JPS62143696A - 真核細胞融合タンパク質、その生産及び用途、並びに方法 - Google Patents
真核細胞融合タンパク質、その生産及び用途、並びに方法Info
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- JPS62143696A JPS62143696A JP61281621A JP28162186A JPS62143696A JP S62143696 A JPS62143696 A JP S62143696A JP 61281621 A JP61281621 A JP 61281621A JP 28162186 A JP28162186 A JP 28162186A JP S62143696 A JPS62143696 A JP S62143696A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はインターロイキン−２をコードするＤＮＡの″
オープン読取り枠”に、並びに、ペプチド及びタンパク
質の発現用の袖助物としてのこのＤＮＡの用途に、関す
る。
オープン読取り枠”に、並びに、ペプチド及びタンパク
質の発現用の袖助物としてのこのＤＮＡの用途に、関す
る。
遺伝子工学による真核細胞タンパク質の製造に際し、特
に、分子量が約１５，０００ドルトン以下でかつ構造中
にジスルフィド結合を有する小さなタンパク質の場合に
おいて、細菌から得られる収量は非常に低いことが多い
。産生されたタンパ＝ ３ − り質が宿主に固有のプロテアーゼにより急速に分解され
るためであると考えられる。したがって、融合タンパク
質をコードする遺伝子構造を組立てることが得策である
が、融合タンパク質のうちの不要部分は宿主に固有のタ
ンパク質であるため、−次産物の分離後に、自体公知の
方法によって切断されることになる。
に、分子量が約１５，０００ドルトン以下でかつ構造中
にジスルフィド結合を有する小さなタンパク質の場合に
おいて、細菌から得られる収量は非常に低いことが多い
。産生されたタンパ＝ ３ − り質が宿主に固有のプロテアーゼにより急速に分解され
るためであると考えられる。したがって、融合タンパク
質をコードする遺伝子構造を組立てることが得策である
が、融合タンパク質のうちの不要部分は宿主に固有のタ
ンパク質であるため、−次産物の分離後に、自体公知の
方法によって切断されることになる。
驚くべきことに、実質上最初の１００個のアミノ酸に相
当するインターロイキン−２のＮ末端部分は融合タンパ
ク質の産生のために特に適していることが今ここに見出
されたのである。このため、得られる一次産物は、真核
細胞タンパク質配列から完全になるか又はそれから主と
してなる融合タンパク質である。意外にも、このタンパ
ク質は関連宿主生物中で明らかに外来タンパク質とは認
識されないばかりか、再び迅速に分解されることもない
。もう一つの利点は、本発明の融合タンパク質は難溶性
又は不溶性であるため、好都合なことに遠心分離によっ
て直ちに可溶性タンパク質から分離することができる点
である。
当するインターロイキン−２のＮ末端部分は融合タンパ
ク質の産生のために特に適していることが今ここに見出
されたのである。このため、得られる一次産物は、真核
細胞タンパク質配列から完全になるか又はそれから主と
してなる融合タンパク質である。意外にも、このタンパ
ク質は関連宿主生物中で明らかに外来タンパク質とは認
識されないばかりか、再び迅速に分解されることもない
。もう一つの利点は、本発明の融合タンパク質は難溶性
又は不溶性であるため、好都合なことに遠心分離によっ
て直ちに可溶性タンパク質から分離することができる点
である。
インターロイキン−２部分が生物学的活性分子を表わす
か否かという“バラスト部分（ｂａｌｌａｓｔｓｅｃｔ
ｉｏｎ ）″としての融合タンパク質の機能は本発明に
おいて重要ではないため、インターロイキン−２部分が
正確な構造であるか否かも重要ではない。したがって、
実質上最初の１００個のＮ末端アミノ酸が存在していれ
ば十分である。このため、例えば、所望のタンパク質が
Ｎ末端に位置している場合には、融合タンパク質を明断
させるためにＮ末端を改変することができる。逆に、所
望のタンパク質が通常どおり融合タンパク質とＣ末端で
結合している場合には、所望のタンパク質の切断を可能
又は容易ならしめるために、Ｃ末端を改変することもで
きる。
か否かという“バラスト部分（ｂａｌｌａｓｔｓｅｃｔ
ｉｏｎ ）″としての融合タンパク質の機能は本発明に
おいて重要ではないため、インターロイキン−２部分が
正確な構造であるか否かも重要ではない。したがって、
実質上最初の１００個のＮ末端アミノ酸が存在していれ
ば十分である。このため、例えば、所望のタンパク質が
Ｎ末端に位置している場合には、融合タンパク質を明断
させるためにＮ末端を改変することができる。逆に、所
望のタンパク質が通常どおり融合タンパク質とＣ末端で
結合している場合には、所望のタンパク質の切断を可能
又は容易ならしめるために、Ｃ末端を改変することもで
きる。
ヒトインターロイキン−２（以下、明細書中“ＩＬ−２
”と称する）をコードする天然ＤＮＡ配列は、欧州特許
公開節ＥＰ−Ａｌ− ０，０９１，，５３９号明細書により公知となっている
。そこで引用された文献もマウス及びラット由来のＩＬ
−２に関する。この哺乳類ＤＮＡは、本発明のタンパク
質の合成のために使用することができる。しかしながら
、合成りＮＡ、特に有利には欧州特許公開節０．１６３
，２４９号明細書に対応する）（後に公開された）西独
特許公開節３．４１９，９９５号明細書で提案されたヒ
トＴＬ−２についてのＤＮＡから開始することが更に好
都合である。この合成りＮＡ配列は、後記の表２ （Ｄ
ＮＡ配列配列中に記載されている。この合成りＮＡは、
そのコードンの選択が、最も頻繁に使用される宿主、即
ち大腸菌、の環境に適しているという利点を有するのみ
ならず、本発明において利用可能な制限エンドヌクレア
ーゼに対するいくつかの切断部位をも有している。下記
表１は、開始及び１００番目のトリプレット領域におけ
る適切な切断部位の選択肢について掲示している。
”と称する）をコードする天然ＤＮＡ配列は、欧州特許
公開節ＥＰ−Ａｌ− ０，０９１，，５３９号明細書により公知となっている
。そこで引用された文献もマウス及びラット由来のＩＬ
−２に関する。この哺乳類ＤＮＡは、本発明のタンパク
質の合成のために使用することができる。しかしながら
、合成りＮＡ、特に有利には欧州特許公開節０．１６３
，２４９号明細書に対応する）（後に公開された）西独
特許公開節３．４１９，９９５号明細書で提案されたヒ
トＴＬ−２についてのＤＮＡから開始することが更に好
都合である。この合成りＮＡ配列は、後記の表２ （Ｄ
ＮＡ配列配列中に記載されている。この合成りＮＡは、
そのコードンの選択が、最も頻繁に使用される宿主、即
ち大腸菌、の環境に適しているという利点を有するのみ
ならず、本発明において利用可能な制限エンドヌクレア
ーゼに対するいくつかの切断部位をも有している。下記
表１は、開始及び１００番目のトリプレット領域におけ
る適切な切断部位の選択肢について掲示している。
しかしながら、このことは中間領域におけるＤＮＡの改
変の可能性までを否定するものではなく、上記特許出願
中に掲示された他の切断部位を利用することもできる。
変の可能性までを否定するものではなく、上記特許出願
中に掲示された他の切断部位を利用することもできる。
衣−ユ
５° ３゜
Ａｈａ Ｉｌ、 Ｂａｎ Ｉ。
Ｈａｅ Ｉｌ、 Ｎａｒ １． ＧＧＣＧＣＣ８Ｂａ
ｎ Ｉｌ、 Ｓａｃ Ｉ。
ｎ Ｉｌ、 Ｓａｃ Ｉ。
Ｓｓｔ Ｉ ＧＡＧＣＴＣ２９１Ｈｈａ
Ｉ ＧＣＧＣ９ Ｈｉｎｆ Ｉ ＧＡＣＴＣ３５Ｐｖｕｌ
’ ＣＧＡＴＣＧ ３４８ヌ
クレアーゼＢａｎＩＩ、Ｓａｃ Ｉ又は５ｓｔＩを使用
する場合は、約９５個のアミノ酸をコードするＩＬ−２
部分配列が得られる。この長さは不溶性融合タンパク質
を得るには通常十分である。
Ｉ ＧＣＧＣ９ Ｈｉｎｆ Ｉ ＧＡＣＴＣ３５Ｐｖｕｌ
’ ＣＧＡＴＣＧ ３４８ヌ
クレアーゼＢａｎＩＩ、Ｓａｃ Ｉ又は５ｓｔＩを使用
する場合は、約９５個のアミノ酸をコードするＩＬ−２
部分配列が得られる。この長さは不溶性融合タンパク質
を得るには通常十分である。
例えば、所望の親水性真核細胞タンパク質の場合に、溶
解性がまだ十分に低くないけれどもできるだけ小さな”
バラスピをＩＴｊるためにＣ末端により近い切断部位を
利用しないときには、適切なアダブター又はリンカ−に
よってＮ及び／又はＣ末端のＤＮＡ配列を延長して、“
バラスト”部分を“調整する（ｔａｉｌｏｒ） ” こ
とができる。勿論、はぼ末端近くまでＤＮＡ配列を使用
することにより、生物学的に活性でかつ場合により改変
された“副産物”としてＩＬ−２を得るか、又はコード
されたタンパク質以外にもＩＬ−２作用を有する二官能
性タンパク質を得ることもできる。
解性がまだ十分に低くないけれどもできるだけ小さな”
バラスピをＩＴｊるためにＣ末端により近い切断部位を
利用しないときには、適切なアダブター又はリンカ−に
よってＮ及び／又はＣ末端のＤＮＡ配列を延長して、“
バラスト”部分を“調整する（ｔａｉｌｏｒ） ” こ
とができる。勿論、はぼ末端近くまでＤＮＡ配列を使用
することにより、生物学的に活性でかつ場合により改変
された“副産物”としてＩＬ−２を得るか、又はコード
されたタンパク質以外にもＩＬ−２作用を有する二官能
性タンパク質を得ることもできる。
このように、本発明は、下記一般式の融合タンパク質に
関するものである。
関するものである。
Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ−Ｚ 又は Ｍｅｔ−Ｚ−Ｙ−Ｘ（Ｉ
ａ） （Ｉｂ）（」二記式中、 Ｘは、好ましくはヒトＩＬ−２の、はぼ最初の１００個
のアミ酸からなるアミノ酸配列を実質的に表わす。
ａ） （Ｉｂ）（」二記式中、 Ｘは、好ましくはヒトＩＬ−２の、はぼ最初の１００個
のアミ酸からなるアミノ酸配列を実質的に表わす。
Ｙは、所望のタンパク質の隣のアミノ酸もしくはアミノ
酸配列が所望のタンパク質の切断を可能ならしめる場合
には直接結合を表わし、それ以外の場合には、１または
２以上の遺伝的にコード可なアミノ酸からなりかつ切断
を可能ならしめる連結要素（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｅｌｅ
ｍｏｎｔ）を表わす。
酸配列が所望のタンパク質の切断を可能ならしめる場合
には直接結合を表わし、それ以外の場合には、１または
２以上の遺伝的にコード可なアミノ酸からなりかつ切断
を可能ならしめる連結要素（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｅｌｅ
ｍｏｎｔ）を表わす。
Ｚは、所望のタンパク質の遺伝的にコード可能なアミノ
酸配列である。） 式Ｉａ及びＩｂから明らかでかつ既に上記されているよ
うに、ＩＬ−２部分の上流又は下流で所望のタンパク質
を発現させることができる。明確化のため、下記におい
て、融合タンパク質の慣用的生産方法に実質に対応する
第一の選択的方法を説明する。このにうに、この“典型
的″変形例が以下に記載されている（）れども、このこ
とは他の変形例を禁する趣旨ではない。
酸配列である。） 式Ｉａ及びＩｂから明らかでかつ既に上記されているよ
うに、ＩＬ−２部分の上流又は下流で所望のタンパク質
を発現させることができる。明確化のため、下記におい
て、融合タンパク質の慣用的生産方法に実質に対応する
第一の選択的方法を説明する。このにうに、この“典型
的″変形例が以下に記載されている（）れども、このこ
とは他の変形例を禁する趣旨ではない。
融合タンパク質は、自体公知の方法で化学的に又は酵素
的に切断することができる。適切な方法の選択は、特に
所望のタンパク質のアミノ酸配列如何に依存している。
的に切断することができる。適切な方法の選択は、特に
所望のタンパク質のアミノ酸配列如何に依存している。
例えば、後者がメチオニンを含有していない場合には、
ＹはＭｅｔを表わすことができ、その際塩化もしくは臭
化シアンにより切断が行なわれる。連結要素ＹのＣ末端
にシスティンが存在するか、又はＹがＣｙｓを表わす場
合には、例えば特異的Ｓ−シアニル化後に酵素的システ
ィン−特異的切断又は化学的切断が行なわれる。結合要
素ＹのＣ末端にトリプトファン在するか、又はＹがＴｒ
ｐを表わす場合には、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる
化学的切断が行われる。
ＹはＭｅｔを表わすことができ、その際塩化もしくは臭
化シアンにより切断が行なわれる。連結要素ＹのＣ末端
にシスティンが存在するか、又はＹがＣｙｓを表わす場
合には、例えば特異的Ｓ−シアニル化後に酵素的システ
ィン−特異的切断又は化学的切断が行なわれる。結合要
素ＹのＣ末端にトリプトファン在するか、又はＹがＴｒ
ｐを表わす場合には、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる
化学的切断が行われる。
アミノ酸配列中に
Ａｓｐ−Ｐｒｏ
を有さすかつ酸に対し十分に安定であるタンパク質は、
自体公知の方法でタンパク質分解により切断することが
できる。これにより、Ｎ末端にプロリンをかつＣ末端に
アスパラギン酸をそれぞれ有するタンパク質が得られる
。したがって、この方法により改変タンパク質を合成す
ることも可能である。
自体公知の方法でタンパク質分解により切断することが
できる。これにより、Ｎ末端にプロリンをかつＣ末端に
アスパラギン酸をそれぞれ有するタンパク質が得られる
。したがって、この方法により改変タンパク質を合成す
ることも可能である。
連結要素が（Ａｓｐ） −Ｐｒｏ又はＧｌｕ−（Ａｓ
ｐ） −Ｐｒｏ （ｎは１〜３を表わす）である場合
には、Ａｓｐ−Ｐｒｏ結合は酸に対しより不安定になる
。
ｐ） −Ｐｒｏ （ｎは１〜３を表わす）である場合
には、Ａｓｐ−Ｐｒｏ結合は酸に対しより不安定になる
。
酵素的切断の例も同様に公知であるが、改善された特異
性をもつ改変された酵素〔例えば、シー・ニス・クレイ
クら、サイエンス、第２２８巻、１９８５年，第２９１
〜２９７頁（Ｃ．Ｓ． Ｃｒａｉｋｅｔ ａｌ．、 Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２２８（１９８５）２９１−２９７）
）を使用することもできる。所望の真核細胞ペプチドが
プロインシュリンである場合には、トリプシンで切断さ
れるアミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ）がプロインシュリンの
Ｎ末端アミノ酸（Ｐｈｅ）と結合しているペプチド配列
、例えばＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｅ−Ａｒｇを配
列Ｙとして選択することが好都合であるが、その理由は
プロテアーゼたるトリプシンでアルギニン−特異的切断
を行なうことができるためである。
性をもつ改変された酵素〔例えば、シー・ニス・クレイ
クら、サイエンス、第２２８巻、１９８５年，第２９１
〜２９７頁（Ｃ．Ｓ． Ｃｒａｉｋｅｔ ａｌ．、 Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２２８（１９８５）２９１−２９７）
）を使用することもできる。所望の真核細胞ペプチドが
プロインシュリンである場合には、トリプシンで切断さ
れるアミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ）がプロインシュリンの
Ｎ末端アミノ酸（Ｐｈｅ）と結合しているペプチド配列
、例えばＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｅ−Ａｒｇを配
列Ｙとして選択することが好都合であるが、その理由は
プロテアーゼたるトリプシンでアルギニン−特異的切断
を行なうことができるためである。
所望のタンパク質がアミノ酸配列：
１ １ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
を有さない場合には、融合タンパク質は因子Ｘａで切断
することができる（欧州特許第 ０、０２５，１９０号及び第０．１６１，９７３号明細
書）。
することができる（欧州特許第 ０、０２５，１９０号及び第０．１６１，９７３号明細
書）。
融合タンパク質は、自体公知の方法により適切な発現系
で発現させるとにより得られる。この目的に適するもの
は、すべての公知の宿主ベクター系、即ち例えば哺乳類
及び酵母菌等の微生物、好ましくは細菌、特に大腸菌、
である。
で発現させるとにより得られる。この目的に適するもの
は、すべての公知の宿主ベクター系、即ち例えば哺乳類
及び酵母菌等の微生物、好ましくは細菌、特に大腸菌、
である。
細胞宿主においては、ｌａｃＳ ｔａｃ，ｔｒｐ。
ファージλのＰＬもしくはＰＲ％ ｈｓｐ，ｏｍｐ又は
例えば西独特許公開箱３，４３０，６８３号（欧州特許
公開節０．１７３．１４９号）明細書に記載されている
ような合成プロモーターからなる群よりプロモーター及
びオペレーターを選択することが得策である。ｔａｃプ
ロモーター−オペレーター配列が有利であり、しかも現
在市販されている〔例えば、発現ベクターｐＫＫ２２３
−３、ファルマシア（ＰｈａｒＩＩｌａｃｉａ ）、“
分子生物学的製剤、化学的製剤及び分子生物学用の装置
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｃ
ｈｅｉｌｃａｌｓ ａｎｄ Ｅｑｕｉｐ−ｍｅｎｔ ｆ
ｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ） ” 、
１ ９ ８４年、第６３頁〕。
例えば西独特許公開箱３，４３０，６８３号（欧州特許
公開節０．１７３．１４９号）明細書に記載されている
ような合成プロモーターからなる群よりプロモーター及
びオペレーターを選択することが得策である。ｔａｃプ
ロモーター−オペレーター配列が有利であり、しかも現
在市販されている〔例えば、発現ベクターｐＫＫ２２３
−３、ファルマシア（ＰｈａｒＩＩｌａｃｉａ ）、“
分子生物学的製剤、化学的製剤及び分子生物学用の装置
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｃ
ｈｅｉｌｃａｌｓ ａｎｄ Ｅｑｕｉｐ−ｍｅｎｔ ｆ
ｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ） ” 、
１ ９ ８４年、第６３頁〕。
本発明の融合タンパク質の発現に際しては、ｍＲＮＡレ
ベルでの塩基対形成を防止するために、ＡＴＧ開始コー
ドン下流の最初の数個のアミノ酸に関するいくつかのト
リプレットを改変することが得策であろう。ＩＬ−２タ
ンパク質部分の各アミノ酸の改変、削除又は挿入ととも
に、このタイプの改変も熟練者にとって周知であり、本
発明もまた改変にも関するものである。
ベルでの塩基対形成を防止するために、ＡＴＧ開始コー
ドン下流の最初の数個のアミノ酸に関するいくつかのト
リプレットを改変することが得策であろう。ＩＬ−２タ
ンパク質部分の各アミノ酸の改変、削除又は挿入ととも
に、このタイプの改変も熟練者にとって周知であり、本
発明もまた改変にも関するものである。
本発明は、下記語例及び図で詳細に説明されている。
一般に、図はスケール通りで描かれてはおらず、特に尺
度はポリリンカーを表わすときに”拡大”されている。
度はポリリンカーを表わすときに”拡大”されている。
例１
プラスミドｐＪＦ１１８ （１）を、ｌａｃリプレッサ
ー〔ピー・ジエイφファラボー、ネーチャー、第２７４
巻、１９７８年、第７６５−７６９頁（Ｐ．Ｊ． Ｆａ
ｒａｂｏｕｇｈ， Ｎａｔｕｒｅ ２７４（１９７８）
７６５−７８９））をプラスミドｐＫＫ１７７−３ Ｃ
アマンら、遺伝子、第２５巻、１９８３年、第１６７頁
（ Ａｍａｎｎａｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ ２５（１９
８３）１８７） ）に挿入することにより得る（図１。
ー〔ピー・ジエイφファラボー、ネーチャー、第２７４
巻、１９７８年、第７６５−７６９頁（Ｐ．Ｊ． Ｆａ
ｒａｂｏｕｇｈ， Ｎａｔｕｒｅ ２７４（１９７８）
７６５−７８９））をプラスミドｐＫＫ１７７−３ Ｃ
アマンら、遺伝子、第２５巻、１９８３年、第１６７頁
（ Ａｍａｎｎａｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ ２５（１９
８３）１８７） ）に挿入することにより得る（図１。
西独特許出願筒Ｐ ３５ ２６９９５．２号明細書
、例６、図６参照）。ｐＪＦ１１８をＡｖａＩの唯一の
制限部位で開環し、自体公知の方法でエキソヌクレアー
ゼ処理して約１、ｏｏｏｂｐ短縮化する。結合させてプ
ラスミドｐＥＷ１０００ （２）（図１）を得るが、こ
のプラスミドにおいてはｌａｃリプレッサー遺伝子が十
分に残存しているものの、短縮化したことにより開始時
のプラスミドよりも著しく多いコピー数で存在している
。
、例６、図６参照）。ｐＪＦ１１８をＡｖａＩの唯一の
制限部位で開環し、自体公知の方法でエキソヌクレアー
ゼ処理して約１、ｏｏｏｂｐ短縮化する。結合させてプ
ラスミドｐＥＷ１０００ （２）（図１）を得るが、こ
のプラスミドにおいてはｌａｃリプレッサー遺伝子が十
分に残存しているものの、短縮化したことにより開始時
のプラスミドよりも著しく多いコピー数で存在している
。
プラスミドｐＫＫ１７７−３の代わりに、」二記市販プ
ラスミドｐＫＫ２２３−２から開始し、ｌａｃリプレッ
サーを挿入し、得た産物を同様に短縮化することもでき
る。
ラスミドｐＫＫ２２３−２から開始し、ｌａｃリプレッ
サーを挿入し、得た産物を同様に短縮化することもでき
る。
プラスミドｐＥＷ］、ｏ００ （２）を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及び５ａｌＩ（３）で開環する。
ＲＩ及び５ａｌＩ（３）で開環する。
ヒルジンをコードしかつ西独時３′１公開第３．４２９
，４３０号（欧州特許公開箱０．１７１，０２４号）明
細書例４（図３）のようにして得られるプラスミド（４
）を制限酵素ＡｃｃＩ及び５ａｌＩで開環して、大部分
がヒルジン配列からなる小さなフラグメン１−（５）を
分離する。
，４３０号（欧州特許公開箱０．１７１，０２４号）明
細書例４（図３）のようにして得られるプラスミド（４
）を制限酵素ＡｃｃＩ及び５ａｌＩで開環して、大部分
がヒルジン配列からなる小さなフラグメン１−（５）を
分離する。
西独特許公開箱３，４１９，９９５号（欧州特許公開第
帆 １６３，２４９号）明細書例４（図５）のようにし
て得られるプラスミドｐ１５９／６（６）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＰｖｕｌで開環し、ＩＬ−２配列の大部分
を有する小さなフラグメント（７）を分離する。この部
分配列及び下記説明軸中の他の短鎖ＩＬ−２配列は、図
中“ΔＩＬ２”で示されている。
帆 １６３，２４９号）明細書例４（図５）のようにし
て得られるプラスミドｐ１５９／６（６）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＰｖｕｌで開環し、ＩＬ−２配列の大部分
を有する小さなフラグメント（７）を分離する。この部
分配列及び下記説明軸中の他の短鎖ＩＬ−２配列は、図
中“ΔＩＬ２”で示されている。
次いで、配列（３）、（５）、（７）及び合成りＮＡ配
列（８゜図１ａ）をＴ４リガーゼで処理する。プラスミ
ドｐＫ３６０ （９）が得られる。
列（８゜図１ａ）をＴ４リガーゼで処理する。プラスミ
ドｐＫ３６０ （９）が得られる。
コンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ）大腸菌細胞を結
合産物で形質転換し、アンピシリン２５μｇ／ｍ１ＮＡ
プレート上で培養する。クローンのプラスミ１：’ Ｄ
Ｎ Ａを制限及び配列分析により確認する。
合産物で形質転換し、アンピシリン２５μｇ／ｍ１ＮＡ
プレート上で培養する。クローンのプラスミ１：’ Ｄ
Ｎ Ａを制限及び配列分析により確認する。
プラスミド（９）含有大腸菌細胞の一夜培養物をアンピ
シリン５０μｇ ／ ｍ＋含有ＬＢ培地〔ジエイ・エッ
チ・ミラー、分子遺伝学における実験、コールドスプリ
ングハーバ−研究所、１９７２年（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌｌｅ
ｒ、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。
シリン５０μｇ ／ ｍ＋含有ＬＢ培地〔ジエイ・エッ
チ・ミラー、分子遺伝学における実験、コールドスプリ
ングハーバ−研究所、１９７２年（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌｌｅ
ｒ、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。
１９７２） ）で約１ ： １００に希釈し、増殖を吸
光度測定によりモニターする。吸光度０． ５の時点で
振盪培養物をイソプロピルβ−ガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）で１．ｍＭに調整し、１５０〜１８０分間後細
菌を沈降さける。細菌を緩衝混合液（７Ｍ尿素、０．］
％ＳＤＳ、０．１．Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）
中で５分間ｉｌｌ騰し、試料をＳＤＳゲル電気泳動プレ
ートに塗布する。プラスミド（９）含有細菌は、期待し
た融合タンパク質の大きさと一致するタンパク質を電気
泳動後に供する。
光度測定によりモニターする。吸光度０． ５の時点で
振盪培養物をイソプロピルβ−ガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）で１．ｍＭに調整し、１５０〜１８０分間後細
菌を沈降さける。細菌を緩衝混合液（７Ｍ尿素、０．］
％ＳＤＳ、０．１．Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）
中で５分間ｉｌｌ騰し、試料をＳＤＳゲル電気泳動プレ
ートに塗布する。プラスミド（９）含有細菌は、期待し
た融合タンパク質の大きさと一致するタンパク質を電気
泳動後に供する。
細菌を破壊し〔フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｂ Ｐｒｅ
ｓｓ）、ダイノミル（（Ｒ）Ｄｙｎｏ ｍ１ｌｌ ）
］かっ遠心分離する。すなわち、融合タンパク質は沈降
物中に存在していて、相当量の他のタンパク質を上澄と
一緒に除去することができる。融合タンパク質の分離後
、臭化シアンで切断し、期待されるヒルジンペプチドを
遊離させる。後者は、分離後、タンパク質配列分析によ
り確認される。
ｓｓ）、ダイノミル（（Ｒ）Ｄｙｎｏ ｍ１ｌｌ ）
］かっ遠心分離する。すなわち、融合タンパク質は沈降
物中に存在していて、相当量の他のタンパク質を上澄と
一緒に除去することができる。融合タンパク質の分離後
、臭化シアンで切断し、期待されるヒルジンペプチドを
遊離させる。後者は、分離後、タンパク質配列分析によ
り確認される。
上記誘導条件は培養物を振盪する場合に妥当するが、大
規模発酵の場合には、吸光度を適度に調整し、かつ適切
であればＩ ＰＴＧ濃度を若干変更することが得策であ
る。
規模発酵の場合には、吸光度を適度に調整し、かつ適切
であればＩ ＰＴＧ濃度を若干変更することが得策であ
る。
餞ヌ
プラスミド（４）（図１）をＡｃｃｌで開環し、突出（
Ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）末端をフレノウポリメラーゼで
埋填する。次いで５ａｃＩで切断し、ヒルジン配列の大
部分を含有するフラグメントを分離する。
Ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）末端をフレノウポリメラーゼで
埋填する。次いで５ａｃＩで切断し、ヒルジン配列の大
部分を含有するフラグメントを分離する。
市販ベクターｐＵｃ１３を制限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＳｍ
ａ Ｉで開環し、大きなフラグメント（１１）を分離す
る。
ａ Ｉで開環し、大きなフラグメント（１１）を分離す
る。
Ｔ４リガーゼにより、フラグメント（１ｏ）及び（１１
）を結合してプラスミドｐＫ４００（１，２）（図２）
を得る。プラスミド（１２）は図２で２回示されている
が、下の方のはこのようにして得られるヒルジン誘導体
のアミノ酸配列を強調したものである。
）を結合してプラスミドｐＫ４００（１，２）（図２）
を得る。プラスミド（１２）は図２で２回示されている
が、下の方のはこのようにして得られるヒルジン誘導体
のアミノ酸配列を強調したものである。
プラスミド（４）（図１）を制限酵素Ｋｐｎｌ及び５ａ
ｉｌで開環し、ヒルジン部分配列を有する小さなフラグ
メント（１３）を分離する。
ｉｌで開環し、ヒルジン部分配列を有する小さなフラグ
メント（１３）を分離する。
プラスミド（１２）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩ及びＫｐｎ
Ｉ・と反応させ、ヒルジン部分配列を有する小さなフラ
グメント（１４）を分離する。
Ｉ・と反応させ、ヒルジン部分配列を有する小さなフラ
グメント（１４）を分離する。
プラスミド（９）（図１．ａ）をＥｃｏＲＩで部分的に
切断し、遊離末端をクレノウボリメラーゼ３による埋填
反応に付し、５ａｌＩ切断を行なう。
切断し、遊離末端をクレノウボリメラーゼ３による埋填
反応に付し、５ａｌＩ切断を行なう。
プラスミドｐＫ３６０の誘導体（１５）が得られる。
フラグメント（３）、（１３）、（１４）及び（１５）
を結合してプラスミドｐＫ４１０ （１６）を得るが、
このプラスミドは図２ａで２回示されており、下の方の
は融合タンパク質のアミノ酸配列及び酸開裂後に得られ
るヒルジン誘導体のアミノ酸配列を示すものである。
を結合してプラスミドｐＫ４１０ （１６）を得るが、
このプラスミドは図２ａで２回示されており、下の方の
は融合タンパク質のアミノ酸配列及び酸開裂後に得られ
るヒルジン誘導体のアミノ酸配列を示すものである。
例１のように発現させかつ完了させて、１位及び２位に
アミノ酸としてプロリン及びヒルジンを有する新規なヒ
ルジン誘導体を得る。このヒルジン誘導体は、西独特許
公開節３，４２９，４３０号明細書で示された、これら
の位置にアミノ酸としてトレオニン及びチロシンを有す
る天然産物と同等の活性を示すが、アミノペプチダーゼ
による攻撃に対しより安定であるため、インビボで使用
する場合には有利であろう。
アミノ酸としてプロリン及びヒルジンを有する新規なヒ
ルジン誘導体を得る。このヒルジン誘導体は、西独特許
公開節３，４２９，４３０号明細書で示された、これら
の位置にアミノ酸としてトレオニン及びチロシンを有す
る天然産物と同等の活性を示すが、アミノペプチダーゼ
による攻撃に対しより安定であるため、インビボで使用
する場合には有利であろう。
町
市販ベクターｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩで開環して、直
鎖プラスミド（１７）を得る。遊離端をｄＡＴＰＳｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰにより部分的に埋填し、突出ヌクレオ
チドＧを８１ヌクレアーゼで切除して、ｐＢＲ３２２誘
導体（１８）を得る。
鎖プラスミド（１７）を得る。遊離端をｄＡＴＰＳｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰにより部分的に埋填し、突出ヌクレオ
チドＧを８１ヌクレアーゼで切除して、ｐＢＲ３２２誘
導体（１８）を得る。
サルプロインシュリン由来ＨａｅｌＩＩフラグメント（
１９）［ウィートカムら、遺伝子、第１９巻、１９８２
年、第１８１頁（Ｗｅｔｅｋａｍ ａｔ ａｔ、、 Ｇ
ｅｎｅ１９（１９８２） １８１） ］をこの改変プラ
スミド（１８）と結合して、プラスミドｐＰＨ１−（２
０）を得る。
１９）［ウィートカムら、遺伝子、第１９巻、１９８２
年、第１８１頁（Ｗｅｔｅｋａｍ ａｔ ａｔ、、 Ｇ
ｅｎｅ１９（１９８２） １８１） ］をこの改変プラ
スミド（１８）と結合して、プラスミドｐＰＨ１−（２
０）を得る。
インシュリン部分配列はテトラサイシリン耐性遺伝子中
に挿入されているため、このプラスミドを含有するクロ
ーンはテトラサイクリンに対する耐性がなく、したがっ
て同定することができる。
に挿入されているため、このプラスミドを含有するクロ
ーンはテトラサイクリンに対する耐性がなく、したがっ
て同定することができる。
プラスミド（２０）をＢａｍＨＩ及びＤｄｅｌで開環し
て、小さなフラグメント（２１）を分離する。
て、小さなフラグメント（２１）を分離する。
更に、サルプロインシュリン配列からＤｄｅＩ−Ｐｖｕ
ｎ部分配列（２２）を分離する。
ｎ部分配列（２２）を分離する。
ベクターｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩ及びＰｖｕ■で開環
して、直鎖プラスミド（２３）を分離する。
して、直鎖プラスミド（２３）を分離する。
インシュリン部分配列（２１）及び（２２）を開環プラ
スミド（２３）と結合して、プラスミドｐＰＨ５（２４
）を得る。後者をＢａｍＨＩ及びＰｖｕＩ［で開環して
、小さなフラグメン１−（２５）を分離する。
スミド（２３）と結合して、プラスミドｐＰＨ５（２４
）を得る。後者をＢａｍＨＩ及びＰｖｕＩ［で開環して
、小さなフラグメン１−（２５）を分離する。
インシュリン構造をコードするＤＮＡ配列（２６）を合
成する。
成する。
市販ベクターｐＵＣ８を酵素ＢａｍＨＩ及び５ａｌＩで
開環し、残ったプラスミド（２７）を分離する。後者を
ＤＮＡ配列（２５）及び（２６）と結合して、プラスミ
ドｐＰＨ１５（２８）を得−２〇 − る。後者を５ａｌＩで開環し、突出端を埋填する。
開環し、残ったプラスミド（２７）を分離する。後者を
ＤＮＡ配列（２５）及び（２６）と結合して、プラスミ
ドｐＰＨ１５（２８）を得−２〇 − る。後者を５ａｌＩで開環し、突出端を埋填する。
ＢａｍＨＩを用いて、得たプラスミド誘導体（２つ）か
らＤＮＡ配列（３０）を切除する。
らＤＮＡ配列（３０）を切除する。
市販ベクターｐＵＣ９を酵素ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで
開環し、大きなフラグメント（３１）を分離する。後者
をＤＮＡ配列（３０）と結合して、プラスミドｐＰＨ１
６（３２）を得、る。
開環し、大きなフラグメント（３１）を分離する。後者
をＤＮＡ配列（３０）と結合して、プラスミドｐＰＨ１
６（３２）を得、る。
プラスミド（３２）を５ａｌＩで開環し、この直鎖プラ
スミド（３３）をｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰで部
分的に埋填し、残ったヌクレオチドＴを８１ヌクレアー
ゼで切除する。得たプラスミド誘導体（３４）をＢａｍ
ＨＩで処理し、突出１本鎖を産物（３５）から８１ヌク
レアーゼにより切除して、プラスミド誘導体（３６）得
る。
スミド（３３）をｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰで部
分的に埋填し、残ったヌクレオチドＴを８１ヌクレアー
ゼで切除する。得たプラスミド誘導体（３４）をＢａｍ
ＨＩで処理し、突出１本鎖を産物（３５）から８１ヌク
レアーゼにより切除して、プラスミド誘導体（３６）得
る。
プラスミド誘導体（３５）のプラント末端を環化して、
プラスミドｐＰＨ２０（３７）を得る。
プラスミドｐＰＨ２０（３７）を得る。
コンピテント大腸菌Ｈｂ１０１細胞を結合混合体で形質
転換し、選択培地」二で培養する。所望のプラスミドを
含有したクローンはプロインシュリンを発現するが、放
射免疫試験によると７０個のクローンのうち２８個は検
出可能なプロインシュリンを含有していた。プラスミド
を更にＤＮＡ配列分析で確認する。これらのプラスミド
は、アルギニンをコードするＤＮＡをＢ鎖の最初のアミ
ノ酸（Ｐｈｅ）のコードンの」二流に有している。
転換し、選択培地」二で培養する。所望のプラスミドを
含有したクローンはプロインシュリンを発現するが、放
射免疫試験によると７０個のクローンのうち２８個は検
出可能なプロインシュリンを含有していた。プラスミド
を更にＤＮＡ配列分析で確認する。これらのプラスミド
は、アルギニンをコードするＤＮＡをＢ鎖の最初のアミ
ノ酸（Ｐｈｅ）のコードンの」二流に有している。
プラスミド（３７）をＨＬｎｄｌ［で切断し、突出末端
を埋填し、しかる後ＤｄｅＩで切断する。
を埋填し、しかる後ＤｄｅＩで切断する。
小さなフラグメント（３８）を分離する。
プラスミド（２８）（図３２）を５ａｌＩ及びＤｄｅＩ
で切断し、小さなフラグメント（３９）を分離する。
で切断し、小さなフラグメント（３９）を分離する。
プラスミド（９，、） （図１ａ）をまずＡｃｃｌで
切断し、遊離端を埋填し、しかる後ＥｃｏＲＩで部分的
に切断する。短鎖ＩＬ−２配列含有フラグメント（４０
）を分離する。
切断し、遊離端を埋填し、しかる後ＥｃｏＲＩで部分的
に切断する。短鎖ＩＬ−２配列含有フラグメント（４０
）を分離する。
直鎖プラスミド（３）（図１）並びにＤＮＡセグメント
（３８）、（３９）及び（４０）を結合して、プラスミ
ドｐＰＨ３０（４１）を得る。このプラスミドは、ＩＬ
−２の１〜１１４位のアミノ酸の下流に、下記アミノ酸
配列を有する融合タンパク質をコードする。
（３８）、（３９）及び（４０）を結合して、プラスミ
ドｐＰＨ３０（４１）を得る。このプラスミドは、ＩＬ
−２の１〜１１４位のアミノ酸の下流に、下記アミノ酸
配列を有する融合タンパク質をコードする。
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｙｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ この連結要素Ｙにおける最後のアミノ酸たるアルギニン
によって、トリプシンによるインシュリン鎖の切断が可
能となる。
ｙｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ この連結要素Ｙにおける最後のアミノ酸たるアルギニン
によって、トリプシンによるインシュリン鎖の切断が可
能となる。
プラスミド（９）（図１ａ）から開始して下記経路によ
りプラスミド（４１）を得ることができる。すなわち、
（９）をＡｃｃＩで開環し、突出末端を埋填し、しかる
後５ａｌＩで切断し、生成プラスミド誘導体（４２）セ
グメント（３）、（３８）及び（３９）と結合する。
りプラスミド（４１）を得ることができる。すなわち、
（９）をＡｃｃＩで開環し、突出末端を埋填し、しかる
後５ａｌＩで切断し、生成プラスミド誘導体（４２）セ
グメント（３）、（３８）及び（３９）と結合する。
例４
プラスミド（６）（図１）を制限酵素Ｔａｑｌ及びＥｃ
ｏＲＩで開環し、小さなフラグメント（４３）を分離す
る。このフラグメントを合成りＮＡ配列（４４）並びに
セグメンＩ−（３）及び（５）と結合して、プラスミド
ｐ Ｐ Ｈ］、 Ｏ０（４５）を得る。このプラスミド
は、最初のＩＬ−２３＝ −２の１３２個のアミノ酸の後に連結要素Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏが、その後にヒルジンのアミノ酸配列が続く融合タン
パク質をコードする。したがって、タンパク質分解によ
り切断すると、１３３位のＴｈｒに代わってＡｓｐを有
する改変された生物学的活性ＩＬ−２’、及び天然産物
のアミノ酸配列の上流にＮ末端Ｐｒｏを有するヒルジン
誘導体が得られる。この産物も生物学的に活性であって
天然産物に匹敵し、プロテアーゼによる攻撃に対しては
より安定である。
ｏＲＩで開環し、小さなフラグメント（４３）を分離す
る。このフラグメントを合成りＮＡ配列（４４）並びに
セグメンＩ−（３）及び（５）と結合して、プラスミド
ｐ Ｐ Ｈ］、 Ｏ０（４５）を得る。このプラスミド
は、最初のＩＬ−２３＝ −２の１３２個のアミノ酸の後に連結要素Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏが、その後にヒルジンのアミノ酸配列が続く融合タン
パク質をコードする。したがって、タンパク質分解によ
り切断すると、１３３位のＴｈｒに代わってＡｓｐを有
する改変された生物学的活性ＩＬ−２’、及び天然産物
のアミノ酸配列の上流にＮ末端Ｐｒｏを有するヒルジン
誘導体が得られる。この産物も生物学的に活性であって
天然産物に匹敵し、プロテアーゼによる攻撃に対しては
より安定である。
ＩＬ−２’ ヒルジン融合タンパク質も生物学的に活性
である。生物学的活性は、ＩＬ−２依存細胞系（ＣＴＬ
Ｌ２）による細胞増殖試験で見出された。 ゛ 更に、６Ｍ塩酸グアニジニウム溶液で変性し、次いで緩
衝液（１０ｍＭｌ−リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，５，１ｍＭ
ＥＤＴＡ）で復元すると、高いＩＬ−２活性が見ら
れた。しかも、トロンビンを加えた酸処理血の凝血時間
は、融合タンパク質添加後に増加した。
である。生物学的活性は、ＩＬ−２依存細胞系（ＣＴＬ
Ｌ２）による細胞増殖試験で見出された。 ゛ 更に、６Ｍ塩酸グアニジニウム溶液で変性し、次いで緩
衝液（１０ｍＭｌ−リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，５，１ｍＭ
ＥＤＴＡ）で復元すると、高いＩＬ−２活性が見ら
れた。しかも、トロンビンを加えた酸処理血の凝血時間
は、融合タンパク質添加後に増加した。
したがって、二官能性融合タンパク質が得られる。
例５
市販ベクターｐＵｃ１２を制限酵素ＥｃｏＲ，Ｉ及びＳ
ａｃ Ｉで開環する。この直鎖プラスミド（４６）に、
プラスミド（６）（図１）から制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
Ｓａｃ Ｉで切断して得たＩＬ−２部分配列を挿入する
。この配列（４７）は最初のＩＬ−２の９４個のアミノ
酸についての完全なトリプレットからなる。（４６）及
び（４７）を結合してプラスミドｐＫ３００（４８）を
得る。
ａｃ Ｉで開環する。この直鎖プラスミド（４６）に、
プラスミド（６）（図１）から制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
Ｓａｃ Ｉで切断して得たＩＬ−２部分配列を挿入する
。この配列（４７）は最初のＩＬ−２の９４個のアミノ
酸についての完全なトリプレットからなる。（４６）及
び（４７）を結合してプラスミドｐＫ３００（４８）を
得る。
プラスミド（９）（図１ａ）をＥｃｏＲＩで開環し、突
出端を埋填し、しかる後Ｈｉｎｄｕで切断する。ヒルジ
ンをコードするＤＮＡ配列の下流にｐＵｃ１２由来ポリ
リンカーの一部を有する小さなフラグメント（４９）を
分離する。
出端を埋填し、しかる後Ｈｉｎｄｕで切断する。ヒルジ
ンをコードするＤＮＡ配列の下流にｐＵｃ１２由来ポリ
リンカーの一部を有する小さなフラグメント（４９）を
分離する。
プラスミド（４８）を制限酵素Ｓｍａ Ｉ及びＨｉｎｄ
ｌｌＩで開環し、大きなフラグメント（５０）を分離す
る。（５０）を（４９）と結合してプラスミドｐＫ３０
１ （５１，）を得る。
ｌｌＩで開環し、大きなフラグメント（５０）を分離す
る。（５０）を（４９）と結合してプラスミドｐＫ３０
１ （５１，）を得る。
結合混合体を用いてコンビプント大腸菌２９４細胞を形
質転換する。プラスミド（５１）含有クローンを制限分
析により確認する。それらは、最初のＩＬ−２の９６個
のアミノ酸についてのコードンの後に６個のアミノ酸の
連結要素についてのコードンがしかる後ヒルジンについ
てのコードンが続＜ＤＮＡを有している。
質転換する。プラスミド（５１）含有クローンを制限分
析により確認する。それらは、最初のＩＬ−２の９６個
のアミノ酸についてのコードンの後に６個のアミノ酸の
連結要素についてのコードンがしかる後ヒルジンについ
てのコードンが続＜ＤＮＡを有している。
プラスミド（５１）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ■と反応
させ、前記真核細胞融合タンパク質についてのＤＮＡ配
列を有するフラグメント（５２）を分離する。
させ、前記真核細胞融合タンパク質についてのＤＮＡ配
列を有するフラグメント（５２）を分離する。
プラスミド（２）（図１）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｕ
で開環する。得た直鎖プラスミド（５３）をＤＮＡ配列
（５２）と結合して、プラスミドｐＫ３７０ （５４
）を得る。
で開環する。得た直鎖プラスミド（５３）をＤＮＡ配列
（５２）と結合して、プラスミドｐＫ３７０ （５４
）を得る。
プラスミド（５４）の発現を例１のように大腸菌で行な
う場合に、得られる融合タンパク質は、最初のＩＬ−２
の９６個のアミノ酸の後に連結要素： Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−１１ｅＴｈｒ を、しかる後ヒルジンのアミノ酸配列を、をする。
う場合に、得られる融合タンパク質は、最初のＩＬ−２
の９６個のアミノ酸の後に連結要素： Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−１１ｅＴｈｒ を、しかる後ヒルジンのアミノ酸配列を、をする。
例６
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｕを用い、サルプロイ
ンシュリンをコードするＤＮＡセグメントをプラスミド
（４１，）（例３、図３ｃ）から切断して得、突出端を
埋填する。ＤＮＡセグメント（５５）を得る。
ンシュリンをコードするＤＮＡセグメントをプラスミド
（４１，）（例３、図３ｃ）から切断して得、突出端を
埋填する。ＤＮＡセグメント（５５）を得る。
プラスミド（４８）（例５、図５）をＳｍａ Ｉで開環
し、ウシアルカリホスファターゼで処理する。生成直鎖
プラスミド（５６＞、をＤＮＡセグメント（５５）と結
合して、プラスミドｐ Ｋ ３０２（５７）を得る。大
腸菌２９４細胞を結合混合体で形質転換し、所望のプラ
スミドを含有するクローンを、まずプラスミドＤ Ｎ
Ａの制限分析で、しかる後配列分析で、確認する。
し、ウシアルカリホスファターゼで処理する。生成直鎖
プラスミド（５６＞、をＤＮＡセグメント（５５）と結
合して、プラスミドｐ Ｋ ３０２（５７）を得る。大
腸菌２９４細胞を結合混合体で形質転換し、所望のプラ
スミドを含有するクローンを、まずプラスミドＤ Ｎ
Ａの制限分析で、しかる後配列分析で、確認する。
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ酸を用い、ＩＬ−２及びサルプ
ロインシュリンをコードするセグメント（５８）をプラ
スミド（５７）から切断して得る。
ロインシュリンをコードするセグメント（５８）をプラ
スミド（５７）から切断して得る。
プラスミド（２）（例１、図１）を同様にＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄｌＩＩで切断し、セグメント（５８）を直鎖
プラスミド（３）に結合する。プラスミドｐＫＨ１０１
（５９）を得る。
びＨｉｎｄｌＩＩで切断し、セグメント（５８）を直鎖
プラスミド（３）に結合する。プラスミドｐＫＨ１０１
（５９）を得る。
例１のように発現させ、最初のＩＬ−２の９６個のアミ
ノ酸の後に（ＤＮＡセグメント（５８）のＹに相当する
）１４個のアミノ酸の連結要素しかる後サルプロインシ
ュリンのアミノ酸配列が続く融合タンパク質を得る。
ノ酸の後に（ＤＮＡセグメント（５８）のＹに相当する
）１４個のアミノ酸の連結要素しかる後サルプロインシ
ュリンのアミノ酸配列が続く融合タンパク質を得る。
ムトヘ■鷲
図１及びその続きの図１ａは、ヒルジン配列を有する融
合タンパク質をコードするプラスミドｐＫ３６０の合成
に関する説明図である。 図２及びその続きの図２ａは、ヒルジンのアミノ酸配列
を有する融合タンパク質を同様にコードするプラスミド
ｐＫ４１０の合成に関する説明図である。 図３及びその続きの図３ａ〜３ｃは、サルインシュリン
のアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするプ
ラスミドｐＰＨコ５、］６．２０及び３０の構造に関す
る説明図である。 図４は、ヒルジンのアミノ酸配列を有する融合タンパク
質をコードするプラスミドｐＰＨ１００の合成に関する
説明図である。 図５及びその続きの図５ａは、ヒルジンのアミノ酸配列
を有する融合タンパク質をコードするプラスミドｐＫ３
７０の構造に関する説明図である。 図６及びその続きの図６ａは、サルプロインシュリンの
アミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするプラ
スミドｐＫＨ１０１の合成に関する説明図である。 出願人代理人 佐 藤 −雄 くヌ （Ｈｏｅ ＩＩＩ ｌ （Ｈａｅ ＩＩＩ
１ｔｅａｍ Ｈｌ ｌ （Ｏｄｅ １１（
Ｄｄｅｌ ｌ （ＰｖｕｌｌｌＩＢａｍ
ＨＩｌ （ＰｖｕｌｌｌｆＰｖｕｌｌ）
ｔｓａｌｌｌ（ＢｏｍＨＩｌ
（Ｓａｌｌ−）＋３６１
＋３５１（ヒＣｏ Ｒ１ｌ
Ｐｖｕ ｌ
（４ｏ）７９１．５７１１．２６１．７
．。、１．カーｔ・ ／づ≦７」３５乙≧〉＼７〈ｙ
〉ヅ。。 ＦＩＧ、４ ｆＴａｑ １１ ｆＡｃ
ｃ ＩＩＦＩＧ、５ ＡＡ ＴＴＣＡＴＧ ＡＴＣＡＣＡ （Ｈｌ、 １−６
４）ＴＡＡ ＴＡＧ ＡＴＴ ＡＡ［ｌ
ＴＡＣＴＡＧ ＴＧＴ ＡＴＴ ＡＴＣ（Ｓｏ”
’ −（ＰＳ”’ ＴＴＣＧＡｆＥｃｏＲＩ−１ｆ４９
１ （）ＩｉｎｄｌｌｌｌＦＩ
Ｇ、５ａ （４日）Ｓｍ０１ １１１ｎＣＩ ＩＩ＋
合タンパク質をコードするプラスミドｐＫ３６０の合成
に関する説明図である。 図２及びその続きの図２ａは、ヒルジンのアミノ酸配列
を有する融合タンパク質を同様にコードするプラスミド
ｐＫ４１０の合成に関する説明図である。 図３及びその続きの図３ａ〜３ｃは、サルインシュリン
のアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするプ
ラスミドｐＰＨコ５、］６．２０及び３０の構造に関す
る説明図である。 図４は、ヒルジンのアミノ酸配列を有する融合タンパク
質をコードするプラスミドｐＰＨ１００の合成に関する
説明図である。 図５及びその続きの図５ａは、ヒルジンのアミノ酸配列
を有する融合タンパク質をコードするプラスミドｐＫ３
７０の構造に関する説明図である。 図６及びその続きの図６ａは、サルプロインシュリンの
アミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするプラ
スミドｐＫＨ１０１の合成に関する説明図である。 出願人代理人 佐 藤 −雄 くヌ （Ｈｏｅ ＩＩＩ ｌ （Ｈａｅ ＩＩＩ
１ｔｅａｍ Ｈｌ ｌ （Ｏｄｅ １１（
Ｄｄｅｌ ｌ （ＰｖｕｌｌｌＩＢａｍ
ＨＩｌ （ＰｖｕｌｌｌｆＰｖｕｌｌ）
ｔｓａｌｌｌ（ＢｏｍＨＩｌ
（Ｓａｌｌ−）＋３６１
＋３５１（ヒＣｏ Ｒ１ｌ
Ｐｖｕ ｌ
（４ｏ）７９１．５７１１．２６１．７
．。、１．カーｔ・ ／づ≦７」３５乙≧〉＼７〈ｙ
〉ヅ。。 ＦＩＧ、４ ｆＴａｑ １１ ｆＡｃ
ｃ ＩＩＦＩＧ、５ ＡＡ ＴＴＣＡＴＧ ＡＴＣＡＣＡ （Ｈｌ、 １−６
４）ＴＡＡ ＴＡＧ ＡＴＴ ＡＡ［ｌ
ＴＡＣＴＡＧ ＴＧＴ ＡＴＴ ＡＴＣ（Ｓｏ”
’ −（ＰＳ”’ ＴＴＣＧＡｆＥｃｏＲＩ−１ｆ４９
１ （）ＩｉｎｄｌｌｌｌＦＩ
Ｇ、５ａ （４日）Ｓｍ０１ １１１ｎＣＩ ＩＩ＋
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、インターロイキン−２の最初の１００個のアミノ酸
に実質的に相当するＣもしくはＮ末端を有する融合タン
パク質。 ２、下記式の融合タンパク質： Ｍｅｔ−Ｘ−Ｙ−Ｚ（ I ａ）又はＭｅｔ−Ｚ−Ｙ−Ｘ
（ I ｂ）（上記式中、 Ｘは、ヒトインターロイキン−２のほぼ最初の１００個
のアミノ酸からなるアミノ酸は配列を実質的に表わす。 Ｙは、直接結合、又は遺伝的にコード可能なアミノ酸か
らなりかつアミノ酸配列の切断を可能ならしめる連結要
素を表わす。 Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である。）
。 ３、Ｚの隣のＹがＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇもし
くはＬｙｓを有するか又はこれらアミノ酸からなる、特
許請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。 ４、Ｚの隣のＹがアミノ酸配列： Ａｓｐ−Ｐｒｏ を有するか又はこの配列からなる、特許請求の範囲第２
項記載の融合タンパク質。 ５、Ｚがプロインシュリン又はヒルジンのアミノ酸配列
を表わす、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１
項に記載の融合タンパク質。 ６、宿主細胞中における融合タンパク質をコードする遺
伝子構造の発現及び融合タンパク質の分離からなる、特
許請求の範囲第１項〜第５項に記載の融合タンパク質の
生産方法。 ７、融合タンパク質を遠心分離によって可溶性タンパク
質から分離する、特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、宿主細胞が細菌である、特許請求の範囲第６項又は
第７項記載の方法。 ９、宿主細胞が大腸菌である、特許請求の範囲第８項記
載の方法。 １０、化学的又は酵素的な切断によるアミノ酸配列Ｚと
実質的に一致するタンパク質の生産用としての、特許請
求の範囲第１項〜第５項に記載の融合タンパク質または
特許請求の範囲第６項〜第９項に記載のようにして得ら
れる融合タンパク質の用途。 １１、特許請求の範囲第１項〜第５項に記載の融合タン
パク質をコードする遺伝子構造。 １２、特許請求の範囲第１１項に記載の遺伝子構造を有
するベクター。 １３、プラスミドｐＥＷ１０００、ｐＫ ３６０、ｐＫ４１０、ｐＰＨ３０、ｐＰＨ１００、ｐＫ
３７０及びｐＫＨ１０１。 １４、特許請求の範囲第１２項に記載のベクターを有す
る宿主細胞。 １５、Ｎ末端のＰｒｏから始まるアミノ酸配列を有する
ヒルジン誘導体。 １６、アミノ酸配列がＮ末端のＰｒｏ− Ｈｉｓ又はＰｒｏ−Ｔｈｒから始まる、特許請求の範囲
第１５項記載のヒルジン誘導体。 １７、Ｃ末端にＡｓｐを有するヒトＩＬ−２誘導体。 １８、ヒトＩＬ−２及びヒルジンからなり、かつＩＬ−
２活性及びヒルジン活性を双方とも有する融合タンパク
質。
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| PT (1) | PT83813B (ja) |
| ZA (1) | ZA868943B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05507209A (ja) * | 1991-02-06 | 1993-10-21 | ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド | チオレドキシンおよびチオレドキシン様分子に対するペプチドおよび蛋白融合 |
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