DK172210B1 - Hirudinderivater - Google Patents
Hirudinderivater Download PDFInfo
- Publication number
- DK172210B1 DK172210B1 DK052292A DK52292A DK172210B1 DK 172210 B1 DK172210 B1 DK 172210B1 DK 052292 A DK052292 A DK 052292A DK 52292 A DK52292 A DK 52292A DK 172210 B1 DK172210 B1 DK 172210B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- hirudin
- plasmid
- gac
- ctg
- leu
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
DK 172210 B1
Den foreliggende opfindelse angår hirudinderivater med hirudinaktivitet, som er ejendommelige ved en aminosyre-sekvens, som N-terminalt begynder med Pro, fortrinsvis med Pro-His eller Pro-Thr.
5 Disse hirudinderivater udviser den samme aktivitet som naturproduktet ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 3.429.430, der i disse positioner har aminosyrerne Thr og Tyr, men er mere stabile mod angreb af aminopeptidaser og er derfor mere fordelagtige ved in vivo-anvendeIse.
10 Hirudinderivaterne ifølge opfindelsen fremstilles for delagtigt genteknologisk ved anvendelse af et "åbent aflæs-ningsraster" fra et DNA, der koder for interleukin-2, som ekspressionshjælpemiddel.
Ved genteknologisk fremstilling af eukaryotiske pro-15 teiner opnås der i bakterier hyppigt kun et ringe udbytte, især ved små proteiner med en molekylvægt på indtil ca.
15.000 dalton, hvis strukturer indeholder disulfidbroer.
Det antages, at de dannede proteiner hurtigt nedbrydes af værtsegne proteaser. Der konstrueres derfor hensigtsmæssigt 20 genstrukturer, der koder for fusionsproteiner, hvorved den uønskede andel af fusionsproteinet er et værtseget protein, som efter isolering af primærproduktet fraspaltes ved i og for sig kendte metoder.
Det har imidlertid vist sig, at en N-terminal andel 25 af interleukin-2, der i det væsentlige svarer til de første 100 aminosyrer, er særlig godt egnet til fremstilling af fusionsproteiner. Der fås altså som primærprodukt et fusionsprotein, der fuldstændigt eller helt overvejende består af eukaryotiske proteinsekvenser. Dette protein erkendes åben-30 bart ikke som fremmedprotein i den anvendte værtsorganisme og nedbrydes ikke straks igen. En anden fordel er, at fusionsproteinerne er tungtopløselige til uopløselige og derfor let kan fraskilles fra de opløselige proteiner, hensigtsmæssigt ved centrifugering.
35 Da det med hensyn til funktionen som "ballast-andel" af fusionsproteinet ikke er af afgørende betydning, at inter- 2 DK 172210 B1 leukin-2-andelen er et biologisk aktivt molekyle, er den nøjagtige struktur af interleukin-2-andelen heller ikke af afgørende betydning. Det er herved tilstrækkeligt, at der i det væsentlige foreligger de første 100 N-terminale amino-5 syrer. Det er altså f.eks. muligt at foretage variationer ved N-terminussen, der tillader en spaltning af fusionsproteinet, hvis det ønskede protein, dvs. et hirudinderivat ifølge opfindelsen, er anordnet N-terminalt dertil. Omvendt kan der foretages C-terminale variationer for at muliggøre 10 eller lette fraspaltningen af det ønskede protein, hvis dette, således som det er almindeligt, er bundet C-terminalt i fusionsproteinet.
Den naturlige DNA-sekvens, der koder for humant inter-leukin-2, i det følgende betegnet IL-2, er kendt fra den 15 europæiske patentansøgning med offentliggørelsesnummeret EP-A1-0.091.539. Den der anførte litteratur refererer til muse- og rotte-IL-2. Disse pattedyr-DNA'er kan anvendes til syntese af de her omhandlede proteiner. Mere hensigtsmæssigt gås der dog ud fra et syntetisk DNA, særlig fordelagtigt 20 fra DNA for humant IL-2, som er foreslået i (ikke offentliggjort) DE offentliggørelsesskrift nr. 3.419.995 (svarende til den europæiske patentansøgning, der er offentliggjort under nr. 163.249). Denne syntetiske DNA-sekvens er anført i bilaget (DNA-sekvens I). Dette syntetiske DNA har ikke 25 kun den fordel, at det med hensyn til codon-valget er afstemt efter forholdene i den hyppigst anvendte værtsorganisme, E. coli, men indeholder også en række af spaltningssteder for restriktionsendonucleaser, hvoraf der kan gøres brug. I den følgende tabel I er der anført et udvalg af egnede spalt-30 ningssteder ved begyndelsen henholdsvis i området af triplet nr. 100. Herved er det dog ikke udelukket, at der kan foretages variationer i DNA'et i det derimellem liggende område, hvorved der kan gøres brug af de i den ovennævnte patentansøgning anførte yderligere spaltningssteder.
35 3 DK 172210 B1
Tabel I
Position af det første nukleotid af genken-5 Genkendelses- delsessekvensen (ko-
Restriktionsenzym_sekvens_derende streng) 5' 3'
Aha II, Ban I,
Hae II, Nar I, GGCGCC 8
Ban II, Sac I, Sst I GAGCTC 291 10
Hha I GCGC 9
Hinf I GACTC 35
Pvu I CGATCG 346
Taq I TCGA 387 15 "
Hvis der gøres brug af nucleaserne Ban II, Sac I eller Sst I, fås der en IL-2-delsekvens, der koder for ca.
95 aminosyrer. Denne længde er i almindelighed tilstrækkelig til at opnå et uopløseligt fusionsprotein. Hvis tungtopløse-2 0 ligheden ikke er tilstrækkelig, men man - for at producere så lidt "ballast" som muligt - ikke vil gøre brug af de spaltningssteder, der ligger nærmere ved C-terminussen, kan man ved hjælp af tilsvarende adaptere eller linkere forlænge DNA-sekvensen ved den N-terminale og/eller C-terminale ende 25 og således "skræddersy" "ballast"-andelen. Man kan naturligvis også mere eller mindre udnytte DNA-sekvensen indtil slutningen og således producere eventuelt modificeret, biologisk aktivt IL-2 som "biprodukt".
Fusionsproteinerne har de almene formler 30 4 DK 172210 B1 *
Met - X - Υ - Z eller Met - Z - Y - X (la) (Ib) hvori X i det væsentlige betyder aminosyresekvensen af 5 de ca. 100 første aminosyrer af fortrinsvis humant IL--2, Y betyder en direkte binding, hvis aminosyren eller aminosyresekvensen, som er nabostillet til det ønskede protein, muliggør en fraspaltning af det ønskede protein, og ellers et broled af en eller flere genetisk 10 koderbare aminosyrer, som muliggør fraspaltningen, og Z betyder en sekvens af genetisk koderbare aminosyrer, der koder for det ønskede protein.
Som det fremgår af formel la og Ib, og som det allerede er nævnt ovenfor, er det muligt at bringe det 15 ønskede protein til ekspression før eller efter IL-2--andelen. For enkeltheds skyld forklares i det følgende i det væsentlige den første mulighed, der svarer til den gængse metode til fremstilling af fusionsproteiner.
Når denne "klassiske" variant beskrives i det følgende, 20 skal det andet alternativ altså ikke herved udelukkes.
Spaltningen af fusionsproteinet kan ske kemisk eller enzymatisk på i og for sig kendt måde. Når Y betyder Met, kan der ske en kemisk spaltning med chlor- eller bromcyan.
Hvis der i bindeleddet Y ved carboxyterminussen foreligger 25 cystein eller Y betyder Cys, kan der ske en enzymatisk cy-steinspecifik spaltning eller en kemisk spaltning, f.eks. ved specifik S-cyanylering. Hvis der i broleddet Y ved carboxyterminussen foreligger tryptophan eller Y betyder Trp, kan der ske en kemisk spaltning med N-bromsuccinimid.
30 Fusionsproteinet kan også spaltes med faktor Xa (EP- patentansøgningerne med offentliggørelsesnumrene 25.190 og 161.973).
Fusionsproteinet fås på i og for sig kendt måde ved ekspression i et egnet ekspressionssystem. Egnet hertil er 35 alle kendte vært-vektor-systemer, altså f.eks. pattedyrceller og mikroorganismer, f.eks. gærarter og fortrinsvis bakterier, især E. coli.
DK 172210 Bl 5 DNA-sekvensen, som koder for det ønskede protein, indbygges på kendt måde i en vektor, som sikrer en god ekspression i det valgte ekspressionssystem.
I bakterielle værtsorganismer vælges promotoren 5 og operatoren hensigtsmæssigt fra gruppen lac, tac, trp, PL eller pr af A”fagt hsp, omp eller en syntetisk promotor, som f.eks. er foreslået i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.430.683 (EP patentansøgning med offentliggørelsesnummeret 173.149). Fordelagtig er tac-promotor-10 -operator-sekvensen, som i mellemtiden er blevet handelsgængs (f.eks. ekspressionsvektor pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 63).
Ved ekspressionen af det her omhandlede fusions-15 protein kan det vise sig at være hensigtsmæssigt at ændre enkelte tripletter af de første aminosyrer efter ATG-start-codonet for at forhindre en eventuel baseparring på mRNA-plan. Sådanne ændringer, ligesom ændringer, udeladelser eller tilføjelser af enkelte aminosyrer i 20 IL-2-proteinandelen, er gængse for en fagmand og ligeledes genstand for opfindelsen.
I de følgende eksempler og på tegningen forklares opfindelsen nærmere.
Fig. 1 og dennes fortsættelse, fig. la, på tegnin-25 gen viser syntesen af plasmidet pK360, der koder for et fusionsprotein, som udviser hirudinsekvensen.
Fig. 2 og dens fortsættelse, fig. 2a, viser syntesen af plasmidet pK410, som ligeledes koder for et fusionsprotein med hirudin-aminosyresekvensen.
30 Fig. 3 viser syntesen af plasmidet pPHIOO, som koder for et fusionsprotein med hirudin-aminosyresekvensen.
Figurerne er ikke målestokskorrekte, fremfor alt er målestokken "strakt" ved polylinkerens område.
0 6 DK 172210 B1
Eksempel 1
Ved indføjelse af lac-repressoren (P.J, Farabaugh,. Nature 274 (1978) 765-769) i plasmidet pKK 177-3 (Amann et al., Gene 25^ (1983) 167) fås plasmidet pJFH8 (1) 5 (fig. 1, jf. DE patentansøgning nr. 3.526.995, eksempel 6, fig. 6). Dette åbnes ved det eneste restriktionssted for Ava I og formindskes med ca. 1000 bp ved exonuclease--behandling på i og for sig kendt måde. Efter ligering fås plasmidet pEW 1000 (2) (fig. 1), hvori lac-repressor-10 genet er bevaret fuldstændig, men på grund af formindskelsen foreligger med et tydeligt højere kopiantal end udgangsplasmidet.
I stedet for plasmidet pKKl77-3 kan man også gå ud fra det ovennævnte handelsgængse plasmid pKK223-3, 15 indbygge lac-repressoren og forkorte det fremkomne produkt på analog måde.
Plasmidet pEW 1000 (2) åbnes med restriktionsenzymerne EcoR I og Sal I (3).
Det for hirudin koderende plasmid (4), fremstil-20 les ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 3.429.430 (EP patentansøgning med offentliggørelsesnummeret 171.024), eksempel 4 (fig. 3), åbnes med restriktionsenzymerne Accl og Sall, og det lille fragment (5), der for størstedelens vedkommende indeholder hirudinsekvensen, isoleres.
25 Plasmidet pl59/6 (6), fremstillet ifølge DE offent liggørelsesskrift nr. 3.419.995 (EP patentansøgning med offentliggørelsesnummeret 163.249), eksempel 4 (fig.
5), åbnes med restriktionsenzymerne Eco RI og Pvu I, og det lille fragment (7), som indeholder størstede-30 len af IL-2-sekvensen, isoleres. Denne delsekvens og i det følgende også andre forkortede IL-2-sekvenser er i figurerne betegnet "AIL2".
Derefter behandles sekvenserne (3), (5), (7) samt den syntetiske DNA-sekvens (8, fig. la) med T4-li-35 gase. Der fås plasmidet pK360 (9).
DK 172210 B1 7 0
Kompetente E. coli-celler transformeres med ligeringsproduktet og udplades på NA-plader, som indeholder 25 ^ig/ml ampicillin. Plasmid-DNA'et af klonerne karakteriseres ved hjælp af restriktions- og sekvensana-5 lyse.
En kultur natten over af E. coli-celler, som indeholder plasmidet (9), fortyndes med LB-medium (J.H.
Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972), som indeholder 50 ^ig/ml am-10 picillin, i forholdet ca. 1:100, og væksten følges ved 0D--måling. Ved en OD-værdi på 0,5 indstilles rystekulturen til 1 mM isopropyl-p-galactopyranosid (IPTG), og bakterierne fracentrifugeres efter 150-180 minutter. Bakterierne koges i 5 minutter i en pufferblanding 15 (7M urinstof, 0,1% SDS, 0,1M natriumphosphat, pH-værdi 7,0) , og prøver anbringes på en SDS-gelelektroforese-plade. Efter elektroforese fås der fra bakterier, som indeholder plasmidet (9), et proteinbånd, som svarer til størrelsen af det forventede fusionsprotein. Efter 20 oplukning af bakterierne (French Press; "Dyno-Muhle") og centrifugering befinder fusionsproteinet sig i bundfaldet, således at der allerede med den ovénstående væske kan fraskilles betydelige mængder af de øvrige proteiner. Efter isolering af fusionsproteinet frigø-25 res det forventede hirudin-peptid ved bromcyan-spalt-ning. Dette karakteriseres efter isolering ved prote-in-sekvensanalyse.
De angivne induktionsbetingelser gælder for rystekulturer. Ved større fermenteringer er tilsvarende 30 ændrede OD-værdier og eventuelt let varierede IPTG-kon-centrationer hensigtsmæssige.
35 0 8 DK 172210 B1
Eksempel 2
Plasmidet (4) (fig. 1) åbnes med Acc I, og de udragende ender opfyldes med Klenow-polymerase. Derefter spaltes der med Sac I, og fragmentet (10), der indehol-5 der størstedelen af hirudin-sekvensen, isoleres.
Den handelsgængse vektor pUC 13 åbnes med restriktionsenzymerne Sac I og Sma I, og det store fragment (11) isoleres.
Ved hjælp af T4-ligase ligeres nu fragmenterne 10 (10) og (11) til plasmidet pK 400 (12) (fig. 2). Plas midet (12) er vist to gange i fig. 2, idet aminosyrese-kvensen af det således fremstillelige hirudinderivat er fremhævet på den nederste afbildning.
Plasmidet (4) (fig. 1) åbnes med restriktionsen-13 zymerne Κρη I og Sal I, og det lille fragment (13), der indeholder hirudin-delsekvensen, isoleres.
Plasmidet (12) omsættes med restriktionsenzymerne Hine II og Κρη I, og det lille fragment (14), der indeholder hirudin-delsekvensen, isoleres.
20 Plasmidet (9) (fig. la) spaltes partielt med
EcoR I, de frie ender opfyldes med Klenow-polymerase ved en "fill-in"-reaktion og spaltes med Sal I. Der fås derivatet af plasmidet pK360 (15).
Ved ligering af fragmenterne (3), (13), (14) og 25 (15) fås plasmidet pK410 (16), som er vist to gange i fig. 2a, idet aminosyresekvensen af fusionsproteinet og dermed det efter syrespaltning fremkomne hirudinderivat fremgår af den nederste afbildning.
Efter ekspression og oparbejdning ifølge eksem-30 pel 1 fås et nyt hirudinderivat, som i positionerne 1 og 2 har aminosyrerne prolin og histidin. Dette hirudinderivat udviser den samme aktivitet som naturproduktet ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 3.429.430, der i disse positioner har aminosyrerne threonin og tyrosin, 35 men er mere stabilt mod angreb af aminopeptidaser, hvilket kan give fordele ved in vivo-anvendelse.
9 0 DK 172210 B1
Eksempel 3
Plasmidet (6) (fig. 1) åbnes med restriktionsenzymerne Taq I og Eco RI, og det lille fragment (43) isoleres. Dette fragment ligeres med den syntetiserede 5 DNA-sekvens (44) og segmenterne (3) og (5) til plasmidet pPH 100 (45) . Dette plasmid koder for et fusionsprotein, hos hvilket der efter de første 132 aminosyrer af IL-2 følger broleddet Asp-Pro og herefter amino-syresekvensen af Hirudin. Den proteolytiske spaltning 10 giver således et modificeret, biologisk aktivt IL-2', som i position 133 i stedet for Thr indeholder Asp, og et hirudinderivat, som N-terminalt indeholder Pro før aminosyresekvensen af naturproduktet. Også dette produkt er biologisk aktiv og i sammenligning med natur-15 produktet mere stabilt mod angreb af proteaser.
11-2'-hirudin-fusionsproteinet udviser ligeledes biologisk aktivitet: ved celleproliferationsforsøg med en IL-2-af-hængig cellelinie (CTLL2) findes biologisk aktivitet.
20 25 30 35 o 10 DK 172210 B1
Bilag I; DNA-sekvens af interleukin-2 5
Triplet nr. 012
Aminosyre Met Ala Pro
Nucleotid nr. 1 10
Kodende streng 5· AA TTC ATG GCG CCG
10 Ikke-kodende streng 3' G TAC CGC GGC
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu 20 30 40
15 ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG
TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTC TGA GTT GAC
13 H 15 16 17 18 19 20 21 22
Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin 20 50 " 60 70
CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG
GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC CTG GAC GTC
23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 25 Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 80 90 100
ATG ATC CTG AAC GGT AT C AAC AAC ' TAC AAA
TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT
30 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 110 120 130
AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC
TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAC TGG AAG
35 o 11 DK 172210 B1 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 140 150 160
AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA
5 TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62
Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu 170 180 190
10 CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG
GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT CTC
63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu 15 200 210 220
CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG
GAC TTT GGC GAC CTC CTT CAA GAC TTG GAC
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 20
Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 230 240 250
GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG
CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC
25 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 260 270 280
CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC
GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG
3Q - 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 290 300 310
GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG
CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC
35 12 0 DK 172210 B1 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340
5 TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG
AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC
113 114 115 116 117 118 119 120 121 122
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile 10 350 360 370
ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC
TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG
123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 15 Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu 380 390 400
ACC TTC TGC CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG
TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC
20 133 134 135
Thr 410 ACC TGA TAG 3' TGG ACT ATC AGC T 5' 25 30 35
Claims (1)
- DK 172210 B1 Hirudinderivater med hirudinaktivitet, kende -tegnet ved en aminosyresekvens, som N-terminalt begynder med Pro, fortrinsvis med Pro-His eller Pro-Thr.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853541856 DE3541856A1 (de) | 1985-11-27 | 1985-11-27 | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE3541856 | 1985-11-27 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK52292A DK52292A (da) | 1992-04-21 |
| DK52292D0 DK52292D0 (da) | 1992-04-21 |
| DK172210B1 true DK172210B1 (da) | 1998-01-05 |
Family
ID=6286938
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK568586A DK172064B1 (da) | 1985-11-27 | 1986-11-26 | Fusionsprotein, dets fremstilling og anvendelse, genstruktur, som koder for fusionsproteinet, vektor, som indeholder genstrukturen, og værtscelle, som indeholder vektoren |
| DK052292A DK172210B1 (da) | 1985-11-27 | 1992-04-21 | Hirudinderivater |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK568586A DK172064B1 (da) | 1985-11-27 | 1986-11-26 | Fusionsprotein, dets fremstilling og anvendelse, genstruktur, som koder for fusionsproteinet, vektor, som indeholder genstrukturen, og værtscelle, som indeholder vektoren |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP0227938B1 (da) |
| JP (1) | JP2566933B2 (da) |
| KR (1) | KR950000300B1 (da) |
| AT (2) | ATE127841T1 (da) |
| AU (1) | AU595262B2 (da) |
| CA (1) | CA1341203C (da) |
| DE (4) | DE3541856A1 (da) |
| DK (2) | DK172064B1 (da) |
| ES (3) | ES2077747T3 (da) |
| FI (1) | FI93471C (da) |
| GR (1) | GR3005042T3 (da) |
| HU (1) | HU203579B (da) |
| IE (1) | IE59488B1 (da) |
| IL (1) | IL80755A0 (da) |
| NO (1) | NO176481C (da) |
| PT (1) | PT83813B (da) |
| ZA (1) | ZA868943B (da) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3125021A (en) * | 1955-11-14 | 1964-03-17 | Smooth | |
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
| DE3712985A1 (de) * | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
| DE3819079A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| WO1991000912A1 (en) * | 1989-07-07 | 1991-01-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Production and use of hybrid protease inhibitors |
| CU22222A1 (es) * | 1989-08-03 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes |
| GB8927722D0 (en) * | 1989-12-07 | 1990-02-07 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
| DE3942580A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-06-27 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von hirudin |
| US5270181A (en) * | 1991-02-06 | 1993-12-14 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| ES2218622T3 (es) | 1996-07-26 | 2004-11-16 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada. |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| DE10033195A1 (de) * | 2000-07-07 | 2002-03-21 | Aventis Pharma Gmbh | Bifunktionale Fusionsproteine aus Hirudin und TAP |
| US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| HUE037449T2 (hu) | 2008-10-17 | 2018-08-28 | Sanofi Aventis Deutschland | Egy inzulin és egy GLP-1 agonista kombinációja |
| RU2537239C2 (ru) | 2009-11-13 | 2014-12-27 | Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх | Фармацевтическая композиция, включающая агонист glp-1, инсулин и метионин |
| PE20121316A1 (es) | 2009-11-13 | 2012-10-05 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1 y metionina |
| PT2611458T (pt) | 2010-08-30 | 2016-12-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Utilização de ave0010 para o fabrico de um medicamento para o tratamento da diabetes mellitus tipo 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| PT2750699E (pt) | 2011-08-29 | 2015-11-03 | Sanofi Aventis Deutschland | Acelerómetro pendular |
| TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
| CA2970200A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| KR20200080748A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법 |
| KR20200080747A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
| CA1341417C (fr) * | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3526995A1 (de) * | 1985-07-27 | 1987-02-05 | Hoechst Ag | Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| US4865974A (en) * | 1985-09-20 | 1989-09-12 | Cetus Corporation | Bacterial methionine N-terminal peptidase |
| CA1297003C (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-10 | Jack H. Nunberg | Composition and method for treating animals |
-
1985
- 1985-11-27 DE DE19853541856 patent/DE3541856A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-11-21 AT AT91114411T patent/ATE127841T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-21 AT AT91114412T patent/ATE122397T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-21 EP EP86116140A patent/EP0227938B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 DE DE8686116140T patent/DE3684892D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 ES ES91114411T patent/ES2077747T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 ES ES91114412T patent/ES2073081T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 DE DE3650322T patent/DE3650322D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 DE DE3650396T patent/DE3650396D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 ES ES198686116140T patent/ES2032378T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 EP EP91114411A patent/EP0468539B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 EP EP91114412A patent/EP0464867B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-25 FI FI864798A patent/FI93471C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-11-25 HU HU864872A patent/HU203579B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-11-25 IL IL80755A patent/IL80755A0/xx unknown
- 1986-11-26 IE IE311986A patent/IE59488B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-11-26 JP JP61281621A patent/JP2566933B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-26 NO NO864759A patent/NO176481C/no unknown
- 1986-11-26 PT PT83813A patent/PT83813B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-11-26 DK DK568586A patent/DK172064B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-11-26 AU AU65693/86A patent/AU595262B2/en not_active Ceased
- 1986-11-26 CA CA000523857A patent/CA1341203C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-26 KR KR1019860009990A patent/KR950000300B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-11-26 ZA ZA868943A patent/ZA868943B/xx unknown
-
1992
- 1992-04-21 DK DK052292A patent/DK172210B1/da not_active IP Right Cessation
- 1992-06-26 GR GR920401111T patent/GR3005042T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK172210B1 (da) | Hirudinderivater | |
| DK172618B1 (da) | Fusionsproteiner, deres fremstilling og anvendelse | |
| DK171278B1 (da) | DNA-Sekvens, vektor omfattende en sådan sekvens, værtsorganisme transformeret med en sådan vektor og fremgangmåde til fremstilling af et protein eller peptidprodukt ved hjælp deraf | |
| FI93734B (fi) | Menetelmä eukaryoottisen painolastiosan sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoisia tuotteita | |
| IL95495A (en) | Fusion proteins their preparation and use | |
| US5496924A (en) | Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion | |
| HUT64582A (en) | Method for producing recombinant human interleukin-1 inhibitor | |
| KR940005585B1 (ko) | 과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(gm-csf)단백질의 제조방법 | |
| DK166681B1 (da) | Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2 | |
| DK171940B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider meden C-terminal carboxamidgruppe, polypeptider til anvendelse ved fremgangsmåden, fusionsproteiner deraf og dertil egnede DNA-sekvenser, plasmider og værtsorganismer | |
| JPS61149089A (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| FI97239B (fi) | Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi | |
| Nishikawa et al. | 27 amino acid residues can be deleted from the N‐terminus of human lymphotoxin without impairment of its cytotoxic activity | |
| JP3252916B2 (ja) | ヒト副甲状腺ホルモンをコードする合成遺伝子 | |
| JPH08140679A (ja) | 微生物によるラットβ２−マイクログロブリン生産 | |
| JPS63313586A (ja) | ＴＧＦ−α |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |