KR19980025768A - 수용성 단백질을 생산하는 새로운 발현 플라스미드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 라이실-tRNA 합성효소의 구조 및 발현 특성을 이용하여 이와 융합한 외래 단백질을 수용성 형태로 생산할 수 있는 새로운 발현 플라스미드 및 이를 이용하여 외래 단백질을 대장균에서 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법을 이용하면 활성이 있는 외래 단백질을 용이하게 대량 생산할 수 있어 산업적으로 널리 이용될 수 있다.

Description

수용성 단백질을 생산하는 새로운 발현 플라스미드
도 1은 라이실-tRNA 합성효소(LysU)의 2차 구조를 도식화하여 나타낸 것이다.
막대기 모양은 헬릭스 구조를 나타내고, 화살표는 β-사슬을 나타낸다.
도 2는lys S유전자가 삽입된 발현 플라스미드 pGE-lysRS 를 제조하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysRS 로 대장균 HMS 174 를 형질전환시킨 다음, Lys S 단백질의 발현을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 나타낸 것이다.
레인 1: 단백질 크기 마커;
레인 2: 발현 유도한 대장균만의 전체 단백질;
레인 3: 형질전환체의 전체 단백질;
레인 4: 발현 유도한 형질전환체의 전체 단백질;
레인 5: 발현 유도한 대장균만을 파쇄한 상층액;
레인 6: 형질전환체를 파쇄한 상층액;
레인 7: 발현 유도한 형질전환체를 파쇄한 상층액;
레인 8: 발현 유도한 대장균만을 파쇄한 침전물;
레인 9: 형질전환체를 파쇄한 침전물;
레인 10: 발현 유도한 형질전환체를 파쇄한 침전물;
도 4는 Lys S 단백질의 아미노 말단 도메인을 융합짝으로 사용하는 발현 플라스미 드 pGE-lysN 을 제조하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN을 이용하여 GMcsf 단백질을 발현하는 대장균 발현 플라스미드 pLysN-GMcsf 를 제조하는 과정을 도식화하여 나타 낸 것이다.
도 6은 본 발명의 발현 플라스미드 pLysN-GMcsf 로 대장균 HMS 174를 형질전환시킨 다음, GMcsf 단백질의 발현을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 나타낸 것이다.
레인 1: 단백질 크기 마커;
레인 2: 형질전환체의 전체 단백질;
레인 3: 발현 유도한 형질전환체의 전체 단백질;
레인 4: 형질전환체를 파쇄한 침전물;
레인 5: 발현 유도한 형질전환체를 파쇄한 침전물;
레인 6: 형질전환체를 파쇄한 상층액;
레인 7: 발현 유도한 형질전환체를 파쇄한 상층액;
도 7은 비교군으로 티오레독신을 융합짝으로 사용한 경우, 대장균 GI724를 발현플라스미드 pTRXFUS-GMcsf 및 pTRXFUS 로 각각 형질전환시킨 다음 단백질의 발현을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 나타낸 것이다.
레인 1: 단백질 크기 마커;
레인 2: 발현 유도한 형질전환체(pTRXFUS-GMcsf)의 상층액;
레인 3: 발현 유도한 형질전환체(pTRXFUS-GMcsf)를 파쇄한 침전물;
레인 4: 발현 유도한 형질전환체(pTRXFUS)의 상층액;
레인 5: 발현 유도한 형질전환체(pTRXFUS)를 파쇄한 침전물;
도 8은 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN 를 이용하여 Gcsf 단백질을 발현하는 대장균 발현 플라스미드 pLysN-Gcsf를 제조하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 발현 플라스미드 pLysN-Gcsf 로 대장균 HMS 174 를 형질전환시킨 다음, Gcsf 단백질의 발현을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 나타낸 것이다.
레인 1: 단백질 크기 마커;
레인 2: 형질전환체의 전체 단백질;
레인 3: 형질전환체를 파쇄한 침전물;
레인 4: 형질전환체를 파쇄한 상층액;
레인 5: 발현 유도한 형질전환체의 전체 단백질;
레인 6: 발현 유도한 형질전환체를 파쇄한 침전물;
레인 7: 발현 유도한 형질전환체를 파쇄한 상층액;
도 10는 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN을 이용하여 TIMP2 단백질을 발현하는 대장균 발현 플라스미드 pLysN-TIMP2 를 제조하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 발현 플라스미드 pLysN-TIMP2 로 대장균 HMS 174 를 형질전환시킨 다음, TIMP2 단백질의 발현을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 나타낸 것이다.
레인 1: 단백질 크기 마커;
레인 2: 형질전환체(pGE-lysN)의 전체 단백질;
레인 3: 발현 유도한 형질전환체(pGE-lysN)의 전체 단백질;
레인 4: 발현 유도한 형질전환체(pGE-lysN)를 파쇄한 침전물;
레인 5: 발현 유도한 형질전환체(pGE-lysN)를 파쇄한 상층액;
레인 6: 형질전환체(plysN-TIMP2)의 전체 단백질;
레인 7: 발현 유도한 형질전환체(plysN-TIMP2)의 전체 단백질;
레인 8: 발현 유도한 형질전환체(plysN-TIMP2)를 파쇄한 침전물;
레인 9: 발현 유도한 형질전환체(plysN-TIMP2)를 파쇄한 상층액;
[발명의상세한설명]
[발명의목적]
본 발명은 라이실-tRNA 합성효소를 이용하여 외래 단백질을 수용성 형태로 생산할 수 있는 새로운 발현 플라스미드 및 이를 이용한 외래 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 라이실-tRNA 합성효소의 구조 및 발현 특성을 이용하여 이와 융합한 외래 단백질을 수용성 형태로 생산할 수 있는 새로운 발현 플라스미드 및 이를 이용하여 외래 단백질을 대장균에서 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법을 이용하면 활성이 있는 외래 단백질을 용이하게 대량 생산할 수 있어 산업적으로 널리 이용될 수 있다.
[발명이속하는기술분야및그분야의종래기술]
유전자 재조합 기술이 발달되면서 동물세포, 효모(yeast) 그리고 대장균과 같은 원핵생물(prokaryote) 등을 이용하여 유용한 외래 단백질(heterogous protein)이 많이 생산되고, 이들 단백질이 의약품 등으로 생물공학 산업에 널리 이용되게 되었다. 특히 대장균은 세포의 성장 속도가 빠르고 그의 유전자에 대한 규명이 다른 생물체에 비하여 잘 연구되어 있으므로, 유전자 재조합 기술에서 외래 단백질을 생산하기 위한 숙주세포 등으로 많이 이용되고 있다.
그러나 대장균은 진핵생물(eukaryote)에서 단백질을 성숙시키는데 필요한 다양한 세포내 요소를 갖추고 있지 못하는 결정적인 단점이 있고, 실제로 글리코실레이션(glycosylation), 디설파이드-크로스링크 (disulfide-crosslinking) 등의 기능이 대장균내에서는 수행되지 않는다. 또한, 대장균에서 외래 단백질이 과량으로 발현되는 경우 이들 단백질이 응집체(inclusion body = insoluble aggregate) 형태로 세포질내에 축적되는 수가 많다. 이러한 응집체는 쉽게 분리될 수 있는 장점이 있지만, 이로부터 활성이 있는 단백질을 얻으려면 고농도의 우레아 또는 구아니디움 염화수소(guanidium HCl) 등으로 응집체를 녹여 1차 구조로 풀어주어야 하고, 상기에서 사용한 시약을 제거하면서 또는 그 후에 풀어진 단백질을 정확히 리폴딩(refolding)시켜야만 한다.
이와 같이 활성이 있는 단백질로 리폴딩하는 과정은 다분히 경험적이어서 항상 성공적으로 수행될 수는 없고, 재조합 단백질을 규모를 확장(scale-up)하여 생산하는데는 어려움이 있다. 또한, 분자량이 큰 항체 단백질, 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator) 및 인자 Ⅷ 등은 현재까지 상기와 같은 리폴딩 과정으로 활성이 있는 단백질 형태로 얻어지는 것이 어렵거나 불가능한 것으로 보고되어 있다.
따라서 외래 단백질을 응집체 형태로 생산할 때 유발되는 상기 문제점을 개선하기 위하여, 대장균에서 외래 단백질을 수용성 단백질 형태로 발현시키는 것은 중요한 의미가 있다.
지금까지 다음과 같은 방법이 외래 단백질을 효과적으로 발현시키는데 주로 이용되어 왔다.
첫째, 외래 단백질의 아미노 말단에 시그날 서열(signal sequence)을 연결함으로써 외래 단백질이 대장균의 페리플라즘(periplasm)으로 분비되도록 하여 수용성 형태로 얻는 방법이 있는데 (Stader, J. A. and Silhavy, T. J., 1970, Methods in Enzymol., 165: 166-187), 이 방법은 단백질의 발현 효율이 낮아 산업적으로는 그 효용이 떨어진다.
둘째, 외래 단백질을 단백질의 폴딩(folding)에 관여하는 gro ES, gro EL 또는 dna K 등의 샤퍼롱(chaperones) 유전자와 함께 발현시킴으로써 수용성 단백질을 얻는 방법이 있는데 (Goloubinoff, P., Gatenby, A. A. and Lorimer, G. H., 1989, Nature, 337: 44-47), 이러한 방법은 특정한 단백질의 경우에만 효과가 있어서 응집체가 형성되는 것을 막는 일반적인 방법은 아니다.
셋째, 대장균에서 발현이 잘되는 단백질을 선택하고 그의 카르복시 말단에 외래 단백질을 융합하여 수용성 단백질을 얻는 방법이 있다. 이 때 융합짝(fusion partner) 단백질의 카르복시 말단에 외래 단백질을 연결하면 상기 융합짝 단백질의 초기 합성 신호(translation initiation signals)를 효과적으로 이용할 수 있고, 융합짝 단백질과 결합한 외래 단백질의 수용성이 증가되어 대장균에서 외래 단백질이 수용성 단백질 형태로 다량 발현될 수 있다.
지금까지 대장균에서 융합 단백질을 생산하기 위하여 Lac Z 또는 Trp E 단백질 등이 융합짝으로 사용되었으나, 이로부터 발현된 융합 단백질은 대부분 응집체 형태로 생산되어 활성이 있는 단백질을 얻는데 어려움이 있었다. 따라서 활성이 있는 외래 단백질을 용이하게 발현시킬 수 있는 새로운 융합짝 단백질을 발견하고자 많은 시도들이 이루어졌다. 실제로 글루타치온-S-전이효소 (glutathione-S- transferase; Smith, D. B. and Johnson, K. S., 1988, Gene, 67: 31-40), 말토스-결합 단백질 (maltose-binding protein; Bedouelle, H. and Duplay, P., 1988, Euro. J. Biochem., 171: 541-549), 프로테인 A (Nilsson, B. et al., 1985, Nucleic Acid Res., 13: 1151- 1162), 프로테인 A의 Z 도메인 (Nilsson, B. et al., 1987, Prot. Eng., 1: 107-113), 프로테인 Z (Nygren, P. A. et al., 1988, J. Mol. Recog., 1: 69-74) 그리고 티오레독신(thioredoxin; Lavallie, E. R. et al., 1993, Bio/Technology, 11: 187-193) 등이 융합짝 단백질로 개발되었다.
지금까지 외래 단백질을 상기의 융합짝 단백질과 결합시켜 수용성 단백질 형태로 발현시키려는 다양한 시도들이 이루어졌으나, 각 융합 단백질의 종류에 따라 응집체 형태로 발현되기도 하고 일부만이 수용성 형태로 발현되기도 하였다. 이 중 티오레독신이 가장 성공적인 융합짝으로 보고되었는데, 이 경우에도 다수의 융합단백질을 수용성 단백질 형태로 발현하기 위해서는 대장균을 15℃ 정도의 낮은 온도에서 배양해야 한다. 그러나 상기 온도에서 대장균은 성장 속도가 극히 낮으므로 이 방법을 산업적으로 이용하는데는 어려움이 있다.
대장균에서 발현이 잘되고 외래 단백질을 결합시키기에 용이한 단백질 중 하나인 라이실-tRNA 합성효소 (lysyl-tRNA synthetase, 이하 Lys RS로 약칭함) 및 그의 유전자에 관하여 살펴보면 다음과 같다.
대장균에서 아미노산화(aminoacylation)는 하나의 특정 아미노에실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase)에 의해 각각 수행되지만, 라이실-tRNA 합성효소의 경우는lys S와lys U라는 2개의 유전자로부터 각각 발현되는 두가지 효소 단백질에 의해 독립적으로 아미노산화 반응이 이루어진다.lys S는 정상 조건에서 항상 발현되는 유전자이고,lys U는 열충격(heat shock), 낮은 pH, 혐기 상태(anaerobiosis), L-알라닌, L-루이신, L-루이실다이펩타이드(L-leucyldipeptide) 등에 의해 발현이 유도되는 유전자로서, 이들 두 유전자로부터 발현되는 효소 단백질의 아미노산 서열은 88% 의 유사성을 나타낸다.
또한lys U유전자로부터 발현되는 라이실-tRNA 합성효소 (이하 Lys U로 약칭함) 단백질의 X-선 결정구조가 2.8Å 수준에서 밝혀졌다 (Onesti, S., Miller, A. D. and Brick, P., 1995, Structure, 3: 163-176). Lys U 단백질은 호모이중체(homodimer)로 구성되어 있고, 각각의 단일체(monomer)는 tRNA와 접촉하는 아미노 말단 도메인(domain) 그리고 다이머가 결합(dimer interface)하는 부부과 효소 활성을 나타내는 카르복시 말단 도메인으로 구성되어 있다 (도 1 참조).
또한, 프레드릭 다델 그룹(Frederic Dardel group)이lys S유전자로부터 발현되는 라이실-tRNA 합성효소 (이하 Lys S로 약칭함)의 아미노 말단 도메인(31-149 amino acid residue)의 핵자기 공명 구조를 밝힘으로써(Stephane, commans et al., J. Mol. Biol., 253: 100-113), Lys U 와 Lys S 단백질이 높은 아미노산 유사성을 갖는다는 사실에서 예상되는 바와 같이 이들 단백질의 아미노 말단 도메인의 구조가 매우 유사함을 확인하였다.
구체적으로 라이실-tRNA 합성효소의 아미노 말단 도메인은 연이은 3개의 α-헬릭스와 세 번째와 네 번째 β-쉬트(β-sheet) 사이에 하나의 α-헬릭스(H4)가 있는 5 사슬 역평행 β 배럴 (five stranded antiparallel β barrel) 형태의 이차 구조를 갖는다. 아미노 말단 도메인의 뒷부분은 OB 폴드(OB fold, A1A2A3H4A4A5)에 해당하는데, OB 폴드는 올리고 사카라이드 또는 올리고 뉴클레오타이드와 결합하는 단백질에 공통적으로 발견되는 폴드이다. 이와 같은 폴드는 효모의 아스파틸-tRNA 합성효소, 열 불안정성 엔테로톡신의 B 서브유니트(B-subunit of heat labile enterotoxin), 베로톡신(berotoxin), 스테필로코칼 뉴클라제(staphylococcal nuclease) 등에서도 발견되어 보고되었다 (Murzin, A. G., 1993, EMBO J., 12: 861-867).
상기와 같은 구조적 특성을 갖는 Lys RS 단백질의 아미노 말단 도메인은 융합짝 단백질로서 다음과 같은 특성을 갖는다.
lys S유전자를 대장균에서 발현시키면 전체 수용성 단백질의 80% 정도를 차지하도록 매우 높게 발현된다. 그러나 Lys S 단백질이 호모이중체로 구성되어 있고 단일체 접촉부위가 Lys S 의 카르복시 말단 도메인에 위치하므로, Lys S 유전자 전체 또는 Lys S 의 카르복시 말단 도메인이 포함한 단백질을 융합짝으로 사용한 융합단백질은 대장균내에 존재하는 Lys S 단백질과 이중체를 만들 수 있다.
이러한 헤테로이중체 단백질은 대장균에 치명적으로 작용하기 때문에 카르복시 말단은 융합짝으로 적합하지 않고, 아미노 말단만이 융합짝으로 유용하게 사용될 수 있다. 실제로 Lys S 단백질의 아미노 말단 도메인 (이하 Lys N 으로 약칭함)만을 발현시켜도 전체 단백질의 40% 정도가 되도록 높게 발현되고, 대부분의 단백질이 수용성 형태로 만들어진다. 상기에서 기술한 바와 같이 Lys RS 의 아미노 말단 도메인에 위치하는 OB 폴드 부분은 단백질의 폴딩에 용이한 이차구조(secondary structure)를 가지므로 발현된 융합 단백질의 수용성을 증가시키는 것으로 보인다.
이와 같은 배경에서 본 발명자들은 유전자 재조합 방법으로 단백질을 생산하는데 유용한 융합짝을 찾고 있던 중, 대장균의 라이실-tRNA 합성효소의 아미노 말단 도메인이 융합짝 단백질로서 외래 단백질을 수용성 형태로 대량 생산하는데 효율적이라는 사실을 발견하고, 이를 이용한 새로운 대장균 발현 플라스미드 및 활성이 있는 외래 단백질을 대량으로 제조하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
[발명이이루고자하는기술적과제]
본 발명은 아미노에실-tRNA 합성효소 유전자 전체 및 그의 일부를 포함하는 발현 플라스미드를 제공함에 그 목적이 있다. 이 때 아미노에실-tRNA 합성효소 유전자는 대장균을 포함한 모든 세포로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 발현 플라스미드는 상기 유전자에 더하여 연결 펩타이드 유전자, 표지 서열 유전자, 단백질 분해효소 인지부위 유전자 또는 외래 단백질 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위 등으로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 라이실-tRNA 합성효소 유전자 전체 또는 그 일부를 포함하는 대장균 발현 플라스미드를 제공함에 그 목적이 있다. 이 때 상기 라이실-tRNA 합성효소 유전자는lys S또는lys U유전자 중에 선별할 수 있다.
구체적으로 본 발명은lys S유전자 전체를 포함하는 대장균 발현 플라스미드 pGE-lysRS 를 제공한다.
또한, 본 발명은 라이실-tRNA 합성효소의 아미노 말단 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 제공함에 그 목적이 있다.
본 발명은 라이실-tRNA 합성효소의 아미노 말단의 아미노산 번호 1번에서 13번까지가 제거된 아미노 말단 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 제공할 수 있다. 또한, 상기와 같이 아미노산 번호 1번에서 29번까지가 제거된 아미노 말단 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 제공할 수 있다.
또한, 라이실-tRNA 합성효소의 OB 폴드 부위만을 포함하는 발현 프라스미드를 제공할 수 있다. 이를 위해 아미노 말단의 아미노산 번호 1번에서 65번까지가 제거된 아미노 말단 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 제조할 수 있다.
구체적으로 본 발명은 대장균 발현 플라스미드 pGE-lysN 을 제공한다. 이를 대장균 HMS 174 균주에 형질전환시키고, 그 형질전환체를 1996년 9월 23일에 한국 종균협회 부설 한국미생물보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC-10918).
또한, 본 발명은 상기 발현 플라스미드에 유용한 외래 단백질 유전자를 삽입하여 이를 수용성인 융합 단백질 형태로 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
구체적으로 본 발명은 상기 발현 플라스미드 pGE-lysN 에 GMcsf(granulocyte and macrophage colony stimulating factor) 유전자를 삽입한 발현 플라스미드 plysN-GMcsf 를 제공한다. 이를 숙주세포에 형질전환시키고 그 형질전환체에 융합 단백질 발현을 유도하여 GMcsf 단백질을 생산한다.
이 때 숙주세포로 대장균 HMS 174 균주를 사용하나, 이외에도 융합 단백질 발현에 적합한 모든 종류의 대장균 균주를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 방법으로 Gcsf(granulocyte colony stimulating factor) 유전자를 삽입하여 발현 플라스미드 plysN-Gcsf 를 제공하고 이로부터 Gcsf 단백질을 생산한다.
또한 본 발명은 상기와 같은 방법으로 TIMP 2(tissue inhibitor of metalloprotease 2) 유전자를 삽입하여 발현 플라스미드 plysN-TIMP2 를 제공하고 이로부터 TIMP 2 단백질을 생산한다.
[발명의구성및작용]
본 발명은 아미노에실-tRNA 합성효소의 구조 및 발현상의 특성을 이용하여 유용한 단백질을 수용성 형태로 생산할 수 있는 발현 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 발현 플라스미드에는 대장균을 포함한 모든 종류의 세포로부터 분리한 아미노에실-tRNA 합성효소 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명은 모든 종류의 아미노에실-tRNA 합성효소를 융합짝 단백질로 이용할 수 있으나, 비교적 유전적으로 연구가 잘되어 있는 라이실-tRNA 합성효소(Lys RS)를 이용한 발현 플라스미드를 제공한다. 이 때 상기 Lys RS 단백질 유전자는lys S또는lys U유전자 중에 선별할 수 있다.
본 발명의 발현 플라스미드의 제조에 사용한 Lys RS 유전자는 대장균의 염색체 DNA (chromosomal DNA)를 주형으로 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 얻고, 이를 플라스미드 pGEMEXTM-1(Promega사 제품)에 삽입하여lys S유전자를 포함하는 발현 플라스미드 pGE-lysRS 를 제조한다 (도 2 참조).
이를 적합한 대장균 균주에 형질전환시켜 형질전환체를 얻고, 상기 형질전환체에 단백질 발현을 유도하면 Lys RS 단백질이 전체 수용성 단백질의 80% 정도로 높게 발현됨을 확인할 수 있다(도 3 참조). 이 때 본 발명의 Lys RS 단백질을 발현시키기 위하여 일반적으로 대장균 형질전환체를 37℃에서 배양하지만, 15℃ - 30℃ 정도의 저온에서 배양하면 수용성 단백질의 비율을 더욱 높일 수 있다.
또한, 본 발명은 Lys RS 단백질의 아미노 말단 도메인을 융합짝 단백질로 이용하는 발현 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 발현 플라스미드는 유용한 외래 단백질을 효과적으로 생산하기 위하여, Lys RS 단백질의 아미노 말단 유전자에 더하여 연결 펩타이드 유전자, 표지 서열 유전자, 단백질 분해효소 인지부위 유전자 또는 제한효소 인지부위 등을 선별적으로 포함한다. 따라서 이로부터 발현된 융합 단백질은 수용성 형태로 숙주세포내에서 생산되고, 분리·정제가 용이하며, 특이적인 단백질 분해효소의 작용에 의해 외래 단백질만으로 순수하게 얻어질 수 있다.
본 발명의 Lys RS 단백질의 아미노 말단 유전자는 상기 발현 플라스미드 pGE-lysRS 를 주형으로 사용한 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻고, 이를 플라스미드 pGEMEXTM-△NdeI 에 삽입하여 Lys RS 단백질의 아미노 말단 유전자를 포함하는 발현 플라스미드 pGE-lysN 을 제조한다 (도 4 참조).
본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN 를 대장균 HMS 174 균주에 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 1996년 9월 23일에 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 기탁하였다 (수탁번호: KFCC-10918).
상기의 과정으로 제조된 본 발명의 발현 플라스미드는 다음과 같은 특성을 갖는다.
본 발명의 발현 플라스미드는 T7 프로모터를 포함하고 이로부터 융합 단백질의 유전자 전사 및 발현이 조절된다. 상기 T7 프로모터 이외에 tac 프로모터 또는 람다 pL 프로모터 등과 같은 대장균에서 사용될 수 있는 모든 종류의 프로모터는 본 발현 플라스미드에 이용될 수 있다.
본 발명의 발현 플라스미드는 Lys RS 단백질의 아미노 말단 도메인을 융합짝 단백질로서 효과적으로 이용할 수 있도록 구성된다.
Lys RS 단백질의 아미노 말단의 구조는 헬리스 1(helix 1) 부분이 연결 펩타이드에 근접하여 있어, 엔테로펩티다제(enteropeptidase)가 융합 단백질을 절단하는 것을 방해하고 발현된 단백질이 제대로 폴딩하는데 영향을 줄 수 있다. 따라서 본 발명의 발현 플라스미드에서 이들 헬릭스 부분을 제거하면 외래 단백질의 생산에 더욱 적합한 발현 플라스미드를 제공할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 발현 플라스미드는 Lys RS 단백질의 아미노 말단의 아미노산 번호 1번에서 13번까지의 부위를 제거한 아미노 말단 유전자만을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 아미노산 번호 1번에서 29번까지의 부위를 제거한 아미노 말단 유전자만을 포함하는 것도 바람직하다.
또한, 본 발명의 발현 플라스미드는 융합짝 단백질로서 Lys RS 단백질의 폴딩에 관여하는 OB 폴드 부위의 유전자만을 포함하는 것도 바람직하다. 실제적으로 본 발현 플라스미드는 Lys RS 단백질의 헬릭스 1, 2, 3 부위인 아미노산 번호 1번에서 65번까지의 부위를 제거한 아미노 말단 유전자을 포함할 수 있고, 이들은 융합 단백질을 수용성 형태로 생산하는데 매우 유용하다.
또한 Lys RS 단백질의 아미노 말단 도메인을 이용하는 외에, 본 발명의 발현 플라스미드는 다른 단백질의 OB 폴드 도메인 유전자를 이용하여 제조될 수 있다. 구체적으로 이미 보고된 바 있는 효모의 아스파틸-tRNA 합성효소, 열 불안정성 엔테로톡신의 B 서브유니트, 베로톡신, 스테필로코칼 뉴클라제 등의 OB 폴드 유전자를 이용할 수 있다 (Murzin, A. G., 1993, EMBO J., 12: 861-867).
또한, 본 발명의 발현 플라스미드는 Lys RS 단백질의 아미노 말단 유전자를 융합 단백질 발현에 적합하도록 변이시키거나 이와 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질의 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 발현 플라스미드는 융합짝 단백질과 외래 단백질을 연결하는 연결 펩타이드(linker peptide)로서 Lys RS 단백질의 아미노산 번호 147번에서 154번까지의 아미노산에 대한 유전자를 사용한다. 유용하게도 이들 연결 펩타이드 부위는 단백질의 표면에 돌출되어 있고 그 부분의 길이를 줄이거나 확장할 수 있으므로 발현되는 외래 단백질의 특성에 따라 조절될 수 있다. 상기 Lys S 단백질 이외에도 유용한 다른 단백질의 연결 펩타이드를 이용하여 발현 플라스미드를 제조할 수 있다.
본 발명의 발현 플라스미드는 상기 연결 펩타이드 유전자 뒤 쪽에 6개의 히스티딘 표지(histidine tag) 유전자를 포함하도록 제조한다. 이들 히스티딘 표지는 본 발명의 발현 플라스미드를 이용하여 생산된 융합 단백질의 분리·정제과정을 용이하게 한다. 실제로 히스티딘 표지가 부착되어 있는 융합 단백질은 니켈 킬레이션 칼럼 크로마토그래피 등을 이용하여 쉽게 분리·정제될 수 있다.
또한, 히스티딘 표지이외에 폴리아르기닌 또는 일치된 바이오틴화 서열(consensus biotinylation sequence) 등을 삽입할 수 있으며 이로부터 생산된 단백질은 다양한 친화 칼럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)를 이용하여 용이하게 분리·정제될 수 있다. 상기의 표지 서열부위는 단백질의 카르복시 말단 또는 아미노 말단 부위 등 어디에도 위치할 수 있다.
본 발명의 발현 플라스미드에는 이로부터 발현된 융합 단백질을 분리·정제한 다음 용이하게 외래 단백질만을 얻어내기 위하여, 단백질 분해효소가 인지하는 절단 부위를 포함시킨다. 구체적으로 본 발명의 발현 플라스미드는 엔테로펩티다제의 인지 서열( D D D K 서열) 유전자를 히스티딘 표지 서열 뒤쪽에 포함하는데, 이는 발현된 융합 단백질이 엔테로펩티다제에 의해 융합짝 단백질과 외래 단백질로 용이하게 분리되게 한다. 이 때 엔테로펩티다제는 상기 인지 서열의 카르복시 말단을 절단한다.
또한 상기 단백질 절단 부위는 발현되는 외래 단백질에 따라 그 생산에 적합하도록, 트롬빈 또는 Xa 인자가 인지하여 절단하는 서열(트롬빈의 경우, L V P R G S ; Xa 인자의 경우, I E G R ) 등으로 대치될 수 있다.
본 발명의 발현 플라스미드에 외래 단백질을 용이하게 클로닝하기 위하여 특정 제한효소의 인지서열을 상기 단백질 절단 부위 뒤에 삽입한다. 구체적으로 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN 은 Kpn I - Bam HI - Eco RI - Sal I - Hind Ⅲ의 제한효소 인지서열을 포함한다. 이외에도 외래 유전자를 용이하게 클로닝할 수 있는 모든 종류의 제한효소 인지서열을 삽입할 수 있다.
상기에서 제조한 발현 플라스미드를 이용하면 대장균에서 단독으로 발현시킬 때 응집체 형태로 발현되는 다양한 외래 단백질을 수용성 단백질 형태로 용이하게 발현시킬 수 있다.
구체적으로 본 발명은 사람의 GMcsf(granulocyte and macrophage colony stimulating factor), Gcsf(granulocyte colony stimulating factor) 및 TLMP 2(tissue inhibitor of metalloprotease 2) 단백질 등을 대량으로 생산하기 위하여, 라이실-tRNA 합성효소의 아미노 말단 도메인(Lys N)을 이용한 발현 플라스미드를 제조한다.
본 발명은 Lys N 단백질을 이용하여 GMcsf 단백질을 수용성 형태로 생산하는발현 플라스미드를 제조한다. 구체적으로 플라스미드 pTRXFUS-GMcsf를 주형으로 사용한 중합효소연쇄반응을 수행하여 GMcsf 유전자를 얻고 이를 상기 발현 플라스미드 pGE-lysN 에 삽입하여 발현 플라스미드 plysN-GMcsf를 제조한다 (도 5 참조).
또한, 본 발명의 Lys S 단백질의 융합짝 단백질로서의 효과를 조사하기 위하여, 티오레독신을 융합짝으로 한 GMcsf 융합 단백질의 발현 결과와 상기 발현 결과를 비교한다. 이를 위해 티오레독신 유전자와 GMcsf 유전자를 포함하고 이를 융합 단백질 형태로 생산할 수 있는 발현 플라스미드 pTRXFUS-GMcsf 를 제조한다 (도 7 참조).
또한, 본 발명은 Gcsf 단백질을 수용성 형태로 생산하는 발현 플라스미드를 제조한다. 구체적으로 플라스미드 pTRXFUS-Gcsf를 주형으로 사용한 중합효소연쇄반응을 수행하여 Gcsf 유전자를 얻고 이를 상기 발현 플라스미드 pGE-lysN 에 삽입하여 발현 플라스미드 plysN-Gcsf 를 제조한다 (도 8 참조).
또한, 본 발명은 TIMP 2 단백질을 수용성 형태로 생산하는 발현 플라스미드를 제조한다. 구체적으로 플라스미드 pGETIMP 2를 주형으로 사용한 중합효소연쇄반응을 수행하여 TIMP 2 유전자를 얻고 이를 상기 발현 플라스미드 pGE-lysN 에 삽입하여 발현 플라스미드 pGElysN-TIMP 2를 제조한다 (도 10 참조).
상기 발현 플라스미드로 대장균을 형질전환시켜 얻은 형질전환체는 Lys N 단백질과 융합한 외래 단백질, 즉 Lys N-GMcsf 단백질, Lys N-Gcsf 단백질, Lys N-TIMP2 단백질을 37℃ 배양 조건에서 대부분 수용성 형태로 전체 수용성 단백질의 약 5 - 30% 에 해당할 정도로 높게 발현한다 (도 6, 도 9 및 도 11 참조). 한편 티오레독신을 융합짝으로 사용한 경우는 융합 단백질이 대부분 응집체 형태로 발현되었다 (도 7 참조). 따라서, 본 발명의 Lys N 단백질이 지금까지 우수한 융합짝 단백질로 알려진 티오레독신보다 훨씬 더 기능이 탁월함을 확인할 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1lys S유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드 pGE-lysRS 의 제조
본 발명의 발현 플라스미드를 제조하는데 필요한lys S유전자를 클로닝하기 위하여, 대장균의 염색체 DNA (chromosomal DNA)를 주형으로 사용하고 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 각각 갖는 시발체 1 및 시발체 2를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다 (서열표 1 및 서열표 2 참조). 상기 반응에 의해 증폭된 유전자 산물을 제한효소 Nde I 및 Hind Ⅲ 로 절단하였다.
또한 클로닝의 편의를 위하여 플라스미드 pGEMEXTM-1(Promega사 제품)의 두 개의 Nde I 인지 부위 중 3251 염기서열에 해당하는 Nde I 부위를 도 2에 도시한 바와 같이 제거하여 플라스미드 pGEMEXTM-△Nde I를 제조하였다. 상기 플라스미드 pGEMEXTM-△Nde I를 제한효소 Nde I 및 Hind Ⅲ로 절단하였다.
절단한 플라스미드와 제한효소로 처리한 상기 PCR 유전자 산물을 각각 1% 아가로스 겔에 전기영동하고 긴 파장의 UV에서 나타난 DNA 절편을 포함하는 겔을 잘랐다. 이로부터 각 DNA 절편을 Jetsorb 키트(GENOMED사 제품)를 사용하여 추출한 다음 라이게이션하였다.
그 결과,lys S유전자가 포함된 발현 플라스미드를 제조하여 이를 발현 플라스미드 pGE-lysRS 로 명명하였다.
실시예 2 Lys S 단백질의 발현
실시예 1에서 제조한 발현 플라스미드 pGE-lysRS 로 대장균 HMS 174 균주를 형질전환시켜 그 중 형질전환된 콜로니를 선별하여 LB 배지(암피실린 100μg/ml, 클로로암페니콜 30 μl/ml 포함) 1.5ml에 접종하였다. 이를 37℃에서 밤새도록 배양한 다음 50ml의 LB 배지에 다시 희석하였다. 균체 농도가 파장 600nm 에서 0.5일 때 IPTG가 0.5mM 이 되도록 첨가하여 단백질의 발현을 유도하고 5시간을 더 배양한 다음 균체를 5000g에서 10분간 원심분리하여 수확하였다. 이 균체를 10ml 인산완충용액(PBS)에 현탁하여 세포를 파쇄한 다음 세포 용출액을 얻고 이를 15,000g에서 15분간 원심분리하여 상층액과 침전물로 분리하였다. 이 침전물은 다시 10ml 인산완충용액에 현탁하였다.
상기의 각 시료 28μl와 5× SDS 로딩 완층용액 7μl를 잘 섞은 다음 5분간 끓였다. 이 중 10μl를 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고 120 V 전압으로 전기영동을 한 다음 단백질 밴드를 쿠마시블루(Coomasie blue)로 염색하여 확인하였다.
그 결과, 도 3의 레인 7에서 보는 바와 같이 본 발명의 발현 플라스미드는 Lys S 단백질을 전체 수용성 단백질의 80% 정도가 되도록 높은 수준으로 발현시킴을 확인하였다 (도 3 참조).
실시예 3 발현 플라스미드 pGE-lysN 의 제조
Lys S 단백질의 아미노 말단 도메인을 융합짝으로 사용하는 발현 플라스미드를 제조하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 플라스미드 pGE-lysRS 를 주형으로 사용하고 서열번호 1 및 서열번호 3의 서열을 각각 갖는 시발체 1 및 시발체 3를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다(서열표 1 및 서열표 3 참조).
상기 반응에 의해 증폭된 유전자 산물을 제한효소 Nde I 과 Hind Ⅲ로 절단하고, 플라스미드 pGEMEXTM-△Nde I 도 제한효소 Nde I 및 Hind Ⅲ로 절단하여 이들 산물을 실시예 1과 동일한 방법으로 추출한 다음 라이게이션하였다 (도 4 참조).
그 결과, Lys S 단백질의 아미노 말단 유전자가 포함된 발현 플라스미드를 제조하여 이를 발현 플라스미드 pGE-lysN 로 명명하였다. 또한 이를 대장균에 형질전환시켜 그 형질전환체를 얻어 1996년 9월 23일에 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC-10918).
실시예 4 발현 플라스미드 plysN-GMcsf 의 제조 및 Lys N-GMcsf 융합단백질의 발현
대장균에서 단독으로 발현시킬 때 응집체 형태로 발현되는 사람의 GMcsf(granulocyte and macrophage colony stimulating factor) 단백질을 대장균에서 수용성 단백질 형태로 발현시키기 위하여, 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN 에 GMcsf 유전자를 클로닝하였다 (도 5 참조).
GMcsf 유전자를 클로닝하기 위하여 발현 플라스미드 pTRXFUS-GMcsf를 주형으로 사용하고, 서열번호 4 및 서열번호 5의 서열을 각각 갖는 시발체 4 및 시발체 5를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다 (서열표 4 및 서열표 5 참조). 상기 반응에 의해 증폭된 유전자 산물을 제한효소 Kpn I 과 Hind Ⅲ 로 절단하고, 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN 도 제한효소 Kpn I 과 Hind Ⅲ로 절단하여 이들 산물을 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 추출한 다음 라이게이션하였다. 그 결과, Lys N 단백질과 GMcsf의 융합 단백질을 생산하는 발현 플라스미드를 제조하여 이를 발현 플라스미드 plysN-GMcsf 로 명명하였다.
또한, 발현 플라스미드 plysN-GMcsf 로 대장균을 형질전환하여 융합 단백질을 발현시켰다. 그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 융합 단백질이 발현되었고 그의 크기는 33 kDa으로 예측한 바와 일치하였다. 또한 대부분의 Lys N-GMcsf 융합 단백질이 수용성으로 전체 수용성 단백질의 10% 정도로 높게 발현되었다(도 6 참조).
실시예 5 발현 플라스미드 pTRXFUS-GMcsf 의 제조 및 티오레독신-GMcsf 융합단백질의 발현
본 발명의 Lys S 단백질의 아미노 말단 도메인의 융합짝 단백질로서의 효과를 조사하기 위하여, 비교군으로 티오레독신 융합짝 단백질이 GMcsf 융합 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
티오레독신을 융합짝 단백질로 사용하는 발현 플라스미드 pTRXFUS (Invitrogen사 제품)의 Kpn I 및 Bam HI 위치에 GMcsf 유전자를 서브클로닝하여 티오레독신과 GMcsf 단백질을 융합 단백질로 생산하는 발현 플라스미드 pTRXFUS-GMcsf 를 제조하였다 (도 7 참조). 본 발현 플라스미드로 대장균을 형질전환시켜 형질전환체를 37℃에서 배양하면 융합 단백질이 대부분 응집체 형태로 발현되었다 (도 7, 레인 3 참조).
그 결과, 티오레독신은 본 발명의 Lys N 단백질보다 융합짝 단백질로서 그 효능이 떨어짐을 확인할 수 있었다.
실시예 6 발현 플라스미드 plysN-Gcsf 의 제조 및 Lys N-Gcsf 융합 단백질의발현
대장균에서 단독으로 발현시킬 때 응집체 형태로 발현되는 사람의 Gcsf(granulocyte colony stimulating factor) 단백질을 대장균에서 수용성 단백질 형태로 발현시키기 위하여, 실시예 4 에서와 같은 방법으로 Gcsf 유전자를 클로닝하였다.
Gcsf 유전자는 플라스미드 pTRXFUS-Gcsf 를 주형으로 사용하고 서열번호 6 및 서열번호 7의 서열을 각각 갖는 시발체 6 및 시발체 7을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻었다(서열표 6 및 서열표 7 참조). 상기 반응에 의해 증폭된 유전자 산물을 T4 폴리뉴클레오타이드 인산화효소(T4 polynucleotide kinase)를 사용하여 인산화하고, 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN 도 제한효소 Eco RV 로 절단하여 CIP (calf intestine phosphatase) 를 처리한 다음 이들 산물을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 추출하여 라이게이션하였다. 그 결과, Lys N 단백질과 Gcsf 의 융합 단백질을 생산하는 발현 플라스미드 plysN-Gcsf를 제조하였다 (도 8 참조).
또한, 발현 플라스미드 plysN-Gcsf 로 대장균을 형질전환하여 융합 단백질을 발현시켰다. 그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이 융합 단백질이 발현되었고 그의 크기는 36 kDa 으로 예측한 바와 일치하였다. 이 때 Lys N-Gcsf 융합단백질은 대부분이 수용성으로 전체 수용성 단백질의 30% 정도로 매우 높게 발현되었다.
실시예 7 발현 플라스미드 plysN-TIMP2의 제조 및 Lys N-TIMP2 융합단백질의 발현
대장균에서 단독으로 발현시킬 때 응집체 형태로 발현되는 사람의 TIMP 2 (tissue inhibitor of metalloprotease 2) 단백질을 대장균에서 수용성 단백질 형태로 발현시키기 위하여, 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN 에 TIMP 2 유전자를 삽입하였다.
TIMP 2 유전자를 클로닝하기 위하여, 플라스미드 pGE-TIMP2를 주형으로 사용하고 서열번호 8 과 서열번호 9의 염기서열을 각각 갖는 시발체 8 및 시발체 9를 이용한 중합효소연쇄반응을 수행하였다 (서열표 8 및 서열표 9 참조). 상기 반응에 의해 증폭된 유전자 산물을 제한효소 Eco RV 와 Hind Ⅲ로 절단하고, 본 발명의 발현 플라스미드 pGE-lysN 도 제한효소 Eco RV 과 Hind Ⅲ로 절단하여 이들 산물을 상기 실시예 1 과 동일한 방법으로 추출한 다음 라이게이션하였다. 그 결과, Lys N 단백질과 TIMP 2의 융합 단백질을 생산하는 발현 플라스미드 plysN-TIMP2를 제조하였다 (도 10 참조).
또한, 발현 플라스미드 plysN-TIMP2 로 대장균을 형질전환시켜, 그 형질전환체로부터 융합 단백질을 발현시켰다. 그 결과 도 11에서 보는 바와 같이 융합 단백질이 발현되었고 그의 크기는 41 kDa으로 예측한 바와 일치하였다. 또한, 상기 Lys N-TIMP2 융합 단백질은 대부분이 수용성으로 전체 수용성 단백질의 5% 정도로 발현되었다(도 11, 레인 9 참조).
[발명의효과]
본 발명의 발현 플라스미드는 라이실-tRNA 합성효소 및 이와 결합한 외래 단백질을 대량 생산할 뿐만 아니라 응집체가 아닌 수용성 단백질 형태로 생산하여 단백질 활성을 그대로 유지할 수 있으므로 유전자 재조합 기술에 있어서 획기적인 발명이라고 할 수 있다.
실제로 본 발명의 발현 플라스미드는 Lys RS 단백질을 전체 수용성 단백질의 80% 정도가 되도록 높은 수준으로 발현하고, Lys N 에 외래 단백질이 결합된 융합 단백질도 5 - 30% 정도로 높게 발현한다. 또한, Lys N 단백질은 기존의 티오레독신보다 융합짝으로서의 효과가 탁월하므로 새로운 융합짝 단백질로서 매우 우수하다.
특히 유용한 외래 단백질인 GMcsf, Gcsf, TIMP 2 단백질 생산에 유용하고, 이외에도 활성이 있는 단백질 형태로 얻는 것이 어렵거나 불가능한 분자량이 큰 항체 단백질, 조직 플라스미노겐 활성인자 및 인자 Ⅷ 등의 생산에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
또한 본 발명의 발현 플라스미드는 외래 유전자의 삽입, 융합 단백질의 분리·정제, 융합 단백질의 절단 등의 과정이 용이하도록 구성되어 다양한 외래 단백질을 생산하는데 널리 이용될 수 있다.
〔서 열 목 록〕
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Claims (16)

  1. 아미노에실-tRNA 합성효소 유전자에 더하여 연결 펩타이드 유전자, 단백질 분해효소 인지부위 유전자, 표지 서열 유전자 또는 제한효소 인지부위를 포함하는 발현 플라스미드.
  2. 제 1항에 있어서, 아미노에실-tRNA 합성효소 유전자는 대장균의 라이실-tRNA 합성효소 유전자인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  3. 제 2항에 있어서, 라이실-tRNA 합성효소 유전자는lys S유전자인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  4. 제 3항에 있어서, 발현 플라스미드 pGE-lysRS 인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  5. 제 4항에 있어서,lys S유전자는 라이실-tRNA 합성효소의 아미노 말단 유전자인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  6. 제 5항에 있어서, 아미노 말단은 아미노산 번호 1번에서 13번 또는 29번까지가 제거된 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  7. 제 5항에 있어서, 아미노 말단은 OB 폴드 부분인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  8. 제 7항에 있어서, OB 폴드 부분은 아미노산 번호 1번에서 65번까지가 제거된 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  9. 제 5항에 있어서, 발현 플라스미드는 pGE-lysN 인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드.
  10. 제 9항의 발현 플라스미드로 대장균 HMS 174 균주를 형질전환시킨 형질전환체 (수탁번호 : KFCC-10918).
  11. 제 1항의 발현 플라스미드에 외래 단백질 유전자를 삽입한 발현 플라스미드.
  12. 제 11항에 있어서, 외래 단백질은 GMcsf 단백질인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드 plysN-GMcsf.
  13. 제 11항에 있어서, 외래 단백질은 Gcsf 단백질인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드 plysN-Gcsf.
  14. 제 11항에 있어서, 외래 단백질은 TIMP 2 단백질인 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드 plysN-TIMP2.
  15. 제 11항의 발현 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시켜 얻은 형질전환체.
  16. 제 15항의 형질전환체를 배양하여 단백질의 발현을 유도한 다음, 이로부터 융합 단백질 형태의 수용성 외래 단백질을 대량 생산하는 단백질의 제조방법.
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