KR950000299B1

KR950000299B1 - 융합 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR950000299B1
Application number: KR1019860006142A
Authority: KR
Inventors: 하버맨 폴; 스텐겔린 시에그프레드; 벤겐마이어 프레드리히
Original assignee: 훽스트 아크티엔게젤샤프트; 베른하르트 벡크, 하인리히 벡커
Priority date: 1985-07-27
Filing date: 1986-07-26
Publication date: 1995-01-13
Also published as: ES2000278A6; IE861977L; GR861957B; FI863041A; FI86887C; FI86887B; NO175640C; NZ216967A; PT83065A; JPH07113040B2; DK355486D0; KR870001312A; NO863000L; NO175640B; EP0211299A2; HU197356B; PT83065B; EP0211299B1; NO863000D0; AU595221B2

Abstract

내용 없음.

Description

융합 단백질의 제조방법

제 1 도는 플라스미드 pH 120/14의 작제도이고,

제 2 도는 플라스미드 pH 106/4의 작제도이며,

제 3 도는 플라스미드 pH 154/25의 작제도이고,

제 4 도는 플라스미드 pH 255의 작제도이며,

제 5 도는 플라스미드 pH 257의 작제도이고,

제 6 도는 플라스미드 pJ 120의 작제도이며,

제 7 도는 플라스미드 pK150의 작제도이고,

제 8 도는 플라스미드 pK160의 작제도이며,

제 9 도는 플라스미드 pK170의 작제도이고,

제 10 도는 플라스미드 pK180의 작제도이며,

제 11 도는 플라스미드 pH155/25의 작제도이고,

제 12 도는 플라스미드 pInt13의 작제도이다.

본 발명의 융합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

유전공학 기법에 의해 분자량 약 15000달톤이하의 비교적 작은 진핵세포 단백질 제조시 세균에서 수득되는 수율은 매우 소량이다. 형성된 단백질은 숙주에게 도유한 프로테아제에 의해 신속히 분해되는 것으로 예상된다. 이러한 이유로, 이런 형태의 단백질은, 특히 숙주에게 고유한 단백질 일부를 갖는 융합 단백질로서 유리하게 제조하는데, 이는 후에 절단해 낸다.

이 . 콜라이(E.coli)의 trp 오페론으로부터의 D-단백질의 단지 약 70개의 아미노산으로 구성된 절편, 특히 이후 " D'-펩티드"라 칭할 아미노산 23 내지 93의 서열 영역[참조 : C. Yanofsky et al., Nucleic Acuids Res.9(1981) 6649]이 융합 단백질 제조시 아주 적합하다는 것이 밝혀졌다. 이 펩티드의 카복실 종결 말단과 목적하는 진핵세포 단백질의 아미노산 서열의 카복실 말단 사이에는 목적하는 단백질을 화학적으로 또는 효소학적으로 절단해낼 수 있는 유전적으로 암호화될 수 있는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 서열이 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 아미노 종결 말단 뒤에는 Lys-Ala로 이루어진, 임의로 1 내지 10개, 특히 1 내지 3개의 짧은 아미노산 서열, 기타 유전적으로 암호화될 수 있는 바람직하게는 2개의 아미노산, 특히 Lys-Gly이 오게된다.

따라서 본 발명은 하기 서열식의 융합 단백질에 관한 것이다.

Met-Xn-D'-Y-Z

상기식에서, n은 0 또는 1이고, X는 유전적으로 암호화될 수 있는 1 내지 12개의 아미노산 서열, 바람직하게는 Lys-Ala이며, D'은 이. 콜라이의 trp오페론중 D-펩티드의 아미노산 23 내지 93서열 영역에 있는 약 70개의 아미노산의 서열이고, Y는 이어지는 아미노산 서열 Z를 절단시킬 수 있게 하는 유전적으로 암호화할 수 있는 하나 이상의 아미노산 서열을 나타내며, Z는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 서열이다.

본 발명의 추가의 양상 및 바람직한 태양을 이후 기술하며 특허청구의 범위에 정의한다.

물론, 융합 단백질의 비목적 부분(숙주에게 고유한)이 가능한한 작으면 세포는 아주 적은 "밸러스트(ballast)"를 제공하기 때문에 목적하는 단백질의 수율이 높아지는 잇점이 있다. 또한, 비목적 부분이 절단되면 보다 소량의 생성되어 용이하게 후처리된다. 이에 대립되는 요소는 추정되기를 비목적 부분의 "보호작용"이 단지 특정 크기 이상에서만 예상된다는 것이다. 놀랍게도, D-단백질로부터 본 발명에 따라 선택된 단편이 비록 약 70개의 아미노산을 함유하난 이 과제를 충족시킨다는 것이 현재 판명되었다.

여러 경우, 특히 X가 Lys-Ala를 나타내거나 N-종결 말단에 이 서열을 함유하는 바람직한 태양에서 형성된 융합 단백질을 불용성이다. 불용성인 융합 단백질은 가용성 단백질로부터 쉽게 분리할 수 있으며, 아주 용이하게 후처리해서 수율을 증가시킨다. 단지 약 70개의 아미노산으로된 세균성 부분이 매우 작고, 숙주 세포증의 용액에 존재하는 단백질의 성분이라는 면에서 볼때 불용성 융합 단백질의 형성은 놀라운 일이다.

"D'-팹티드의 아미노산 23 내지 93서열 영역중의 약 70개의 아미노산"이란, 그 자체가 공지된 방법으로 변이를 수행할 수 있다는 것, 즉 본 발명에 따른 융합 단백질의 특성을 크게 변화시키지 않고 각각의 아미노산을 결실, 대체 또는 교체할 수 있음을 의미한다. 본 발명은 마찬가지로 이런 형태의 변이물에 관한 것이다.

목적하는 진핵 세포의 단백질을 바람직하게는 히루딘과 같은 생물학적 활성 단백질이거나, 사람 프로인슐린과 같은 단백질의 전구물질이다.

융합 단백질은 적합한 시스템에서 발현시켜 수득하며, 특히 바람직한 태양에서는 숙주 세포의 파괴이후 그의 미진한 용해성으로 인해 농축되어 있는 침전물로부터 분리한다. 따라서, 세포의 가용성 성분으로부터 분리하기가 쉽다.

적합한 숙주 세포는 공지된 발현 시스템 모두, 즉 포유류 세포 및 미생물, 바람직하게는 세균, 특히 이.콜라이며, 결국 융학 단백질의 세균성 부분을 숙주 이.콜라이에 고유한 단백질이다.

본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 DNA서열은 선택된 변화 시스템에서 만족스럽게 발현되는 벡터에 공지된 방법으로 삽입된다.

세균 숙주에서, 예를 들면, 독일연방공화국 공개특허 공보 제3,430,683호(유럽 특허원 제0,173,149호)에 기술된 바와 같이 Lac, Tac, 파지 λ의 P_L또는 P_R, hsp, omp또는 합성 프로모터로 이루어진 그룹중에서 프로모터 및 오퍼레이트를 선택하는 것이 편리하다.

특히 적합한 벡터는 이.콜라이의 trp 오페론의 다음 요소를 함유하는 것이다 : 프로모터, 오퍼레이터 및 L-펩티드의 리보솜 결합부위. 이 L-펩티드의 첫 번째 3개의 아미노산이 암호화 영역을 따르고, 이어서 짧은 아미노산 서열 및 trp오페론중 D-단백질의 아미노산 23 내지 93이 이어지는 것이 특히 유리하다.

목적하는 폴리펩티드를 절단할 수 있게하는 중간 서열 Y는 이 목적 펩티드의 조성에 따라 좌우된다 : 예를 들면, 목적 펩티드가 메티오닌을 함유하지 않을 경우, Y는 Met를 나타낼 수 있으며, 시아노겐브로마이드로 화학적 절단을 수행한다. 연결부 Y에서 카복실 종결 말단에 시스테인이 있는 경우, 또는 Y가 Cys를 나타내는 경우, 예를 들면, 특이적 S-시아닐활(S-Cyanylation)후 시스테인-특이적 효소적 절단 또는 또는 화학적 절단을 수행할 수 있다. 연결부 Y의 카복실 종결 말단에 트립토판이 있는 겨우, 또는 Y가 Trp를 나타내는 경우, N-브로모석신이미드로 화학적 절단을 수행할 수 있다. Y가 Asp-Pro를 나타내는 경우, 단백질 분해 절단은 그 자체가 공지된 방법으로 수행할 수 있다. [참조 : D. Piszkiewicz et al., Biochemical and Biophysical Research Communications40(1970) 1173-1178]. Y가 (Asp)m-Pro또는 Glu-(Asp)m-Pro(여기서, m은 1, 2 또는 3을 나타낸다)인 경우, 이미 밝혀진 바와 같이 Asp-Pro결합은 산에 더욱 불안정해진다. 이런 경우에 수득한 절단 생성물은 N-종결 말단이 Pro로 시작하고 C-종결말단이 Asp로 끝난다.

효소적 절단의 실례가 역시 공지되어 있어 증진된 특이성을 갖는 변형된 효소를 사용할 수 있다. [참조 : C. S. Craik et al., Science 228(1985)291-297]. 목적하는 진핵세포 펩티드가 사람 프로인슐린인 경우, 트립신에 의해 절단될 수 있는 아미노산(Arg, Lys)이 프로인슐린의 N-종결 아미노산(Phe)에 결합되어 있는 아미노산 서열, 예를 들면, Ala-Ser-Met-Thr-Arg을 서열 Y로 선택하고, 이어서 아르기닌-특이적 절단의 프로테아제 트립신으로 수행할 수 있다. 목적하는 단백질이 아미노산 서열 ile-Glu-Gly-Arg을 함유하지 않은 경우, 인자 Xa로 절단할 수도 있다(유럽 특허원 제 0,161,937호).

서열 Y의 고안에서 합성 상황을 고려하고 제한 효소를 위한 적합한 절단 부위를 삽입시킬 수 있다. 따라서, 아미노산 서열 Y에 상응하는 DNA서열은 링커(linker) 또는 어답터(adapter)의 작용을 추정할 수 있다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 이.콜라이의 trp오페론의 통제하에 유리하게 발현된다. trp오페론의 프로모터 및 오퍼레이터를 함유하는 DNA절편은 현재 시판된다. trp오페론 통제하에 단백질 발현은 수차례 기술된 바 있으며, 예를 들면, 유럽 특허원 제0,036,776호가 있다. trp오페론의 유도는 배지중 L-트립토판의 부재 및/또는 인돌릴-3-아크릴산의 존재에 의해 수행할 수 있다.

trp오퍼레이터으 통제하에서, 우선 L-펩티드를 암호화하는 DNA영역의 전사가 일어나다. 14개의 아미노산으로 구성된 이 L-펩티드는 위치 10과 11에 각각 L-트립토판을 함유한다. L-펩티드의 단백질 합성속도는 하부 구조 유전자가 마찬가지로 해독되는지 또는 단백질 합성이 종결되는지의 여부를 결정한다. L-트립토판이 결핍되면 L-트립포판에 대한 tRNA의 낮은 농도의 결과로 L-펩티드의 합성이 느려지고, 뒤따르는 단백질이 합성된다. 반면에 L-트립토판의 농도가 높아지면, mRNA의 상응하는 단편이 신속히 판독되고, mRNA는 터미네이터(terminator) 유사 구조로 추정되기 때문에 단백질 생합성이 종결된다[참조 : C. Yanofsky et al., 상기 인용].

mRNA의 해독은 개시 코돈 주변에 있는 뉴클레오티드의 특성에 의해 크게 영항을 받는다. 따라서, trp오페론의 도움에 의한 융합 단백질의 발현시 융합 단백질의 구조유전자의 개시를 위해 L-펩티드의 첫 번째 수개의 아미노산에 대한 뉴클레오티드를 삽입하는 것이 바람직한 것으로 보인다. trp시프템을 사용하는 본 발명의 바람직한 태양에서는, L-펩티드의 첫 번째 3개의 아미노산(이하, L'-펩티드라 칭함)의 뉴클레오티드를 융합 단백질의N-말단 아미노산을 위한 코돈으로서 선택하였다.

따라서, 본 발명은 또한 융합 단백질의 발현용 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 관한 것으로, 벡터 DNA는 5'-말단으로부터 다음의 특성을 갖는다(적합한 순서와 간격으로) : 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위 및 융합 단백질의 구조 유전자, 후자는 목적 단백질 서열의 상부에 아미노산 서열 I(별첨)을 함유한다. 구조 유전자의 상부에, 또는 구조 유전자의 첫 번째 삼중자(triplet)로서 개시 코돈(ATG) 및 임의로 개시 코돈과 D'-서열 사이 또는 D'-서열과 목적 단백질의 유전자 사이에 배열된 기타 아미노산에 대한 코돈이 위치한다. 구조 유전자의 상부의 DNA서열의 선택은 목적 단백질의 아미노산 조성에 따라 변경하여 목적 단백질을 융합 단백질로부터 절단해 낼 수 있게 한다.

본 발명에 따른 융합 단백질의 발현시 ATG개시 코돈의 하부의 첫 번째 몇몇 아미노산 각각의 삼중자를 변형시켜 mRNA층에서의 염기-짝지움을 방지하는 것이 유익하다. 이런 형태의 변형이 바로 당해 분야 숙련가에게 친숙한, D'-단백질 각각의 아미노산의 변형, 결실 또는 첨가하며, 본 발명은 마찬가지로 이들에 관한 것이다.

비교적 작은 플라스미드가 여러 가지 장점을 제공하기 때문에, 본 발명의 바람직한 태양은 pBR 322로부터 유도한 플라스미드로부터 테트라사이클린 내성 구조 유전자의 DNA단편을 제거함을 포함한다. 위치 29의 HindIII제한 부위로부터 위치 2066의 PvuII제한 부위까지 절편을 결실시키는 것이 유리하다. 본 발명에 따라 trp오페론(비필수부에 위치)의 개시부(판독 방향으로)에 PvuII제한 부위를 사용함으로써, 플라스미드로부터 다소 큰 DNA단편을 결실시키는 것이 특히 유리하다. 따라서, 두개의 PvuII제한 부위가 잇는 생성된 큰 단편을 직접 연결시킬 수 있다. 약 2Kbp가 단축된 생성된 플라스미드는 발현을 증가시키는 효과가 있으며, 속주 세포에서 복제수의 증가를 유도할 수 있다.

본 발명을 하기 실시예로 상세히 설명한다.

[실시예 1]

a) 염색체성 이.콜라이 DNA를 Hind I 으로 절단하고, 프로모터, 오퍼레이터, L-펩티드의 구조 유전자, 어테뉴에이터(attenuator)및 trp-E구조 유전자의 첫 번째 여섯 개의 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 492bp단편을 trp오페론으로부터 분리한다. 이 단편을 클레나우 폴리머라제를 사용하여 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트로 채우고, 양 말단에 HindIII인식 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 연결시키며, HindIII로 절단한다. 수득한 HindIII단편을 pBR 322의 HindIII절단 부위에 결합시킨다. 이 결과 플라스미드 prtpE 2-1이 제조된다[참조 : J.C.Edman et al., Nature 291(1981) 503-506]. 이것을 기술하는 바와 같이 플라스미드 ptrpL1로 전환한다.

2본쇄 올리고뉴클레오티드(N3)와 하이브리드화(hybridize)하는 함성 올리고뉴클레오티드(N1) 및 (N2)를 사용하여, L-펩티드의 첫 번째 3개의 아미노산의 DNA서열을 플라스미드 ptrpL1(제 1 도) 의 Cla I 부위에 결합시키고, 그밖의 DNA삽입을 위한 제한 부위(Stu I)를 형성시킨다 :

5' CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3' (N1)

5' CCT TTG CTT TCA TTG T 3' (N2)

5' CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3'

3' A GTT ACT TTC GTT TCC 5'

플라스미드 ptrpL1을 제조자의 지시에 따라 효소 Cla I과 반응시키고, 혼합물을 페놀로 추출하며, DNA를 에탄올로 침전시킨다. 개방된 플라스미드를 이.콜라이로부터의 알칼리성 포스파타제와 반응시켜 5'-말단의 포스페이트 그룸을 제거한다. 합성 뉴클레오티드를 5'-말단에서 포스포릴화하고, 포스파타제로 처리한 개방된 플라스미드 T₄DNA리가제를 사용하여 삽입한다. 리가제 반응이 완료된 후, 이.콜라이 294로 형질 전환시키며, Amp 내성 및 Stu I제한 부의 존재로 형질전화체를 선별한다.

생성된 클론의 약 80%가 예정된 제한 부위를 갖고 있다 : 제 1 도에서 도시한 뉴클레오티드 서열은 서열 분석에 의해 확인된 것이다. L-펩티드의 리보솜 결합 부위의 하부에 L-펩티드의 첫 번째 3개의 아미노산 (L'-펩티드)에 대한 뉴클레오티드 삼중자를 함유하고, 그 밖의 DNA삽입을 혀용하는 Stu I 부위가 이어져서 L-펩티드의 첫번째 3개의 아미노산을 갖는 융합 단백질의 형성을 가능케하는 플라스미드 pH 120/4 가 수득된다.

b) 상기 사용한 올리고뉴클레오티드(N1)의 실례를 하기에 사용하여 이러한 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성을 예증한다.

문헌 [참조 : M. J. Gait et al., Nucleic Acids Research 8(1980) 1081-1096]의 방법을 사용하여 3'-말단의 뉴클레오시드, 즉 당해 경우에 있어서 구아노신을 3'-하이드록실 그룹을 통해 유리 비드 지지체[피어스 (Pierce) 에 의해 공급되는 CPG(controlled pore glass)LCAA(장쇄알킬아민)]에 공유 결합시킨다. 이는 구아노신이 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 및 4-디메톡시트리틸 에테르로서 변형된 지지체와 반응하고, 석시닐 라디칼의 유리 카복실 그룹에 의한 지지체상의 장쇄 아민의 아미노 라디칼의 아실화를 수반한다.

합성의 다음 단게에서, 염기 성분은 5'-O-디메톡시트리틸뉴클레오시드-3罕-인산의 모노-메틸 에스테르의 클로라이드 또는 디알킬아미드로 사용되고, 아데닌은 N6-벤조일 화합물의 형태가 되며, 시톤신은 N4-벤조일 화합물의 형태가 되고, 구아닌은 N2-이소부티릴 화합물의 형태가 되며, 아미노 그룹을 함유하지 않는 티민은 보호 그룹이 없다.

결합 구아노신 1㎛ol함유하는 지지체 40㎎을 하기 시약으로 연속 처리한다.

a) 메틸렌 클로라이드, b) 메틸렌 클로라이드중의 10%트리클로로아세트산, c) 메탄올, d) 테트라하이드로푸란, e) 아세토니트릴, f) 무수 아세토니트릴 0.3㎖중의 적합한 뉴클레오시드 포스파이트 15㎛ol 및 테트라졸 70㎛ol(5분), g) 40%루티딘(lutidine) 및 10%디메틸아미노피리딘을 함유하는 테트라하이드로푸란중의 20%아세트산 무수물(2분), h) 테트라하디르로푸탄, I) 20%물 및 40%루티딘을 함유하는 테트라하이드로푸란, j) 5: 4: 1용적비인 콜리딘(collidine)/물/테트라하이드로푸란중의 3%요오드, k) 테트라하이드로푸란 및 l) 메탄올.

본 명세서중의 용어 "포스파이트"는 데옥시리보스-3'-인산의 모노메틸 에스테르로서 정의되며, 제 3 원자가는 염소 또는 3급 아미노 그룹, 예를 들면, 디이소프로필아미노 라디칼에 의해 포화된다. 합성에서 각각의 단계로부터의 수율은 매 트리틸 분해 반응(detritylation reaction) 이후 b) 분광 측정법으로 파장 496nm에서 디메톡시트릴틸의 흡광도를 측정함으로써 측정할 수 있다.

일단 올리고뉴클레오티드의 합성이 완료되면, 올리고머 상의 메틸 포스페이트 보호그룹을 p-티오크레졸 및 트리에틸아민을 사용하여 절단한다.

이어서, 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 암모니아로 3시간 동안 처리하여 떼어낸다. 올리고머를 농축 암모니아로 2 내지 3일동안 처리하면 염기상의 아미노 보호그룹을 상당히 절단해 낼 수 있다. 수득한 조 생성물을 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 정제한다.

기타 올리고뉴클레오티드를 또한 전적으로 상응하게 합성한다.

c) 플라스키드 prtpE 5-1[참조 : R. A. Hallewell et al., Gene 9(1980) 27-47]을 제조자의 지시에 따라 제한효소 HindIII 및 Sal I과 반응시키고, 약 620pb의 DNA단편을 떼어낸다. 합성 올리고뉴클레오티드 (N4) 및 (N5)를 포스폴리화하고, 37℃에서 배양하며, 프로인슐린[참조 : W. Wetekam et al., Gene 19(1982) 179-183] 의 평활-말단 DNA상에 DNA리가제를 사용하여 가한다 :

5' : AGC TTC CAT GCG T 3' (N4)

5' ACG CGT GGA 3' (N5)

HindIII및 Sal I 과의 반응 후, 현재 연장되어 있는 프로인슐린 DNA를 개방된 플라스미드에 효소 T₄DNA리가제를 사용하여 공유 결합시키며(제 2 도), 이렇게 하여 플라스미드 pH 106/4를 제조한다.

플라스미드 pH 106/14를 우선 Sal I 과 한번더 반응시키고, 겹쳐진 말단을 클레나우 폴리머라제로 채워서 평화 말단으로 하여, 생성물을 효소 Mst I과 배양한다. 플로인슐린을 암호화하는 전체 부분 및 이.콜라이의 trp오페론으로부터의 D-단백질의 약 210bp단편을 함유하는 약 500bp의 DNA단편을 분리한다. DNA단편은 평활-말단이고 플라스미드 pH 120/4의 Stu I 부위에 삽입하여 플라스미드 pH 154/25를 수득한다(제 3 도). 이것은 trp오페론의 통제하에서 융합 단백질의 발현에 적합하고, 여기에서 아미노산 서열 Ala-Ser-Met-Thr-Arg는 L'- 및 D-'-펩티드 다음에 위치하며, 프로인슐린의 아미노산 서열이 뒤따른다.

[실시예 2]

플라스미드 pH 154/25(제 3 도)를 제한 효소 BamHI및 XamIII과 반응시킨다. 돌출 말단을 클레나우 폴리머라제로 채우고 T₄DNA리가제를 사용하여 연결시킨다. 이 결과 trp프로모터의 통제하에 아미노산 서열 L', D'-프로인슐린을 갖는 융합 단백질의 발현에 적합한 플라스미드 pH 254(제 4 도)를 수득한다. 이 플라스미드는 pH 154/25보다 다소 작아 유리하다.

[실시예 3]

플라스키드 pH 254(실시에 2 : 제 4 도)를 제한효소 Mlu I 및Sal I과 배양하여 280p의 DNA단편을 유리시켜 제거한다. 잔여 플라스미드를 클레나우 폴리머라제로 처리하여 평활-말단 형태로 전환하고 DNA리가 제로 다시 공류적으로 폐환시킨다. 이 결과, 제한 부위 Mlu I, Sal I 및 EcoRI중 하나에 구조 유전자를 삽입시키는데 적합한 플라스미드 pH 255(제 4 도)가 수득된다. L', D'-단백질과 융합 단백질 형성은 유도조건하에 수행한다. 물론, 플라스미드 pH 255에 적합한 링커에 의해 다른 제한 부위를 삽입할 수 있다.

[실시예 4]

플라스미드 pH 154/25(제 3 도)를 효소 Mlu I 및 EcoRI과 배양하고, 유리된 DNA단편(약 300bp)을 제거한다. 잔연 플라스미드를 클레나우 폴리머라제로 채운다. 폐환은 DNA리가제의 작용에 의해 수행한다. 생성된 플라스미드 pH 256(제 5 도)은 EcoRI부위에 구조 유전자를 삽입할 때 사용할 수 있다.

[실시예 5]

제한효소 BamHI 및 NruI을 사용하여 플라스미드 pH 256(실시예 4 : 제 5 도)으로부터 600bp단편을 결실시켜서 플라스미드 pH 257을 수득한다(제 5 도). 이 목적을 위해서, pH 256을 우선 BamHI 과 배양하고, 클레나우 폴리머라제를 사용하여 평활 말단으로 한다. Nru I과의 배양 및 600bp단편의 제거후 DNA리가제와 배양하여 pH 257을 형성한다.

[실시예 6]

Lac 억제인자[참조 : P. J. Farabaugh, Nature 274, (1978) 759-769]를 플라스미드 pKK 177-3[참조 : 유럽 특허원 제0,133,282호의 실시예 5]에 삽입하여 플라스미드 pJF 188을 수득한다. 이것을 EcoRI 및 SalI과 반응시키고, 잔여 플라스미드를 분리한다.

SalI의 작용 및 MstI과의 배양에 의해 플라스미드 pH 106/4(제 2 도)로부터 크기가 약 495bp인 단편을 수득한다.

합성에 의해 수득한 올리고뉴켈레오티드(N6) 및 (N7)을 포르포릴화하고, DNA리가제를 사용하여 평활-말단 DNA단편상에 가한다 :

5' ACG AAT TCA TGA AAG CAA AGG 3' (N6)

5' CCT TTG CTT TCA TGA ATT CGT 3' (N7)

EcoR I 및 Sal I과 반응은 겹쳐진 말단을 퍼지게 하여 개방된 플라스미드 pJF 118에의 연결을 가능하게 한다.

이렇게 수득한 하이브리드 플라스미드를 이. 콜라이 294에 형질 전환시킨 후, 제한 단편의 크기를 기본으로 해서 정확한 클론을 선별한다. 이 플라스미드를 pJ 120(제 6 도)이라 명명한다.

융합 단백질의 발현은 하기와 같은 진탕 플라스크에서 수행한다.

암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 배지[참조 : J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, Laboratory, 1972]에서, 플라스미드 pJ 120을 함유하는 이.콜라이 294-형질전환체를 밤새 배양한 배양물을 사용하여 약 1:100의 비율로 새로운 배양물을 준비하고, 성장을 OD로 측정한다. OD가 0.5일 때, 이소프로필 β-D-갈락토피라노시드(IPTG)를 배양물에 가하여 그의 농도가 1mM이 되도록 하고, 150 내지 180분 후 원심분리하여 세균을 제거한다. 세균을 완충혼합물(7M 우레아, 0.1% SDS, 0.1M인산나트륨, pH 7.0)중에서 5분동안 가열하고, 샘플을 SOS겔 전기영동 플레이트에 적용한다. 전기 영동 후 플라스미드 pH 120을 함유하는 세균을 예상되는 융합 단백질의 크기에 상응하고 인슐린에 대한 항체와 반응하는 단백질 밴드를 제공한다. 융합 단백질을 분리한 후 시아노겐 브로마이드로 절단하여, 예기한 프로인슐린 유도체를 유리시킬 수 있다. 세균의 파괴(French Press ;^(R)Dyno-mill) 및 원심분리후, L', D'-프로인슐린 융합 단백질은 침전물에 존재하며, 따라서 상당량의 기타 단백질을 상등액과 함께 제거할 수 있다.

상기한 유도 조건을 진탕 배양물에 적용한다 ; 대량 발효시는 OD값도 변경시키고, 경우에 따라 IPTG농도를 약간 변화시키는 것이 유리하다.

[실시예 7]

50㎍/㎖암피실린을 함유하는 LB배지중에서 밤새 배양한 배양물을 플라스미드 pH 154/25(제 3 도)를 함유하는 이.콜라이 294형질전환체로부터 준비하고, 이튼날 아침 카사미노산 2000㎍/㎖ 및 티아민 1㎍/㎖를 함유하는 M9배지[참조 : J. H. Miller, 상기 인용]중에 약 1:100의 비율로 희석한다. OD가 0.5일 때 인돌릴-3-아크릴산을 가하여 최종 농도를 15㎍/㎖로 한다. 2 내지 3시간동안 배양한 후, 세균을 원심분리하여 제거한다. SDS겔 전기영동은 융합 단백질로 예상되는 위치에 있고, 인슐린에 대한 항체와 반응하는 아주 명백한 단백질 밴드를 나타낸다. 세균의 파괴 및 원심분리후, L',D'-프로인슐린 융합 단백질은 침전물에 존재하며, 따라서 다시 상당량의 다른 단백질이 상등액과 함께 제거된다.

당해 경우에도, 상술한 유도 조건을 진탕 배양물에 적용한다. 대량 발효시는 카사미노산의 농도를 변경시키거나 L-트립토판을 첨가해야 한다.

[실시예 8]

플라스미드 pH 154(제 3 도)를 EcoRI로 개방시키고 돌출한 DNA I본쇄를 클레나우 폴리머라제로 채운다. 수득한 DNA를 효소 Mlu I과 배양하고, 인슐린을 암호화하는 DNA를 플라스미드에서 절단한다. 겔 전기영동에 의해 분리하여 잔여 플라스미드로부터 이 단편을 제거하고, 잔연 플라스미드를 분리한다.

독일연방공화국 공개공보 제3,429,430호(유럽 특허원 제A1 0,171,024호)의 제 3 도의 나타낸 플라스미드를 제한 효소 Acc I 및 Sal I과 반응시키고, 히루딘 서열을 함유하는 DNA단편을 수취한다. Sal I제한 부위의 돌출 말단을 클레나우 폴리머라제로 채운 후, DNA단편을 서열실(N8)의 합성 DNA와 연결시킨다 :

Met Thr

5' CCC ACG CGT ATG ACG T 3'(N8)

3' GGG TGC GCA TAC TGC ATA 5'

연결 생성물을 Mlu I과 배양한다. 효소를 65℃에서 불활성시킨 후, DNA혼합물을 37℃에서 소의 알칼리성 포스파타제로 1시간 동안 처리한다. 이어서, 페놀로 추출하여 혼합물로부터 포스파타제 및 제한 효소를 제거하고, 에탄올 침전으로 DNA를 정제한다. 이렇게 처리한 DNA는 T₄리가제를 사용하여 플라스미드 pH 154/25의 개방되 잔여물에 삽입하고, 이 결과 제한 분석 및 막삼(Maxam)과 길버트(Gilbert) 방법에 의한 DNA서열분석으로 특성지운 플라스미드 pK 150을 수득한다(제 7 도).

[실시예 9]

플라스미드 pK 150(제 7 도)을 함유하는 이.콜라이 294 세균을 암피실린 30 내지 50㎍/㎖를 함유하는 LB 배지중, 37℃에서 밤새 배양한다. 카사미노산 2000㎍/㎖ 및 타이민 1㎍/㎖를 함유하는 M 9 배지로 배양물을 1:100의 비율로 희석하고, 혼합물을 지속적으로 혼합하면서 37℃에서 배양한다. OD₆₀₀이 0.5 또는 1일 때, 인돌린-3-아크릴산을 가하여 최종 농도를 15㎍/㎖로 하고, 혼합물을 2 내지 3시간 또는 16시간 동안 각각 배양한다. 이어서, 원심분리로 세균을 수취하고, 0.1M인산나트륨 완충액(pH 6.5)중에서 가압하에 파괴한다. 난용성 단백질을 원심분리로 수거하고 SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한다. trp오페론이 유도되는 세포는 20,000달톤 미만, 14,000달톤 이상의 영역에서 신규한 단백질을 함유하나 비-유도 세포에서는 발견되지 않음이 판명된다. 융합 단백질을 분리하고 시아노겐 브로마이드로 반응시키면 히루딘이 유리된다.

[실시예 10]

하기에 기술되는 작제물은 trp-D서열의 5'-말단의 상부에, trp-D서열을 가능한한 광범위하게 원핵세포 발현 시스템에 결합시키기 위해 가능한한 여러 가지 제한 효소의 많은 인식 부위를 함유하는 DNA서열의 유도를 허용한다.

플라스미드 pUC 12 및 pUc 13[참조 : Pharmacia P-L Biochemicals, 5401 St. Goar : The Molecular Biology Catalougue 1983, Appemdox p. 89]은 폴리링커 서열을 함유하고 있으며, 이것은 플라스미드 pUC 13에서 Xma I 및 Sac I의 제한 절단부위와, 폴라스미드 pK 150(제 7 도)로부터의 HindIII-히루딘-SacI단편과 융합된 플라스미드 p 106/4(제 2 도)로부터의 MstI-HindIII trp단편사이에 삽입하도록 의도되었다.

이 목적을 위해, 플라스미드 pUC 13의 DNA를 우선 제한 효소 Xma I 로 처리한다. 선형화된 플라스미드의 말단을 클레나우 폴리머라제 반응에 의해 채워 넣는다. 에탄올 침전 후, DNA를 효소 SacI로 처리하고, 다시 반을 혼합물로부터 에탄올로 다시 침전시킨다. DNA를 수성 연결 혼합물중에서 플라스미드 pH 106/4로부터 분리한 MstI-HindIII trp-D단편 및 플라스미드 pK 150으로부터 분리한 HindIII-Sac I히루딘 단편, 그리고 T₄DNA리가제와 함께 반응시킨다.

이렇게 수득한 플라스미드 pK 160은 trp-D서열의 바로위에 효서 XamI,Sma I, BamH I, XbaI, HincIII, Sal I, Acc I, Pst I 및 HindIII에 대한 제한 부위를 포함하는 다수의 제한 효소 인식 서열을 함유한다. 또한, EcoR I제한 부위가 이 작제물(제 8 도)에 있는 히루딘 서열의 3'-말단의 하부에 생성된다.

[실시예 11]

플라스미드 pH 131/5(비공고된 독일연방공화국 특허원 제 p 35 14 113. 1호, 실시에 1, 제 1 도에 나타난 바와 같음)를 하기와 같이 제조한다:

플라스미드 ptrL1[참조 : J. C. Edman et al., 상기 인용]을 Cla I로 개방시키고 합성적으로 제조한 자기-보충적인 올리고뉴클레오티드(N9)와 결합시킨다:

5' pCGACCATGGT 3' (N9)

이렇게 수득한 플라스미드 pH 131/5(제 9 도)를 이 방법을 도입한 제한 효소 Nco I의 제한 부위에서 개방시키고, 생성된 돌출 1본쇄 말단을 클레나우 폴리머라제 반응에 의해 채워 넣는다. 선형화 평활-말단 DNA를 효소 EcoRI로 절단하고, 생성된 2개의 대형 DNA서열을 소형 서열로부터 에탄올 침전에 의해 분리한다. 이렇게 수득한 플라스미드 pH 131/5의 잔여 플라스미드 DNA서열을 소형 서열로부터 에탄올 침전에 의해 분리한다. 이렇게 수득한 플라스미드 pH 131/5의 잔여 플라스미드 DNA를 trp-D'-히루딘을 암호화하는 pK 160으로부터의 단편과 T₄리가제 반응에 의해 연결시킨다. 이 단편을, HineII 및 EcoRI를 사용하여 플라스미드를 개방시켜 플라스미드 pK 160에서 절단해 낸다. 단편을 겔 전기영동에 의해 잔여 플라스미드로부터 수취하고, 이어서 겔 물질로부너 용출시킨다. 연결 생성물을 이.콜라이 K12에 형질전환한다. 플라스미드 DNA를 함유하는 클론을 분석하고 제한 분석 및 DNA서열 분석으로 특성을 알아낸다. 이렇게 수득한 플라스미드 pK 170은 trp오퍼레이터 상에 융합된 MeT-Asp-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-trp-D'-(히루딘)을 암호화하는 DNA서열을 함유하고 있다(제 9 도).

[실시예 12]

플라스미드 pJF 118(실시예 6)을 EcoR I로 개방시키고, 돌출한 DNA말단을 클레나우 폴리머라제 반응에 의해 평활말단으로 전환한다. 이렇게 처리한 DNA를 효소 Sal I로 절단하고, 짧은 EcoRI-SalI단편을 겔 전기 영동으로 수취한다.

플라스미드 pK 170(실시예 11)을 Nco I로 절단하고, 돌출한 말단을 클레나우 폴리머라제를 사용하여 평활 말단으로 전환한다. 플라스미드 DNA를 에탄올 침전에 의해 반응 혼합물로부터 수취하고, 효소 HindIII 및 BamHI로 처리한다. 생성된 2개의 단편, 즉 ,Nco(사채운)-trp-D'-HindIII단편 및 HindIII-히루딘-BamH I단편을 분리한다(독일연방공화국 공개공보 제3,429,430호). 겔 전기영동에 의해 두 단편을 분리한다. 더불어 독일연방공화국 공개공보 제3,429,430호에 나타난 BamGH I-Sal I-히루딘 II단편을 분리한다. 연결 반응에서 4개의 단편, 즉 플라스미드 pJF188의 잔여물, Nco I-trp-D'-HindIII단편, HindIII-히루딘-BamH I단편 및 히루딘II단편을 서로 반응시키고, 생성된 플라스미드 pK 80(제 10 도)을 이.콜라이 K12-W 3110에 형질전환한다. 플라스미드 DNA중 EcoRI-trp-D'-히루딘-Sal I단편을 검출하여 정확한 플라스미드를 선별한다. trp-D'-히루딘 서열은 tac프로모터에 결합된다. 융합 단백질을 실시예 6과 같이 발현시킨다.

[실시예 13]

pH 120/14(실시예 1, 제 1 도), pH 154/25(실시예 1, 제 3 도), pH 256(실시예 4, 제 5 도), pK 150(실시예 8, 제 7 도) 및 pK 170(실시예 11, 제 9 도)과 같이 pBR 322로부터 유도된 플라스미드들은 융합 단백질의 개시 코돈과 다음의 HindIII부위 (pBR 322에서 위치 29의 HindIII에 상응)사이에 trp프로모터 및 오퍼레이터를 함유하는 단편 영역, 그러나 프로모터 부위밖에 부가적인 PvuII부위를-시계 방향으로-함유한다.

기술한 Pvu II부위에 의해 결합된 DNA단편 및 pBR 322에서 위치 2066에 상응하는 PuvII부위의 결실에 의해, 클론된 단백질(또는 융합 단백질)의 수율이 크게 증가함이 발견된었다.

플라스미드 pH 154/25를 단축하여 pH 154/25^*를 수득하는 방법이 이후 실시에에 기술되어 있으며, 상술한 기타 플라스미드에 대해서도 마찬가지로 수행할 수 있다(단축된 플라스미드는 역시 별표로 구분한다).

pH 154/25를 PvuII와 반응시켜(제조자의 지시에 따라)3개의 단편을 수득한다:

단편 1 ; 프로인슐린 유전자의 PvuII제한부위부터 pBR 322에서 위치 2066에 상응하는 pvuII제한 부위까지, 단편 2 : trp-프로모터 근처의 PvuII 제한부위부터 프로인슐린 유전자의 pvuII부위까지, 및 단편 3; trp프로모터 단편 근처의 pvuII 부위부터 pBR 322에 위치 2066에 상응하는 PvuII부위까지, 단편들을 아가로스상에서 전기영동하여 분리하고, 이어서 분리한다[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982].

단편 1 및 2를 효소 T₄DNA리가제를 사용하여 평활말단 조건하에 결합시킨다. 이.콜라이 294로의 형질전환에 이어서, 완전한 프로인슐린 서열의 플라스미드를 함유하여서 목적하는 순서로 단편을 갖는 콜로니들에 대해 시험한다. 플라스미드 pH 154/25^*가 제 11 도에 도시되어 있다.

상기한 실시예대로 수행한 결과, 발현시 융합 단백질 비율이 현저히 증가됨이 관찰된다.

[실시예 14]

플라스미드 pH 154/25^*(실시예 13, 제 11 도)를 HindIII 및 Sal I로 분해하고, 소단편(프로인슐린 서열 함유)을 겔 전기영동에 의해 분리한다. 대단편을 분리하고 합성 DNA(N10)와 연결시킨다 :

(ALa) Trp Glu Asp Pro Met ILe Glu (Gly) (Arg)

A GCT TGG GAG GAT CCT ATG ATC GAG GG (N10)

ACC CTC CTA GGA TAC TAG CTC CCA GCT

플라스미드 pInt13(제 12 도)이 생성된다.

DNA(N10)는 화학적 절단을 위한 수개의 절단 부위를 함유하는 아미노산을 암호화하고 있다:

a) 시아노겐 브로마이드를 위한 Met, b) N-브로모석신아미드(NBS 또는 BSI)를 위한 Trp,c) 단백질 분해적 절단을 위한 Asp-Pro, 상부 Glu는 산의 작용에 대해 Asp-Pro결합을 부가적으로 약화시키고 있음.

이 HindIII-Sal I-링커(N-10)의 암호화된 폴리펩티드의 판독 프레임으로의 도입은, 목적하는 단백질의 아미노산 서열 및 절단제에 대한 그의 민감성에 따라 화학적 절단 제거에 대해 임의로 언급할 수 있다.

도면들은 일정한 축척에 따른 것이 아니다.

Claims

하기 서열실(1)의 융합 단백질을 암호화하는 유전자 구조물을 숙주 세포에서 발현시키고 융합 단백질을 분리시킴을 특징으로 하여, 하기 서열식(1)의 융합 단백질을 제조하는 방법.

Met-Xn-D'-Y-Z (1)

상기식에서, n은 0또는 1이고, X는 유전적으로 암호화할 수 있는 1 내지 12개의 아미노산 서열이며, D'은 이.콜라이의 trp오페론중 D-펩티드의 아미노산 23 내지 93서열영역에 있는 약 70개의 아미노산 서열이고, Y는 이어지는 아미노산 서열 Z를 절단시킬 수 있게 하는 유전적으로 암호화할 수 있는 하나 이상의 아미노산 서열이며, Z는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 서열이다.
제 1 항에 있어서, n인 1이고 X가 5개 이하의 아미노산을 함유하는 서열식(1)의 융합 단백질을 위한 유전자 구조물을 이용하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, n이 1이고 Lys-Ala이 X의 N-종결 말단에 위치하는 서열실(1)의 융합 단백질을 위한 유전자 구조물을 이용하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Y가 C-종결 말단에 Met, Cys, Trp, Arg 또는 Lys, 또는 그룹 (Asp)m-Pro 또는 Glu-(Asp)m-Pro(여기서, m은 1,2 또는 3을 나타낸다), 또는 Ile-Glu-Gly-Arg중 하나를 함유하거나, 이들 아미노산 또는 이들 그룹중 하나로 구성되는 서열실(1)의 융합 단백질을 위한 유전자 구조물을 이용하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Z가 사람 프로인슐린 또는 히루딘의 아미노산 서열을 나타내는 서열식(1)의 융합 단백질을 위한 유전자 구조물을 이용하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, DNA서열(I)(별첨)이 D'를 암호화하는 서열실(1)의 융합 단백질을 위한 유전자 구조물을 이용하는 방법.
제 6 항에 있어서, 하기 DNA서열(암호화 본쇄)이 유전자 구조물에서 X를 암호화하는 방법.

5' AAA GCA AAG GGC 3'
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 융합 단백질이 불응성이 되도록 유전자 구조물을 선택하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유전자 구조물을 이.콜라이의 trp오페론으로부터의 프로모터, 오퍼레이터 및 L-펩티드의 리보솜 결합부위를 함유하는 벡터내에 함유시키는 방법.
제 9 항에 있어서, 벡터가, pBR 322 DNA로 부터의 위치 29의 Hind III부위에서 위치 2066의 PvuII부위까지의 절편이 결실된, pBR 322의 유도체인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 숙주 세포가 이.콜라이인 방법.
제 1 항에 따라 수득한 융합 단백질로부터 아미노산 서열 Z를 화학적으로 또는 효소학적으로 절단시킴을 특징으로 하여, 진핵 세포의 단백질을 제조하는 방법.