Verbindungen mit biologischer Wirkung als Thrombinhemmer und ihre Verwendung |
| DE10301255A1 (de) | 2003-01-15 | 2004-07-29 | Cpi Creative Pharma International Gmbh | Organische Verbindungen mit biologischer Wirkung als Thrombinhemmer und ihre Verwendung |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE53166B1 (en) * | 1980-08-05 | 1988-08-03 | Searle & Co | Synthetic urogastrone gene,corresponding plasmid recombinants,transformed cells,production thereof and urogastrone expression |
| DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
| CA1341414C (fr) * | 1984-03-27 | 2002-12-31 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
-
1984
- 1984-08-10 DE DE19843429430 patent/DE3429430A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-07-09 IL IL76059A patent/IL76059A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-07-30 EP EP85109567A patent/EP0171024B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-30 DE DE8585109567T patent/DE3584053D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-30 AT AT85109567T patent/ATE67245T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-05 HU HU852980A patent/HU206135B/hu unknown
- 1985-08-08 NZ NZ213049A patent/NZ213049A/en unknown
- 1985-08-08 ES ES545994A patent/ES8605040A1/es not_active Expired
- 1985-08-08 FI FI853056A patent/FI91883C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-08-09 DK DK198503645A patent/DK175337B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-08-09 NO NO853155A patent/NO177434C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-08-09 PT PT80930A patent/PT80930B/pt unknown
- 1985-08-09 AU AU45977/85A patent/AU584628B2/en not_active Expired
- 1985-08-09 IE IE197385A patent/IE58485B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-08-09 ZA ZA856026A patent/ZA856026B/xx unknown
- 1985-08-09 JP JP60174404A patent/JPH0811073B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-09 GR GR851962A patent/GR851962B/el unknown
- 1985-08-09 CA CA000488468A patent/CA1341124C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-10 KR KR1019850005776A patent/KR930009337B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT80930B (pt) | 1987-11-11 |
| FI91883B (fi) | 1994-05-13 |
| CA1341124C (en) | 2000-10-24 |
| IE58485B1 (en) | 1993-09-22 |
| DE3584053D1 (de) | 1991-10-17 |
| EP0171024A1 (de) | 1986-02-12 |
| NO177434B (no) | 1995-06-06 |
| AU584628B2 (en) | 1989-06-01 |
| EP0171024B1 (de) | 1991-09-11 |
| NZ213049A (en) | 1988-05-30 |
| KR930009337B1 (ko) | 1993-09-27 |
| ES545994A0 (es) | 1986-02-16 |
| NO853155L (no) | 1986-02-11 |
| ES8605040A1 (es) | 1986-02-16 |
| AU4597785A (en) | 1986-02-13 |
| ZA856026B (en) | 1986-03-26 |
| FI853056L (fi) | 1986-02-11 |
| DK364585A (da) | 1986-02-11 |
| KR870002257A (ko) | 1987-03-30 |
| PT80930A (de) | 1985-09-01 |
| HU206135B (en) | 1992-08-28 |
| JPH0811073B2 (ja) | 1996-02-07 |
| GR851962B (fi) | 1985-12-03 |
| IL76059A0 (en) | 1985-12-31 |
| HUT38968A (en) | 1986-07-28 |
| FI853056A0 (fi) | 1985-08-08 |
| ATE67245T1 (de) | 1991-09-15 |
| IL76059A (en) | 1993-08-18 |
| JPS6147198A (ja) | 1986-03-07 |
| DE3429430A1 (de) | 1986-02-20 |
| NO177434C (no) | 1995-09-13 |
| IE851973L (en) | 1986-02-10 |
| DK175337B1 (da) | 2004-08-30 |
| DK364585D0 (da) | 1985-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI91883C (fi) | Menetelmä hirudiinin vaikutusta omaavan polypeptidin valmistamiseksi | |
| EP0046039B2 (en) | Synthetic urogastrone gene, corresponding plasmid recombinants, transformed cells, production thereof and urogastrone expression | |
| EP0163406B1 (en) | Novel polypeptide expression method | |
| KR950000299B1 (ko) | 융합 단백질의 제조방법 | |
| EP0155655B1 (en) | Process for production of insulin-like growth factor i | |
| IL95495A (en) | Fusion proteins their preparation and use | |
| EP0130166A1 (en) | A recombinant plasmid, a transformant microorganism, a polydeoxy-ribonucleotide segment, a process for producing a biologically active protein, and the protein thus produced | |
| JPH06153957A (ja) | ヒトγ−インターフェロンの部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列 | |
| EP0158892A2 (en) | 59 Valine insulin-like growth factor I and process for production thereof | |
| DK166681B1 (da) | Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2 | |
| JP3531947B2 (ja) | ペプチドの製造方法 | |
| DK171940B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider meden C-terminal carboxamidgruppe, polypeptider til anvendelse ved fremgangsmåden, fusionsproteiner deraf og dertil egnede DNA-sekvenser, plasmider og værtsorganismer | |
| JPH0690759A (ja) | 新規ペプチド | |
| US4711847A (en) | Preparation of secretin | |
| EP0153961B1 (en) | Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-iii and analogs thereof | |
| HU197939B (en) | Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor | |
| AU592062B2 (en) | Synthetic regulation region | |
| IE852440L (en) | Signal for protein transport | |
| IE57976B1 (en) | Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives | |
| JPH06335393A (ja) | フラビン還元酵素遺伝子 | |
| AU656791B2 (en) | Process for producing peptide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| MA | Patent expired |