DK172618B1 - Fusionsproteiner, deres fremstilling og anvendelse - Google Patents
Fusionsproteiner, deres fremstilling og anvendelse Download PDFInfo
- Publication number
- DK172618B1 DK172618B1 DK198603554A DK355486A DK172618B1 DK 172618 B1 DK172618 B1 DK 172618B1 DK 198603554 A DK198603554 A DK 198603554A DK 355486 A DK355486 A DK 355486A DK 172618 B1 DK172618 B1 DK 172618B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- sequence
- amino acids
- fusion protein
- plasmid
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
i DK 172618 B1
Den foreliggende opfindelse angår fusionsproteiner, deres fremstilling og anvendelse.
Ved den gentekniske fremstilling af mindre eukaryo-tiske proteiner med en molekylvægt på indtil ca. 15.000 5 dalton fås der i bakterier hyppigt kun et ringe udbytte.
Formodentlig nedbrydes de dannede proteiner hurtigt af værtsegne proteaser. Sådanne proteiner fremstilles derfor hensigtsmæssigt som fusionsproteiner, især med en værtsegen proteinandel, som derefter fraspaltes, 10 Det har nu vist sig, at et afsnit på kun ca. 70 aminosyrer af D-proteinet fra trp-operonet af E. coli er særlig godt egnet til dannelse af fusionsproteiner, nemlig i området af aminosyresekvens 23 til 93 (C. Yanofsky et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 6647), der i det føl-15 gende også betegnes "D'-peptid". Mellem carboxyterminusen af dette peptid og aminosyresekvensen af det ønskede eu-karyotiske protein befinder der sig en sekvens af en eller flere, genetisk koderbare aminosyrer, der muliggør en kemisk eller enzymatisk fraspaltning af det Ønskede pro-20 tein. Ved foretrukne udførelsesformer for opfindelsen er der til aminoterminusen knyttet en kort aminosyresekvens bestående af Lys-Ala, eventuelt fulgt af en sekvens af 1--10, især 1-3 yderligere genetisk koderbare aminosyrer, fortrinsvis 2 aminosyrer, især Lys-Gly.
25 Opfindelsen angår således et fusionsprotein med den almene formel
Met-X -D’-Y-Z n hvori n betyder 0 eller 1, 30 x betyder en sekvens af 1-12 genetisk koderbare aminosyrer, fortrinsvis Lys-Ala, D' betyder en sekvens af ca. 70 aminosyrer i området af aminosyresekvensen 23-93 af D-peptidet i trp-operonet af E. coli, 35 y betyder en sekvens af én eller flere genetisk koderbare aminosyrer, der muliggør en fraspaltning af den følgende aminosyresekvens Z, og DK 172618 B1 2 Z betyder en sekvens af genetisk koderbare aminosyrer.
Yderligere aspekter af opfindelsen og foretrukne udførelsesformer er beskrevet i det følgende og defineret i patentkravene.
5 Det er naturligvis fordelagtigt, at den uønskede (værtsegne) andel af fusionsproteinet er så lille som muligt, da cellen da kun producerer en ringe mængde "ballast", og udbyttet af det Ønskede protein herved er højt.
Desuden opstår der ved fraspaltningen af den uønskede an-10 del færre biprodukter, hvilket letter oparbejdningen. I modsætning hertil står, at den (formodede) "beskyttelsesfunktion" af den uønskede andel kun skulle forventes fra og med en bestemt størrelse. Det har nu overraskende vist sig, at det ifølge opfindelsen valgte segment af D-protei-15 net opfylder denne opgave, selv om det kun indeholder ca.
70 aminosyrer.
I mange tilfælde, frem for alt ved den foretrukne udførelsesform, hvor X betyder Lys-Ala eller indeholder denne sekvens N-terminal, dannes der et uopløseligt fusions-20 protein. Dette kan på simpel måde skilles fra de opløselige proteiner, hvilket letter oparbejdningen meget og forøger udbyttet. Dannelsen af et uopløseligt fusionsprotein er overraskende, da på den ene side den bakterielle andel med kun ca. 70 aminosyrer er relativt ringe og på den an-25 den side er bestanddel af et protein, som foreligger i opløsning i værtscellen.
Udtrykket "ca. 70 aminosyrer i området af aminosyre-sekvensen 23 til 93 i D-peptidet" indebærer, at variationer er mulige på i og for sig kendt måde, dvs. enkelte 30 aminosyrer kan udelades, erstattes eller ombyttes, uden at de her omhandlede fusionsproteiners egenskaber ændres væsentligt herved. Sådanne variationer er ligeledes genstand for opfindelsen.
Det ønskede eukaryotiske protein er fortrinsvis et 35 biologisk aktivt protein, såsom et hirudin, eller et forstadium af et sådant protein, såsom humant proinsulin.
3
O
DK 172618 B1
Fusionsproteinet fås ved ekspression i et egnet system og isoleres ved den særlig foretrukne udførelsesform efter oplukning af værtscellerne fra bundfaldet, hvori det koncentreres på grund af tungtopløseligheden. På den-5 ne måde er en let fraskillelse af de opløselige bestanddele af cellen mulig.
I betragtning som værtsceller kommer alle, for hvilke der kendes ekspressionssystemer, altså pattedyrceller og mikroorganismer, fortrinsvis bakterier, især E. coli, 10 da den bakterielle andel af fusionsproteinet jo er et værtsegent protein af E. coli.
DNA-sekvensen, der koder for det omhandlede fusionsprotein, indbygges på kendt måde i en vektor, der sikrer en god ekspression i det valgte ekspressionssystem.
15 I bakterielle værter vælger man hensigtsmæssigt promotoren og operatoren fra gruppen Lac, Tac, eller P af λ-fag, hsp, omp eller en syntetisk promotor, f.eks. som beskrevet i DE-offentliggørelsesskrift nr. 3.430.683 (EP-patentansøgning nr. 173.149).
20 Særlig egnet er en vektor, der fra trp-operonet af E. coli indeholder følgende elementer: promotoren, operatoren og ribosombindingsstedet af L-peptidet. I det koderende område følger der særlig hensigtsmæssigt de tre første aminosyrer af dette L-peptid, hvorefter der via en 25 kort aminosyresekvens følger aminosyrerne 23-93 af D-pro-teinet i trp-operonet.
Mellemsekvensen Y, der muliggør en fraspaltning af det ønskede polypeptid, retter sig efter sammensætningen af dette ønskede peptid. Når dette f.eks. ikke indeholder 30 methionin, kan Y betyde Met, hvorpå der følger en kemisk spaltning med bromcyan. Hvis der i bindeleddet Y findes cystein ved carboxyterminusen, eller Y betyder Cys, kan der følge en enzymatisk cysteinspecifik spaltning eller en kemisk spaltning, f.eks. efter specifik S-cyanylering.
35 Hvis der i broleddet Y findes tryptophan ved carboxyterminusen, eller Y betyder Trp, kan der ske en kemisk spalt- 4
O
DK 172618 B1 ning med N-bromsuccinimid. Hvis Y betyder Asp-Pro, kan der på kendt måde (D. Piszkiewicz et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 40 (1970) 1173-1178) ske en proteolytisk spaltning. Asp-Pro-bindingen kan, som 5 det har vist sig, gøres mere syrelabil, når Y betyder (Asp) -Pro eller Glu-(Asp) -Pro hvori m betyder 1, 2 eller 3. Herved fås spaltningsprodukter, der N-terminalt begynder med Pro eller ender C-ter-minalt med Asp.
10 Eksempler på enzymatiske spaltninger er ligeledes kendte, hvorved der også kan anvendes modificerede enzymer med forbedret specificitet (jf. C.S. Craik et al.. Science 228 (1985) 291-297). Hvis det ønskede eukaryotiske peptid er humant proinsulin, kan der som sekvens Y vælges en pep-15 tidsekvens, hvori en med trypsin fraspaltelig aminosyre (Arg, Lys) er bundet til den N-terminale aminosyre (Phe) af proinsulin, f.eks. Ala-Ser-Met-Thr-Arg, da der da kan ske en argininspecifik spaltning med proteasen trypsin. Hvis det ønskede protein ikke indeholder aminosyrerækkefølgen 2o Ile-Glu-Gly-Arg, er også en spaltning med faktor Xa mulig (EP-A nr. 161.937) .
Ved udformningen af sekvensen Y er det også muligt at tage hensyn til synteseomstændighederne og indbygge egnede spaltningssteder for restriktionsenzymer. DNA-sekven-25 sen svarende til aminosyresekvensen Y kan desuden også o-vertage funktionen af en linker eller adapter.
Det her omhandlede fusionsprotein eksprimeres fordelagtigt under kontrol af trp-operonet af E. coli. Et DNA— -afsnit indeholdende promotoren og operatoren af trp-ope-30 ronet er blevet handelsgængst. Ekspressionen af proteiner under kontrol af trp-operonet er beskrevet adskillige gange, f.eks. i EP-A2 036.776. Induktion af trp-operonet kan opnås ved fraværelse af L-tryptophan og/eller tilstedeværelse af indolyl-3-acrylsyre i mediet.
35 Under kontrol af trp-operatoren sker der først en transkription af L-peptidet, der består af 14 aminosyrer.
O
DK 172618 B1 5
Dette L-peptid indeholder L-tryptophan i positionerne 10 og 11. Hastigheden af proteinsyntesen af L-peptidet bestemmer, om de efterfølgende strukturgener ligeledes transla-teres, eller om proteinsyntesen afbrydes. Ved mangel på 5 L-tryptophan sker der kun en langsom syntese af L-peptidet som følge af en ringe koncentration af tRNA for L-tryptophan, og der sker en syntese af de følgende proteiner. Ved høje koncentrationer af L-tryptophan sker der derimod en hurtig aflæsning af det tilsvarende afsnit af mRNA, og der 10 sker en afbrydelse af proteinbiosyntesen, da mRNA antager en terminatorlignende struktur (C. Yanofsky et al., se ovenfor).
Hyppigheden af translation af et mRNA påvirkes stærkt af arten af nucleotiderne i startkodonets omgivel-15 ser. Ved ekspression af et fusionsprotein ved hjælp af trp-operonet synes det derfor at være gunstigt at anvende nucleotider for de første aminosyrer i L-peptidet til begyndelsen af strukturgenet for fusionsproteinet. Ved den foretrukne udførelsesform for opfindelsen i trp-systemet 2o vælges nucleotiderne for de første tre aminosyrer i L-peptidet (i det følgende betegnet L’-peptidet) som kodoner for de N-terminale aminosyrer i fusionsproteinet.
Opfindelsen angår derfor vektorer, fortrinsvis plas-mider til ekspression af fusionsproteiner, hvor vektorer-25 nes DNA fra 5’-enden har de følgende særlige træk (i passende anordning og i fase): en promotor, en operator, et ribosombindingssted og strukturgenet for fusionsproteinet, hvorved sidstnævnte indeholder aminosyresekvens I (se bilag) før sekvensen af det ønskede protein. Før struk-3Q turgenet eller som første triplet af strukturgenet findes startkodonet (ATG) og eventuelt yderligere kodoner for andre aminosyrer, der er anordnet mellem startkodonet og D'--sekvensen eller mellem D'-sekvensen og genet for det ønskede protein. Alt efter aminosyresammensætningen af det 35 ønskede protein vælges DNA-sekvensen før strukturgenet således, at der muliggøres en fraspaltning af det ønskede 6
O
DK 172618 B1 protein fra fusionsproteinet.
Ved ekspressionen af det her omhandlede fusionsprotein kan det vise sig at være hensigtsmæssigt at ændre enkelte tripletter af de første aminosyrer efter ATG-5 -startkodonet for at forhindre en eventuel baseparring på mRNA-plan. Sådanne forandringer, ligesom forandringer, udeladelser eller tilføjelser af enkelte aminosyrer i D'-proteinet er nærliggende for en fagmand og ligeledes genstand for opfindelsen.
10 Da mindre plasmider har flere fordele, består en foretrukken udførelsesform for opfindelsen i, at der fra plasmider, der er afledt af pBR 322, elimineres et DNA--afsnit med strukturgenet for tetracyclinresistens. Fordelagtigt fjernes segmentet fra Hindlll-spaltningsstedet 15 ved position 29 og indtil PvuII-spaltningsstedet ved position 2066. Ved de her omhandlede plasmider er det særlig hensigtsmæssigt at fjerne et noget større DNA-afsnit, idet man udnytter PvuII-spaltningsstedet ved begyndelsen (i aflæsningsretningen) af trp-operonet (som ligger i en ikke-20 -essentiel del). Man kan således direkte ligere det dannede store fragment med de to PvuII-spaltningssteder. Det fremkomne plasmid, der er formindsket med ca. 2 kbp, bevirker en ekspressionsforøgelse, der muligvis skyldes et forhøjet kopiantal i værtscellen.
25 Opfindelsen illustreres ved de følgende eksempler.
EKSEMPEL 1 a) Chromosomalt E. coli-DNA spaltes med Hinf I, og der foretages en isolering af 492 bp-fragmentet, der fra trp-ope-30 ronet indeholder promotoren, operatoren, strukturgenet for L-peptidet, attenuatoren og kodonet for de første seks aminosyrer af trp-E-strukturgenet. Dette fragment opfyldes ved hjælp af Klenow-polymerase med deoxynucleotidtriphos-phater, forbindes ved begge ender med et oligonucleotid, 35 som indeholder et genkendelsessted for Hindlll og efter-spaltes med Hindlll. Det således fremkomne Hindlll-frag-
O
DK 172618 B1 7 ment ligeres i Hindlll-spaltningsstedet af pBR 322, På denne måde fås plasmidet ptrpE2-l (J.C. Edmann et al., Nature 291 (1981) 503-506). Dette omdannes som beskrevet til plasmidet ptrpLl.
5 Ved hjælp af de syntetiske oligonucleotider (NI) og (N2) 5’ CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3' (NI) 10 5' CCT TTG CTT TCA TTG T 3' (N2) der komplementeres til det dobbeltstrengede oligonucleo-tid (N3) 15 5' CGA C AA TGA AAG C AA AGG 3’ (N3) 3 ’ T GTT ACT TTC GTT TCC 5 ’ indbygges der i Clal-stedet af plasmidet ptrpLl DNA-sek-vensen for de første tre aminosyrer af L-peptidet samt 2o dannes et restriktionssted (Stul) til indsætning af yderligere DNA (fig. 1). Plasmidet ptrpLl omsættes med enzymet Clal ifølge producentens oplysninger, blandingen ekstraheres med phenol, og DNA udfældes med ethanol. Det åbnede plasmid omsættes med alkalisk phosphatase fra E.
25 coli til fjernelse af phosphatgrupperne ved 5'-enderne.
De syntetiske nucleotider phosphoryleres ved 5'-enderne og indsættes med T4-DNA-ligase i det åbnede phosphatasebe-handlede plasmid. Efter endt ligasereaktion sker transformationen i E. coli 294, og selektionen af transforman-30 terne sker ved hjælp af Amp-resistens og tilstedeværelse af et Stul-restriktionssted.
Ca. 80% af de fremkomne kloner udviser det forventede restriktionssted. Den i fig. 1 anførte nucleotidsek-vens bekræftes ved sekvensanalyse. Der fås plasmidet 35 pH120/14, der efter ribosombindingsstedet for L-peptidet udviser nucleotidtripletterne for de første tre aminosy- 8
O
DK 172618 B1 rer af L-peptidet (L’-peptid), efterfulgt af et Stul-sted, der på sin side muliggør indsættelse af yderligere DNA og således muliggør dannelse af fusionsproteiner med de første tre aminosyrer af L-peptidet.
5 b) I det følgende illustreres den kemiske syntese af sådanne oligonucleotider med det ovenfor anvendte oligonucleo-tid (Ni) som eksempel.
Ved metoden ifølge M.J. Gait et al«. Nucleic Acids Research 8 (1980) 1081-1096, bindes det ved 3'-enden fore-10 liggende nucleosid, i det foreliggende tilfælde altså guanosin, covalent til en glaskuglebærer (CPG (= controlled pore glass) LCAA (= long chain alkyl amine) fra fa.
Pierce) via 3'-hydroxyfunktionen. Herved omsættes guanosin som N-2-isobutyroyl-3'-O-succinoyl-5'-dimethoxy-tritylet-15 her med den modificerede bærer i nærværelse af Ν,Ν'-di-cyclohexylcarbodiimid og 4-dimethylaminopyridin, hvorved den frie carboxygruppe af succinoylgruppen acylerer amino-gruppen af den langkædede amin på bæreren.
I de følgende syntesetrin anvendes basekomponenten 2o som 5'-0-dimethoxytrityl-nucleosid-3'-phosphorsyrling-mono- methylester-dialkylamid eller -chlorid, hvorved adenin foreligger som N6-benzoylforbindelse, cytosin foreligger som N4-benzoylforbindelse, guanin foreligger som N2-iso-butyrylforbindelse, og thymin, som ikke indeholder nogen 25 aminogruppe, foreligger uden beskyttelsesgruppe.
40 mg af bæreren, som bundet indeholder 1 μπιοί guanosin, behandles successivt med følgende midler: a) methylenchlorid, 30 b) 10% trichloreddikesyre i methylenchlorid, c) methanol, d) tetrahydrofuran, e) acetonitril, f) 15 μπιοί af det tilsvarende nucleosidphosphit og 35 70 μπιοί tetrazol i 0,3 ml vandfrit acetonitril (5 minutter), 9
O
DK 172618 B1 g) 20% acetanhydrid i tetrahydrofuran med 40% lutidin og 10% dimethylaminopyridin (2 minutter), h) tetrahydrofuran, i) tetrahydrofuran med 20% vand og 40% lutidin, 5 j) 3% iod i kollidin/vand/tetrahydrofuran i volumenfor holdet 5:4:1, k) tetrahydrofuran, og l) methanol.
Ved "phosphit" forstås herved deoxyribose-3'-mono-10 phosphorsyrling-monomethylester, hvorved den tredie valens er optaget af chlor eller en tertiær aminogruppe, f.eks. en diisopropylaminogruppe. Udbytterne af de enkelte syntesetrin kan bestemmes spektrofotometrisk efter detrityle-ringsreaktion b) ved måling af absorptionen af dimethoxy-15 tritylkationen ved en bølgelængde på 496 nm.
Efter afsluttet syntese af oligonucleotidet fraspaltes methylphosphat-beskyttelsesgrupperne af oligomeren ved hjælp af p-thiocresol og triethylamin.
Derefter skilles oligonucleotidet fra den faste bærer 2o ved 3 timers behandling med ammoniak. Ved 2-3 dages behandling af oligomeren med koncentreret ammoniak fraspaltes basernes aminobeskyttelsesgrupper kvantitativt. Det således fremkomne råprodukt renses ved højtryksvæskechro-matografi (HPLC) eller ved polyacrylamid-gelelektrophorese.
25 På ganske tilsvarende måde syntetiseres også de øvrige oligonucleotider.
b) Plasmidet ptrpE5-l (R.A. Hallewell et al.. Gene 9 (1980) 27-47) omsættes med restriktionsenzymerne Hindlll og Sall ifølge producentens oplysninger, og DNA-fragmen-30 tet på ca. 620 bp fjernes. De syntetiske oligonucleotider (N4) og (N5) 5' AGC TTC CAT GAC GCG T 3' (N4) 35 5' ACG CGT CAT GGA 3' (N5) DK 172618 B1 10 o phosphoryleres, inkuberes i fællesskab ved 37°C og adderes ved hjælp af DNA-ligase til det stumpendede DNA for proinsulin (W. Wetekam et al.f Gene 19 (1982) 179-183).
Efter omsætning med HindiII og Sall indbygges det nu for-5 længede proinsulin-DNA covalent i det åbnede plasmid med enzymet T4-DNA-ligase (fig. 2), hvorved der dannes plas-midet pHl06/4.
Plasmidet pH106/4 omsættes først yderligere med Sall, og de overlappende ender suppleres med Klenow-poly-10 merase til stumpe ender, hvorefter der inkuberes med enzymet Mstl, Der isoleres et DNA-fragment på ca. 500 bp, som indeholder den samlede koderende del af proinsulinet samt et ca. 210 bp stort afsnit af D-proteinet fra trp--operonet af E. coli. DNA-fragmentet har stumpe ender og 15 indsættes i Stul-stedet af plasmidet pHl20/14, hvorved der dannes plasmidet pHl54/25 (fig. 3). Dette er egnet til ekspression af et fusionsprotein under kontrol af trp--operonet, ved hvilket der efter L'- og D'-peptidet er an-ordnet aminosyresekvensen Ala-Ser-Met-Thr-Arg, efter hvil-20 ken der følger aminosyresekvensen af proinsulin.
EKSEMPEL 2
Plasmidet pH154/25 (fig. 3) omsættes med restriktionsenzymerne BamHI og Xmalll. De overlappende ender op-25 fyldes ved hjælp af Klenow-polymerase og forbindes med T4-DNA-ligase. Herved fås plasmidet pH254 (fig. 4), der er egnet til ekspression af et fusionsprotein med aminosyresekvensen L1,D'-proinsulin under kontrol af trp-pro-motoren. Plasmidet er noget mindre end pH154/25, hvilket 30 kan være fordelagtigt.
EKSEMPEL 3
Ved inkubering af plasmidet pH254 (eksempel 2, fig. 4) med restriktionsenzymerne Mlul og Sall frigøres 35 et DNA-afsnit med 280 bp, som fraskilles. Restplasmidet omdannes med Klenow-polymerase til den stumpendede form o DK 172618 B1 11 og ringsluttes igen covalent med DNA-ligase. Derved dannes plasmidet pH255 (fig. 4), der er egnet til indsætning af et strukturgen i et af restriktionsstederne Mlul, Sall og EcoRI. Under induktionsbetingelser sker der dannelse af 5 et fusionsprotein med L' ,D'-protein. Naturligvis kan der ved hjælp af egnede linkere indføjes yderligere restriktionssteder i plasmidet pH255.
EKSEMPEL 4 10 Plasmidet pHl54/25 (fig. 3) inkuberes med enzymer ne Mlul og EcoRI, og det frigjorte DNA-fragment (ca. 300 bp) fjernes. Restplasmidet opfyldes med Klenow-polymera-se. Ringslutningen sker ved indvirkning af DNA-ligase. Det dannede plasmid pH256 (fig. 5) kan anvendes til indsætning !5 af strukturgener i EcoRI-stedet.
EKSEMPEL 5
Ved fjernelse af et 600 bp-fragment fra plasmidet pH256 (eksempel 4, fig. 5) med restriktionsenzymerne BamHl 2o og Nrul fås plasmidet pH257 (fig. 5). Herved inkuberes pH256 først med BamHl, og der dannes stumpe ender med Klenow-polymerase. Efter inkubering med Nrul og fraskillel-se af 600 bp-fragmentet sker dannelsen af pH257 efter inkubering med DNA-ligase.
25 EKSEMPEL 6
Ved indsætning af lac-repressor (P. J. Farabaugh,
Nature 274 (1978) 765-769) i plasmidet pKK 177-3 (Amann et al., Gene 25 (1983) 167) fås plasmidet pJF118. Dette 30 omsættes med EcoRI og Sall, og restplasmidet isoleres.
Fra plasmidet pH106/4 (fig. 2) fås der ved indvirkning af Sall og inkubering med MstI et fragment på ca.
495 bp.
De syntetisk fremstillede oligonucleotider (N6) 35 og (N7) 12
O
DK 172618 B1 5' ACG AAT TCA TGA AAG C AA AGG 3' (N6) 5' CCT TTG CTT TCA TGA ATT CGT 3' (N7) g phosphoryleres og adderes med DNA-ligase til det stumpendede DNA-fragment. Ved omsætning med EcoRI og Sall frigøres o-verlappende ender, der muliggør en ligering i det åbnede plasmid pJFll8.
Efter transformation af det således fremkomne hy-10 bridplasmid i E. coli 294 udvælges de rigtige kloner på grundlag af størrelsen af restriktionsfragmenterne. Dette plasmid betegnes pJ120 (fig. 6).
Ekspressionen af fusionsproteinet gennemføres i rystekolber på følgende måde: 15 Fra en kultur natten over af E coli 294-transfor- manter, som indeholder plasmidet pJ120, i LB-medium (J. H.
Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) med 50 pg/ml ampicillin startes en frisk kultur i forholdet ca. 1:100, og væksten følges 2o ved hjælp af OD-måling. Ved en OD-værdi på 0,5 tilsættes kulturen så meget isopropyl-B-D-galactopyranosid (IPTG), at dettes koncentration er 1 mM, og bakterierne fracentrifugeres efter 150-180 minutter. Bakterierne koges i 5 minutter i en pufferblanding (7M urinstof, 0,1% SDS, 0,1 M na-25 triumphosphat, pH-værdi 7,0), og prøver anbringes på en SDS-gelelektrophoreseplade. Efter elektrophorese fås der fra bakterier, som indeholder plasmidet pJ120, et proteinbånd, som svarer til størrelsen af det forventede fusionsprotein og reagerer med antistoffer mod insulin. Ef-30 ter isolering af fusionsproteinet kan det forventede pro-insulinderivat frigøres ved bromcyanspaltning. Efter oplukning af bakterierne (French Press; Dyno-mølle) og centrifugering befinder L1,D'-proinsulin-fusionsproteinet sig i bundfaldet, således at der allerede med den ovenstå-35 ende væske kan fraskilles betydelige mængder af de øvrige proteiner.
13
O
DK 172618 B1
De angivne induktionsbetingelser gælder for rystekulturer. Ved større fermenteringer er tilsvarende OD-værdier og eventuelt let ændrede IPTG-koncentrationer hensigtsmæssige.
5 EKSEMPEL 7
Ud fra E. coli 294-transformanter, som indeholder plasmidet pH154/25 (fig. 3), fremstilles en kultur natten over i LB-medium med 50 Mg/ml ampicillin, og den næste morgen fortyndes der i forholdet ca. 1:100 i M9-medium (J. H.
10 Miller, se ovenfor) med 2000 Mg/ml Casamino Acids og 1 Mg/-ml thiamin. Ved en OD-værdi på 0,5 tilsættes der indolyl--3-acrylsyre, således at slutkoncentrationen er 15 Mg/ml.
Efter 2-3 timers inkubering fracentrifugeres bakterierne.
En SDS-gelelektrophorese viser på det for fusionsproteinet 15 ventede sted et særdeles tydeligt proteinbånd, som reagerer med antistoffer mod insulin. Efter oplukning af bakterierne og centrifugering befinder L’,D'-proinsulin-fusionsproteinet sig i bundfaldet, således at der også her allerede kan fraskilles betydelige mængder af de øvrige 2o proteiner med den ovenstående væske.
Også i det foreliggende tilfælde gælder de angivne induktionsbetingelser for rystekulturer. Fermenteringer i større volumen kræver ændrede koncentrationer af Casamino Acids eller en tilsætning af L-tryptophan.
25 EKSEMPEL 8
Plasmidet pH154/25 (fig. 3) åbnes med EcoRI, og de overlappende DNA-enkeltstrenge opfyldes med Klenow-polyme-rase. Det således fremkomne DNA inkuberes med enzymet 30 Mlul, og det for insulin koderende DNA udskæres fra plasmidet. Ved gelelektrophoretisk adskillelse skilles dette fragment fra restplasmidet, og restplasmidet isoleres.
Plasmidet ifølge fig. 3 i DE-offentliggørelsesskrift nr. 3.429.430 (EP-patentansøgning nr. EP-A1 171.024) om-35 sættes med restriktionsenzymerne Accl og Sall, og DNA- -fragmentet indeholdende hirudinsekvensen fraskilles. Ef- 14
O
DK 172618 B1 ter opfyldning af de overlappende ender af Sall-spalt-ningsstedet med Klenow-polyinerase ligeres DNA-segmentet med det syntetiske DNA med formlen (N8).
5 Met Thr 5’ CCC ACG CGT ATG ACG T 3' 3' GGG TGC GCA TAC TGC ATA 5’ (NS)
Ligeringsproduktet inkuberes med Mlul. Efter inaktivering 10 af enzymet ved 65°C behandles DNA-blandingen med alkalisk kvægphosphatase i 1 time ved 37°C. Herefter fjernes phos-phatasen og restriktionsenzymet fra blandingen ved phenol-ekstraktion, og DNA renses ved ethanolfældning. Det således behandlede DNA indsættes med T4-ligase i det åbnede 15 restplasmid pHl54/25, hvorved der fås plasmidet pK150, som karakteriseres ved restriktionsanalyse og DNA-sekvens-bestemmelse ifølge Maxam og Gilbert (fig. 7).
EKSEMPEL 9 20 E. coli 294-bakterier, som indeholder plasmidet pK150 (fig. 7}, dyrkes natten over ved 37°C i LB-medium med 30-50 pg/ml ampicillin. Kulturen fortyndes i forholdet 1:100 med M9-medium, som indeholder 2000 pg/ml Casamino Acids og 1 pg/ml thiamin, og inkuberes ved 37°C under kon-25 stant gennemblanding. Ved en ODg0Q-værdi på 0,5 hhv. 1 tilsættes der indolyl-3-acrylsyre til en slutkoncentra-tion på 15 Mg/ml og der inkuberes 2-3 timer hhv. 16 timer.
Derefter fracentrifugeres bakterierne og oplukkes under tryk i 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH-værdi 6,5). De 30 tungtopløselige proteiner fracentrifugeres og analyseres ved SDS-polyacrylamid-elektrophorese. Det viser sig, at celler, hvis trp-operon, induceres, indeholder et nyt protein i området under 20.000 dalton, men over 14.000 dalton, som ikke findes i ikke-inducerede celler. Efter 35 isolering af fusionsproteinet og omsætning med bromcyan frigøres hirudin.
15
O
DK 172618 B1 EKSEMPEL 10 I det følgende beskrives konstruktioner, der gør det muligt før S'-enden af trp-D-sekvensen at indføre DNA--sekvenser, der indeholder så mange genkendelsessteder for 5 forskellige restriktionsenzymer som muligt, således at trp- -D-sekvensen kan indbygges så universelt som muligt i de mest forskellige prokaryotiske ekspressionssystemer.
Plasmiderne pUC12 og pUCl3 (Pharmacia P-L Bio-chemicals, 5401 St. Goar: The Molecular Biology Catalogue 10 1983, Appendix, s. 89) indeholder en polylinkersekvens, hvorved der i plasmidet pUC13 mellem restriktionsspaltningsstederne for Xmal og SacI skal indsættes MstI-HindIII-trp--fragmentet fra plasmid pl06/4 (fig. 2), fusioneret med Hindlll-hirudin-SacI-fragmentet fra plasmid pHl50 (fig. 7).
15 Herved behandles DNA af plasmidet pUC13 først med restriktionsenzymet Xmal. Enderne af det lineariserede plasmid opfyldes ved hjælp af Klenow-polymerasereaktion.
Efter ethanolfældning behandles DNA med enzymet SacI og fældes på ny fra reaktionsblandingen med ethanol. DNA om-20 sættes nu i en vandig ligeringsreaktionsblanding med Mstl--HindIII-trp-D-fragmentet, isoleret fra plasmid pH106/4, og Hindlll-SacI-hirudin-fragmentet, isoleret fra plasmid pK150, og T4-DNA-ligase.
Det således fremkomne plasmid pK160 indeholder nu 25 umiddelbart før begyndelsen af trp-D-sekvensen en multipel restriktionsenzym-genkendelsessekvens, som omfatter spaltningssteder for enzymerne Xmal, Smal, BamHI, Xbal,
Hindi, Sall, Accl, PstI og Hindlll. Med denne konstruktion dannes der endvidere efter 3'-enden af hirudin-sek-30 vensen et EcoRI-spaltningssted (fig. 8).
EKSEMPEL 11
Plasmidet pH131/5 fremstilles (ifølge den ikke offentliggjorte tyske patentansøgning nr. P 35 14 113.1, 35 eksempel 1, fig. 1) på følgende mådes 16
O
DK 172618 B1
Plasmidet ptrpLl (J. C. Edman et al., Nature 291 (1981) 503-506) åbnes med Clal og ligeres med det syntetisk fremstillede, selv-komplementære oligonucleotid (N9) 5'pCGACCATGGT 3’ (N9).
5 Det således fremkomne plasmid pHl31/5 (fig. 9) åb nes ved det på denne måde indførte spaltningssted for restriktionsenzymet Ncol, og de fremkomne overlappende enkeltstrenge opfyldes ved hjælp af Klenow-polymerasereaktion.
Det lineariserede DNA med glatte ender efterspaltes nu med 10 enzymet EcoRI, og den største af de to dannede DNA-sekven-ser skilles fra den mindste sekvens ved ethanolfældning.
Det således udvundne restplasmid-DNA af plasmidet pHl31/5 ligeres nu med et for trp-D'-hirudin koderende fragment fra pKl60 ved T4-ligasereaktion. Dette fragment udspaltes 15 fra plasmidet pKl60 ved åbning af plasmidet med Hindi og
EcoRI. Fragmentet skilles gelelektrophoretisk fra restplas-midet og elueres derefter fra gelmaterialet. Ligeringsproduktet transformeres i E. coli K12. Klonerne indeholdende plasmid-DNA isoleres og karakteriseres ved restriktions-20 analyse og DNA-sekvensanalyse. Det således fremkomne plasmid pK170 indeholder fusioneret til trp-operatoren en DNA--sekvens, der koder for Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly--trp-D'-(hirudin) (fig. 9).
25 EKSEMPEL 12
Plasmidet pJF118 (eksempel 6) åbnes med EcoRI, og de udragende DNA-ender omdannes til glatte ender ved hjælp af Klenow-polymerasereaktion. Det således behandlede DNA spaltes derefter med enzymet Sall og skilles gelelektro-30 phoretisk fra det korte EcoRI-Sall-fragment.
Plasmidet pKl70 (eksempel 11) spaltes med Ncol, og de udragende ender omdannes til glatte ender ved hjælp af Klenow-polymerase. Plasmid-DNA skilles fra reaktionsblandingen ved ethanolfældning og behandles med enzymerne 35 Hindlll og BamHI. Blandt de dannede fragmenter isoleres to, nemlig Ncol-(med opfyldt ende)-trpD'-Hindlll-fragmen- 17
O
DK 172618 B1 tet og Hindlll-hirudin-BamHI-fragmentet (DE-offentliggø-relsesskrift nr. 3.429.430). De to fragmenter isoleres ved gelelektrophoretisk adskillelse.
Endvidere isoleres BamHl-Sall-hirudinll-fragmen-5 tet ifølge fig. 2 i DE-offentliggørelsesskrift nr.
3.429.430. Ved en ligeringsreaktion omsættes de fire fragmenter, nemlig pJF118-restplasmidet, Ncol-trpD'-Hindlll--fragmentet, Hindlll-hirudin-BamHI-fragmentet og hirudin- II-fragmentet, med hinanden, og det fremkomne plasmid 10 pK180 (fig. 10) transformeres i E. coli K12-W 3110. Der foreligger rigtige plasmider, når der kan påvises et EcoRI-trpD'-hirudin-Sall-fragment i plasmid-DNA. trpD'--hirudin-sekvensen er nu sluttet til tac-promotoren. Fusionsproteinet eksprimeres ifølge eksempel 6.
15 EKSEMPEL 13
Hos plasmiderne, som afledes af pBR322, såsom pH120/14 (eksempel 1, fig. 1), pHl54/25 (eksempel 1, fig.
3), pH256 (eksempel 4, fig. 5), pK150 (eksempel 8, fig. 7) 2o og pK170 (eksempel 11, fig. 9) befinder der sig, i retning med uret på figurerne, mellem startkodonet af fusionsproteinet og det næste Hindlll-sted (svarende til Hindlll ved position 29 i pBR322) et yderligere PvuII-sted i området af fragmentet, som indeholder trp-promotoren og 25 -operatoren, dog udenfor promotorområdet.
Det er nu blevet konstateret, at der ved fjernelse af DNA-afsnittet, der begrænses af det beskrevne Pvull--sted og Pvull-stedet, der svarer til position 2066 i pBR322, opnås et tydeligt forhøjet udbytte af et klonet 30 protein (eller fusionsprotein).
I det følgende beskrives eksempelvis forkortningen af plasmidet pHl54/25 til pH154/25*, der kan ske op tilsvarende måde for de øvrige ovennævnte plasmider (de forkortede plasmider er markeret med en stjerne): 35 pH154/25 omsættes (ifølge producentens angivelser) med PvuII, hvorved der dannes tre fragmenter: 18
O
DK 172618 B1
Fragment 1: Fra PvuII-restriktionsstedet i proinsulin indtil PvuII-restriktionsstedet svarende til position 2066 i pBR322, fragment 2: fra PvuII-restriktionsstedet nær trp-promotoren 5 indtil PvuII-stedet i proinsulin, og fragment 3: fra PvuII-stedet nær trp-promotor-fragmentet indtil PvuII-stedet svarende til position 2066 i pBR322.
Fragmenterne kan adskilles ved elektrophorese på 10 agarose og derefter isoleres (Maniatis, Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor 1982) .
Fragmenterne 1 og 2 forbindes ved hjælp af enzymet T4-DNA-ligase under "stump-ende"-betingelser. Efter transformation i E. coli 294 undersøges det, i hvilke kolonier 15 der er et plasmid til stede med den fuldstændige proinsu-linsekvens og dermed foreligger fragmenter med den Ønskede anordning. Plasmid pHl54/25* er vist i fig. 11.
Ved ekspressionen, der sker som beskrevet i de foregående eksempler, observeres en tydelig forøgelse af fu-2o sionsproteinandelen.
EKSEMPEL 14
Plasmidet pH154/25* (eksempel 13, fig. 11) nedbrydes med Hindlll og Sall, og det lille fragment (med pro-25 insulinsekvensen) fraskilles gelelektrophoretisk. Det store fragment isoleres og ligeres med det syntetiske DNA (N10) (Ala) Trp Glu Asp Pro Met Ile Glu (Gly) (Arg)
30 A GCT TGG GAG GAT CCT ATG ATC GAG GG
ACC CTC CTA GGA TAC TAG CTC CCA GCT
(N10) herved dannes plasmidet plntl3 (fig. 12).
DNA (N10) koder for en aminosyresekvens, der inde-35 holder flere spaltningssteder til en kemisk spaltning: 19
O
DK 172618 B1 a) Met for bromcyan, b) Trp for N-bromsuccinimid (NBS eller BSI) c) Asp-Pro til proteolytisk spaltning, idet det foranstillede Glu svækker Asp-Pro-bindingen yderligere overfor 5 indvirkning af syrer.
Indføringen af denne Hindlll-Sall-linker (N10) i aflæsningsrammen af et kodet polypeptid giver altså de anførte muligheder for en kemisk fraspaltning alt efter aminosyrerækkefølgen af det ønskede protein eller dets 10 følsomhed overfor spaltningsmidlerne.
Figurerne er ikke i korrekt målestok.
15 20 25 30 35 20
O
DK 172618 B1
Aminosyresekvens I 23
Ser Asn Gly His Asn Val Val Ile 5 10
Tyr Arg Asn His Ile Pro Ala Gin 20 10 Thr Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr 30
Met Ser Asn Pro Val Leu Met Leu 15 40
Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro Ser
Glu Ala Gly Cys Met Pro Glu Leu 20 50
Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu 60 25 Pro Ile Ile Gly Ile Cys Leu Gly 70 (93)
His Gin Ala Ile Val Glu Ala 30 35 21
O
DK 172618 B1
DNA-Sekvens I
Ser Asn Gly His Asn Val Val Ile
5 AGC AAT GGG CAT AAC GTG GTG ATT
10
Tyr Arg Asn His Ile Pro Ala Gin
TAC CGC AAC CAT ATA CCG GCG C AA
10 20
Thr Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr
ACC TTA ATT G AA CGC TTG GCG ACC
50 15 30
Met Ser Asn Pro Val Leu Met Leu
ATG AGT AAT CCG GTG CTG ATG CTT
40 2o Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro Ser
TCT CCT GGC CCC GGT GTG CCG AGC
100
Glu Ala Gly Cys Met Pro Glu Leu
25 G AA GCC GGT TGT ATG CCG G AA CTC
50
Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu
CTC ACC CGC TTG CGT GGC AAG CTG
150 30 60
Pro Ile Ile Gly Ile Cys Leu Gly
CCC ATT ATT GGC ATT TGC CTC GGA
35 7 0
His Gin Ala Ile Val Glu Ala
CAT CAG GCG ATT GTC G AA GCT
200
Claims (12)
1. Fusionsprotein med den almene formel Met-X -D'-Y-Z n 5 hvori n betyder 0 eller 1, X betyder en sekvens af 1-12 genetisk koderbare aminosyrer, D' betyder en sekvens på ca. 70 aminosyrer i området af aminosyresekvensen 23-93 i D-peptidet i trp-operonet af 10 E. coli, Y betyder en sekvens af én eller flere genetisk koderbare aminosyrer, der muliggør en fraspaltning af den følgende aminosyresekvens Z, og Z betyder en sekvens af genetisk koderbare aminosyrer.
2. Fusionsprotein ifølge krav 1, kendeteg net ved, at n betyder 1, og X omfatter indtil 5 aminosyrer, hvorved der fortrinsvis N-terminalt er placeret Lys-Ala i X.
3. Fusionsprotein ifølge krav 1 eller 2, kende- 2o tegnet ved, at Y C-terminalt indeholder Met, Cys, Trp, Arg eller Lys eller en af grupperne (AspJ^-Pro hhv. Glu-(Asp)m~Pro eller Ile-Glu-Gly-Arg 25 hvori m betyder 1, 2 eller 3, eller består af disse aminosyrer eller en af disse grupper.
4. Fusionsprotein ifølge et eller flere af kravene 1-3, kendetegnet ved, at Z betyder aminosyresekvensen af humant proinsulin eller et hirudin.
5. Fremgangsmåde til fremstilling af fusionsprotei ner ifølge et eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at en genstruktur, der koder for disse fusionsproteiner, eksprimeres i en værtscelle, fortrinsvis i en bakterie, især E. coli, og fusionsproteinet fraskilles.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg net ved, at DNA-sekvensen I (jf. bilag) koder for D* DK 172618 B1 i genstrukturen, og/eller DNA-sekvensen (kodende streng) 5' AAA GCA AAG GGC 3' 5 koder for X i genstrukturen, og/eller at genstrukturen vælges således, at fusionsproteinet er uopløseligt, og/eller at genstrukturen er indeholdt i fase i en vektor, der fra trp-operonet af E. coli indeholder promotoren, operatoren og ribosombindingsstedet af L-peptidet.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg net ved, at vektoren er et derivat af pBR322, hvorved der fra pBR322-DNA er fjernet afsnittet fra HindIII-ste-det ved position 29 til PvuII-stedet ved position 2066.
8. Genstruktur, kodende for fusionsproteiner iføl- 15 ge krav 1-4.
9. Vektor, fortrinsvis derivat af plasmid pBR322, hvor der fra pBR322-DNA er fjernet afsnittet fra Hindlll--stedet ved position 29 til PvuII-stedet ved position 2066, indeholdende en genstruktur ifølge krav 8.
10. Ekspressionssystem, fortrinsvis E. coli-system, indeholdende en vektor ifølge krav 9.
11. Fremgangsmåde til fremstilling af et eukaryo-tisk protein, kendetegnet ved, at der fra et fusionsprotein ifølge krav 1-4 foretages en kemisk eller 25 enzymatisk fraspaltning af aminosyresekvensen Z.
12. Plasmiderne pHl54/25 (fig. 3), pH254 (fig. 4), pH255 (fig. 4), pH256 (fig. 5), pH257 (fig. 5), pH120/14 (fig. 1), pK150 (fig. 7), pK160 (fig. 8), pK170 (fig. 9), pK180 (fig. 10), pH154/25* (fig. 11), pH256*, der svarer 30 til pH256 i figur 5, hvoraf fragmentet der fås med PvuII fjernes som vist i figur li, pH120/l4*, der svarer til pH120/l4 i figur l, hvoraf fragmentet der fås med PvuII fjernes som vist i figur li, pK150*, der svarer til pKl50, i fig. 7, hvoraf fragmentet som fås med PvuII fjernes som 35 vist i figur 11, pK170*, der svarer til pK170 i figur 9, hvoraf fragmentet der fås med PvuII fjernes som vist i figur 11 og plntl3 (fig. 12).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853526995 DE3526995A1 (de) | 1985-07-27 | 1985-07-27 | Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| DE3526995 | 1985-07-27 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK355486D0 DK355486D0 (da) | 1986-07-25 |
| DK355486A DK355486A (da) | 1987-01-28 |
| DK172618B1 true DK172618B1 (da) | 1999-03-01 |
Family
ID=6276985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198603554A DK172618B1 (da) | 1985-07-27 | 1986-07-25 | Fusionsproteiner, deres fremstilling og anvendelse |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0211299B1 (da) |
| JP (1) | JPH07113040B2 (da) |
| KR (1) | KR950000299B1 (da) |
| AT (1) | ATE50596T1 (da) |
| AU (1) | AU595221B2 (da) |
| CA (1) | CA1336329C (da) |
| DE (2) | DE3526995A1 (da) |
| DK (1) | DK172618B1 (da) |
| ES (1) | ES2000278A6 (da) |
| FI (1) | FI86887C (da) |
| GR (1) | GR861957B (da) |
| HU (1) | HU197356B (da) |
| IE (1) | IE59127B1 (da) |
| IL (1) | IL79522A (da) |
| NO (1) | NO175640C (da) |
| NZ (1) | NZ216967A (da) |
| PT (1) | PT83065B (da) |
| ZA (1) | ZA865556B (da) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE3781819T2 (de) * | 1986-03-12 | 1993-01-07 | Imcera Group Inc | Hybride expressionsvektoren, deren herstellung und verwendungen. |
| EP0371041A1 (en) * | 1987-06-24 | 1990-06-06 | Novo Nordisk A/S | A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| US5358857A (en) * | 1989-08-29 | 1994-10-25 | The General Hospital Corp. | Method of preparing fusion proteins |
| US5227293A (en) * | 1989-08-29 | 1993-07-13 | The General Hospital Corporation | Fusion proteins, their preparation and use |
| GR1005153B (el) * | 1989-08-29 | 2006-03-13 | The General Hospital Corporation | Πρωτεινες συντηξεως, παρασκευη τους και χρηση τους. |
| GB8927722D0 (en) * | 1989-12-07 | 1990-02-07 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
| DE3942580A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-06-27 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von hirudin |
| ATE264871T1 (de) | 1996-07-26 | 2004-05-15 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivate mit erhöhter zinkbindung |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| EP2522728A1 (en) | 2007-09-21 | 2012-11-14 | Cadila Healthcare Limited | GCSF fusion protein systems suitable for high expression of peptides |
| LT2349324T (lt) | 2008-10-17 | 2017-12-27 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulino ir glp-1 agonisto derinys |
| PL2498801T3 (pl) | 2009-11-13 | 2018-08-31 | Sanofi Aventis Deutschland | Kompozycja farmaceutyczna zawierająca desPro<sup>36</sup>eksendyno-4(1-39)-Lys6-NH2 i metioninę |
| ES2534191T3 (es) | 2009-11-13 | 2015-04-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Composición farmacéutica que comprende un agonista de GLP-1, una insulina y metionina |
| HUE031181T2 (en) | 2010-08-30 | 2017-06-28 | Sanofi Aventis Deutschland | Use of AVE0010 for the manufacture of a medicament for the treatment of type 2 diabetes |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| CN108079281A (zh) | 2011-08-29 | 2018-05-29 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 用于2型糖尿病患者中的血糖控制的药物组合 |
| AR087744A1 (es) | 2011-09-01 | 2014-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa |
| US9950039B2 (en) | 2014-12-12 | 2018-04-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| KR20200080747A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법 |
| KR20200080748A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR68404B (da) * | 1979-06-01 | 1981-12-29 | Univ California | |
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| JPS62502586A (ja) * | 1985-03-18 | 1987-10-08 | ジ−ン ラブズ，インコ−ポレイテツド | ハイブリツド遺伝子カセツトベクタ− |
| GB8507666D0 (en) * | 1985-03-25 | 1985-05-01 | Wellcome Found | Epidermal growth factor production |
| WO1986006099A1 (en) * | 1985-04-08 | 1986-10-23 | Genetic Systems Corporation | EXPRESSION AND DIAGNOSTIC USE OF gag ENCODED PEPTIDES WHICH ARE IMMUNOLOGICALLY REACTIVE WITH ANTIBODIES TO LAV |
-
1985
- 1985-07-27 DE DE19853526995 patent/DE3526995A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-07-19 EP EP86109945A patent/EP0211299B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-19 AT AT86109945T patent/ATE50596T1/de active
- 1986-07-19 DE DE8686109945T patent/DE3669175D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-24 FI FI863041A patent/FI86887C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-07-24 ES ES8600544A patent/ES2000278A6/es not_active Expired
- 1986-07-25 PT PT83065A patent/PT83065B/pt unknown
- 1986-07-25 DK DK198603554A patent/DK172618B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 IE IE197786A patent/IE59127B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 GR GR861957A patent/GR861957B/el unknown
- 1986-07-25 IL IL79522A patent/IL79522A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 ZA ZA865556A patent/ZA865556B/xx unknown
- 1986-07-25 AU AU60565/86A patent/AU595221B2/en not_active Expired
- 1986-07-25 NO NO863000A patent/NO175640C/no unknown
- 1986-07-25 HU HU863100A patent/HU197356B/hu unknown
- 1986-07-25 NZ NZ216967A patent/NZ216967A/xx unknown
- 1986-07-25 CA CA000514682A patent/CA1336329C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-26 KR KR1019860006142A patent/KR950000299B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-07-26 JP JP61176558A patent/JPH07113040B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK355486A (da) | 1987-01-28 |
| IE59127B1 (en) | 1994-01-12 |
| JPS6229600A (ja) | 1987-02-07 |
| EP0211299A2 (de) | 1987-02-25 |
| IL79522A0 (en) | 1986-10-31 |
| DE3526995A1 (de) | 1987-02-05 |
| JPH07113040B2 (ja) | 1995-12-06 |
| DE3669175D1 (de) | 1990-04-05 |
| ES2000278A6 (es) | 1988-02-01 |
| NO175640C (no) | 1994-11-09 |
| AU6056586A (en) | 1987-01-29 |
| EP0211299A3 (en) | 1988-06-01 |
| DK355486D0 (da) | 1986-07-25 |
| PT83065A (de) | 1986-08-01 |
| IE861977L (en) | 1987-01-27 |
| GR861957B (en) | 1986-11-25 |
| IL79522A (en) | 1991-08-16 |
| ZA865556B (en) | 1987-03-25 |
| FI863041A (fi) | 1987-01-28 |
| FI86887B (fi) | 1992-07-15 |
| FI86887C (fi) | 1992-10-26 |
| HU197356B (en) | 1989-03-28 |
| KR870001312A (ko) | 1987-03-13 |
| NO863000L (no) | 1987-01-28 |
| NO863000D0 (no) | 1986-07-25 |
| CA1336329C (en) | 1995-07-18 |
| NO175640B (da) | 1994-08-01 |
| FI863041A0 (fi) | 1986-07-24 |
| NZ216967A (en) | 1988-08-30 |
| PT83065B (pt) | 1989-02-28 |
| HUT43629A (en) | 1987-11-30 |
| AU595221B2 (en) | 1990-03-29 |
| ATE50596T1 (de) | 1990-03-15 |
| EP0211299B1 (de) | 1990-02-28 |
| KR950000299B1 (ko) | 1995-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK172618B1 (da) | Fusionsproteiner, deres fremstilling og anvendelse | |
| IL95495A (en) | Fusion proteins their preparation and use | |
| DK172210B1 (da) | Hirudinderivater | |
| FI91883C (fi) | Menetelmä hirudiinin vaikutusta omaavan polypeptidin valmistamiseksi | |
| Miller | Primary structure of the himA gene of Escherichia coli: homology with DNA-binding protein HU and association with the phenylalanyl-tRNA synthetase operon | |
| Lupski et al. | Regulation of the rpsU-dnaG-rpoD macromolecular synthesis operon and the initiation of DNA replication in Escherichia coli K-12 | |
| KR100858009B1 (ko) | 세균 배양물의 상층액으로 목적 단백질의 분비를 위한 융합 단백질 | |
| AU607209B2 (en) | Secretion of insulin-like growth factor-i in e. coli | |
| US5489517A (en) | Secretion of insulin-like growth factor-I in E. coli | |
| Sung et al. | Short synthetic oligodeoxyribonucleotide leader sequences enhance accumulation of human proinsulin synthesized in Escherichia coli. | |
| DK166681B1 (da) | Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2 | |
| DK171940B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider meden C-terminal carboxamidgruppe, polypeptider til anvendelse ved fremgangsmåden, fusionsproteiner deraf og dertil egnede DNA-sekvenser, plasmider og værtsorganismer | |
| CA1340280C (en) | Synthetic signal sequence for the transport of proteins in expression systems | |
| EP0046669A1 (en) | Somatostatin or somatostatin precursors | |
| EP0207165A1 (en) | Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms | |
| IE57976B1 (en) | Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives | |
| Murata et al. | Production of poly (L-aspartyl-L-phenylalanine) in Escherichia coli | |
| AU600229B2 (en) | Modification of the DNA sequemce between the shine-dalgarno sequence and the start codon of the TRP operon to increase protein expression | |
| KR840002090B1 (ko) | 폴리펩티드 헵텐을 함유하는 면역성 물질인 폴리펩티드를 제조하는 방법 | |
| KR840002106B1 (ko) | 세균숙주의 형질전환에 적합한 재조합 클로닝 베히클의 제조방법 | |
| Narang | Chemical synthesis, cloning and expression of human preproinsulin gene |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |