JPH0673096A - 成長ホルモン前駆体 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 成長ホルモン前駆体を提供する。
【構成】 Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−成長ホルモンは成長
ホルモン前駆体として有用である。
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−成長ホルモンは成長
ホルモン前駆体として有用である。
Description
【発明の詳細な説明】 【０００１】 本発明は、蛋白質生産物の製造に有用な
新規なＤＮＡ配列およびクローニングベクター（ビヒク
ル）に関する。Ｍａｓａｙｏｒｉ Ｉｎｏｕｙｅおよび
その協同研究者達は、グラム陰性菌の外膜蛋白質、特に
リポプロテインに関する広範な研究を行なった。その結
果、リポプロテインは細菌細胞に多量存在することがわ
かった。例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大
腸菌）の外膜には、細胞当たり約７．２×１０５分子の
リポプロテインが存在している。このＥ．ｃｏｌｉ染色
体には、リポプロテインの為の構造遺伝子が１個しか存
在していないので、その転写機構は著しく効率の良いも
のに違いない。Ｉｎｏｕｙｅおよびその協力者達の最近
の研究は、適当当に組み立てたプラスミドを使って、形
質転換した微生物中でリポプロテインを発現させ、種々
のリポプロテイン遺伝子（ｌｐｐ）のＤＮＡ配列を分析
することに向けられて来た。例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ
およびＩｎｏｕｙｅのＣｅｌｌ１８、１１０９−１１１
７（１９７９）には、Ｅ．ｃｏｌｉの外膜リポプロテイ
ンのＤＮＡ配列が報告されている。この配列のプロモー
ター領域を分析した結果、いくつかの興味ある特徴が見
つかった。先ず第１に、転写開始サイトの前の２６１塩
基対（ｂｐ）（−１〜−２６１）のセグメントにおける
ＡＴ含量が７０％であり、これは、３２２ｂｐ ｍＲＮ
Ａ領域の５３％、転写終了サイトの後の１２７ｂｐのセ
グメントの４４％およびＥ．ｃｏｌｉ染色体の平均ＡＴ
含量４９％と比較して著しく高いことがわかった。次
に、転写開始サイトから上流のはじめの４５ｂｐ（−１
〜−４５）が、ＡまたはＴの３６個の塩基対（８０％）
を含んでいることがわかった。第３番目に、転写開始サ
イトから８塩基の所に、「プリブノー・ボックス（Ｐｒ
ｉｂｎｏｗ ｂｏｘ）」と類似したヘプタヌクレオチド
配列が存在していた。第４番目に−２７および−３９位
の間の両鎖に、「ＲＮＡポリメラーゼ認識サイト」に類
似した配列が存在していた。第５番目に、転写開始サイ
トにおいて、長い一対の対称が中心をなしていた。Ｉｎ
ｏｕｙｅおよびその協力者達は、ｌｐｐプロモータの力
が強いのは、上記の特徴のいずれかまたはそれらの協力
作用によるものと考えた。特に、プロモータ配列中のＡ
Ｔ含量が高い為にＤＮＡのヘリックス構造が不安定化す
る傾向にあり、従って、転写の開始に必須である所の鎖
の巻き戻しが促進されると推論された。Ｉｎｏｕｙｅら
の研究グループは、他の、多分全ての、グラム陰性菌の
リポプロテイン遺伝子配列についても、これと非常に類
似した事実が存在することを示した。例えば、Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのリポプロテイン遺伝
子のＤＮＡ配列を分析し、Ｅ．ｃｏｌｉのｌｐｐ遺伝子
のそれと比較すると、それらが極めて類似していること
がわかった（ＮａｋａｍｕｒａおよびＩｎｏｕｙｅ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７ １
３６９−１３７３、１９８０年）。特に、プロモータ領
域は高い（８４％）類似性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を備え
ており、Ｅ．Ｃｏｌｉ（８０％）と同様、極めて高いＡ
およびＴ含量（７８％）を持っていた。さらに、リポプ
ロテインｍＲＮＡの５′−非翻訳領域も、高い類似性
（９５％）を備えていた。極く最近、Ｙａｍａｇａｔ
ａ，ＮａｋａｍｕｒａおよびＩｎｏｕｙｅらは、Ｅｒｗ
ｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａのリポプロテイン遺伝子
のＤＮＡ配列を分析し、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓのそれらと比較した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５６、２１９４〜２１９８、１９８１年）。
この研究によっても、ｌｐｐ遺伝子に高い類似性が確認
された。即ち、プロモータ領域（−４５〜−１）は高い
類似性を有していた（Ｅ．ｃｏｌｉに対して８７％、
Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓに対して９３％）。Ａおよび
Ｔ含量は、Ｅ．ｃｏｌｉ（８０％）およびＳ．ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ（７８％）と同様、極めて高かった（８０
％）。更に、ｍＲＮＡの非翻訳領域の配列は高い類似姓
を示した（Ｅ．ｃｏｌｉに対して９７％、Ｓ．ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓに対して９２％）。Ｉｎｏｕｙｅの研究に
基ずく、リポプロテイン遺伝子について観察された高レ
ベルの構成性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）転写は、そ
れが外来性ＤＮＡフラグメントの発現の為のビヒクルと
して有用であることを示している。更に、Ｉｎｏｕｙｅ
らの研究は、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｕ
ｉ，Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎ−ｔｅｒｉａｅ，Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ｃ
ｉｔｒｏ−ｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ，Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌ
ｌａ ｔａｒｄａ，Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒ
ａ， Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓなどを
含むグラム陰性菌の広範囲のリポプロテイン遺伝子のい
ずれも使用し得ることを示唆している。更に最近、Ｉｎ
ｏｕｙｅらにより、生産物発現のためにリポプロテイン
遺伝子が好適であることが立証された（Ｃ．Ｌｅｅ，Ｎ
ａｋａｍｕｒａ，およびＩｎｏｕｙｅ，Ｊ・Ｂａｃｔｅ
ｒ．１４６ ８６１−８６６、１９８１年）。この研究
では、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのリポプロテイン遺伝
子がラムダーファージにクローンされ、次いでプラスミ
ドベクターｐＢＲ３２２およびｐＳＣ１０１に再クロー
ンされた。このＳ．ｍａｒｏｅｓｃｅｎｓのｌｐｐ遺伝
子を持った両ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換
するのに使用された。Ｅ．ｃｏｌｉのｌｐｐ遺伝を持っ
たベクターと比較すると若干低レベルではあるが、正常
な発現が証明された。いずれにせよ、この文献により、
ｌｐｐ遺伝子プロモータおよび５′−非翻訳領域を含む
ベクターは、高いレベルのリポプロテイン発現を達成す
るのに使用し得ることが確立された。本明細書におい
て、「ベクター」なる用語は、（１）宿主細胞内で複製
可能であり、（２）宿主細胞を形質転換することがで
き、そして（３）形質転換された細胞を同定するのに好
適に使用し得るマーカーを含んでいるプラスミド、ファ
ージＤＮＡあるいはその他のＤＮＡ配列を意味する。本
発明に係る特異なクローニングベクターには２つの態様
がある。このクローニングベクターの態様のいずれを用
いても、極めて高いレベルで外来蛋白質を発現させるこ
とができる。最初の態様では、クローニングベクター
は、縦列に、リポプロテインプロモータ領域を指定して
いるヌクレオチド配列、リポプロテイン５′−非翻訳領
域を指定しているヌレオレチド配列、および外来蛋白質
生産物を暗号化している配列を含む様に組み立てられて
おり、該蛋白質生産物を暗号化している配列は、翻訳開
始信号コドンを介して、リポプロテイン遺伝子の５′−
非翻訳領域の３′末端と結合している。第２の態様で
は、外来蛋白質生産物を暗号化している配列は、上記の
開始コドンおよびエンテロキナーゼ開裂サイトを暗号化
しているヌクレオチド配列を介して、リポプロテイン遺
伝子の５′−非翻訳領域の３′末端と結合している。即
ち、本発明は、外来蛋白質を発現させるのに有用な組換
えＤＮＡクローニングベクターであって、（ａ）複製の
機能起源（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｉｇｉｎ）を含
有しているＤＮＡセグメント、（ｂ）該ベクターを形質
転換し得る宿主細胞に導入した場合、選択に使用するこ
とができる性質を該宿主細胞に伝達する１種またはそれ
以上のＤＮＡセグメント、および（ｃ）縦列に、（１）
リポプロテインの発現コントロール配列のプロモータ、
（２）リポプロテインの発現コントロール配列の５′−
非翻訳領域、および（３）固有（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕ
ｓ）蛋白質を暗号化しているヌクレオチド配列の全てま
たは１部によって介在されることなく、（イ）外来蛋白
質を暗号化している配列、または（ロ）外来蛋白質を暗
号化しているヌクレオチド配列と、中断されることな
く、結合しているエンテロキナーゼ開裂サイトを暗号化
しているヌクレオチド配列、が後に続いている翻訳開始
コドン、を指定している配列を含むＤＮＡセグメント、
を含有している組換えＤＮＡクローニングベクターに関
する。本発明の相換えＤＮＡクローニングベクターは、
ＤＮＡセグメント（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を連結
（ｌｉｎｋ）することにより製造される。既述した様
に、本発明は、外来蛋白質を生産するのに極めて効率の
良いＤＮＡ配列および組換えＤＮＡクローニングベクタ
ーを提供するものである。これらはいずれも、リポプロ
テイン遺伝子（ｌｐｐ）機構、好ましくはグラム陰性菌
のリポプロテイン遺伝子の少なくとも１部を使用するも
のである。本明細書に於いて、「外来蛋白質」なる用語
は、リポプロテイン遺伝子機構によって正常に発現され
るリポプロテイン分子以外の蛋白質生産物またはその様
な分子のあらゆる部分を指すものとする。ｌｐｐ機構の
ソース（ｓｏｕｒｃｅ）として役立つグラム陰性菌の代
表例は例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｓｈ
ｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ−ｒｉｕｍ，Ｃｉｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｄｗａｒｄ−ｓｉｅｌｌａ ｔａｒ
ｄａ，Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ，Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ−ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓなどである。このｌｐ
ｐ遺伝子は、５つの要素で表わすことができる。この遺
伝子中のこれらの要素の順序は以下の通りである：
（１）プロモータ領域、（２）５′−非翻訳領域、
（３）リポプロテイン暗号領域、（４）３′−非翻訳領
域、および（５）転写終了サイト。遺伝子系でのこれら
の要素の夫々の機能はよく知られている。プロモータ領
域は、メッセンジャーＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の生産（転
写）の開始をとりなす。プロモータは外部コントロール
がなくてもよく（構成性）、それが存在するとき、遺伝
子機能を抑制する物質即ちリプレッサの支配下であって
もよく、また、遺伝子機能を誘発するのに必要な物質、
即ちインジューサの支配下にあってもよい。ｌｐｐ遺伝
子は外部コントロールがなく、従って「構成性」と呼ば
れる。プロモータまたはその近くに、ＲＮＡポリメラー
ゼが結合しｍＲＮＡの転写を開始する点、「転写開始サ
イト」が存在する。転写が開始されると、ｍＲＮＡが生
成する。生成したｍＲＮＡの構造は、上記の遺伝子要素
（２）〜（４）のＤＮＡ配列によって決まる。生成した
ｍＲＮＡは、蛋白質生産物に翻訳され得る配列を持って
いる。この翻訳される配列は、５′−非翻訳領域の下流
であって、３′−非翻訳領域の上流に存在する。翻訳
は、ｍＲＮＡ５′−非翻訳領域内のリボゾーム結合サイ
トと呼ばれる配列にリボゾームが結合することによって
媒介され、生産物遺伝子配列の最初のコドンとして存在
し、アミノ酸、メチオニン（Ｍｅｔ）を暗号化している
ものでもある翻訳開始コドン（ＡＵＧ）において開始さ
れる。翻訳は翻訳領域の末端に存在する１もしくはそれ
以上の終止コドンで終了する。ベクターに、発現コント
ロール（調節）配列、即ち構造遺伝子に効果的に（ｏｐ
ｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結したとき該遺伝子の発現をコ
ントロールし調整するヌクレオチド配列、を挿入するこ
とにより、外来（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）蛋白質の生産に
有用なクローニングベクターを調整することが、組換え
ＤＮＡ技術によって最近可能となってきた。本発明の要
旨は、前記の要素（１）、（２）、（４）および（５）
を含む、ｌｐｐ発現コントロール配列の全てまたは一部
を使用したクローニングヘクターに存する。本発明のク
ローニングベクターにおいては、これらの４つの要素の
うち要素（１）および（２）、即ちプロモータ領域およ
び５′−非翻訳領域だけが必要である。従来、組換えＤ
ＮＡ法によって、外来蛋白質を暗号化しているＤＮＡ配
列を、クローニングベクターの発現コントロール配列
に、発現された生産物がハイブリッド（雑種）蛋白質に
なるような位置に挿入することにより、外来蛋白質を生
産するのが普通であった。本明細書に於いて、「ハイブ
リッド蛋白質」とは、外来蛋白質が付着している、発現
コントロール配列によって生産される固有の（ｅｎｄｏ
ｇｅｎｏｕｓ）蛋白質（この場合リポプロテイン）の全
てまたは一部からなる組換えＤＮＡ生産物を意味する。
適切に設計されたハイブリッド蛋白質は、固有の蛋白質
部分と外来蛋白質との結合部に開裂サイトを含有してい
る。ハイブリッド蛋白質生成物を化学的にまたは酵素的
に処理するとこの開裂サイトによって外来蛋白質生成物
が完全な形で生成する。既述したように、ｌｐｐ発現コ
ントロール配列は外来蛋白質の発現に有用であることが
解った。しかし極く最近、このｌｐｐ発現コントロール
配列は次のような設計で組み立てを行うとき、非常に好
都合に外来蛋白質を発現するのに使用し得ることが解っ
た：即ち縦列に、プロモータおよびリポプロテイン発現
コントロール配列の５′−非翻訳領域を指定している配
列および翻訳開始コドンを含み、その後に、固有の蛋白
質を暗号化しているヌクレオチド配列の全てまたは一部
分で中断されることなく、外来蛋白質を暗号化している
配列、或いは、外来蛋白質を暗号化している配列と中断
することなく結合しているエンテロキナーゼ開裂サイト
を暗号化しているヌクレオチド配列、が続いているとい
ったＤＮＡセグメント。これはリポプロテインまたはそ
の一部および外来蛋白質からなるハイブリッド蛋白質と
は対照的なものである。本発明に係るクローニングベク
ターを組み立てるには２，３の要素が必要である。必要
な要素の２つは有用なクローニングベクターの全てに共
通している。第１は、このベクターは複製の機能起源
（レプリコン）を含有するＤＮＡセグメントを持ってい
なければならないということである。プラスミドおよび
ファージＤＮＡは、本来、宿主細胞中で複製を促進する
レプリコンを含んでいる。第２に、このベクターは非形
質転換細胞から形質転換細胞を選択するのに有用な性質
を形質転換し得る宿主細胞に運び込むＤＮＡセグメント
を持っていなければならない。選択の目的には広範囲の
性質のいずれをも使用することができる。最も普通に使
用される性質の１つは抗生物質耐性、例えばテトラサイ
クリン耐性またはアンピシリン耐性である。上記の２つ
要素は一般に容易に入手し得る、そして知られているク
ローニングベクター中に存在している。好適なクローニ
ングベクターの例は細菌性プラスミド、例えばｐＢＲ３
２２，ｐＭＢ８９，ＣｏｌＥ１，ｐＣＲ１を包含する
Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミド、ＲＰ４を含むより広い
宿主範囲のプラスミド、ハァージＤＮＡ、例えばラムダ
ーなどである。全てではないが、上記の既知のベクター
の大部分は、前記の２つの要素を既に含んでいる。本発
明に係るベクターに特異な第３の要素はリポプロテイン
発現コントロール（調節）配列である。プラスミド ｐ
Ｋ ＥＮ１１１に存在し、Ｅ．ｃｏｌｉＣＣ６２０で培
養されるＥ．Ｃｏｌｉリポプロテイン発現コントロール
配列は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒ
ｅｇｉｏｎ，１８１５Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｅｔ
ｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉ−ｎｏｉ
ｓ，６１６０４に寄託され、そのストックカルチャーコ
レクションの一部となっており、そこから誰でも寄託番
号ＮＲＲＬ１５０１１で利用することが出来る。このリ
ポプロテイン発現コントロール配列は、ｐＫＥＮ１１１
から、認識されている制限サゴトおよびそれに相当する
制限エンドヌクレアーゼを使って取除くことができる。
広範囲のその他のリポプロテイン発現コントロール配列
も認識されている方法を使って利用することができる。
このような方法には、例えば、合成による調製、または
入手し得るｌｐｐ配列（例えばｐＫＥＮ１１１）を使っ
てプローブを単離し、ｌｐｐ配列間の高度の類似性を利
用して、このプローブを使って選択し、ハイブリジデー
ション（雑種形成）によって他のソースからのｌｐｐ配
列を調整する方法が含まれる。リポプロテイン発現コン
トロール配列を挿入することにより好適なクローニング
ベクターを製造するには常法を用いてもよい。クローニ
ングベクター内には特定の制限エンドヌクレアーゼを使
って切断し得る種々のサイトが存在する。これらのサイ
ト（部位）はいずれもリポプロテイン発現コントロール
配列の挿入に選択、使用することができる。例えば、よ
く知られた、そして文献に記載されているプラスミドｐ
ＢＲ３２２にはいくつかの好適な制限サイトが存在し、
そのいずれも挿入サイトとして使用することができる。
ＰｓｔＩサイトはβ−ラクタマーゼの遺伝子内に存在し
ている。全ての特異な暗号領域の外側の他のサイトはＥ
ｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩである。これらの、およびそ
の他のサイトは当業者にはよく知られている。これら
の、或いはその他のサイトを利用して、リポプロテイン
発現コントロール配列またはその必須部分を容易に挿入
することができ、本発明に係るベクターを製造すること
ができる。本発明に係るベクターに特異な第４番目の要
素は、外来蛋白質を暗号化しているＤＮＡ配列である。
本発明のベクターにおける外来蛋白質ＤＮＡ配列に関す
る必須要件はその位置にある。これはリポプロテイン発
現コントロール配列の５′−非翻訳領域の３′末端の下
流に存在しなければならず、翻訳開始コドンを介してそ
れと連結していなければならない。本発明のベクターに
おいては、リボプロテインを暗号化しているＤＮＡ配列
はいかなるものも、５′−非翻訳領域および外来蛋白質
を暗号化している配列の間に介在してはならない。本発
明に係る第２の態様のベクターに特異な第５番目の要素
では、翻訳コドンの後に外来蛋白質を暗号化している配
列と、中断することなく結合しているエンテロキナーゼ
開裂サイトを暗号化しているヌクレオチド配列が続いて
いる。上記の開裂サイトのアミノ酸配列は、酵素エンテ
ロキナーゼにより認識され、そのカルボキシ末端で開裂
される。エンテロキナーゼで開裂されるアミノ酸配列を
暗号化しているヌクレオチド配列は、その５′末端にお
いて翻訳開始コドンと結合しており、その３′−末端に
おいて外来蛋白質を暗号化しているヌクレオチド配列の
５′末端と結合しており、（メチオニン）−（エンテロ
キナーゼ開裂サイト）−（外来蛋白質）という構成の得
られた翻訳生産物をエンテロキナーゼで処理することに
より開裂することができ、完全な外来蛋白質を生産し得
るように設計する。エンテロキナーゼ（３．４．２１．
９）は十二指腸の刷子縁膜に存在する多数の加水分解酵
素の１つとして記載されている（Ｊ．Ｊ．Ｌｉｅｐｎｉ
ｅｋｓおよびＡ．Ｌｉｇｈｔ，Ｊ．Ｂｉｌｏ．Ｃｈｅ
ｍ．２５４、１６７７−１６８３（１９７９））。その
単離および精製については多くの文献、例えばＬｉｅｐ
ｎｉｅｋｓ、上記、Ｓ．Ｍｒｏｕｘ，Ｊ．Ｂａｒａｔｔ
ｉおよびＰ．Ｄｅｓｎｕｅｌｌｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２４６、５０３１−５０３９（１９７１）、およ
びＪ．Ｂａｒａｔｔｉ，Ｓ．Ｍａｒｏｕｘ，Ｄ．Ｌｏｕ
ｖａｒｄ，およびＰ．ＤｅｓｎｕｅｌｌｅのＢｉｏｃｈ
ｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ
３１５、１４７−１６１（１９７３）に記載されてい
る。エンテロキナーゼは、各種のアミノ酸、例えばグル
タミン酸（Ｇｌｕ）および／またはアスパラギン酸（Ａ
ｓｐ）に続くリシン（Ｌｙｓ）残基のカルボキシル基で
ペプチドを開裂するようである。例えばＡ．Ｌｉｇｈ
ｔ，Ｈ．Ｓ．ＳａｖｉｔｈｒｉおよびＪ．Ｊ．Ｌｉｅｐ
ｎｉｅｋｓのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６、１９
９−２０６（１９８０）には、エンテロキナーゼで認識
されるアミノ酸配列が多数記載されており、例えば以下
のものが含まれている：Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ；Ｖａｌ−Ａｓｐ
一Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ；Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ；Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ：Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ；Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ。本発明に係るクローニングベクター
には上記のおよびその他のいずれかを暗号化しているヌ
クレオチド配列が存在していてよい。必要なことは、そ
のヌクレオチド配列は、エンテロキナーゼにより認識さ
れ、長鎖のペプチド中に存在する場合そのカルボキシ末
端で開裂されるアミノ酸配列を暗号化しているものであ
るという点だけである。この要求を満たすベクターを組
み立てるにあたり、Ｅ．ｃｏｌｉリポプロテイン発現コ
ントロール配列の５′−非翻訳領域に存在する唯一（ｕ
ｎｉｑｕｅ）のＸｂａＩ制限サイトを好都合に利用する
ことができる。このＸｂａＩサイトで切断することがで
き、５′−非翻訳領域の一部を除去することができる。
既知のオリゴヌクレオチド合成法を使って、開始コドン
またはエンテロキナーゼ開裂サイトが後に続く開始コド
ンを暗号化しているＤＮＡ配列と結合している５′−非
翻訳領域の除去された部分および外来蛋白質の全てまた
は一部を含有しているリンカーを製造することができ
る。外来蛋白質を暗号化しているＤＮＡ配列は合成によ
り、例えば既知のホスホトリエステル法或いはその他の
よく知られた方法を使って組み立てることができるが、
このＤＮＡ配列はまた、既知の方法で、単離されたｍＲ
ＮＡからのコピーとして得ることもできる。一度得られ
ると、このｃＤＮＡコピーは開始コドンが得られる点に
存在する制限サイトで切断することができる。本発明に
係るクローニングベクターの第１番目の態様では、Ｘｂ
ａＩ開裂によって除去されたリポプロテイン５′−非翻
訳領域フラグメントとそれに続く開始コドンを含む外来
蛋白質の開裂部分から構成されるリンカーを合成的に製
造することができる。本発明に係るクローニングベクタ
ーの第２番目の態様では、ＸｂａＩ開裂によって除去さ
れたリポプロテイン５′−非翻訳領域フラグメントおよ
びそれに続く開始コドン、エンテロキナーゼ開裂サイ
ト、および外来蛋白質の開裂された部分からなるリンカ
ーを合成的に製造することができる。ギャップを埋める
（橋渡しする）に十分なこれらのリンカーは、リポプロ
テイン発現コントロール配列の残りの利用し得る要素と
共に、ベクターを調製するのに使用する。本発明に係る
クローニングベクターは哺乳動物およびヒトのホルモン
類、酵素類、および免疫源（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）
蛋白質を含む広範囲の外来蛋白質（またはその中間体）
を生産するのに使用することができる。このような生産
物の例は、インシュリンＡ鎖、インシュリンＢ鎖、プロ
インシュリン、インターフェロン、成長ホルモン、足お
よび口腔疾患のための抗原性蛋白質、ソマトスタチン、
β−エンドルフィンなどである。好ましいクローニング
ベクターはヒト成長ホルモンまたは牛成長ホルモンを生
産するように設計されたベクターである。第１番目の態
様のクローニングベクターによる発現生産物は、開始コ
ドンが存在するため、そのアミノ末端にメチオニン（Ｍ
ｅｔ）を含んでいることは容易に理解されよう。第２番
目の態様のベクターによる発現生産物は、メチオニン
（開始コドン）、エンテロキナーゼ開裂サイト、および
外来蛋白質を含んでいる。完全な外来蛋白質は、発現生
産物を、既知の方法（例えばＬｉｇｈｔらの文献、上記
参照）でエンテロキナーゼで処理することにより生成す
る。本発明に係るクローニングベクターは広範囲の徴生
物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｓｅｒ
ｒａｒｉａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，などのグラム陰
性原核生物、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓなどのグラム陽性原核生物、およびＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓなどの真核生物などの宿主生物において使
用することができる。宿主生物はグラム陰性原核生物で
あることが好ましい。グラム陰性原核生物のうち、Ｅ．
ｃｏｌｉは特に好ましく例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２
株、例えばＲＶ３０８は特に好ましい。よく知られた方
法を使って、このクローニングベクターを適当な宿主生
物に導入して形質転換し、その生物中で増幅させ、標準
的な発酵条件を使用して外来蛋白質生産物を発現させる
ことができる。得られた発酵ブロスから常法により外来
蛋白質生産物を単離することができる。本発明に係るク
ローニングベクターの構造および機能を後記実施例にお
いて例示する。この実施例は添付の図面を参照して理解
されるべきである。第１図〜第４図は、一緒になって、
本発明に係る両態様のクローニングベクターを組み立て
るのに有用な中間体および出発物質の製造を図式化して
示したものである。第５図は第１〜４図と一緒になっ
て、メチオニル（Ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ）ヒト成長ホルモ
ンを生産するのに有用なクローニングベクターを組み立
てるための後記実施例１に記載した方法を図式化したも
のである。第６〜８図は、第１〜５図と一緒になって、
メチオニル牛成長ホルモンの生産に有用なクローニング
ベクターを組み立てるための実施例２に記載した方法を
図式化したものである。第９図は、第１〜５図と一緒に
なってメチオニルヒト成長ホルモンの生産に有用な、実
施例１に記載のクローニングベクターの変異体であるク
ローニングベクターを組み立てるための実施例３に記載
の方法を図式化したものである。第１０図は、第１〜４
図と一緒になって、ヒト成長ホルモンの生産に有用な本
発明に係る第２の態様のクローニングベクターを組み立
てるための実施例４に記載した方法を図式化したもので
ある。第１１図〜第１３図は、第１０図および第１〜４
図と一緒になって、牛成長ホルモンの生産のための第２
の態様のクローニングベクターを組み立てるための実施
例５に記載の方法を図式化したものである。製造例 本発明に係る第１および第２の態様のプラスミ
ドを組み立てるための共通の中間体および出発物質。プ
ラスミドベクターｐＫＥＮ０２１（第３図の１０６）の
ＸｂａＩ（５′ＴＣＴＡＧＡ３′）、ＢａｍＨ Ｉ
（５′ＧＧＡＴＣＣ３′）開裂によって得られる〜５．
１ｋｂ（キロ塩基）フラグメントを出発物質として使用
した。ｐＫＥＮ０２１はｐＫＥＮ１１１（第１図の１０
１）の誘導体である（Ｌｅｅ，Ｎ．らＪ．Ｂａｃｔ．１
４６、８６１−８６６（１９８１）およびＺｗｉｅｂｅ
ｌ，Ｌ．Ｊ．らＪ．Ｂａｃｔ．１４５、６５４−６５６
（１９８１）参照。これはＥ．ｃｏｌｉ ＣＣ６２０に
入れて寄託されている（ＮＲＲＬ寄託番号１５０１
１））。プラスミドｐＫＥＮ１１１はＥ．ｃｏｌｉのリ
ポプロテイン遺伝子を含む２．８ｋｂフラグメントを持
っている。このフラグメントについてはＮａｋａｍｕｒ
ａ，Ｋ．およびＩｎｏｕｙｅ，Ｍ．のＣｅｌｌ１８、１
１０９−１１１７（１９７９）に記載されている。ｐＫ
ＥＮ０２１においては、ｐＢＲ３２２の唯一のＥ ｃｏ
Ｒ Ｉ（５′ＧＡＡＴＴＣ３′）およびＳａｌＩ（５′
ＧＴＣＧＡＣ３′）制限サイトの間の６５０ｂｐ（塩基
対）配列が、Ｅ．ｃｏｌｉのリポプロテイン遺伝子から
得た配列で置き換えられている。この遺伝子の全ての機
能部分のヌクレオチド配列は決定されている。リポプロ
テイン遺伝子配列（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．およびＩｎ
ｏｕｙｅ，Ｍ，のＣｅｌｌ１８、１１０９−１１１７
（１９７９））は、リポプロテイン遺伝子の最初のコド
ン（メチオニン）の上流に４６２ｂｐＡｌｕＩ（５′Ａ
ＧＣＴ３′）フラグメントを含んでいる。このフラグメ
ントはプロモータ、５′−非翻訳領域およびリボゾーム
結合サイトを持っている。唯一のＸｂａＩ（５′ＴＣＴ
ＡＧＡ３′）制限サイトは翻訳開始メチオニンコドンの
１６ｂｐ前のリボゾーム結合サイト内に存在する。構造
遺伝子の翻訳終止コドンの１０５ｂｐ上流に存在するＰ
ｖｕＩＩ（５′ＣＡＧＣＴＧ３′）制限サイトを、合成
ＤＮＡアダプターフラグメント（５′ＣＣＧＧＡＴＣＣ
ＧＧ３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈから入手）を付加することにより、ＢａｍＨＩ
（５′ＧＧＡＴＣＣ３′）制限サイトに変換した。リポ
プロテインの最後の３５アミノ酸のための暗号配列、翻
訳終止コドンおよびメッセンジャーＲＮＡの３′−非翻
訳領域に相当する配列がこのＢａｍＨＩサイトに続いて
いる。プラスミドｐＫＥＮ０２１はまた、リポプロテイ
ン遺伝子に関係のない、Ｅ．Ｃｏｌｉ染色体においてそ
の下流に位置する約８５０ｂｐの外来性の配列を含んで
いる。これらの配列は、この方法の結果として、また、
遺伝子の最初の単離に使用した制限酵素サイトの結果と
して含まれたものである。第１〜第３図に関し、プラス
ミドｐＫＥＮ０２１は以下の方法でｐＫＥＮ１１１から
誘導する：ｐＫＥＮ１１１（第１図の１０１）５０μｇ
を、２０ｍＭトリス：塩酸（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭ
ｇＣｌ２および６ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含
む緩衝液３００μｌ中、制限酵素ＨｐａＩＩ（５′ＣＣ
ＧＧ３′）２５単位を用いて３７℃で２時間消化する。
この混合物をフェノールおよびクロロホルムの混合物
（５０：５０）３００μｌで２回抽出し、回収した水相
にエタノール２．５容を加えて沈澱させる。ＤＮＡペレ
ットを電気泳動緩衝液１００μｌに溶解し、５％のポリ
アクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス比（ｂｉｓ
ｒａｔｉｏ）は、特に指摘しないかぎり全てのゲルにお
いて２９：１である）を用いて分画する。このゲルを
０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含有する溶液
に入れて染色し、帯を長波長の紫外線下で観察する。９
５０ｂｐの帯を単離し、電気溶出によりゲルから透析袋
に回収する。フェノール／ＣＨＣｌ３抽出、およびエタ
ノール沈澱の後、回収したＤＮＡ（約２．５μｇ）を２
５μｌのＴＥＮ（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリ
ス：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１ｍＭのナトリウムエ
チレンジニトリロテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、ｐＨ
８．０）に溶解する。９５０ｂｐのＨｐａＩＩフラグメ
ント２μｇを、５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭトリス：Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．６）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２および６ｍＭ
β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液２００μ
ｌ中、制限酵素ＡｌｕＩ（５′ＡＧＣＴ３′）を用いて
２時間３７℃で消化する。ＤＮＡを６％のポリアクリル
アミドゲル上で分画し、生成した４６２ｂｐＡｌｕＩフ
ラグメントを既述した方法で回収し精製する。この４６
２ｂｐＡｌｕＩフラグメント（約１μｇ）を１５０ピカ
モル（ｐｉｃａｍｏｌｅ）のリン酸化ＥｃｏＲＩリンカ
ー（５′ＧＧＡＡＴＴＣＣ３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔ
ｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）および２単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６
６ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、１０ｍＭジチオトレイット、０．４ｍＭ ＡＴ
Ｐ）１０μｌに溶解する。４℃で１６時間インキュベー
トした後、この混合物を６５℃で１０分間加熱し、Ｅｃ
ｏＲＩ緩衝液（１００ｍＭ トリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６
ｍＭβ−メルカプトエタノール）および４０単位のＥｃ
ｏＲＩ酵素を加えて１００μｌに希釈する。３７℃で２
時間放置した後、この試料をフェノール／ＣＨＣｌ３で
抽出し、上記の方法でエタノール沈澱させる。このＤＮ
Ａを、０．１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼおよびＥｃｏＲ
Ｉで線状化し、アリカリホスファターゼ処理により末端
ホスフェートを除去した０．１μｇのｐＢＲ３２２（第
１図の１０２）を含有するＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２
０μｌに溶解する。４℃で１６時間結合させた後、この
物質を用いてＨＢ１０１のような好適なＥ．ｃｏｌｉ株
（ｈｓｒ−、ｈｓｍ＋）を形質転換する。この細菌細胞
は、標準的なＣａＣｌ２処理により形質転換に関してコ
ンピテントにする。テトラサイクリン１２μｇ／ｍｌを
含有する寒天平板上で形質転換体を選択する。Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．およびＤｏｌｙ，Ｊ．の高速アルカ
リ抽出法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ７、１５１３−１５２３（１９７９））で多くのテ
トラサイクリン耐性コロニーからプラスミドを単離す
る。４６６ｂｐＸｂａＩ、ＢａｍＨＩフラグメントを含
有するプラスミド（所望の配向、第１図の１０３）を選
択し、次の工程の出発物質として使用する。このプラス
ミド２μｇ（第２図の１０３）（１個のＨｉｎｄＩＩＩ
（５′ＡＡＧＣＴＴ３′）制限サイトを持っている）
を、ＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液（６０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍトリス： ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２および６ｍＭ β−メルカプトエタノール）５０μ
ｌ中、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素２単位を用いて３７℃で１時
間消化する。フェノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノ
ール沈澱の後、このＤＮＡを３００ｍＭ ＮａＣｌ、３
０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２５）、１ｍＭ Ｚｎ
Ｃｌ２および１本鎖ＤＮＡに特異なＳ１ヌクレアーゼ
（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２００単位
を含有する緩衝液２００μｌに溶解する。１５℃で１時
間反応させた後、フェノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエ
タノール沈澱により反応を停止させる。１本鎖Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−生成末端を除去されたこのプラスミドを２０ピ
カモルのリン酸化ＢａｍＨＩリンカー（５′ＣＣＧＧＡ
ＴＣＣＧＧ３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒａ−ｔｉｖｅ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈから入手）および２単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液１０μｌに溶解す
る。４℃で１６時間反応させた後、この反応混合物を６
５℃で１０分間加熱してリガーゼを不活性化する。この
混合物を２０単位のＢａｍＨＩ酵素を含有するＢａｍＨ
Ｉ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス：Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ
β−メルカプトエタノール）１００μｌに希釈する。３
７℃で２時間放置した後、この混合物を１％アガロース
ゲル上で精製する。ゲルを染色し、大きいほうのフラグ
メント（４．５ｋｂ）を凍結後溶出により回収し、フェ
ノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール沈澱により精
製する。ＢａｍＨＩ相補末端を持ったこの回収したプラ
スミドを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．１単位を含有するＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解する。４℃で１
６時間放置した後、このＤＮＡを使ってＥ．ＣｏｌｉＨ
Ｂ１０１を形質転換する。形質転換体を１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンに対する耐性（Ａｐｒ）により選択
し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンに対する感受性
（Ｔｃｓ）についてスクリーニングする。ＡｐｒＴｃｓ
であるコロニーから既述のＢｉｒｎ−ｂｏｉｍ法により
いくつかのプラスミドを調製する。これらのＨｉｎｄＩ
ＩＩサイトの非存在および唯一のＢａｍＨＩサイトの存
在について試験する。ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで順次消化
すると、４６６ｂｐおよび３０５ｂｐのフラグメントが
得られる。これらの特性を持ったプラスミド（第２図の
１０４）を選択し、ｌｐｐプロモータの上流に位置する
ＥｃｏＲＩサイトを除去しこれをＨｉｎｄＩＩＩ制限サ
イトに変換するように改変する。プラスミド（第２図の
１０４）２μｇを、ＥｃｏＲＩ緩衝液１００μｌ中、Ｅ
ｃｏＲＩ、０．２単位を用いて３７℃で１０分間消化す
る。６５℃で１０分間加熱して反応を停止させる。フェ
ノール／ＣＨＣｌ３抽出の後、このＤＮＡをエタノール
沈澱させ、１０００単位／ｍｌの割合いでＳ１ヌクレア
ーゼを含有しているＳ１ヌクレアーゼ緩衝液２００μｌ
に溶解する。１２℃で１時間反応させた後、フェノール
／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール沈澱により反応を停
止させる。ＤＮＡを、２０ピカモルのリン酸化Ｈｉｎｄ
ＩＩＩリンカー（５′ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ３′、Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）
および２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ緩衝液１０μｌに再懸濁する。４℃で１６時
間放置した後、６５℃で１０分間加熱してリガーゼを不
活性化する。この反応混合物を１０単位のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ酵素を含有するＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液１５０μｌに希
釈する。３７℃で２時間インキュベートした後、この混
合物を１％アガロースゲル上で分画する。エチジウムブ
ロミドで染色した後、最大の帯（シングルカットのプラ
スミドに等しい）を回収し精製する。このプラスミドを
０．２単位のＴ４リガーゼを含有するＴ４リガーゼ緩衝
液２０μｌに溶解し、４℃で１６時間インキュベート
し、これを使ってＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換す
る。形質転換体をアンピシリン耐性について選択し、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ法によりスクリーニングする。プラスミ
ド単離物をＥｃｏＲＩ（１サイト）およびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（１サイト）酵素を用いて制限分析する。５００ｂｐ
のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを持ったプ
ラスミド（第２図の１０５）を選択し、ｌｐｐ遺伝子の
３′領域の付加のためのクローニングベクターとして使
用する。プラスミト（第３図の１０５）２μｇをＳａｌ
Ｉ制限緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭトリス：
ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭβ
−メルカプトエタノール）５０μｌ中、ＳａｌＩ２単位
を用いて３７℃で１時間消化する。この溶液をＢａｍＨ
Ｉ２単位を含有するＢａｍＨＩ緩衝液１５０μｌに希釈
する。３７℃で１時間放置した後、アルカリホスファタ
ーゼ２．５単位を加え６５℃で１時間インキュベートす
る。この物質をフエノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタ
ノール沈澱させ、ＴＥＮに溶解し、ｌｐｐ３′フラグメ
ントのためのクローニングベクターとして使用する。ｌ
ｐｐ３′領域を含むフラグメントを得るために、ｐＫＥ
Ｎ１１１（第３図の１０１）１０μｇをＨｐａＩ緩衝液
（２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および６ ｍＭ β−
メルカプトエタノール）２００μｌ中、ＨｐａＩ（５′
ＧＴＴＡＡＣ３′）１０単位を用いて３７℃で２時間消
化する。フェノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール
沈澱の後、ＤＮＡを２０ピカモルのリン酸化ＳａｌＩリ
ンカー（５′ＧＧＴＣＧＡＣＣ３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）および２単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するＴ４ＤＮＡリガーゼ緩
衝液１０μｌに溶解する。４℃で１６時間放置した後、
６５℃で１０分間加熱してリガーゼを不活性化する。こ
の物質を１０単位のＳａｌＩを含有するＳａｌＩ緩衝液
１００μｌに希釈し、３７℃で１時間インキュベートす
る。このＤＮＡを１０単位のＰｖｕＩＩ制限酵素を含有
するＰｖｕＩＩ緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭト
リス：ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６
ｍＭ β−メルカプトエタノール）３００μｌに希釈す
る。３７℃で１時間放置した後このＤＮＡを５％のポリ
アクリルアミドゲル上で分画する。約０．５μｇの９５
０ｂｐフラグメントを回収し、精製し、ＴＥＮに溶解す
る。２／１０μｇのフラグメントを２０ピカモルのリン
酸化ＢａｍＨＩリンカー（５′ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ
３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
から入手）および２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含むＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに希釈する。４℃で１
６時間放置した後、６５℃で１０分間加熱してリガーゼ
を不活性化する。このＤＮＡを２０単位のＢａｍＨＩを
含有するＢａｍＨＩ緩衝液１００μｌに希釈する。３７
℃で２時間保持した後、ＤＮＡを５％のポリアクリルア
ミドゲル上で分画し、過剰のリンカー分子を除去する。
ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ相補末端を持った９５０ｂｐ
フラグメントを回収し精製する。このフラグメントを
０．２μｇの既述したクローニングベクターおよび０．
２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液２０μｌに溶解する。４℃で１６時間インキ
ュベートした後、この物質を使ってＥ．ｃｏｌｉＨＢ１
０１を形質転換する。アンピシリン耐性形質転換体から
プラスミドを調製し、９５０ｂｐのＳａｌＩ、ＢａｍＨ
Ｉフラグメントについて分析する。所望のプラスミド
（５．２ｋｂ）はｐＫＥＮ０２１と命名した（第３図１
０６）。ｐＫＥＮ０２１ １０μｇをＸｂａＩ／Ｂａｍ
ＨＩ緩衝液２００μｌ中（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０
ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、６ｍＭ β−メルカプトエタノール）、ＢａｍＨ
Ｉ１０単位を使って３７℃で１時間、次いでＸｂａＩ
１０単位を使って３７℃で１時間消化した。このＤＮＡ
をアルカリホスファターゼ２．５単位で６５℃で１．５
時間処理し、フェノール／ＣＨＣｌ３抽出し、エタノー
ル沈澱によって集め、０．２μｇ／μｌとなるようにＴ
ＥＮ５０μｌ（１０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解
した。この調製物（第３図の１０７）をプラスミドクロ
ーニングベクターとして使用した。ヒト成長ホルモン遺
伝子部分のための暗号配列を含んでいるＤＮＡフラグメ
ントのソースとして、Ｍａｒｔｉａｌ，Ｊ．Ｈ．らによ
り記載されているプラスミドｐｔｒｐＥＤ５０ｃｈＧＨ
８００（第４図の１０８）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５、
６０２−６０７（１９７９））を使用した。このフラグ
メントは、ヒトの脳下垂体からヒト成長ホルモンを暗号
化しているｍＲＮＡを単離する既知の方法により得るこ
ともできる。このような方法はＧｏｏｄｍａｎ，Ｈ．
Ｍ．らにより報告されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍ−ｏｌｏｇｙ６８、７５−９０（１９７
９））。プラスミドｐｔｒｐＥＤ５０ｃｈＧＨ８００の
ヒト成長ホルモン遺伝子部分には、この遺伝子の翻訳終
止コドンから６ｂｐ下流に唯一のＳｍａＩ（５′ＣＣＣ
ＧＧＧ３′）制限サイトが含まれている。このサイトを
以下の手法でＢａｍＨＩサイトに変換した：このプラス
ミド６μｇをＳｍａＩ制限緩衝液（１５ｍＭトリス：塩
酸（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ Ｋ
Ｃｌおよび６ｍＭ β−メルカプトエタノール）２００
μｌ中、ＳｍａＩ６単位を用いて３７℃で１．５時間消
化した。消化が完了した後、フェノール／ＣＨＣｌ３抽
出を行ない、ＤＮＡをエタノール沈澱により回収した。
沈澱したＤＮＡをＴＥＮ２４μｌに溶解した。リン酸化
ＢａｍＨＩアダプターフラグメント（Ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ Ｒｅ−ｓｅａｒｃｈ）４０ピカモルを、２
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液１
６μｌ中、上記の消化したプラスミド０．５μｇ（０．
２ピカモルｅｎｄｓ）に添加した。２２℃で２時間、４
℃で１６時間結合させた。６５℃で１０分間Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを不活性化した。２０単位のＢａｍＨＩ酵素を
含有するＢａｍＨＩ緩衝液に希釈し、最終全容量を４０
μｌとし、次いで３７℃で１時間インキュベートするこ
とによりＢａｍＨＩ相補末端を生成させた。この酵素に
よりリンカー配列およびヒト成長ホルモンのクローンし
たｃＤＮＡ配列の初めの部分に存在するＢａｍＨＩサイ
トが開裂された。その結果、相補ＢａｍＨＩ末端を有す
る６９１ｂｐフラグメントが生成し、これを６％ポリア
クリルアミドゲル上で分離し、１μｇ／ｍｌのエチジウ
ムブロンド溶液中で染色した後長波長の紫外線により観
察した。このフラグメントを含有するゲル部分を切取
り、透析袋への電気溶出次いでエタノール沈澱によりＤ
ＮＡフラグメントを回収した。沈澱したＤＮＡを遠心分
離により回収し、ＴＥＮに溶解し、フェノール／ＣＨＣ
ｌ３抽出してエチジュウムブロンドを除去し次いでエタ
ノール沈澱させた。回収したＤＮＡフラグメントを、既
述した条件下で緩衝液２０μｌ中、０．２単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて、その唯一のＢａｍＨＩサイトで
予め開裂させ次いでアルカリホスファターゼで処理した
ｐＢＲ３２２０．２μｇ（第４図の１０２）と結合させ
た。４℃で１６時間放置した後、この物質を用いて、寄
託番号ＮＲＲＬＮｏ．１５０１４で寄託されているＥ．
ｃｏｌｉ株ＪＡ２２１（ｒｅｃＡ−，ｈｒｓ− ｈｓｍ
＋，Δ ｔｒｐＥ５，ｔｈｒ，ｌｅｕ，ｔｈｉ，ｌａｃ
Ｙ−）を形質転換した。Ｗｅｎｓｉｎｋ Ｐ．Ｃ．らの
形質転換法（Ｃｅｌｌ ３、３１５−３２５（１９７
４）を使用し、形質転換されたコロニーを１００μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含有する寒天平板上で選択した。
Ｂｉｒｎｂｏｉｍによって記載されている高速アルカリ
変性法により、１６個のアンピシリン耐性コロニーから
プラスミド、ＤＮＡを単離し、次いで制限酵素消化およ
びゲル電気泳動により分析した。調べた１６個のプラス
ミドのうち１１個が約７００ｂｐのＢａｍＨ Ｉ フラ
グメントを含有していることが解った。これらのプラス
ミドの１つｐＮＭ５７５（第４図の１０９）を選んで増
幅させ、以降のプラスミド組み立てのためのＤＮＡフラ
グメントのソースとして使用した。完全なヒト成長ホル
モンのＤＮＡ配列には、最初のヌクレオチドから４７ｂ
ｐのところに１個のＦｎｕＤＩＩ（５′ＣＧＣＧ３′）
サイトが含まれている。ｐＢＲ３２２にはこの酵素の認
識サイトが２３存在する。ｐＮＭ５７５の２５μｇを、
ＢａｍＨＩ緩衝液２５０μｌ中、２５単位ＢａｍＨＩを
用いて３７℃で１時間消化した。ＢａｍＨＩ相補末端を
持った６９１ｂｐフラグメントを６％のポリアクリルア
ミドゲルから単離し、前記の方法で精製した。このフラ
グメントを精製した後、その１／３（プラスミド８μｇ
に相当）を、ＦｎｕＤＩＩ緩衝液１００μｌ中（６ｍＭ
ＮａＣｌ、６ｍＭ トリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル）、２．５単位のＦｎｕＤＩＩを用いて３７℃で１．
５時間消化した。６％のポリアクリルアミトゲル上で電
気泳動し、標準的な回収操作を用いてこの遺伝子の最後
の１７５アミノ酸およびそれに続く翻訳終止コドンの暗
号配列を含有している５３８ｂｐＤＮＡフラグメントを
単離した。実施例１ Ｅ．ｃｏｌｉのリポプロテインプロモータを使ったメチ
オニルヒト成長ホルモン発現のためのプラスミド Ａ． 組み立て ヒト成長ホルモンを直接発現させるため、リン酸トリエ
ステル法により、ｌｐｐプロモータ領域をヒト成長ホル
モン暗号領域と結合させて２本鎖ＤＮＡフラグメント
（第５図の１１０）を合成した。上の鎖（ｕｐｐｅｒ
ｓｔｒａｎｄ）は、ＸｂａＩ開裂により生じた４ヌクレ
オチドの１本鎖配列を５′末端に含んでいる６６ヌクレ
オチドを持っている。下の鎖は上の鎖の最後の６２ヌク
レオチドに相補的な６２ヌクレオチドを持っている。こ
の合成ＤＮＡフラグメントの最初の部分は、リボゾーム
結合サイトのＸｂａＩ制限サイトから翻訳開始メチオニ
ンコドンまで（１９ｂｐ）の天然のｌｐｐ遺伝子配列に
続いており、その後に既述した唯一のＦｎｕＤＩＩサイ
トまでのヒト成長ホルモンの最初の４７ヌクレオチドの
ための配列が続いている。この２本鎖ＤＮＡフラグメン
ト（第５図１１０）は以下の構造を持っている： このフラグメントは、以下のセグメントを製造した既知
のリン酸トリエステル法によって調製した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣ ４）ＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣ ５）ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧ ６）ＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧ ７）ＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ ８）ＧＧＴＴＧＧＧＡＡ ９）ＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴ １０）ＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴ １１）ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴ 上で調製したセグメントを使って以下の３種の２連体を
製造した。 ａ） 確立された方法（Ｅ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｂｅ
ｌａｇａｊｅ，Ｍ．Ｊ．ＲｙａｎおよびＨ．Ｇ．Ｋｈｏ
−ｒａｎａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ ６８，１０９−１５１（１９７９））に従って、
５′−リン酸化セグメント７の存在下、Ｔ４リガーゼを
使用して、セグメント１（５′−非リン酸化）を５′−
リン酸化セグメント２と結合させて２連体１を製造し
た。この２連体を１５％のポリアクリルアミドゲル上、
プレパラティブゲル電気泳動法により単離した。 ｂ）５′−リン酸化セグメント８および９の存在下、Ｔ
４リガーゼを使って５′−リン酸化セグメント３を５′
−リン酸化セグメント４と結合させ２連体２を調製し、
これを１５％のポリアクリルアミド上、プレパラティブ
ゲル電気泳動法により単離した。この反応は上記と同様
にして行なった。 ｃ）５′−リン酸化セグメント１０および５′−非リン
酸化セグメント１１の存在下、Ｔ４リガーゼを使って
５′−リン酸化セグメント５を５′−リン酸化セグメン
ト６と結合させ２連体３を調製した。この反応は上記と
同様にして行なった。この２連体を１５％のポリアクリ
ルアミド上、プレパラティブゲル電気泳動法により単離
した。 ２連体１，２および３をＴ４リガーゼにより結合させ、
２本鎖ＤＮＡセグメント（第５図の１１０）を調製し、
これを１５％のポリアクリルアミド上、プレパラティブ
ゲル電気泳動法により単離した。この生成物の５′末端
を、以下の確立された方法に従い、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼおよび［γ−ｐ３２］ＡＴＰを使って酵素的
にリン酸化した。リゲーション緩衝液１４μｌ中、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ２単位を使用して、０．１ピカモル
（０．４μｇ）のプラスミドベクター（第５図の１０
７）、３．２ピカモルの合成ＤＮＡフラグメント（第５
図の１１０）および０．２４ピカモル（０．０８μｇ）
の５３８ｂｐフラグメント（第５図の１０９、製造法参
照）を酵素的に結合させて発現プラスミドを組み立て
た。４℃で１６時間インキュベートした後、この混合物
を使って既述したようにＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１を形
質転換した。形質転換されたコロニーを、１００μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含有する寒天平板上で選択した。
既述したＢｉｒｎ−ｂｏｉｍスクリーニング法により１
０コロニーからプラスミドを調整した。制限酵素Ｘｂａ
ＩおよびＢａｍＨＩによる消化およびそれに続くアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により、１つのプラスミドが期
待した６０４ｂｐフラグメントを含有していることが解
った。このプラスミドを増幅させ、ＸｂａＩサイトから
ＦｎｕＤＩＩサイトまでのＤＮＡ配列をＭａｘａｍ，
Ａ．Ｍ．およびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．の方法（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４，５６
０−５６４（１９７７））に従って測定し、正しいこと
を確めた。このプラスミドを以降 ｐＮＭ６４５（第５
図の１１１）と呼ぶ。 Ｂ． ヒト成長ホルモンの発現 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１中のプラスミド ｐＮＭ６４
５によるヒト成長ホルモンの初期の発現は、Ｂｒｏｏｍ
ｅ，Ｓ．およびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．のＰｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７５、２７４６−２
７４９（１９７８）、Ｈｉｔｚｅｍａｎ，Ｒ．Ａ．らの
ＩＣＮ−ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ
１４、５７−６８（１９７９）およびＥｒｌｉｃｈ，
Ｈ．Ａ．らのＣｅｌｌ１３、６８１−６８９（１９７
８）に記載されている固相放射免疫分析法の変法によっ
て検出した。Ｌｅａｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．らの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ２２７、６８０−６８５（１９７０））により
全細菌細胞蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分
析することにより、主要な蛋白質帯は約２００００ダル
トンであることが解った。この帯は全蛋白質の少くとも
１０％に相当すると考えられ、ｐＫＥＮ０２１を含有す
るＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１の標本には存在しない。Ｔ
ｗｏｍｅｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｊ．Ｍ．およ
びＷｕ，Ｇ．Ｔ．らの標準的な放射免疫分析法（Ｃｌｉ
ｎ Ｃｈｅｍ２０、３８９−３９１（１９７４））によ
り発現を定量的に測定した結果、細胞当り少くとも２百
万分子存在することが解った。８Ｍ尿素および１％トリ
トンＸ１００で抽出することによりメチオニルヒト成長
ホルモンを５００ｇｍのＥ．ｃｏｌｉ細胞から部分的に
精製した。遠心分離により残骸を除去し、可溶性の成長
ホルモンを含有している上澄液をＷｈａｔｍａｎ ＤＥ
５２カラムで分画した。放射免疫分析（ＲＩＡ）によっ
て測定したピークフラクションを集め、等電点沈澱にか
けた。この物質をＷｈａｔｍａｎ ＳＥ５３カラムでさ
らに精製した。ピークフラクションをＲＩＡによって測
定し、この物質を等電点沈澱または限外濾過によって濃
縮した。回収したメチオニルヒト成長ホルモンの生物活
性を、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｆ．Ｓ．らの方法（Ｅｎｄ
ｏ−ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ４５、４５５−４６３（１９４
８））により、脳下垂体切除した雌ラットにおける基部
上生軟骨幅を測定することにより測定した。その活性は
死体から得たヒト成長ホルモンのそれと同じであること
が解った。実施例２ Ｅ．ｃｏｌｉ のリポプロテインプロモータ
を使用したメチオニル牛成長ホルモン発現のためのプラ
スミド メチオニル牛成長ホルモンを発現させるプラスミドを組
み立てるための出発物質として、メチオニルヒト成長ホ
ルモンのための発現プラスミドであるプラスミド ｐＮ
Ｍ６４５（第６図の１１１）を使用した。Ｍｉｌｌｅ
ｒ，Ｗ．Ｌ．らにより記載されているプラスミド ｐＢ
Ｐ３４８（第６図の１１２）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５５、７５２１−７５２４（１９８０））を、牛
成長ホルモン遺伝子部分の暗号列を含んでいる２つのＤ
ＮＡフラグメントのソースとして使用した。このプラス
ミドはｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ（５′ＣＴＧＣＡＧ
３′）制限サイトにクローンした牛成長ホルモンを暗号
化している８３１ｂｐ配列を含んでいる。Ｍｉｌｌｅｒ
らにより記載された方法の別法として、牛成長ホルモン
のための配列は、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．ら（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８，７５−９０
（１９７９））により記載されている常法により、牛の
脳下垂体から単離したメッセンジャーＲＮＡから得るこ
とができる。ヒト成長ホルモンの暗号配列と牛成長ホル
モンのそれとは非常に類似しており著しい相同性を示
す。制限酵素ＰｖｕＩＩ（５′ＣＡＧＣＴＧ３′）によ
る消化によって生成するフラグメントは、牛成長ホルモ
ンの発現プラスミドを相み立てるのに特に有用である。
生成したフラグメントのサイズはヒト成長ホルモンにお
いては４９７ｂｐであり、牛成長ホルモンでは４９４ｂ
ｐである。両配列において相当する制限ナイトは同じ暗
号枠内にある。１分子当り３ＰｖｕＩＩサイトを含有す
るｐＮＭ６４５（第６図の１１１）１０μｇを、２００
μｌのＰｖｕＩＩ制限緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣｌ、６
ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ
２、６ｍＭ β−メルカプトエタノール）中、ＰｖｕＩ
Ｉ１単位を用いて３７℃で１０分間消化した。６５℃で
１０分間加熱して反応を停止させ、ＤＮＡをアルカリホ
スファターゼで処理した。この限られた消化方法によ
り、存在するＰｖｕＩＩサイトの１／２〜２／３が開裂
される。フラグメントを１％アガロースゲル上で分離
し、４９７ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメントを欠く線状プ
ラスミドに相当するサイズのＤＮＡフラグメント（第６
図１１３）（シングルカットのプラスミドより僅かに速
く移動する）を切り取り、精製し、中間体プラスミドｐ
ＮＭ６８５（第６図の１１４）を組み立てるためのベク
ターとして使用した。４９４ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメ
ントをｐＢＰ３４８から調製した。このプラスミド１０
μｇを２００μｌのＰｖｕＩＩ緩衝液中、ＰｖｕＩＩ１
０単位を用いて３７℃で１時間消化した。フラグメント
を６％のポリアクリルアミドゲル上で分離し、既述した
方法で４９４ｂｐフラグメント（第６図の１１２から）
を観察し、精製した。２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含
有しているＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌ中、０．
２μｇのベクターを０．０５μｇの４９４ｂｐフラグメ
ントと連結することにより、中間体プラスミドｐＮＭ６
８５（第６図の１１４）を組み立てた。形質転換および
アンピシリン耐性による形質転換体の選択の後、既述し
たＢｉｒｎｂｏｉｍ法により調製したプラスミドを４９
４ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメントの存在について分析し
た。酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩで連続的に消化するこ
とによりフラグメントの正しい方向性を確認した。牛成
長ホルモン配列からの４９４ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメ
ントは唯一の非対称ＳｍａＩ制限サイトをもっている。
親のプラスミドｐＮＭ６４５はＳｍａＩサイトを含んで
いない。４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントおよび４１
６ｂｐ ＸｂａＩ、ＳｍａＩフラグメントを持ったプラ
スミドを所望の中間体として選択し、その後の組立てに
使用した。プラスミドｐＮＭ６８５（第７図の１１４）
を、２つの方法で牛成長ホルモン発現プラスミドに変換
した：（１）ヒト成長ホルモンの最初の２２アミノ酸の
暗号配列を除去し、牛成長ホルモンの最初の２３アミノ
酸の暗号配列で置換えた、および（２）暗号配列の第２
のＰｖｕＩＩサイトから終止コドンの短い配列（これは
ヒト成長ホルモン配列である）を、牛成長ホルモンの１
９０番目のアミノ酸すなわちアラニンのためのコドンを
復活するため合成フラグメントで置換えた。１０μｇの
ｐＮＭ６８５をＰｖｕＩＩ緩衝液２００μｌ中、１単位
のＰｖｕＩＩを用いて３７℃で５分間消化した。６５℃
で１０分間加熱して反応を停止させた。フラグメントの
混合物を１％のアガロースゲル上に広げ、１分子当りた
だ１つのＰｖｕＩＩカットを有する線状プラスミドを回
収し精製した。この回収した物質（約３μｇ）を５単位
のＸｂａＩで完全に消化し、アルカリホスファターゼで
処理した。フラグメントを１％のアガロースゲル上に広
げ、最大のフラグメント（ヒトおよび牛成長ホルモンに
おいてＸｂａＩおよび最初のＰｖｕＩＩサイト間の８５
ｂｐフラグメントを欠失している）を回収し、クローニ
ングベクターとして使用した（第７図の１１５）。最初
のＰｖｕＩＩサイトまでの牛成長ホルモンの最初の２３
アミノ酸（６９ｂｐ）のためのＤＮＡ配列には、酵素Ｈ
ｐａＩＩ（５′ＣＣＧＧ３′）のための２つの制限サイ
トが含まれている。最初のサイトは、暗号配列の最初の
ヌクレオチドから２３ｂｐにある。牛成長ホルモンの最
初の２３ｂｐのための配列が後に続く、ｌｐｐリボゾー
ム結合サイトのＸｂａＩサイトからＡＴＧ開始コドンま
での１９ｂｐ配列に相当する４２ｂｐフラグメント（第
７図の１１６）をリン酸トリエステル法により合成し
た。このフラグメントは以下の構造を有する： この４２ｂｐフラグメントを製造するに当り、以下の６
つのセグメントを調製した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＧＣＴＴＴＴＣ ３）ＣＧＧＣＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣ ４）ＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ ５）ＴＡＧＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣ ６）ＣＧＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡ 上記のセグメントを使用して、５′−リン酸化セグメン
ト２、５′−リン酸化セグメント３、５′−リン酸化セ
グメント５および５′−非リン酸化セグメント６を、Ｔ
４リガーゼを使って連結し２連体を調製した。この２連
体を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精
製した。この２連体に、Ｔ４リガーゼの存在下、５′−
非リン酸化セグメント１および５′−リン酸化セグメン
ト４を加えた。得られた４２ｂｐＤＮＡ２連体（第７図
の１１６）を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により単離した。既知の方法に従い、この２連体の５′
末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−ｐ
３２］ＡＴＰを使って酵素的にリン酸化した。上記のＨ
ｐａＩＩサイトからＰｖｕＩＩサイトに至る４６ｂｐの
ＤＮＡフラグメントをもとのｐＢＰ３４８プラスミドか
ら得た。１００μｇのプラスミドを、４００μｌの Ｐ
ｖｕＩＩ緩衝液中、５０単位のＰｖｕＩＩを用いて３７
℃で２時間消化した。フェノール抽出およびエタノール
沈澱の後、ＤＮＡを５０単位のＰｓｔＩを含む４００μ
ｌのＰｓｔＩ（５′ＣＴＧＣＡＧ３′）緩衝液（５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、６ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル）に３７℃で２時間溶解した。このＤＮＡフラグメン
トを６％のポリアクリルアミドゲル（長さ３０ｃｍ）上
に広げ、所望の４６ｂｐ配列を含む１３５ｂｐフラグメ
ントを回収し、常法により精製した。回収したＤＮＡの
１／３（プラスミド３３μｇに相当）をＨｐａＩＩ制限
酵素による限定された消化にかけた。このＤＮＡを１０
０μｌのＨｐａＩＩ緩衝液（２０ｍＭトリス：ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール）中、１単位のＨｐａＩＩを用いて
３７℃で４０分間消化した。６５℃で１０分間加熱して
反応を停止させた。このＤＮＡフラグメントを５％のア
クリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス比１９：１）
上で展開させた。ＳａｕＩＩＩＡ制限酵素で消化した１
μｇのｐＢＲ３２２を別の井戸（ｗｅｌｌ）で展開し
た。このフラグメント混合物は、サイズマーカーとして
使用される４６ｂｐフラグメントを含んでいる。１３５
ｂｐフラグメントのＨｐａＩＩ部分的消化によって生成
する４６ｂｐフラグメントを標準的な方法で精製した
（第７図の１１２から）。ＸｂａＩおよびＰｖｕＩＩ末
端を有するプラスミドベクター（第７図の１１５）２／
１０μｇを１．６ピカモルの合成４２ｂｐフラグメント
（第７図の１１６）および０．５〜１ピカモルの４６ｂ
ｐフラグメント（第７図の１１２から）と、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ２単位とともにリゲーション緩衝液１０μｌ中
で混合し、４℃で１６時間連結させた。この混合物を用
いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１を形質転換し、アンピシ
リン耐性で選択したコロニーからプラスミドを調製し
た。４９４ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメントおよび８８ｂ
ｐ ＸｂａＩ、ＰｖｕＩＩフラグメントの存在について
プラスミドをスクリーニングした。分析した３６のうち
１８がこれらのフラグメントを持っていた。２つのプラ
スミドにつき、ＸｂａＩサイトからＰｖｕＩＩサイトま
でを配列化し、牛成長ホルモンのものかどうか放射免疫
分析により試験した。放射免疫分析で陽性の反応を示し
た１つは正しい配列を持っていた。このプラスミドはｐ
ＮＭ７９７（第７図の１１７）と命名した。標準的な放
射免疫分析法により牛成長ホルモンの発現を定量的に測
定し、１細胞当り少くとも１０５分子が存在することが
解った。プラスミドｐＮＭ７９７（第８図の１１７）
は、完全に牛成長ホルモンに変換するには、１個のアミ
ノ酸コドンを変換しなければならない。これは、ｐＮＭ
７９７の２８ｂｐ ＰｖｕＩＩ〜ＢａｍＨＩフラグメン
トを除去し、以下の配列を有する、第８図の１１８に示
した合成２本鎖フラグメント（上の鎖１３ｂｐ、下の鎖
１７ｂｐ）で置換えることにより達成することができ
る： １０μｇのｐＮＭ７９７をＰｖｕＩＩ緩衝液２００μｌ
中、ＰｖｕＩＩ１単位を用いて３７℃で５分間消化す
る。６５℃で１０分間加熱して酵素を不活性化させる。
この試料に、ＢａｍＨＩ緩衝液を加えて３００μｌに希
釈し、１０単位のＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間完
全に消化する。次いでアルカリホスファターゼ５単位を
添加し、６５℃で１時間インキュベートする。ＤＮＡフ
ラグメントを１％のアガロースゲル上で分離し、シング
ルカットプラスミドのサイズのＤＮＡフラグメント（第
８図の１１９）を精製する。この２／１０μｇを、リガ
ーゼ緩衝液２０μｌ中、Ｔ４リガーゼ２単位を用いて５
ピカモルの合成フラグメントと一夜４℃で連結させる。
形質転換および既述したＢｉｒｎｂｏｉｍプラスミド単
離法により、適切なサイズのＰｖｕＩＩフラグメント
（４９４ｂｐ）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩフラグメン
ト（６０４ｂｐ）を含有しているいくつかのプラスミド
を選択する。これらのうち少くとも２つの配列を、Ｂａ
ｍＨＩサイトから唯一のＳｍａＩサイトまで測定し、所
望の配列を持った１つを選択する（第８図の１２０）。実施例３ 実施例１のプラスミドの変異体 ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限サイトの間のｌｐｐ３′
配列を、ｐＢＲ３２２から誘導したＤＮＡフラグメント
（第９図の１０２）で置換えることによりｐＮＭ６４５
のテトラサイクリン耐性変異体（第９図の１１１）を組
み立てた。ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性はその
プロモータがＨｉｎｄＩＩＩ（５′ＡＡＧＣＴＴ３′）
によって開裂される遺伝子の生産物により付与される。
この遺伝子の暗号領域はその近くで始まり、プラスミド
のＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限サイトまで伸びてい
る。テトラサイクリンプロモータはＨｉｎｄＩＩＩによ
る配列の消化およびそれに続く１本鎖末端を除去するＳ
１ヌクレアーゼ処理により破壊される。５μｇのｐＢＲ
３２２をＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液２００μｌ中 （６０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭβ−メルカプトエ
タノール）、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを用いて３７℃
で１時間消化し、ＤＮＡをフエノール／ＣＨＣｌ３抽出
し、エタノール沈澱させ、Ｓ１緩衝液３００μｌ（３０
０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
２５）、１ｍＭＺｎＣｌ２）に再懸濁する。Ｓ１ヌクレ
アーゼを１０００単位／ｍｌの割合いで加え、１５℃で
１時間インキュベートした。フェノール／ＣＨＣｌ３抽
出およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡを２００μｌのＳ
ａｌＩ制限緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭトリ
ス：ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍ
Ｍ β−メルカプトエタノール）に再懸濁し、５単位の
ＳａｌＩを用いて３７℃で１時間消化した。６％のポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動し、生成した６００ｂ
ｐフラグメントを単離した。既述した方法でこのフラグ
メントを回収し精製した。５μｇのｐＮＭ６４５を５単
位のＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間消化した。フェ
ノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール沈澱の後ＤＮ
ＡをＴＥＮに溶解した。２μｇのＢａｍＨＩ相補末端を
持ったｐＮＭ６４５を２０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ
緩衝液（７０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｔ
ＴＰ）中、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩの大型
フラグメント１単位を用いて１５℃で１時間、鈍感末端
ＤＮＡに変換するために埋める（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉ
ｎ）。この酵素を６５℃で１０分間変性させ、ＤＮＡを
ＳａｌＩ緩衝液および３単位のＳａｌＩ制限酵素を加え
て３７℃で１時間開裂させた。このＤＮＡを１％のアガ
ロースゲル上で分離し、凍結後大きいプラスミドフラグ
メントをゲルから溶離した。エチジウムブロミドおよび
アガロースフラグメントをフェノール／ＣＨＣｌ３抽出
およびエタノール沈澱により除去した。プラスミドをＴ
ＥＮ２０μｌに溶解した。既述した条件下で、２／１０
μｇのプラスミドベクター（０．０５ピカモル）を０．
２μｇの６１７ｂｐフラグメント（０．５ピカモル）と
連結した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１コロ
ニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する寒天平板上で選
択した。プラスミド（ｐＮＭ７３６と命名された。第９
図の１２１）を単離し、制限酵素分析により所望の配列
を含んでいることが解った。メチオニルヒト成長ホルモ
ンの発現はｐＮＭ６４５の場合と同じほど高率であるこ
とが解った。実施例４ Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ヒト成長ホルモン発
現のためのプラスミドおよびエンテロキナーゼ（３．
４．２１．９）による選択的開裂にそれを基質として使
用する成熟ヒト成長ホルモンの生産 リン酸トリエステル法により、ｌｐｐプロモータ領域
を、開始コドンおよびエンテロキナーゼに認識され、開
裂される配列を指定している短いペプチドのための暗号
領域に続くヒト成長ホルモン暗号領域と連結することに
より２本鎖ＤＮＡフラグメント（第１０図の１２２）を
合成した。上の鎖は９０ヌクレオチドからなり、これは
５′末端にＸｂａＩ開裂により生じた４ヌクレオチド１
本鎖配列を含んでいる。下の鎖は８６ヌクレオチドから
なり、これは上の鎖の最後の８６ヌクレオチドと相補的
である。この合成ＤＮＡフラグメントの最初の部分は、
リボゾーム結合サイトのＸｂａＩ制限サイトから翻訳開
始メチオニンコドンまで（１９ｂｐ）のｌｐｐ遺伝子の
天然の配列に続いており、エンテロキナーゼ開裂サイト
のための配列および既述した唯一のＦｎｕＤＩＩサイト
までのヒト成長ホルモンの最初の４７ヌクレオチドがそ
の後に続いている。 この２本鎖ＤＮＡフラグメント
（第１０図の１２２）は以下の構造を有する： このフラグメントは既知のリン酸トリエステル法により
調製し、この際以下のセグメントを製造した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣ ６）ＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣ ７）ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧ ８）ＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧ ９）ＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ １０）ＡＴＧＧＧＡＡ １１）ＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ １２）ＧＧＴＴＧＧＧＡＡ １３）ＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴ １４）ＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴ １５）ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴ 上記のセグメントを使用して、以下に示すようにＴ４リ
ガーゼ触媒連結反応を段階的に行なった： ａ）５′−非リン酸化セグメント１を、５′−リン酸化
セグメント９の存在下、Ｔ４リガーゼを使って５′−リ
ン酸化セグメント２に結合させ、ＤＮＡ２連体１を製造
した（Ｅ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｂｅｌａｇａｊｅ，
Ｍ．Ｊ．ＲｙａｎおよびＨ．Ｇ．Ｋｈｏ−ｒａｎａ，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８、１
０９−１５１（１９７９））。この２連体を１５％ポリ
アクリルアミド上、プレパラティブゲル電気泳動法によ
り単離した。 ｂ）５′−リン酸化セグメント３を、５′−リン酸化セ
グメント１１の存在下、Ｔ４リガーゼを使って５′−リ
ン酸化セグメント４と結合させ、ＤＮＡ２連体２を調製
し、これを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より精製した。 ｃ）５′−リン酸化セグメント５を、５′−リン酸化セ
グメント１２および１３の存在下、Ｔ４リガーゼを使っ
て５′−リン酸化セグメント６と結合させＤＮＡ２連体
３を調製し、これを１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により精製した。 ｄ）５′−リン酸化セグメント７を、５′−リン酸化セ
グメント１４および５′−非リン酸化セグメント１５の
存在下、Ｔ４リガーゼを使って５′−リン酸化セグメン
ト８と結合させ、ＤＮＡ２連体４を調整し、これを１５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製した。 ｅ）ＤＮＡ２連体２、３および４をＴ４リガーゼにより
結合させてＤＮＡ２連体５を調製し、これを１５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により精製した。 ｆ）次いでこのＤＮＡ２連体１に、５′−リン酸化セグ
メント１０およびＤＮＡ２連体５をＴ４リガーゼの存在
下で加え、得られたＤＮＡ２連体（第１０図の１１０）
を１０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精
製した。次いでこのＤＮＡ２連体を、既知の方法によ
り、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−
ｐ３２］ＡＴＰを使って酵素的にリン酸化した。 ０．１ピカモル（０．４μｇ）のプラスミドベクター
（第５図の１０７）、０．０２５ピカモルの合成ＤＮＡ
フラグメント（第５図の１１０）および０．３ピカモル
（０．０８μｇ）の５３８ｂｐフラグメント（第１０図
の１０９、製造法参照）を、リゲーション緩衝液２４μ
ｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１．５単位を用いて酵素的に
結合させることにより発現プラスミドを組み立てた。４
℃で１６時間インキュベートした後、既述したようにこ
の混合物を使ってＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１を形質転換
した。形質転換されたコロニーを、１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含有する寒天平板上で選択した。既述し
たＢｉｒｎｂｏｉｍスクリーニング法により１９のコロ
ニーからプラスミドを調製した。制限酵素ＸｂａＩおよ
びＢａｍＨＩによる消化、次いでアクリルアミドゲル電
気泳動法により、１２個のプラスミドが所望の６２８ｂ
ｐフラグメントを含んでいることが解った。陽性プラス
ミドの８個を、ＸｂａＩ次いでＰｖｕＩＩで順次消化し
たところ、これらのうち７個が１０９ｂｐフラグメント
を生成した。１つのプラスミドの配列を、Ｍａｘａｍ，
Ａ．Ｍ．およびＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｗ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４、５６０−５６４
（１９７７））により測定したところ正しいことが解っ
た。このプラスミドはｐＮＭ７０２（第１０図の１２
３）と命名された。ヒト成長ホルモンの発現は、Ｔｗｏ
ｍｅｙ，Ｓ．Ｌ．らの標準的放射免疫分析法（Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ，２０、３８９−３９１（１９７４））に
より検出した。定量的に発現を測定した結果細胞当り少
くとも２百万分子であることが解った。５００ｇｍの
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から、８Ｍ尿素および１％のトリトン
Ｘ１００で抽出することによりＭｅｔ−ｐｈｅ−ｐｒｏ
−ｌｅｕ（ａｓｐ）４ｌｙｓ−ヒト成長ホルモンを部分
的に精製した。遠心分離により残骸を除去し、可溶性の
ヒト成長ホルモン生成物を含有している上澄液をワット
マンＤＥ５２カラムで分画した。放射免疫分析（ＲＩ
Ａ）により検出したピークフラクションを集め、等電点
沈澱にかけた。この物質をさらにワットマンＳＥ５３カ
ラムで精製した。ピークフラクションをＲＩＡで検出
し、その物質を等電点沈澱または限外濾過により濃縮し
た。部分的に精製したこの物質をエンテロキナーゼ開裂
にかけた。粗製の豚の腸エンテロキナーゼ（Ｍｉｌｅｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＡｎｄｅｒｓｏｎらの
方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１６、３３５４−３３
６０（１９７７））でさらに精製した。エンテロキナー
ゼを基質とともにインキュベートし、時々試料を採取し
て等電点焦点ゲル（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕ
ｓ−ｉｎｇｇｅｌ）で調べた。出発物質の等電点は４．
３であり、これは時間とともにヒト成長ホルモンの等電
点（４．９１）を有するバンド（帯）にシフトするのが
見られる。実施例５ Ｅ．ｃｏｌｉのリポプロテインプロモータを
使ったＭｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−牛成長ホルモン発現のた
めのプラスミド Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−牛成長ホルモン発現プラスミド
組み立てのための出発物質として、ヒト成長ホルモン発
現プラスミドであるプラスミドｐＮＭ７０２（第１１図
の１２３）を使用した。Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．Ｌ．ら
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５、７５２１−７５２
４（１９８０））により記載されているプラスミドｐＢ
Ｐ３４８（第１１図の１２４）を、牛成長ホルモン遺伝
子部分の暗号配列を含んでいる２つのＤＮＡフラグメン
トのソースとして使用した。このプラスミドは、ｐＢＲ
３２２のＰｓｔＩ（５′ＣＴＧＣＡＧ３′）制限サイト
にクローンされた牛成長ホルモンを暗号化している８３
１ｂｐ配列を含んでいる。Ｍｉｌｌｅｒらの方法の別法
として、牛成長ホルモンの配列は、現在通常の方法とな
っているＧｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．らの方法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８、７５−９
０（１９７９）により牛の脳下垂体から単離したメッセ
ンジャーＲＮＡからも得ることができる。既述したよう
に、ヒト成長ホルモンおよび牛成長ホルモンの暗号配列
は非常に類似しており、著しい相同性を示す。制限酵素
ＰｖｕＩＩ（５′ＣＡＧＣＴＧ３′）による消化により
生成したフラグメントは、牛成長ホルモンのための発現
プラスミドを組み立てるのにも有用であった。１分子当
り３個のＰｖｕＩＩサイトを含んでいるｐＮＭ７０２
（第１１図の１２３）１０μｇを、２００μｌのＰｖｕ
ＩＩ制限緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭトリス：
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ
β−メルカプトエタノール）中、１単位のＰｖｕＩＩを
用いて３７℃で１０分間消化する。６５℃で１０分間加
熱して反応を停止し、ＤＮＡをアルカリホスファターゼ
で処理する。この限られた消化法により、存在するＰｖ
ｕＩＩサイトの１／２〜２／３が開裂される。フラグメ
ントを１％のアガロースゲル上で分離し、４９７ｂｐＰ
ｖｕＩＩフラグメントを欠失している線状プラスミドに
相当するサイズのＤＮＡフラグメント（第１１図の１２
５）（シングルカットプラスミドより僅かに早く移動す
る）を切り取って精製し、中間的プラスミドの組み立て
にベクターとして使用した（第１１図の１２６）。ｐＢ
Ｐ３４８から４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントを調製
した。このプラスミド１０μｇを、２００μｌのＰｖｕ
ＩＩ緩衝液中、１０単位のＰｖｕＩＩを用いて３７℃で
１時間消化した。フラグメントを６％のポリアクリルア
ミドゲル上で分離し、４９４ｂｐフラグメント（第１１
図の１２４から）を既述した方法で確認し、精製した。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位を含有する２０μｌのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液中、０．２μｇのベクターを０．０
５μｇの４９４ｂｐフラグメントと４℃で１６時間連結
することにより中間的プラスミド（第１１図の１２６）
を組み立てる。形質転換次いでアンピシリン耐性に対す
る形質転換体の選択の後、既述のＢｉｒｎｂｏｉｍ法に
より調製したプラスミドを、４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラ
グメントの存在について分析する。フラグメントが適正
な配向性を有するかどうかは酵素ＸｂａＩおよびＳｍａ
Ｉで連続的に消化することにより調べる。牛成長ホルモ
ン配列からの４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントは唯一
の非対称ＳｍａＩ制限サイトを持っている。親プラスミ
ドｐＮＭ７０２はＳｍａＩサイトを持っていない。４９
４ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントおよび４４０ｂｐＸｂａ
Ｉ、ＳｍａＩフラグメントを有するプラスミドを所望の
中間体として選択しその後の組み立てに使用する。中間
体プラスミド（第１２図の１２６）を以下の２つの方法
で所望の融合牛成長ホルモン発現プラスミドに変換す
る：（１）エンテロキナーゼ基質−ヒト成長ホルモンの
最初の３０アミノ酸の暗号配列を除去し、エンテロキナ
ーゼ基質−牛成長ホルモンの最初の３１アミノ酸の暗号
配列で置換え、（２）この暗号配列内の第２のＰｖｕＩ
Ｉサイトから終止コドンまでの短い配列（これはヒト成
長ホルモン配列である）を合成フラグメントで置換え、
牛成長ホルモンの１９０番目のアミノ酸であるアラニン
のためのコドンを復活させる。この中間体プラスミド
（第１２図の１２６）１０μｇを、ＰｖｕＩＩ緩衝液２
００μｌ中、１単位のＰｖｕＩＩを用いて３７℃で５分
間消化する。６５℃で１０分間加熱して反応を停止させ
る。フラグメントの混合物を１％のアガロースゲル上に
広げ、１分子当りただ１個のＰｖｕＩＩカットを持った
線状プラスミドを回収して精製する。この回収した物質
（約３μｇ）を５単位のＸｂａＩで完全に消化し、アル
カリホスファターゼで処理する。このフラグメントを１
％のアガロースゲル上に広げ、最も大きなフラグメント
（ヒトおよび牛成長ホルモンにおけるＸｂａＩおよび最
初のＰｖｕＩＩサイトの間の１０９ｂｐフラグメントを
欠失している）を回収し、クローニングベクターとして
使用する（第１２図の１２７）。最初のＰｖｕＩＩサイ
トまでの牛成長ホルモンの最初の２３アミノ酸のための
ＤＮＡ配列（６９ｂｐ）は、酵素ＨｐａＩＩ（５′ＣＣ
ＧＧ３′）のための２個の制限サイトを含んでいる。最
初のサイトは、暗号配列の最初のヌクレオチドから２３
ｂｐのところにある。６３ｂｐフラグメント（第１２図
の１２８）はリン酸トリエステル法により合成した。こ
のフラグメントは、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのための暗号配列（２
４ｂｐ）および牛成長ホルモンのＰｈｅから最初のＨｐ
ａＩＩサイトまでの暗号配列の２０ヌクレオチドが後に
ついた、ｌｐｐリボゾーム結合サイトのＸｂａＩサイト
からＡＴＧ開始コドンまでの１９ｂｐ配列に相当する。
このフラグメントは以下の構造を有する： この６３ｂｐフラグメントを製造するのに以下の９個の
セグメントを製造した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣ ６）ＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡ−ＣＣＣＴ ７）ＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ ８）ＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣ ９）ＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣ 上記のセグメントを使用し、以下に述べる方法でＴ４リ
ガーゼ触媒結合反応を段階的に行なった： ａ）５′−非リン酸化セグメント１を５′−リン酸化セ
グメント６の存在下、Ｔ４リガーゼを使って５′−リン
酸化セグメント２と結合させ、ＤＮＡ２連体１を調製
し、これを１５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により精製した。 ｂ）５′−リン酸化セグメント３、４および５を５′−
リン酸化セグメント７および８、ならびに５′−非リン
酸化セグメント９の存在下、Ｔ４リガーゼを使って結合
させ、ＤＮＡ２連体２を調製し、これを１５％のポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により精製した。 ｃ）次いで２連体１および２をＴ４リガーゼで結合させ
てＤＮＡ２連体（第１２図の１２８）を調製し、これを
１５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製
した。次いでこのＤＮＡ２連体を確立された方法に従
い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−
ｐ３２］ＡＴＰを使って酵素的にリン酸化した。 上記のＨｐａＩＩサイトからＰｖｕＩＩサイトまでの４
６ｂｐのＤＮＡフラグメントを、もとのｐＢＰ３４８プ
ラスミドから得た。プラスミド１００μｇを４００μｌ
のＰｖｕＩＩ緩衝液中、５０単位のＰｖｕＩＩを用いて
３７℃で２時間消化した。フェノール抽出およびエタノ
ール沈澱の後、このＤＮＡを４００μｌのＰｓｔＩ
（５′ＣＴＧＣＡＧ３′）緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、６ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、６ｍＭ β−メルカプトエタノール）に、５
０単位のＰｓｔＩとともに３７℃で２時間溶解した。こ
のＤＮＡフラグメントを６％のポリアクリルアミドゲル
（長さ３０ｃｍ）に広げ、所望の４６ｂｐ配列を含む１
３５ｂｐフラグメントを回収し標準的な方法で精製し
た。回収したＤＮＡの１／３（プラスミド３３μｇに相
当）をＨｐａＩＩ制限酵素を用いて部分的に消化した。
このＤＮＡを、ＨｐａＩＩ緩衝液（２０ｍＭトリス：Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ β
−メルカプトエタノール）１００μｌ中、１単位のＨｐ
ａＩＩを用いて３７℃で４０分間消化した。６５℃で１
０分間加熱して反応を停止させた。このＤＮＡフラグメ
ントを５％のアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビ
ス比１９：１）上で展開した。ＳａｕＩＩＩＡ制限酵素
で消化したｐＢＲ３２２の１μｇを別の井戸（ｗｅｌ
ｌ）で展開した。このフラグメントの混合物はサイズマ
ーカーとして使用される４６ｂｐフラグメントを含んで
いる。１３５ｂｐフラグメントの部分的ＨｐａＩＩ消化
により生成した４６ｂｐフラグメント（第１２図の１２
４から）を標準的な手法で精製した。ＸｂａＩおよびＰ
ｖｕＩＩ末端を有するプラスミドベクター（第１２図の
１２７）２／１０μｇを、合成６３ｂｐフラグメント
（第１２図の１２８）３．２ピカモルおよび４６ｂｐフ
ラグメント（第１２図の１２４から）０．５〜１ピカモ
ルと、リゲーション緩衝液１０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ２単位とともに混合し、４℃で１６時間連結させ
た。この混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１を形
質転換し、アンピシリン耐性により選択されたコロニー
からプラスミドを調製した。このプラスミドを４９４ｂ
ｐＰｖｕＩＩフラグメントおよび１０９ｂｐＸｂａＩ、
ＰｖｕＩＩフラグメントの存在についてスクリーニング
した。分析した１２個のうち１個がこれらのフラグメン
トを持っていた。このフラグメントをＸｂａＩサイトか
らＰｖｕＩＩサイトまで配列化し、牛成長ホルモンにつ
いて放射免疫分析で試験した。これは、放射免疫分析に
おいて陽性であることが解り、正しい配列を持ってい
た。このプラスミドはｐＮＭ７８９（第１２図の１２
９）と命名された。牛成長ホルモンについて標準的な放
射免疫分析法により定量的に発現を測定したところ、細
胞当り少くとも１０５分子が存在することが解った。プ
ラスミドｐＮＭ７８９（第１３図の１２９）は、牛成長
ホルモンに完全に変換するには１つのアミノ酸コドンを
変換する必要がある。これはｐＮＭ７８９の２８ｂｐの
ＰｖｕＩＩからＢａｍＨＩフラグメントを除去し、以下
の配列であって第１３図の１３０に示す合成２本鎖フラ
グメント（上の鎖１３ｂｐ、下の鎖１７ｂｐ）で置換え
ることにより達成される： ｐＮＭ７８９（１０μｇ）をＰｖｕＩＩ緩衝液２００μ
ｌ中、１単位のＰｖｕＩＩを用いて３７℃で５分間消化
する。６５℃で１０分間加熱してこの酵素を非活性化す
る。このサンプルをＢａｍＨＩ緩衝液を加えて３００μ
ｌに希釈し、１０単位のＢａｍＨＩを用いて３７℃で１
時間完全に消化する。次いでアルカリホスファターゼ５
単位を添加し、６５℃で１時間インキュベートする。Ｄ
ＮＡフラグメントを１％のアガロースゲル上で分離し、
シングルカットのプラスミドサイズのＤＮＡフラグメン
ト（第１３図の１３１）を精製する。この２／１０μｇ
を、リガーゼ緩衝液２０μｌ中、Ｔ４リガーゼ２単位を
用いて合成フラグメント５ピカモルと４℃で一夜連結さ
せる。形質転換および既述したＢｉｒｎｂｏｉｍプラス
ミド単離法に従い、適当なサイズのＰｖｕＩＩフラグメ
ント（４９４ｂｐ）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩフラグ
メント（６２８ｂｐ）を含むいくつかのプラスミドを選
択する。これらのうち少くとも２つの配列をＢａｍＨＩ
サイトから唯一のＳｍａＩサイトまで測定し、所望の配
列（第１３図の１３２）を持った１つを選択した。
新規なＤＮＡ配列およびクローニングベクター（ビヒク
ル）に関する。Ｍａｓａｙｏｒｉ Ｉｎｏｕｙｅおよび
その協同研究者達は、グラム陰性菌の外膜蛋白質、特に
リポプロテインに関する広範な研究を行なった。その結
果、リポプロテインは細菌細胞に多量存在することがわ
かった。例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大
腸菌）の外膜には、細胞当たり約７．２×１０５分子の
リポプロテインが存在している。このＥ．ｃｏｌｉ染色
体には、リポプロテインの為の構造遺伝子が１個しか存
在していないので、その転写機構は著しく効率の良いも
のに違いない。Ｉｎｏｕｙｅおよびその協力者達の最近
の研究は、適当当に組み立てたプラスミドを使って、形
質転換した微生物中でリポプロテインを発現させ、種々
のリポプロテイン遺伝子（ｌｐｐ）のＤＮＡ配列を分析
することに向けられて来た。例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ
およびＩｎｏｕｙｅのＣｅｌｌ１８、１１０９−１１１
７（１９７９）には、Ｅ．ｃｏｌｉの外膜リポプロテイ
ンのＤＮＡ配列が報告されている。この配列のプロモー
ター領域を分析した結果、いくつかの興味ある特徴が見
つかった。先ず第１に、転写開始サイトの前の２６１塩
基対（ｂｐ）（−１〜−２６１）のセグメントにおける
ＡＴ含量が７０％であり、これは、３２２ｂｐ ｍＲＮ
Ａ領域の５３％、転写終了サイトの後の１２７ｂｐのセ
グメントの４４％およびＥ．ｃｏｌｉ染色体の平均ＡＴ
含量４９％と比較して著しく高いことがわかった。次
に、転写開始サイトから上流のはじめの４５ｂｐ（−１
〜−４５）が、ＡまたはＴの３６個の塩基対（８０％）
を含んでいることがわかった。第３番目に、転写開始サ
イトから８塩基の所に、「プリブノー・ボックス（Ｐｒ
ｉｂｎｏｗ ｂｏｘ）」と類似したヘプタヌクレオチド
配列が存在していた。第４番目に−２７および−３９位
の間の両鎖に、「ＲＮＡポリメラーゼ認識サイト」に類
似した配列が存在していた。第５番目に、転写開始サイ
トにおいて、長い一対の対称が中心をなしていた。Ｉｎ
ｏｕｙｅおよびその協力者達は、ｌｐｐプロモータの力
が強いのは、上記の特徴のいずれかまたはそれらの協力
作用によるものと考えた。特に、プロモータ配列中のＡ
Ｔ含量が高い為にＤＮＡのヘリックス構造が不安定化す
る傾向にあり、従って、転写の開始に必須である所の鎖
の巻き戻しが促進されると推論された。Ｉｎｏｕｙｅら
の研究グループは、他の、多分全ての、グラム陰性菌の
リポプロテイン遺伝子配列についても、これと非常に類
似した事実が存在することを示した。例えば、Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのリポプロテイン遺伝
子のＤＮＡ配列を分析し、Ｅ．ｃｏｌｉのｌｐｐ遺伝子
のそれと比較すると、それらが極めて類似していること
がわかった（ＮａｋａｍｕｒａおよびＩｎｏｕｙｅ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７ １
３６９−１３７３、１９８０年）。特に、プロモータ領
域は高い（８４％）類似性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を備え
ており、Ｅ．Ｃｏｌｉ（８０％）と同様、極めて高いＡ
およびＴ含量（７８％）を持っていた。さらに、リポプ
ロテインｍＲＮＡの５′−非翻訳領域も、高い類似性
（９５％）を備えていた。極く最近、Ｙａｍａｇａｔ
ａ，ＮａｋａｍｕｒａおよびＩｎｏｕｙｅらは、Ｅｒｗ
ｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａのリポプロテイン遺伝子
のＤＮＡ配列を分析し、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓのそれらと比較した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５６、２１９４〜２１９８、１９８１年）。
この研究によっても、ｌｐｐ遺伝子に高い類似性が確認
された。即ち、プロモータ領域（−４５〜−１）は高い
類似性を有していた（Ｅ．ｃｏｌｉに対して８７％、
Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓに対して９３％）。Ａおよび
Ｔ含量は、Ｅ．ｃｏｌｉ（８０％）およびＳ．ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ（７８％）と同様、極めて高かった（８０
％）。更に、ｍＲＮＡの非翻訳領域の配列は高い類似姓
を示した（Ｅ．ｃｏｌｉに対して９７％、Ｓ．ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓに対して９２％）。Ｉｎｏｕｙｅの研究に
基ずく、リポプロテイン遺伝子について観察された高レ
ベルの構成性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）転写は、そ
れが外来性ＤＮＡフラグメントの発現の為のビヒクルと
して有用であることを示している。更に、Ｉｎｏｕｙｅ
らの研究は、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｕ
ｉ，Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎ−ｔｅｒｉａｅ，Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ｃ
ｉｔｒｏ−ｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ，Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌ
ｌａ ｔａｒｄａ，Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒ
ａ， Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓなどを
含むグラム陰性菌の広範囲のリポプロテイン遺伝子のい
ずれも使用し得ることを示唆している。更に最近、Ｉｎ
ｏｕｙｅらにより、生産物発現のためにリポプロテイン
遺伝子が好適であることが立証された（Ｃ．Ｌｅｅ，Ｎ
ａｋａｍｕｒａ，およびＩｎｏｕｙｅ，Ｊ・Ｂａｃｔｅ
ｒ．１４６ ８６１−８６６、１９８１年）。この研究
では、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのリポプロテイン遺伝
子がラムダーファージにクローンされ、次いでプラスミ
ドベクターｐＢＲ３２２およびｐＳＣ１０１に再クロー
ンされた。このＳ．ｍａｒｏｅｓｃｅｎｓのｌｐｐ遺伝
子を持った両ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換
するのに使用された。Ｅ．ｃｏｌｉのｌｐｐ遺伝を持っ
たベクターと比較すると若干低レベルではあるが、正常
な発現が証明された。いずれにせよ、この文献により、
ｌｐｐ遺伝子プロモータおよび５′−非翻訳領域を含む
ベクターは、高いレベルのリポプロテイン発現を達成す
るのに使用し得ることが確立された。本明細書におい
て、「ベクター」なる用語は、（１）宿主細胞内で複製
可能であり、（２）宿主細胞を形質転換することがで
き、そして（３）形質転換された細胞を同定するのに好
適に使用し得るマーカーを含んでいるプラスミド、ファ
ージＤＮＡあるいはその他のＤＮＡ配列を意味する。本
発明に係る特異なクローニングベクターには２つの態様
がある。このクローニングベクターの態様のいずれを用
いても、極めて高いレベルで外来蛋白質を発現させるこ
とができる。最初の態様では、クローニングベクター
は、縦列に、リポプロテインプロモータ領域を指定して
いるヌクレオチド配列、リポプロテイン５′−非翻訳領
域を指定しているヌレオレチド配列、および外来蛋白質
生産物を暗号化している配列を含む様に組み立てられて
おり、該蛋白質生産物を暗号化している配列は、翻訳開
始信号コドンを介して、リポプロテイン遺伝子の５′−
非翻訳領域の３′末端と結合している。第２の態様で
は、外来蛋白質生産物を暗号化している配列は、上記の
開始コドンおよびエンテロキナーゼ開裂サイトを暗号化
しているヌクレオチド配列を介して、リポプロテイン遺
伝子の５′−非翻訳領域の３′末端と結合している。即
ち、本発明は、外来蛋白質を発現させるのに有用な組換
えＤＮＡクローニングベクターであって、（ａ）複製の
機能起源（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｉｇｉｎ）を含
有しているＤＮＡセグメント、（ｂ）該ベクターを形質
転換し得る宿主細胞に導入した場合、選択に使用するこ
とができる性質を該宿主細胞に伝達する１種またはそれ
以上のＤＮＡセグメント、および（ｃ）縦列に、（１）
リポプロテインの発現コントロール配列のプロモータ、
（２）リポプロテインの発現コントロール配列の５′−
非翻訳領域、および（３）固有（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕ
ｓ）蛋白質を暗号化しているヌクレオチド配列の全てま
たは１部によって介在されることなく、（イ）外来蛋白
質を暗号化している配列、または（ロ）外来蛋白質を暗
号化しているヌクレオチド配列と、中断されることな
く、結合しているエンテロキナーゼ開裂サイトを暗号化
しているヌクレオチド配列、が後に続いている翻訳開始
コドン、を指定している配列を含むＤＮＡセグメント、
を含有している組換えＤＮＡクローニングベクターに関
する。本発明の相換えＤＮＡクローニングベクターは、
ＤＮＡセグメント（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を連結
（ｌｉｎｋ）することにより製造される。既述した様
に、本発明は、外来蛋白質を生産するのに極めて効率の
良いＤＮＡ配列および組換えＤＮＡクローニングベクタ
ーを提供するものである。これらはいずれも、リポプロ
テイン遺伝子（ｌｐｐ）機構、好ましくはグラム陰性菌
のリポプロテイン遺伝子の少なくとも１部を使用するも
のである。本明細書に於いて、「外来蛋白質」なる用語
は、リポプロテイン遺伝子機構によって正常に発現され
るリポプロテイン分子以外の蛋白質生産物またはその様
な分子のあらゆる部分を指すものとする。ｌｐｐ機構の
ソース（ｓｏｕｒｃｅ）として役立つグラム陰性菌の代
表例は例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｓｈ
ｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ−ｒｉｕｍ，Ｃｉｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｄｗａｒｄ−ｓｉｅｌｌａ ｔａｒ
ｄａ，Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ，Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ−ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓなどである。このｌｐ
ｐ遺伝子は、５つの要素で表わすことができる。この遺
伝子中のこれらの要素の順序は以下の通りである：
（１）プロモータ領域、（２）５′−非翻訳領域、
（３）リポプロテイン暗号領域、（４）３′−非翻訳領
域、および（５）転写終了サイト。遺伝子系でのこれら
の要素の夫々の機能はよく知られている。プロモータ領
域は、メッセンジャーＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の生産（転
写）の開始をとりなす。プロモータは外部コントロール
がなくてもよく（構成性）、それが存在するとき、遺伝
子機能を抑制する物質即ちリプレッサの支配下であって
もよく、また、遺伝子機能を誘発するのに必要な物質、
即ちインジューサの支配下にあってもよい。ｌｐｐ遺伝
子は外部コントロールがなく、従って「構成性」と呼ば
れる。プロモータまたはその近くに、ＲＮＡポリメラー
ゼが結合しｍＲＮＡの転写を開始する点、「転写開始サ
イト」が存在する。転写が開始されると、ｍＲＮＡが生
成する。生成したｍＲＮＡの構造は、上記の遺伝子要素
（２）〜（４）のＤＮＡ配列によって決まる。生成した
ｍＲＮＡは、蛋白質生産物に翻訳され得る配列を持って
いる。この翻訳される配列は、５′−非翻訳領域の下流
であって、３′−非翻訳領域の上流に存在する。翻訳
は、ｍＲＮＡ５′−非翻訳領域内のリボゾーム結合サイ
トと呼ばれる配列にリボゾームが結合することによって
媒介され、生産物遺伝子配列の最初のコドンとして存在
し、アミノ酸、メチオニン（Ｍｅｔ）を暗号化している
ものでもある翻訳開始コドン（ＡＵＧ）において開始さ
れる。翻訳は翻訳領域の末端に存在する１もしくはそれ
以上の終止コドンで終了する。ベクターに、発現コント
ロール（調節）配列、即ち構造遺伝子に効果的に（ｏｐ
ｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結したとき該遺伝子の発現をコ
ントロールし調整するヌクレオチド配列、を挿入するこ
とにより、外来（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）蛋白質の生産に
有用なクローニングベクターを調整することが、組換え
ＤＮＡ技術によって最近可能となってきた。本発明の要
旨は、前記の要素（１）、（２）、（４）および（５）
を含む、ｌｐｐ発現コントロール配列の全てまたは一部
を使用したクローニングヘクターに存する。本発明のク
ローニングベクターにおいては、これらの４つの要素の
うち要素（１）および（２）、即ちプロモータ領域およ
び５′−非翻訳領域だけが必要である。従来、組換えＤ
ＮＡ法によって、外来蛋白質を暗号化しているＤＮＡ配
列を、クローニングベクターの発現コントロール配列
に、発現された生産物がハイブリッド（雑種）蛋白質に
なるような位置に挿入することにより、外来蛋白質を生
産するのが普通であった。本明細書に於いて、「ハイブ
リッド蛋白質」とは、外来蛋白質が付着している、発現
コントロール配列によって生産される固有の（ｅｎｄｏ
ｇｅｎｏｕｓ）蛋白質（この場合リポプロテイン）の全
てまたは一部からなる組換えＤＮＡ生産物を意味する。
適切に設計されたハイブリッド蛋白質は、固有の蛋白質
部分と外来蛋白質との結合部に開裂サイトを含有してい
る。ハイブリッド蛋白質生成物を化学的にまたは酵素的
に処理するとこの開裂サイトによって外来蛋白質生成物
が完全な形で生成する。既述したように、ｌｐｐ発現コ
ントロール配列は外来蛋白質の発現に有用であることが
解った。しかし極く最近、このｌｐｐ発現コントロール
配列は次のような設計で組み立てを行うとき、非常に好
都合に外来蛋白質を発現するのに使用し得ることが解っ
た：即ち縦列に、プロモータおよびリポプロテイン発現
コントロール配列の５′−非翻訳領域を指定している配
列および翻訳開始コドンを含み、その後に、固有の蛋白
質を暗号化しているヌクレオチド配列の全てまたは一部
分で中断されることなく、外来蛋白質を暗号化している
配列、或いは、外来蛋白質を暗号化している配列と中断
することなく結合しているエンテロキナーゼ開裂サイト
を暗号化しているヌクレオチド配列、が続いているとい
ったＤＮＡセグメント。これはリポプロテインまたはそ
の一部および外来蛋白質からなるハイブリッド蛋白質と
は対照的なものである。本発明に係るクローニングベク
ターを組み立てるには２，３の要素が必要である。必要
な要素の２つは有用なクローニングベクターの全てに共
通している。第１は、このベクターは複製の機能起源
（レプリコン）を含有するＤＮＡセグメントを持ってい
なければならないということである。プラスミドおよび
ファージＤＮＡは、本来、宿主細胞中で複製を促進する
レプリコンを含んでいる。第２に、このベクターは非形
質転換細胞から形質転換細胞を選択するのに有用な性質
を形質転換し得る宿主細胞に運び込むＤＮＡセグメント
を持っていなければならない。選択の目的には広範囲の
性質のいずれをも使用することができる。最も普通に使
用される性質の１つは抗生物質耐性、例えばテトラサイ
クリン耐性またはアンピシリン耐性である。上記の２つ
要素は一般に容易に入手し得る、そして知られているク
ローニングベクター中に存在している。好適なクローニ
ングベクターの例は細菌性プラスミド、例えばｐＢＲ３
２２，ｐＭＢ８９，ＣｏｌＥ１，ｐＣＲ１を包含する
Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミド、ＲＰ４を含むより広い
宿主範囲のプラスミド、ハァージＤＮＡ、例えばラムダ
ーなどである。全てではないが、上記の既知のベクター
の大部分は、前記の２つの要素を既に含んでいる。本発
明に係るベクターに特異な第３の要素はリポプロテイン
発現コントロール（調節）配列である。プラスミド ｐ
Ｋ ＥＮ１１１に存在し、Ｅ．ｃｏｌｉＣＣ６２０で培
養されるＥ．Ｃｏｌｉリポプロテイン発現コントロール
配列は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒ
ｅｇｉｏｎ，１８１５Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｅｔ
ｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉ−ｎｏｉ
ｓ，６１６０４に寄託され、そのストックカルチャーコ
レクションの一部となっており、そこから誰でも寄託番
号ＮＲＲＬ１５０１１で利用することが出来る。このリ
ポプロテイン発現コントロール配列は、ｐＫＥＮ１１１
から、認識されている制限サゴトおよびそれに相当する
制限エンドヌクレアーゼを使って取除くことができる。
広範囲のその他のリポプロテイン発現コントロール配列
も認識されている方法を使って利用することができる。
このような方法には、例えば、合成による調製、または
入手し得るｌｐｐ配列（例えばｐＫＥＮ１１１）を使っ
てプローブを単離し、ｌｐｐ配列間の高度の類似性を利
用して、このプローブを使って選択し、ハイブリジデー
ション（雑種形成）によって他のソースからのｌｐｐ配
列を調整する方法が含まれる。リポプロテイン発現コン
トロール配列を挿入することにより好適なクローニング
ベクターを製造するには常法を用いてもよい。クローニ
ングベクター内には特定の制限エンドヌクレアーゼを使
って切断し得る種々のサイトが存在する。これらのサイ
ト（部位）はいずれもリポプロテイン発現コントロール
配列の挿入に選択、使用することができる。例えば、よ
く知られた、そして文献に記載されているプラスミドｐ
ＢＲ３２２にはいくつかの好適な制限サイトが存在し、
そのいずれも挿入サイトとして使用することができる。
ＰｓｔＩサイトはβ−ラクタマーゼの遺伝子内に存在し
ている。全ての特異な暗号領域の外側の他のサイトはＥ
ｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩである。これらの、およびそ
の他のサイトは当業者にはよく知られている。これら
の、或いはその他のサイトを利用して、リポプロテイン
発現コントロール配列またはその必須部分を容易に挿入
することができ、本発明に係るベクターを製造すること
ができる。本発明に係るベクターに特異な第４番目の要
素は、外来蛋白質を暗号化しているＤＮＡ配列である。
本発明のベクターにおける外来蛋白質ＤＮＡ配列に関す
る必須要件はその位置にある。これはリポプロテイン発
現コントロール配列の５′−非翻訳領域の３′末端の下
流に存在しなければならず、翻訳開始コドンを介してそ
れと連結していなければならない。本発明のベクターに
おいては、リボプロテインを暗号化しているＤＮＡ配列
はいかなるものも、５′−非翻訳領域および外来蛋白質
を暗号化している配列の間に介在してはならない。本発
明に係る第２の態様のベクターに特異な第５番目の要素
では、翻訳コドンの後に外来蛋白質を暗号化している配
列と、中断することなく結合しているエンテロキナーゼ
開裂サイトを暗号化しているヌクレオチド配列が続いて
いる。上記の開裂サイトのアミノ酸配列は、酵素エンテ
ロキナーゼにより認識され、そのカルボキシ末端で開裂
される。エンテロキナーゼで開裂されるアミノ酸配列を
暗号化しているヌクレオチド配列は、その５′末端にお
いて翻訳開始コドンと結合しており、その３′−末端に
おいて外来蛋白質を暗号化しているヌクレオチド配列の
５′末端と結合しており、（メチオニン）−（エンテロ
キナーゼ開裂サイト）−（外来蛋白質）という構成の得
られた翻訳生産物をエンテロキナーゼで処理することに
より開裂することができ、完全な外来蛋白質を生産し得
るように設計する。エンテロキナーゼ（３．４．２１．
９）は十二指腸の刷子縁膜に存在する多数の加水分解酵
素の１つとして記載されている（Ｊ．Ｊ．Ｌｉｅｐｎｉ
ｅｋｓおよびＡ．Ｌｉｇｈｔ，Ｊ．Ｂｉｌｏ．Ｃｈｅ
ｍ．２５４、１６７７−１６８３（１９７９））。その
単離および精製については多くの文献、例えばＬｉｅｐ
ｎｉｅｋｓ、上記、Ｓ．Ｍｒｏｕｘ，Ｊ．Ｂａｒａｔｔ
ｉおよびＰ．Ｄｅｓｎｕｅｌｌｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２４６、５０３１−５０３９（１９７１）、およ
びＪ．Ｂａｒａｔｔｉ，Ｓ．Ｍａｒｏｕｘ，Ｄ．Ｌｏｕ
ｖａｒｄ，およびＰ．ＤｅｓｎｕｅｌｌｅのＢｉｏｃｈ
ｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ
３１５、１４７−１６１（１９７３）に記載されてい
る。エンテロキナーゼは、各種のアミノ酸、例えばグル
タミン酸（Ｇｌｕ）および／またはアスパラギン酸（Ａ
ｓｐ）に続くリシン（Ｌｙｓ）残基のカルボキシル基で
ペプチドを開裂するようである。例えばＡ．Ｌｉｇｈ
ｔ，Ｈ．Ｓ．ＳａｖｉｔｈｒｉおよびＪ．Ｊ．Ｌｉｅｐ
ｎｉｅｋｓのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６、１９
９−２０６（１９８０）には、エンテロキナーゼで認識
されるアミノ酸配列が多数記載されており、例えば以下
のものが含まれている：Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ；Ｖａｌ−Ａｓｐ
一Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ；Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ；Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ：Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ；Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ。本発明に係るクローニングベクター
には上記のおよびその他のいずれかを暗号化しているヌ
クレオチド配列が存在していてよい。必要なことは、そ
のヌクレオチド配列は、エンテロキナーゼにより認識さ
れ、長鎖のペプチド中に存在する場合そのカルボキシ末
端で開裂されるアミノ酸配列を暗号化しているものであ
るという点だけである。この要求を満たすベクターを組
み立てるにあたり、Ｅ．ｃｏｌｉリポプロテイン発現コ
ントロール配列の５′−非翻訳領域に存在する唯一（ｕ
ｎｉｑｕｅ）のＸｂａＩ制限サイトを好都合に利用する
ことができる。このＸｂａＩサイトで切断することがで
き、５′−非翻訳領域の一部を除去することができる。
既知のオリゴヌクレオチド合成法を使って、開始コドン
またはエンテロキナーゼ開裂サイトが後に続く開始コド
ンを暗号化しているＤＮＡ配列と結合している５′−非
翻訳領域の除去された部分および外来蛋白質の全てまた
は一部を含有しているリンカーを製造することができ
る。外来蛋白質を暗号化しているＤＮＡ配列は合成によ
り、例えば既知のホスホトリエステル法或いはその他の
よく知られた方法を使って組み立てることができるが、
このＤＮＡ配列はまた、既知の方法で、単離されたｍＲ
ＮＡからのコピーとして得ることもできる。一度得られ
ると、このｃＤＮＡコピーは開始コドンが得られる点に
存在する制限サイトで切断することができる。本発明に
係るクローニングベクターの第１番目の態様では、Ｘｂ
ａＩ開裂によって除去されたリポプロテイン５′−非翻
訳領域フラグメントとそれに続く開始コドンを含む外来
蛋白質の開裂部分から構成されるリンカーを合成的に製
造することができる。本発明に係るクローニングベクタ
ーの第２番目の態様では、ＸｂａＩ開裂によって除去さ
れたリポプロテイン５′−非翻訳領域フラグメントおよ
びそれに続く開始コドン、エンテロキナーゼ開裂サイ
ト、および外来蛋白質の開裂された部分からなるリンカ
ーを合成的に製造することができる。ギャップを埋める
（橋渡しする）に十分なこれらのリンカーは、リポプロ
テイン発現コントロール配列の残りの利用し得る要素と
共に、ベクターを調製するのに使用する。本発明に係る
クローニングベクターは哺乳動物およびヒトのホルモン
類、酵素類、および免疫源（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）
蛋白質を含む広範囲の外来蛋白質（またはその中間体）
を生産するのに使用することができる。このような生産
物の例は、インシュリンＡ鎖、インシュリンＢ鎖、プロ
インシュリン、インターフェロン、成長ホルモン、足お
よび口腔疾患のための抗原性蛋白質、ソマトスタチン、
β−エンドルフィンなどである。好ましいクローニング
ベクターはヒト成長ホルモンまたは牛成長ホルモンを生
産するように設計されたベクターである。第１番目の態
様のクローニングベクターによる発現生産物は、開始コ
ドンが存在するため、そのアミノ末端にメチオニン（Ｍ
ｅｔ）を含んでいることは容易に理解されよう。第２番
目の態様のベクターによる発現生産物は、メチオニン
（開始コドン）、エンテロキナーゼ開裂サイト、および
外来蛋白質を含んでいる。完全な外来蛋白質は、発現生
産物を、既知の方法（例えばＬｉｇｈｔらの文献、上記
参照）でエンテロキナーゼで処理することにより生成す
る。本発明に係るクローニングベクターは広範囲の徴生
物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｓｅｒ
ｒａｒｉａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，などのグラム陰
性原核生物、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓなどのグラム陽性原核生物、およびＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓなどの真核生物などの宿主生物において使
用することができる。宿主生物はグラム陰性原核生物で
あることが好ましい。グラム陰性原核生物のうち、Ｅ．
ｃｏｌｉは特に好ましく例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２
株、例えばＲＶ３０８は特に好ましい。よく知られた方
法を使って、このクローニングベクターを適当な宿主生
物に導入して形質転換し、その生物中で増幅させ、標準
的な発酵条件を使用して外来蛋白質生産物を発現させる
ことができる。得られた発酵ブロスから常法により外来
蛋白質生産物を単離することができる。本発明に係るク
ローニングベクターの構造および機能を後記実施例にお
いて例示する。この実施例は添付の図面を参照して理解
されるべきである。第１図〜第４図は、一緒になって、
本発明に係る両態様のクローニングベクターを組み立て
るのに有用な中間体および出発物質の製造を図式化して
示したものである。第５図は第１〜４図と一緒になっ
て、メチオニル（Ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ）ヒト成長ホルモ
ンを生産するのに有用なクローニングベクターを組み立
てるための後記実施例１に記載した方法を図式化したも
のである。第６〜８図は、第１〜５図と一緒になって、
メチオニル牛成長ホルモンの生産に有用なクローニング
ベクターを組み立てるための実施例２に記載した方法を
図式化したものである。第９図は、第１〜５図と一緒に
なってメチオニルヒト成長ホルモンの生産に有用な、実
施例１に記載のクローニングベクターの変異体であるク
ローニングベクターを組み立てるための実施例３に記載
の方法を図式化したものである。第１０図は、第１〜４
図と一緒になって、ヒト成長ホルモンの生産に有用な本
発明に係る第２の態様のクローニングベクターを組み立
てるための実施例４に記載した方法を図式化したもので
ある。第１１図〜第１３図は、第１０図および第１〜４
図と一緒になって、牛成長ホルモンの生産のための第２
の態様のクローニングベクターを組み立てるための実施
例５に記載の方法を図式化したものである。製造例 本発明に係る第１および第２の態様のプラスミ
ドを組み立てるための共通の中間体および出発物質。プ
ラスミドベクターｐＫＥＮ０２１（第３図の１０６）の
ＸｂａＩ（５′ＴＣＴＡＧＡ３′）、ＢａｍＨ Ｉ
（５′ＧＧＡＴＣＣ３′）開裂によって得られる〜５．
１ｋｂ（キロ塩基）フラグメントを出発物質として使用
した。ｐＫＥＮ０２１はｐＫＥＮ１１１（第１図の１０
１）の誘導体である（Ｌｅｅ，Ｎ．らＪ．Ｂａｃｔ．１
４６、８６１−８６６（１９８１）およびＺｗｉｅｂｅ
ｌ，Ｌ．Ｊ．らＪ．Ｂａｃｔ．１４５、６５４−６５６
（１９８１）参照。これはＥ．ｃｏｌｉ ＣＣ６２０に
入れて寄託されている（ＮＲＲＬ寄託番号１５０１
１））。プラスミドｐＫＥＮ１１１はＥ．ｃｏｌｉのリ
ポプロテイン遺伝子を含む２．８ｋｂフラグメントを持
っている。このフラグメントについてはＮａｋａｍｕｒ
ａ，Ｋ．およびＩｎｏｕｙｅ，Ｍ．のＣｅｌｌ１８、１
１０９−１１１７（１９７９）に記載されている。ｐＫ
ＥＮ０２１においては、ｐＢＲ３２２の唯一のＥ ｃｏ
Ｒ Ｉ（５′ＧＡＡＴＴＣ３′）およびＳａｌＩ（５′
ＧＴＣＧＡＣ３′）制限サイトの間の６５０ｂｐ（塩基
対）配列が、Ｅ．ｃｏｌｉのリポプロテイン遺伝子から
得た配列で置き換えられている。この遺伝子の全ての機
能部分のヌクレオチド配列は決定されている。リポプロ
テイン遺伝子配列（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．およびＩｎ
ｏｕｙｅ，Ｍ，のＣｅｌｌ１８、１１０９−１１１７
（１９７９））は、リポプロテイン遺伝子の最初のコド
ン（メチオニン）の上流に４６２ｂｐＡｌｕＩ（５′Ａ
ＧＣＴ３′）フラグメントを含んでいる。このフラグメ
ントはプロモータ、５′−非翻訳領域およびリボゾーム
結合サイトを持っている。唯一のＸｂａＩ（５′ＴＣＴ
ＡＧＡ３′）制限サイトは翻訳開始メチオニンコドンの
１６ｂｐ前のリボゾーム結合サイト内に存在する。構造
遺伝子の翻訳終止コドンの１０５ｂｐ上流に存在するＰ
ｖｕＩＩ（５′ＣＡＧＣＴＧ３′）制限サイトを、合成
ＤＮＡアダプターフラグメント（５′ＣＣＧＧＡＴＣＣ
ＧＧ３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈから入手）を付加することにより、ＢａｍＨＩ
（５′ＧＧＡＴＣＣ３′）制限サイトに変換した。リポ
プロテインの最後の３５アミノ酸のための暗号配列、翻
訳終止コドンおよびメッセンジャーＲＮＡの３′−非翻
訳領域に相当する配列がこのＢａｍＨＩサイトに続いて
いる。プラスミドｐＫＥＮ０２１はまた、リポプロテイ
ン遺伝子に関係のない、Ｅ．Ｃｏｌｉ染色体においてそ
の下流に位置する約８５０ｂｐの外来性の配列を含んで
いる。これらの配列は、この方法の結果として、また、
遺伝子の最初の単離に使用した制限酵素サイトの結果と
して含まれたものである。第１〜第３図に関し、プラス
ミドｐＫＥＮ０２１は以下の方法でｐＫＥＮ１１１から
誘導する：ｐＫＥＮ１１１（第１図の１０１）５０μｇ
を、２０ｍＭトリス：塩酸（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭ
ｇＣｌ２および６ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含
む緩衝液３００μｌ中、制限酵素ＨｐａＩＩ（５′ＣＣ
ＧＧ３′）２５単位を用いて３７℃で２時間消化する。
この混合物をフェノールおよびクロロホルムの混合物
（５０：５０）３００μｌで２回抽出し、回収した水相
にエタノール２．５容を加えて沈澱させる。ＤＮＡペレ
ットを電気泳動緩衝液１００μｌに溶解し、５％のポリ
アクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス比（ｂｉｓ
ｒａｔｉｏ）は、特に指摘しないかぎり全てのゲルにお
いて２９：１である）を用いて分画する。このゲルを
０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含有する溶液
に入れて染色し、帯を長波長の紫外線下で観察する。９
５０ｂｐの帯を単離し、電気溶出によりゲルから透析袋
に回収する。フェノール／ＣＨＣｌ３抽出、およびエタ
ノール沈澱の後、回収したＤＮＡ（約２．５μｇ）を２
５μｌのＴＥＮ（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリ
ス：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１ｍＭのナトリウムエ
チレンジニトリロテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、ｐＨ
８．０）に溶解する。９５０ｂｐのＨｐａＩＩフラグメ
ント２μｇを、５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭトリス：Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．６）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２および６ｍＭ
β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液２００μ
ｌ中、制限酵素ＡｌｕＩ（５′ＡＧＣＴ３′）を用いて
２時間３７℃で消化する。ＤＮＡを６％のポリアクリル
アミドゲル上で分画し、生成した４６２ｂｐＡｌｕＩフ
ラグメントを既述した方法で回収し精製する。この４６
２ｂｐＡｌｕＩフラグメント（約１μｇ）を１５０ピカ
モル（ｐｉｃａｍｏｌｅ）のリン酸化ＥｃｏＲＩリンカ
ー（５′ＧＧＡＡＴＴＣＣ３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔ
ｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）および２単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６
６ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、１０ｍＭジチオトレイット、０．４ｍＭ ＡＴ
Ｐ）１０μｌに溶解する。４℃で１６時間インキュベー
トした後、この混合物を６５℃で１０分間加熱し、Ｅｃ
ｏＲＩ緩衝液（１００ｍＭ トリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６
ｍＭβ−メルカプトエタノール）および４０単位のＥｃ
ｏＲＩ酵素を加えて１００μｌに希釈する。３７℃で２
時間放置した後、この試料をフェノール／ＣＨＣｌ３で
抽出し、上記の方法でエタノール沈澱させる。このＤＮ
Ａを、０．１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼおよびＥｃｏＲ
Ｉで線状化し、アリカリホスファターゼ処理により末端
ホスフェートを除去した０．１μｇのｐＢＲ３２２（第
１図の１０２）を含有するＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２
０μｌに溶解する。４℃で１６時間結合させた後、この
物質を用いてＨＢ１０１のような好適なＥ．ｃｏｌｉ株
（ｈｓｒ−、ｈｓｍ＋）を形質転換する。この細菌細胞
は、標準的なＣａＣｌ２処理により形質転換に関してコ
ンピテントにする。テトラサイクリン１２μｇ／ｍｌを
含有する寒天平板上で形質転換体を選択する。Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．およびＤｏｌｙ，Ｊ．の高速アルカ
リ抽出法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ７、１５１３−１５２３（１９７９））で多くのテ
トラサイクリン耐性コロニーからプラスミドを単離す
る。４６６ｂｐＸｂａＩ、ＢａｍＨＩフラグメントを含
有するプラスミド（所望の配向、第１図の１０３）を選
択し、次の工程の出発物質として使用する。このプラス
ミド２μｇ（第２図の１０３）（１個のＨｉｎｄＩＩＩ
（５′ＡＡＧＣＴＴ３′）制限サイトを持っている）
を、ＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液（６０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍトリス： ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２および６ｍＭ β−メルカプトエタノール）５０μ
ｌ中、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素２単位を用いて３７℃で１時
間消化する。フェノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノ
ール沈澱の後、このＤＮＡを３００ｍＭ ＮａＣｌ、３
０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２５）、１ｍＭ Ｚｎ
Ｃｌ２および１本鎖ＤＮＡに特異なＳ１ヌクレアーゼ
（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２００単位
を含有する緩衝液２００μｌに溶解する。１５℃で１時
間反応させた後、フェノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエ
タノール沈澱により反応を停止させる。１本鎖Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−生成末端を除去されたこのプラスミドを２０ピ
カモルのリン酸化ＢａｍＨＩリンカー（５′ＣＣＧＧＡ
ＴＣＣＧＧ３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒａ−ｔｉｖｅ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈから入手）および２単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液１０μｌに溶解す
る。４℃で１６時間反応させた後、この反応混合物を６
５℃で１０分間加熱してリガーゼを不活性化する。この
混合物を２０単位のＢａｍＨＩ酵素を含有するＢａｍＨ
Ｉ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス：Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ
β−メルカプトエタノール）１００μｌに希釈する。３
７℃で２時間放置した後、この混合物を１％アガロース
ゲル上で精製する。ゲルを染色し、大きいほうのフラグ
メント（４．５ｋｂ）を凍結後溶出により回収し、フェ
ノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール沈澱により精
製する。ＢａｍＨＩ相補末端を持ったこの回収したプラ
スミドを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．１単位を含有するＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに溶解する。４℃で１
６時間放置した後、このＤＮＡを使ってＥ．ＣｏｌｉＨ
Ｂ１０１を形質転換する。形質転換体を１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンに対する耐性（Ａｐｒ）により選択
し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンに対する感受性
（Ｔｃｓ）についてスクリーニングする。ＡｐｒＴｃｓ
であるコロニーから既述のＢｉｒｎ−ｂｏｉｍ法により
いくつかのプラスミドを調製する。これらのＨｉｎｄＩ
ＩＩサイトの非存在および唯一のＢａｍＨＩサイトの存
在について試験する。ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで順次消化
すると、４６６ｂｐおよび３０５ｂｐのフラグメントが
得られる。これらの特性を持ったプラスミド（第２図の
１０４）を選択し、ｌｐｐプロモータの上流に位置する
ＥｃｏＲＩサイトを除去しこれをＨｉｎｄＩＩＩ制限サ
イトに変換するように改変する。プラスミド（第２図の
１０４）２μｇを、ＥｃｏＲＩ緩衝液１００μｌ中、Ｅ
ｃｏＲＩ、０．２単位を用いて３７℃で１０分間消化す
る。６５℃で１０分間加熱して反応を停止させる。フェ
ノール／ＣＨＣｌ３抽出の後、このＤＮＡをエタノール
沈澱させ、１０００単位／ｍｌの割合いでＳ１ヌクレア
ーゼを含有しているＳ１ヌクレアーゼ緩衝液２００μｌ
に溶解する。１２℃で１時間反応させた後、フェノール
／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール沈澱により反応を停
止させる。ＤＮＡを、２０ピカモルのリン酸化Ｈｉｎｄ
ＩＩＩリンカー（５′ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ３′、Ｃｏ
ｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）
および２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ緩衝液１０μｌに再懸濁する。４℃で１６時
間放置した後、６５℃で１０分間加熱してリガーゼを不
活性化する。この反応混合物を１０単位のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ酵素を含有するＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液１５０μｌに希
釈する。３７℃で２時間インキュベートした後、この混
合物を１％アガロースゲル上で分画する。エチジウムブ
ロミドで染色した後、最大の帯（シングルカットのプラ
スミドに等しい）を回収し精製する。このプラスミドを
０．２単位のＴ４リガーゼを含有するＴ４リガーゼ緩衝
液２０μｌに溶解し、４℃で１６時間インキュベート
し、これを使ってＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換す
る。形質転換体をアンピシリン耐性について選択し、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ法によりスクリーニングする。プラスミ
ド単離物をＥｃｏＲＩ（１サイト）およびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（１サイト）酵素を用いて制限分析する。５００ｂｐ
のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを持ったプ
ラスミド（第２図の１０５）を選択し、ｌｐｐ遺伝子の
３′領域の付加のためのクローニングベクターとして使
用する。プラスミト（第３図の１０５）２μｇをＳａｌ
Ｉ制限緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭトリス：
ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭβ
−メルカプトエタノール）５０μｌ中、ＳａｌＩ２単位
を用いて３７℃で１時間消化する。この溶液をＢａｍＨ
Ｉ２単位を含有するＢａｍＨＩ緩衝液１５０μｌに希釈
する。３７℃で１時間放置した後、アルカリホスファタ
ーゼ２．５単位を加え６５℃で１時間インキュベートす
る。この物質をフエノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタ
ノール沈澱させ、ＴＥＮに溶解し、ｌｐｐ３′フラグメ
ントのためのクローニングベクターとして使用する。ｌ
ｐｐ３′領域を含むフラグメントを得るために、ｐＫＥ
Ｎ１１１（第３図の１０１）１０μｇをＨｐａＩ緩衝液
（２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および６ ｍＭ β−
メルカプトエタノール）２００μｌ中、ＨｐａＩ（５′
ＧＴＴＡＡＣ３′）１０単位を用いて３７℃で２時間消
化する。フェノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール
沈澱の後、ＤＮＡを２０ピカモルのリン酸化ＳａｌＩリ
ンカー（５′ＧＧＴＣＧＡＣＣ３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手）および２単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するＴ４ＤＮＡリガーゼ緩
衝液１０μｌに溶解する。４℃で１６時間放置した後、
６５℃で１０分間加熱してリガーゼを不活性化する。こ
の物質を１０単位のＳａｌＩを含有するＳａｌＩ緩衝液
１００μｌに希釈し、３７℃で１時間インキュベートす
る。このＤＮＡを１０単位のＰｖｕＩＩ制限酵素を含有
するＰｖｕＩＩ緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭト
リス：ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６
ｍＭ β−メルカプトエタノール）３００μｌに希釈す
る。３７℃で１時間放置した後このＤＮＡを５％のポリ
アクリルアミドゲル上で分画する。約０．５μｇの９５
０ｂｐフラグメントを回収し、精製し、ＴＥＮに溶解す
る。２／１０μｇのフラグメントを２０ピカモルのリン
酸化ＢａｍＨＩリンカー（５′ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ
３′、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
から入手）および２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含むＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌに希釈する。４℃で１
６時間放置した後、６５℃で１０分間加熱してリガーゼ
を不活性化する。このＤＮＡを２０単位のＢａｍＨＩを
含有するＢａｍＨＩ緩衝液１００μｌに希釈する。３７
℃で２時間保持した後、ＤＮＡを５％のポリアクリルア
ミドゲル上で分画し、過剰のリンカー分子を除去する。
ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ相補末端を持った９５０ｂｐ
フラグメントを回収し精製する。このフラグメントを
０．２μｇの既述したクローニングベクターおよび０．
２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液２０μｌに溶解する。４℃で１６時間インキ
ュベートした後、この物質を使ってＥ．ｃｏｌｉＨＢ１
０１を形質転換する。アンピシリン耐性形質転換体から
プラスミドを調製し、９５０ｂｐのＳａｌＩ、ＢａｍＨ
Ｉフラグメントについて分析する。所望のプラスミド
（５．２ｋｂ）はｐＫＥＮ０２１と命名した（第３図１
０６）。ｐＫＥＮ０２１ １０μｇをＸｂａＩ／Ｂａｍ
ＨＩ緩衝液２００μｌ中（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０
ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、６ｍＭ β−メルカプトエタノール）、ＢａｍＨ
Ｉ１０単位を使って３７℃で１時間、次いでＸｂａＩ
１０単位を使って３７℃で１時間消化した。このＤＮＡ
をアルカリホスファターゼ２．５単位で６５℃で１．５
時間処理し、フェノール／ＣＨＣｌ３抽出し、エタノー
ル沈澱によって集め、０．２μｇ／μｌとなるようにＴ
ＥＮ５０μｌ（１０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解
した。この調製物（第３図の１０７）をプラスミドクロ
ーニングベクターとして使用した。ヒト成長ホルモン遺
伝子部分のための暗号配列を含んでいるＤＮＡフラグメ
ントのソースとして、Ｍａｒｔｉａｌ，Ｊ．Ｈ．らによ
り記載されているプラスミドｐｔｒｐＥＤ５０ｃｈＧＨ
８００（第４図の１０８）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５、
６０２−６０７（１９７９））を使用した。このフラグ
メントは、ヒトの脳下垂体からヒト成長ホルモンを暗号
化しているｍＲＮＡを単離する既知の方法により得るこ
ともできる。このような方法はＧｏｏｄｍａｎ，Ｈ．
Ｍ．らにより報告されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍ−ｏｌｏｇｙ６８、７５−９０（１９７
９））。プラスミドｐｔｒｐＥＤ５０ｃｈＧＨ８００の
ヒト成長ホルモン遺伝子部分には、この遺伝子の翻訳終
止コドンから６ｂｐ下流に唯一のＳｍａＩ（５′ＣＣＣ
ＧＧＧ３′）制限サイトが含まれている。このサイトを
以下の手法でＢａｍＨＩサイトに変換した：このプラス
ミド６μｇをＳｍａＩ制限緩衝液（１５ｍＭトリス：塩
酸（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ Ｋ
Ｃｌおよび６ｍＭ β−メルカプトエタノール）２００
μｌ中、ＳｍａＩ６単位を用いて３７℃で１．５時間消
化した。消化が完了した後、フェノール／ＣＨＣｌ３抽
出を行ない、ＤＮＡをエタノール沈澱により回収した。
沈澱したＤＮＡをＴＥＮ２４μｌに溶解した。リン酸化
ＢａｍＨＩアダプターフラグメント（Ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ Ｒｅ−ｓｅａｒｃｈ）４０ピカモルを、２
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液１
６μｌ中、上記の消化したプラスミド０．５μｇ（０．
２ピカモルｅｎｄｓ）に添加した。２２℃で２時間、４
℃で１６時間結合させた。６５℃で１０分間Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを不活性化した。２０単位のＢａｍＨＩ酵素を
含有するＢａｍＨＩ緩衝液に希釈し、最終全容量を４０
μｌとし、次いで３７℃で１時間インキュベートするこ
とによりＢａｍＨＩ相補末端を生成させた。この酵素に
よりリンカー配列およびヒト成長ホルモンのクローンし
たｃＤＮＡ配列の初めの部分に存在するＢａｍＨＩサイ
トが開裂された。その結果、相補ＢａｍＨＩ末端を有す
る６９１ｂｐフラグメントが生成し、これを６％ポリア
クリルアミドゲル上で分離し、１μｇ／ｍｌのエチジウ
ムブロンド溶液中で染色した後長波長の紫外線により観
察した。このフラグメントを含有するゲル部分を切取
り、透析袋への電気溶出次いでエタノール沈澱によりＤ
ＮＡフラグメントを回収した。沈澱したＤＮＡを遠心分
離により回収し、ＴＥＮに溶解し、フェノール／ＣＨＣ
ｌ３抽出してエチジュウムブロンドを除去し次いでエタ
ノール沈澱させた。回収したＤＮＡフラグメントを、既
述した条件下で緩衝液２０μｌ中、０．２単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて、その唯一のＢａｍＨＩサイトで
予め開裂させ次いでアルカリホスファターゼで処理した
ｐＢＲ３２２０．２μｇ（第４図の１０２）と結合させ
た。４℃で１６時間放置した後、この物質を用いて、寄
託番号ＮＲＲＬＮｏ．１５０１４で寄託されているＥ．
ｃｏｌｉ株ＪＡ２２１（ｒｅｃＡ−，ｈｒｓ− ｈｓｍ
＋，Δ ｔｒｐＥ５，ｔｈｒ，ｌｅｕ，ｔｈｉ，ｌａｃ
Ｙ−）を形質転換した。Ｗｅｎｓｉｎｋ Ｐ．Ｃ．らの
形質転換法（Ｃｅｌｌ ３、３１５−３２５（１９７
４）を使用し、形質転換されたコロニーを１００μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含有する寒天平板上で選択した。
Ｂｉｒｎｂｏｉｍによって記載されている高速アルカリ
変性法により、１６個のアンピシリン耐性コロニーから
プラスミド、ＤＮＡを単離し、次いで制限酵素消化およ
びゲル電気泳動により分析した。調べた１６個のプラス
ミドのうち１１個が約７００ｂｐのＢａｍＨ Ｉ フラ
グメントを含有していることが解った。これらのプラス
ミドの１つｐＮＭ５７５（第４図の１０９）を選んで増
幅させ、以降のプラスミド組み立てのためのＤＮＡフラ
グメントのソースとして使用した。完全なヒト成長ホル
モンのＤＮＡ配列には、最初のヌクレオチドから４７ｂ
ｐのところに１個のＦｎｕＤＩＩ（５′ＣＧＣＧ３′）
サイトが含まれている。ｐＢＲ３２２にはこの酵素の認
識サイトが２３存在する。ｐＮＭ５７５の２５μｇを、
ＢａｍＨＩ緩衝液２５０μｌ中、２５単位ＢａｍＨＩを
用いて３７℃で１時間消化した。ＢａｍＨＩ相補末端を
持った６９１ｂｐフラグメントを６％のポリアクリルア
ミドゲルから単離し、前記の方法で精製した。このフラ
グメントを精製した後、その１／３（プラスミド８μｇ
に相当）を、ＦｎｕＤＩＩ緩衝液１００μｌ中（６ｍＭ
ＮａＣｌ、６ｍＭ トリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル）、２．５単位のＦｎｕＤＩＩを用いて３７℃で１．
５時間消化した。６％のポリアクリルアミトゲル上で電
気泳動し、標準的な回収操作を用いてこの遺伝子の最後
の１７５アミノ酸およびそれに続く翻訳終止コドンの暗
号配列を含有している５３８ｂｐＤＮＡフラグメントを
単離した。実施例１ Ｅ．ｃｏｌｉのリポプロテインプロモータを使ったメチ
オニルヒト成長ホルモン発現のためのプラスミド Ａ． 組み立て ヒト成長ホルモンを直接発現させるため、リン酸トリエ
ステル法により、ｌｐｐプロモータ領域をヒト成長ホル
モン暗号領域と結合させて２本鎖ＤＮＡフラグメント
（第５図の１１０）を合成した。上の鎖（ｕｐｐｅｒ
ｓｔｒａｎｄ）は、ＸｂａＩ開裂により生じた４ヌクレ
オチドの１本鎖配列を５′末端に含んでいる６６ヌクレ
オチドを持っている。下の鎖は上の鎖の最後の６２ヌク
レオチドに相補的な６２ヌクレオチドを持っている。こ
の合成ＤＮＡフラグメントの最初の部分は、リボゾーム
結合サイトのＸｂａＩ制限サイトから翻訳開始メチオニ
ンコドンまで（１９ｂｐ）の天然のｌｐｐ遺伝子配列に
続いており、その後に既述した唯一のＦｎｕＤＩＩサイ
トまでのヒト成長ホルモンの最初の４７ヌクレオチドの
ための配列が続いている。この２本鎖ＤＮＡフラグメン
ト（第５図１１０）は以下の構造を持っている： このフラグメントは、以下のセグメントを製造した既知
のリン酸トリエステル法によって調製した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣ ４）ＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣ ５）ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧ ６）ＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧ ７）ＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ ８）ＧＧＴＴＧＧＧＡＡ ９）ＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴ １０）ＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴ １１）ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴ 上で調製したセグメントを使って以下の３種の２連体を
製造した。 ａ） 確立された方法（Ｅ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｂｅ
ｌａｇａｊｅ，Ｍ．Ｊ．ＲｙａｎおよびＨ．Ｇ．Ｋｈｏ
−ｒａｎａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ ６８，１０９−１５１（１９７９））に従って、
５′−リン酸化セグメント７の存在下、Ｔ４リガーゼを
使用して、セグメント１（５′−非リン酸化）を５′−
リン酸化セグメント２と結合させて２連体１を製造し
た。この２連体を１５％のポリアクリルアミドゲル上、
プレパラティブゲル電気泳動法により単離した。 ｂ）５′−リン酸化セグメント８および９の存在下、Ｔ
４リガーゼを使って５′−リン酸化セグメント３を５′
−リン酸化セグメント４と結合させ２連体２を調製し、
これを１５％のポリアクリルアミド上、プレパラティブ
ゲル電気泳動法により単離した。この反応は上記と同様
にして行なった。 ｃ）５′−リン酸化セグメント１０および５′−非リン
酸化セグメント１１の存在下、Ｔ４リガーゼを使って
５′−リン酸化セグメント５を５′−リン酸化セグメン
ト６と結合させ２連体３を調製した。この反応は上記と
同様にして行なった。この２連体を１５％のポリアクリ
ルアミド上、プレパラティブゲル電気泳動法により単離
した。 ２連体１，２および３をＴ４リガーゼにより結合させ、
２本鎖ＤＮＡセグメント（第５図の１１０）を調製し、
これを１５％のポリアクリルアミド上、プレパラティブ
ゲル電気泳動法により単離した。この生成物の５′末端
を、以下の確立された方法に従い、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼおよび［γ−ｐ３２］ＡＴＰを使って酵素的
にリン酸化した。リゲーション緩衝液１４μｌ中、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ２単位を使用して、０．１ピカモル
（０．４μｇ）のプラスミドベクター（第５図の１０
７）、３．２ピカモルの合成ＤＮＡフラグメント（第５
図の１１０）および０．２４ピカモル（０．０８μｇ）
の５３８ｂｐフラグメント（第５図の１０９、製造法参
照）を酵素的に結合させて発現プラスミドを組み立て
た。４℃で１６時間インキュベートした後、この混合物
を使って既述したようにＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１を形
質転換した。形質転換されたコロニーを、１００μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含有する寒天平板上で選択した。
既述したＢｉｒｎ−ｂｏｉｍスクリーニング法により１
０コロニーからプラスミドを調整した。制限酵素Ｘｂａ
ＩおよびＢａｍＨＩによる消化およびそれに続くアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により、１つのプラスミドが期
待した６０４ｂｐフラグメントを含有していることが解
った。このプラスミドを増幅させ、ＸｂａＩサイトから
ＦｎｕＤＩＩサイトまでのＤＮＡ配列をＭａｘａｍ，
Ａ．Ｍ．およびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．の方法（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４，５６
０−５６４（１９７７））に従って測定し、正しいこと
を確めた。このプラスミドを以降 ｐＮＭ６４５（第５
図の１１１）と呼ぶ。 Ｂ． ヒト成長ホルモンの発現 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１中のプラスミド ｐＮＭ６４
５によるヒト成長ホルモンの初期の発現は、Ｂｒｏｏｍ
ｅ，Ｓ．およびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．のＰｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７５、２７４６−２
７４９（１９７８）、Ｈｉｔｚｅｍａｎ，Ｒ．Ａ．らの
ＩＣＮ−ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ
１４、５７−６８（１９７９）およびＥｒｌｉｃｈ，
Ｈ．Ａ．らのＣｅｌｌ１３、６８１−６８９（１９７
８）に記載されている固相放射免疫分析法の変法によっ
て検出した。Ｌｅａｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．らの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ２２７、６８０−６８５（１９７０））により
全細菌細胞蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分
析することにより、主要な蛋白質帯は約２００００ダル
トンであることが解った。この帯は全蛋白質の少くとも
１０％に相当すると考えられ、ｐＫＥＮ０２１を含有す
るＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１の標本には存在しない。Ｔ
ｗｏｍｅｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｊ．Ｍ．およ
びＷｕ，Ｇ．Ｔ．らの標準的な放射免疫分析法（Ｃｌｉ
ｎ Ｃｈｅｍ２０、３８９−３９１（１９７４））によ
り発現を定量的に測定した結果、細胞当り少くとも２百
万分子存在することが解った。８Ｍ尿素および１％トリ
トンＸ１００で抽出することによりメチオニルヒト成長
ホルモンを５００ｇｍのＥ．ｃｏｌｉ細胞から部分的に
精製した。遠心分離により残骸を除去し、可溶性の成長
ホルモンを含有している上澄液をＷｈａｔｍａｎ ＤＥ
５２カラムで分画した。放射免疫分析（ＲＩＡ）によっ
て測定したピークフラクションを集め、等電点沈澱にか
けた。この物質をＷｈａｔｍａｎ ＳＥ５３カラムでさ
らに精製した。ピークフラクションをＲＩＡによって測
定し、この物質を等電点沈澱または限外濾過によって濃
縮した。回収したメチオニルヒト成長ホルモンの生物活
性を、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｆ．Ｓ．らの方法（Ｅｎｄ
ｏ−ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ４５、４５５−４６３（１９４
８））により、脳下垂体切除した雌ラットにおける基部
上生軟骨幅を測定することにより測定した。その活性は
死体から得たヒト成長ホルモンのそれと同じであること
が解った。実施例２ Ｅ．ｃｏｌｉ のリポプロテインプロモータ
を使用したメチオニル牛成長ホルモン発現のためのプラ
スミド メチオニル牛成長ホルモンを発現させるプラスミドを組
み立てるための出発物質として、メチオニルヒト成長ホ
ルモンのための発現プラスミドであるプラスミド ｐＮ
Ｍ６４５（第６図の１１１）を使用した。Ｍｉｌｌｅ
ｒ，Ｗ．Ｌ．らにより記載されているプラスミド ｐＢ
Ｐ３４８（第６図の１１２）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５５、７５２１−７５２４（１９８０））を、牛
成長ホルモン遺伝子部分の暗号列を含んでいる２つのＤ
ＮＡフラグメントのソースとして使用した。このプラス
ミドはｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ（５′ＣＴＧＣＡＧ
３′）制限サイトにクローンした牛成長ホルモンを暗号
化している８３１ｂｐ配列を含んでいる。Ｍｉｌｌｅｒ
らにより記載された方法の別法として、牛成長ホルモン
のための配列は、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．ら（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８，７５−９０
（１９７９））により記載されている常法により、牛の
脳下垂体から単離したメッセンジャーＲＮＡから得るこ
とができる。ヒト成長ホルモンの暗号配列と牛成長ホル
モンのそれとは非常に類似しており著しい相同性を示
す。制限酵素ＰｖｕＩＩ（５′ＣＡＧＣＴＧ３′）によ
る消化によって生成するフラグメントは、牛成長ホルモ
ンの発現プラスミドを相み立てるのに特に有用である。
生成したフラグメントのサイズはヒト成長ホルモンにお
いては４９７ｂｐであり、牛成長ホルモンでは４９４ｂ
ｐである。両配列において相当する制限ナイトは同じ暗
号枠内にある。１分子当り３ＰｖｕＩＩサイトを含有す
るｐＮＭ６４５（第６図の１１１）１０μｇを、２００
μｌのＰｖｕＩＩ制限緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣｌ、６
ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ
２、６ｍＭ β−メルカプトエタノール）中、ＰｖｕＩ
Ｉ１単位を用いて３７℃で１０分間消化した。６５℃で
１０分間加熱して反応を停止させ、ＤＮＡをアルカリホ
スファターゼで処理した。この限られた消化方法によ
り、存在するＰｖｕＩＩサイトの１／２〜２／３が開裂
される。フラグメントを１％アガロースゲル上で分離
し、４９７ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメントを欠く線状プ
ラスミドに相当するサイズのＤＮＡフラグメント（第６
図１１３）（シングルカットのプラスミドより僅かに速
く移動する）を切り取り、精製し、中間体プラスミドｐ
ＮＭ６８５（第６図の１１４）を組み立てるためのベク
ターとして使用した。４９４ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメ
ントをｐＢＰ３４８から調製した。このプラスミド１０
μｇを２００μｌのＰｖｕＩＩ緩衝液中、ＰｖｕＩＩ１
０単位を用いて３７℃で１時間消化した。フラグメント
を６％のポリアクリルアミドゲル上で分離し、既述した
方法で４９４ｂｐフラグメント（第６図の１１２から）
を観察し、精製した。２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含
有しているＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌ中、０．
２μｇのベクターを０．０５μｇの４９４ｂｐフラグメ
ントと連結することにより、中間体プラスミドｐＮＭ６
８５（第６図の１１４）を組み立てた。形質転換および
アンピシリン耐性による形質転換体の選択の後、既述し
たＢｉｒｎｂｏｉｍ法により調製したプラスミドを４９
４ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメントの存在について分析し
た。酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩで連続的に消化するこ
とによりフラグメントの正しい方向性を確認した。牛成
長ホルモン配列からの４９４ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメ
ントは唯一の非対称ＳｍａＩ制限サイトをもっている。
親のプラスミドｐＮＭ６４５はＳｍａＩサイトを含んで
いない。４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントおよび４１
６ｂｐ ＸｂａＩ、ＳｍａＩフラグメントを持ったプラ
スミドを所望の中間体として選択し、その後の組立てに
使用した。プラスミドｐＮＭ６８５（第７図の１１４）
を、２つの方法で牛成長ホルモン発現プラスミドに変換
した：（１）ヒト成長ホルモンの最初の２２アミノ酸の
暗号配列を除去し、牛成長ホルモンの最初の２３アミノ
酸の暗号配列で置換えた、および（２）暗号配列の第２
のＰｖｕＩＩサイトから終止コドンの短い配列（これは
ヒト成長ホルモン配列である）を、牛成長ホルモンの１
９０番目のアミノ酸すなわちアラニンのためのコドンを
復活するため合成フラグメントで置換えた。１０μｇの
ｐＮＭ６８５をＰｖｕＩＩ緩衝液２００μｌ中、１単位
のＰｖｕＩＩを用いて３７℃で５分間消化した。６５℃
で１０分間加熱して反応を停止させた。フラグメントの
混合物を１％のアガロースゲル上に広げ、１分子当りた
だ１つのＰｖｕＩＩカットを有する線状プラスミドを回
収し精製した。この回収した物質（約３μｇ）を５単位
のＸｂａＩで完全に消化し、アルカリホスファターゼで
処理した。フラグメントを１％のアガロースゲル上に広
げ、最大のフラグメント（ヒトおよび牛成長ホルモンに
おいてＸｂａＩおよび最初のＰｖｕＩＩサイト間の８５
ｂｐフラグメントを欠失している）を回収し、クローニ
ングベクターとして使用した（第７図の１１５）。最初
のＰｖｕＩＩサイトまでの牛成長ホルモンの最初の２３
アミノ酸（６９ｂｐ）のためのＤＮＡ配列には、酵素Ｈ
ｐａＩＩ（５′ＣＣＧＧ３′）のための２つの制限サイ
トが含まれている。最初のサイトは、暗号配列の最初の
ヌクレオチドから２３ｂｐにある。牛成長ホルモンの最
初の２３ｂｐのための配列が後に続く、ｌｐｐリボゾー
ム結合サイトのＸｂａＩサイトからＡＴＧ開始コドンま
での１９ｂｐ配列に相当する４２ｂｐフラグメント（第
７図の１１６）をリン酸トリエステル法により合成し
た。このフラグメントは以下の構造を有する： この４２ｂｐフラグメントを製造するに当り、以下の６
つのセグメントを調製した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＧＣＴＴＴＴＣ ３）ＣＧＧＣＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣ ４）ＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ ５）ＴＡＧＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣ ６）ＣＧＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡ 上記のセグメントを使用して、５′−リン酸化セグメン
ト２、５′−リン酸化セグメント３、５′−リン酸化セ
グメント５および５′−非リン酸化セグメント６を、Ｔ
４リガーゼを使って連結し２連体を調製した。この２連
体を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精
製した。この２連体に、Ｔ４リガーゼの存在下、５′−
非リン酸化セグメント１および５′−リン酸化セグメン
ト４を加えた。得られた４２ｂｐＤＮＡ２連体（第７図
の１１６）を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により単離した。既知の方法に従い、この２連体の５′
末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−ｐ
３２］ＡＴＰを使って酵素的にリン酸化した。上記のＨ
ｐａＩＩサイトからＰｖｕＩＩサイトに至る４６ｂｐの
ＤＮＡフラグメントをもとのｐＢＰ３４８プラスミドか
ら得た。１００μｇのプラスミドを、４００μｌの Ｐ
ｖｕＩＩ緩衝液中、５０単位のＰｖｕＩＩを用いて３７
℃で２時間消化した。フェノール抽出およびエタノール
沈澱の後、ＤＮＡを５０単位のＰｓｔＩを含む４００μ
ｌのＰｓｔＩ（５′ＣＴＧＣＡＧ３′）緩衝液（５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、６ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル）に３７℃で２時間溶解した。このＤＮＡフラグメン
トを６％のポリアクリルアミドゲル（長さ３０ｃｍ）上
に広げ、所望の４６ｂｐ配列を含む１３５ｂｐフラグメ
ントを回収し、常法により精製した。回収したＤＮＡの
１／３（プラスミド３３μｇに相当）をＨｐａＩＩ制限
酵素による限定された消化にかけた。このＤＮＡを１０
０μｌのＨｐａＩＩ緩衝液（２０ｍＭトリス：ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール）中、１単位のＨｐａＩＩを用いて
３７℃で４０分間消化した。６５℃で１０分間加熱して
反応を停止させた。このＤＮＡフラグメントを５％のア
クリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス比１９：１）
上で展開させた。ＳａｕＩＩＩＡ制限酵素で消化した１
μｇのｐＢＲ３２２を別の井戸（ｗｅｌｌ）で展開し
た。このフラグメント混合物は、サイズマーカーとして
使用される４６ｂｐフラグメントを含んでいる。１３５
ｂｐフラグメントのＨｐａＩＩ部分的消化によって生成
する４６ｂｐフラグメントを標準的な方法で精製した
（第７図の１１２から）。ＸｂａＩおよびＰｖｕＩＩ末
端を有するプラスミドベクター（第７図の１１５）２／
１０μｇを１．６ピカモルの合成４２ｂｐフラグメント
（第７図の１１６）および０．５〜１ピカモルの４６ｂ
ｐフラグメント（第７図の１１２から）と、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ２単位とともにリゲーション緩衝液１０μｌ中
で混合し、４℃で１６時間連結させた。この混合物を用
いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１を形質転換し、アンピシ
リン耐性で選択したコロニーからプラスミドを調製し
た。４９４ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメントおよび８８ｂ
ｐ ＸｂａＩ、ＰｖｕＩＩフラグメントの存在について
プラスミドをスクリーニングした。分析した３６のうち
１８がこれらのフラグメントを持っていた。２つのプラ
スミドにつき、ＸｂａＩサイトからＰｖｕＩＩサイトま
でを配列化し、牛成長ホルモンのものかどうか放射免疫
分析により試験した。放射免疫分析で陽性の反応を示し
た１つは正しい配列を持っていた。このプラスミドはｐ
ＮＭ７９７（第７図の１１７）と命名した。標準的な放
射免疫分析法により牛成長ホルモンの発現を定量的に測
定し、１細胞当り少くとも１０５分子が存在することが
解った。プラスミドｐＮＭ７９７（第８図の１１７）
は、完全に牛成長ホルモンに変換するには、１個のアミ
ノ酸コドンを変換しなければならない。これは、ｐＮＭ
７９７の２８ｂｐ ＰｖｕＩＩ〜ＢａｍＨＩフラグメン
トを除去し、以下の配列を有する、第８図の１１８に示
した合成２本鎖フラグメント（上の鎖１３ｂｐ、下の鎖
１７ｂｐ）で置換えることにより達成することができ
る： １０μｇのｐＮＭ７９７をＰｖｕＩＩ緩衝液２００μｌ
中、ＰｖｕＩＩ１単位を用いて３７℃で５分間消化す
る。６５℃で１０分間加熱して酵素を不活性化させる。
この試料に、ＢａｍＨＩ緩衝液を加えて３００μｌに希
釈し、１０単位のＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間完
全に消化する。次いでアルカリホスファターゼ５単位を
添加し、６５℃で１時間インキュベートする。ＤＮＡフ
ラグメントを１％のアガロースゲル上で分離し、シング
ルカットプラスミドのサイズのＤＮＡフラグメント（第
８図の１１９）を精製する。この２／１０μｇを、リガ
ーゼ緩衝液２０μｌ中、Ｔ４リガーゼ２単位を用いて５
ピカモルの合成フラグメントと一夜４℃で連結させる。
形質転換および既述したＢｉｒｎｂｏｉｍプラスミド単
離法により、適切なサイズのＰｖｕＩＩフラグメント
（４９４ｂｐ）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩフラグメン
ト（６０４ｂｐ）を含有しているいくつかのプラスミド
を選択する。これらのうち少くとも２つの配列を、Ｂａ
ｍＨＩサイトから唯一のＳｍａＩサイトまで測定し、所
望の配列を持った１つを選択する（第８図の１２０）。実施例３ 実施例１のプラスミドの変異体 ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限サイトの間のｌｐｐ３′
配列を、ｐＢＲ３２２から誘導したＤＮＡフラグメント
（第９図の１０２）で置換えることによりｐＮＭ６４５
のテトラサイクリン耐性変異体（第９図の１１１）を組
み立てた。ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性はその
プロモータがＨｉｎｄＩＩＩ（５′ＡＡＧＣＴＴ３′）
によって開裂される遺伝子の生産物により付与される。
この遺伝子の暗号領域はその近くで始まり、プラスミド
のＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限サイトまで伸びてい
る。テトラサイクリンプロモータはＨｉｎｄＩＩＩによ
る配列の消化およびそれに続く１本鎖末端を除去するＳ
１ヌクレアーゼ処理により破壊される。５μｇのｐＢＲ
３２２をＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液２００μｌ中 （６０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭβ−メルカプトエ
タノール）、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩを用いて３７℃
で１時間消化し、ＤＮＡをフエノール／ＣＨＣｌ３抽出
し、エタノール沈澱させ、Ｓ１緩衝液３００μｌ（３０
０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
２５）、１ｍＭＺｎＣｌ２）に再懸濁する。Ｓ１ヌクレ
アーゼを１０００単位／ｍｌの割合いで加え、１５℃で
１時間インキュベートした。フェノール／ＣＨＣｌ３抽
出およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡを２００μｌのＳ
ａｌＩ制限緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭトリ
ス：ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍ
Ｍ β−メルカプトエタノール）に再懸濁し、５単位の
ＳａｌＩを用いて３７℃で１時間消化した。６％のポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動し、生成した６００ｂ
ｐフラグメントを単離した。既述した方法でこのフラグ
メントを回収し精製した。５μｇのｐＮＭ６４５を５単
位のＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間消化した。フェ
ノール／ＣＨＣｌ３抽出およびエタノール沈澱の後ＤＮ
ＡをＴＥＮに溶解した。２μｇのＢａｍＨＩ相補末端を
持ったｐＮＭ６４５を２０μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ
緩衝液（７０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｔ
ＴＰ）中、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩの大型
フラグメント１単位を用いて１５℃で１時間、鈍感末端
ＤＮＡに変換するために埋める（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉ
ｎ）。この酵素を６５℃で１０分間変性させ、ＤＮＡを
ＳａｌＩ緩衝液および３単位のＳａｌＩ制限酵素を加え
て３７℃で１時間開裂させた。このＤＮＡを１％のアガ
ロースゲル上で分離し、凍結後大きいプラスミドフラグ
メントをゲルから溶離した。エチジウムブロミドおよび
アガロースフラグメントをフェノール／ＣＨＣｌ３抽出
およびエタノール沈澱により除去した。プラスミドをＴ
ＥＮ２０μｌに溶解した。既述した条件下で、２／１０
μｇのプラスミドベクター（０．０５ピカモル）を０．
２μｇの６１７ｂｐフラグメント（０．５ピカモル）と
連結した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１コロ
ニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する寒天平板上で選
択した。プラスミド（ｐＮＭ７３６と命名された。第９
図の１２１）を単離し、制限酵素分析により所望の配列
を含んでいることが解った。メチオニルヒト成長ホルモ
ンの発現はｐＮＭ６４５の場合と同じほど高率であるこ
とが解った。実施例４ Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ヒト成長ホルモン発
現のためのプラスミドおよびエンテロキナーゼ（３．
４．２１．９）による選択的開裂にそれを基質として使
用する成熟ヒト成長ホルモンの生産 リン酸トリエステル法により、ｌｐｐプロモータ領域
を、開始コドンおよびエンテロキナーゼに認識され、開
裂される配列を指定している短いペプチドのための暗号
領域に続くヒト成長ホルモン暗号領域と連結することに
より２本鎖ＤＮＡフラグメント（第１０図の１２２）を
合成した。上の鎖は９０ヌクレオチドからなり、これは
５′末端にＸｂａＩ開裂により生じた４ヌクレオチド１
本鎖配列を含んでいる。下の鎖は８６ヌクレオチドから
なり、これは上の鎖の最後の８６ヌクレオチドと相補的
である。この合成ＤＮＡフラグメントの最初の部分は、
リボゾーム結合サイトのＸｂａＩ制限サイトから翻訳開
始メチオニンコドンまで（１９ｂｐ）のｌｐｐ遺伝子の
天然の配列に続いており、エンテロキナーゼ開裂サイト
のための配列および既述した唯一のＦｎｕＤＩＩサイト
までのヒト成長ホルモンの最初の４７ヌクレオチドがそ
の後に続いている。 この２本鎖ＤＮＡフラグメント
（第１０図の１２２）は以下の構造を有する： このフラグメントは既知のリン酸トリエステル法により
調製し、この際以下のセグメントを製造した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣ ６）ＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣ ７）ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧ ８）ＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧ ９）ＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ １０）ＡＴＧＧＧＡＡ １１）ＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ １２）ＧＧＴＴＧＧＧＡＡ １３）ＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴ １４）ＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴ １５）ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴ 上記のセグメントを使用して、以下に示すようにＴ４リ
ガーゼ触媒連結反応を段階的に行なった： ａ）５′−非リン酸化セグメント１を、５′−リン酸化
セグメント９の存在下、Ｔ４リガーゼを使って５′−リ
ン酸化セグメント２に結合させ、ＤＮＡ２連体１を製造
した（Ｅ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｂｅｌａｇａｊｅ，
Ｍ．Ｊ．ＲｙａｎおよびＨ．Ｇ．Ｋｈｏ−ｒａｎａ，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８、１
０９−１５１（１９７９））。この２連体を１５％ポリ
アクリルアミド上、プレパラティブゲル電気泳動法によ
り単離した。 ｂ）５′−リン酸化セグメント３を、５′−リン酸化セ
グメント１１の存在下、Ｔ４リガーゼを使って５′−リ
ン酸化セグメント４と結合させ、ＤＮＡ２連体２を調製
し、これを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より精製した。 ｃ）５′−リン酸化セグメント５を、５′−リン酸化セ
グメント１２および１３の存在下、Ｔ４リガーゼを使っ
て５′−リン酸化セグメント６と結合させＤＮＡ２連体
３を調製し、これを１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により精製した。 ｄ）５′−リン酸化セグメント７を、５′−リン酸化セ
グメント１４および５′−非リン酸化セグメント１５の
存在下、Ｔ４リガーゼを使って５′−リン酸化セグメン
ト８と結合させ、ＤＮＡ２連体４を調整し、これを１５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製した。 ｅ）ＤＮＡ２連体２、３および４をＴ４リガーゼにより
結合させてＤＮＡ２連体５を調製し、これを１５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により精製した。 ｆ）次いでこのＤＮＡ２連体１に、５′−リン酸化セグ
メント１０およびＤＮＡ２連体５をＴ４リガーゼの存在
下で加え、得られたＤＮＡ２連体（第１０図の１１０）
を１０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精
製した。次いでこのＤＮＡ２連体を、既知の方法によ
り、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−
ｐ３２］ＡＴＰを使って酵素的にリン酸化した。 ０．１ピカモル（０．４μｇ）のプラスミドベクター
（第５図の１０７）、０．０２５ピカモルの合成ＤＮＡ
フラグメント（第５図の１１０）および０．３ピカモル
（０．０８μｇ）の５３８ｂｐフラグメント（第１０図
の１０９、製造法参照）を、リゲーション緩衝液２４μ
ｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１．５単位を用いて酵素的に
結合させることにより発現プラスミドを組み立てた。４
℃で１６時間インキュベートした後、既述したようにこ
の混合物を使ってＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１を形質転換
した。形質転換されたコロニーを、１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含有する寒天平板上で選択した。既述し
たＢｉｒｎｂｏｉｍスクリーニング法により１９のコロ
ニーからプラスミドを調製した。制限酵素ＸｂａＩおよ
びＢａｍＨＩによる消化、次いでアクリルアミドゲル電
気泳動法により、１２個のプラスミドが所望の６２８ｂ
ｐフラグメントを含んでいることが解った。陽性プラス
ミドの８個を、ＸｂａＩ次いでＰｖｕＩＩで順次消化し
たところ、これらのうち７個が１０９ｂｐフラグメント
を生成した。１つのプラスミドの配列を、Ｍａｘａｍ，
Ａ．Ｍ．およびＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｗ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４、５６０−５６４
（１９７７））により測定したところ正しいことが解っ
た。このプラスミドはｐＮＭ７０２（第１０図の１２
３）と命名された。ヒト成長ホルモンの発現は、Ｔｗｏ
ｍｅｙ，Ｓ．Ｌ．らの標準的放射免疫分析法（Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ，２０、３８９−３９１（１９７４））に
より検出した。定量的に発現を測定した結果細胞当り少
くとも２百万分子であることが解った。５００ｇｍの
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から、８Ｍ尿素および１％のトリトン
Ｘ１００で抽出することによりＭｅｔ−ｐｈｅ−ｐｒｏ
−ｌｅｕ（ａｓｐ）４ｌｙｓ−ヒト成長ホルモンを部分
的に精製した。遠心分離により残骸を除去し、可溶性の
ヒト成長ホルモン生成物を含有している上澄液をワット
マンＤＥ５２カラムで分画した。放射免疫分析（ＲＩ
Ａ）により検出したピークフラクションを集め、等電点
沈澱にかけた。この物質をさらにワットマンＳＥ５３カ
ラムで精製した。ピークフラクションをＲＩＡで検出
し、その物質を等電点沈澱または限外濾過により濃縮し
た。部分的に精製したこの物質をエンテロキナーゼ開裂
にかけた。粗製の豚の腸エンテロキナーゼ（Ｍｉｌｅｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＡｎｄｅｒｓｏｎらの
方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１６、３３５４−３３
６０（１９７７））でさらに精製した。エンテロキナー
ゼを基質とともにインキュベートし、時々試料を採取し
て等電点焦点ゲル（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕ
ｓ−ｉｎｇｇｅｌ）で調べた。出発物質の等電点は４．
３であり、これは時間とともにヒト成長ホルモンの等電
点（４．９１）を有するバンド（帯）にシフトするのが
見られる。実施例５ Ｅ．ｃｏｌｉのリポプロテインプロモータを
使ったＭｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−牛成長ホルモン発現のた
めのプラスミド Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−牛成長ホルモン発現プラスミド
組み立てのための出発物質として、ヒト成長ホルモン発
現プラスミドであるプラスミドｐＮＭ７０２（第１１図
の１２３）を使用した。Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．Ｌ．ら
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５、７５２１−７５２
４（１９８０））により記載されているプラスミドｐＢ
Ｐ３４８（第１１図の１２４）を、牛成長ホルモン遺伝
子部分の暗号配列を含んでいる２つのＤＮＡフラグメン
トのソースとして使用した。このプラスミドは、ｐＢＲ
３２２のＰｓｔＩ（５′ＣＴＧＣＡＧ３′）制限サイト
にクローンされた牛成長ホルモンを暗号化している８３
１ｂｐ配列を含んでいる。Ｍｉｌｌｅｒらの方法の別法
として、牛成長ホルモンの配列は、現在通常の方法とな
っているＧｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．らの方法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８、７５−９
０（１９７９）により牛の脳下垂体から単離したメッセ
ンジャーＲＮＡからも得ることができる。既述したよう
に、ヒト成長ホルモンおよび牛成長ホルモンの暗号配列
は非常に類似しており、著しい相同性を示す。制限酵素
ＰｖｕＩＩ（５′ＣＡＧＣＴＧ３′）による消化により
生成したフラグメントは、牛成長ホルモンのための発現
プラスミドを組み立てるのにも有用であった。１分子当
り３個のＰｖｕＩＩサイトを含んでいるｐＮＭ７０２
（第１１図の１２３）１０μｇを、２００μｌのＰｖｕ
ＩＩ制限緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭトリス：
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ
β−メルカプトエタノール）中、１単位のＰｖｕＩＩを
用いて３７℃で１０分間消化する。６５℃で１０分間加
熱して反応を停止し、ＤＮＡをアルカリホスファターゼ
で処理する。この限られた消化法により、存在するＰｖ
ｕＩＩサイトの１／２〜２／３が開裂される。フラグメ
ントを１％のアガロースゲル上で分離し、４９７ｂｐＰ
ｖｕＩＩフラグメントを欠失している線状プラスミドに
相当するサイズのＤＮＡフラグメント（第１１図の１２
５）（シングルカットプラスミドより僅かに早く移動す
る）を切り取って精製し、中間的プラスミドの組み立て
にベクターとして使用した（第１１図の１２６）。ｐＢ
Ｐ３４８から４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントを調製
した。このプラスミド１０μｇを、２００μｌのＰｖｕ
ＩＩ緩衝液中、１０単位のＰｖｕＩＩを用いて３７℃で
１時間消化した。フラグメントを６％のポリアクリルア
ミドゲル上で分離し、４９４ｂｐフラグメント（第１１
図の１２４から）を既述した方法で確認し、精製した。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位を含有する２０μｌのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液中、０．２μｇのベクターを０．０
５μｇの４９４ｂｐフラグメントと４℃で１６時間連結
することにより中間的プラスミド（第１１図の１２６）
を組み立てる。形質転換次いでアンピシリン耐性に対す
る形質転換体の選択の後、既述のＢｉｒｎｂｏｉｍ法に
より調製したプラスミドを、４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラ
グメントの存在について分析する。フラグメントが適正
な配向性を有するかどうかは酵素ＸｂａＩおよびＳｍａ
Ｉで連続的に消化することにより調べる。牛成長ホルモ
ン配列からの４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントは唯一
の非対称ＳｍａＩ制限サイトを持っている。親プラスミ
ドｐＮＭ７０２はＳｍａＩサイトを持っていない。４９
４ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントおよび４４０ｂｐＸｂａ
Ｉ、ＳｍａＩフラグメントを有するプラスミドを所望の
中間体として選択しその後の組み立てに使用する。中間
体プラスミド（第１２図の１２６）を以下の２つの方法
で所望の融合牛成長ホルモン発現プラスミドに変換す
る：（１）エンテロキナーゼ基質−ヒト成長ホルモンの
最初の３０アミノ酸の暗号配列を除去し、エンテロキナ
ーゼ基質−牛成長ホルモンの最初の３１アミノ酸の暗号
配列で置換え、（２）この暗号配列内の第２のＰｖｕＩ
Ｉサイトから終止コドンまでの短い配列（これはヒト成
長ホルモン配列である）を合成フラグメントで置換え、
牛成長ホルモンの１９０番目のアミノ酸であるアラニン
のためのコドンを復活させる。この中間体プラスミド
（第１２図の１２６）１０μｇを、ＰｖｕＩＩ緩衝液２
００μｌ中、１単位のＰｖｕＩＩを用いて３７℃で５分
間消化する。６５℃で１０分間加熱して反応を停止させ
る。フラグメントの混合物を１％のアガロースゲル上に
広げ、１分子当りただ１個のＰｖｕＩＩカットを持った
線状プラスミドを回収して精製する。この回収した物質
（約３μｇ）を５単位のＸｂａＩで完全に消化し、アル
カリホスファターゼで処理する。このフラグメントを１
％のアガロースゲル上に広げ、最も大きなフラグメント
（ヒトおよび牛成長ホルモンにおけるＸｂａＩおよび最
初のＰｖｕＩＩサイトの間の１０９ｂｐフラグメントを
欠失している）を回収し、クローニングベクターとして
使用する（第１２図の１２７）。最初のＰｖｕＩＩサイ
トまでの牛成長ホルモンの最初の２３アミノ酸のための
ＤＮＡ配列（６９ｂｐ）は、酵素ＨｐａＩＩ（５′ＣＣ
ＧＧ３′）のための２個の制限サイトを含んでいる。最
初のサイトは、暗号配列の最初のヌクレオチドから２３
ｂｐのところにある。６３ｂｐフラグメント（第１２図
の１２８）はリン酸トリエステル法により合成した。こ
のフラグメントは、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのための暗号配列（２
４ｂｐ）および牛成長ホルモンのＰｈｅから最初のＨｐ
ａＩＩサイトまでの暗号配列の２０ヌクレオチドが後に
ついた、ｌｐｐリボゾーム結合サイトのＸｂａＩサイト
からＡＴＧ開始コドンまでの１９ｂｐ配列に相当する。
このフラグメントは以下の構造を有する： この６３ｂｐフラグメントを製造するのに以下の９個の
セグメントを製造した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣ ６）ＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡ−ＣＣＣＴ ７）ＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ ８）ＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣ ９）ＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣ 上記のセグメントを使用し、以下に述べる方法でＴ４リ
ガーゼ触媒結合反応を段階的に行なった： ａ）５′−非リン酸化セグメント１を５′−リン酸化セ
グメント６の存在下、Ｔ４リガーゼを使って５′−リン
酸化セグメント２と結合させ、ＤＮＡ２連体１を調製
し、これを１５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により精製した。 ｂ）５′−リン酸化セグメント３、４および５を５′−
リン酸化セグメント７および８、ならびに５′−非リン
酸化セグメント９の存在下、Ｔ４リガーゼを使って結合
させ、ＤＮＡ２連体２を調製し、これを１５％のポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により精製した。 ｃ）次いで２連体１および２をＴ４リガーゼで結合させ
てＤＮＡ２連体（第１２図の１２８）を調製し、これを
１５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製
した。次いでこのＤＮＡ２連体を確立された方法に従
い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−
ｐ３２］ＡＴＰを使って酵素的にリン酸化した。 上記のＨｐａＩＩサイトからＰｖｕＩＩサイトまでの４
６ｂｐのＤＮＡフラグメントを、もとのｐＢＰ３４８プ
ラスミドから得た。プラスミド１００μｇを４００μｌ
のＰｖｕＩＩ緩衝液中、５０単位のＰｖｕＩＩを用いて
３７℃で２時間消化した。フェノール抽出およびエタノ
ール沈澱の後、このＤＮＡを４００μｌのＰｓｔＩ
（５′ＣＴＧＣＡＧ３′）緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、６ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、６ｍＭ β−メルカプトエタノール）に、５
０単位のＰｓｔＩとともに３７℃で２時間溶解した。こ
のＤＮＡフラグメントを６％のポリアクリルアミドゲル
（長さ３０ｃｍ）に広げ、所望の４６ｂｐ配列を含む１
３５ｂｐフラグメントを回収し標準的な方法で精製し
た。回収したＤＮＡの１／３（プラスミド３３μｇに相
当）をＨｐａＩＩ制限酵素を用いて部分的に消化した。
このＤＮＡを、ＨｐａＩＩ緩衝液（２０ｍＭトリス：Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ｍＭ β
−メルカプトエタノール）１００μｌ中、１単位のＨｐ
ａＩＩを用いて３７℃で４０分間消化した。６５℃で１
０分間加熱して反応を停止させた。このＤＮＡフラグメ
ントを５％のアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビ
ス比１９：１）上で展開した。ＳａｕＩＩＩＡ制限酵素
で消化したｐＢＲ３２２の１μｇを別の井戸（ｗｅｌ
ｌ）で展開した。このフラグメントの混合物はサイズマ
ーカーとして使用される４６ｂｐフラグメントを含んで
いる。１３５ｂｐフラグメントの部分的ＨｐａＩＩ消化
により生成した４６ｂｐフラグメント（第１２図の１２
４から）を標準的な手法で精製した。ＸｂａＩおよびＰ
ｖｕＩＩ末端を有するプラスミドベクター（第１２図の
１２７）２／１０μｇを、合成６３ｂｐフラグメント
（第１２図の１２８）３．２ピカモルおよび４６ｂｐフ
ラグメント（第１２図の１２４から）０．５〜１ピカモ
ルと、リゲーション緩衝液１０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ２単位とともに混合し、４℃で１６時間連結させ
た。この混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１を形
質転換し、アンピシリン耐性により選択されたコロニー
からプラスミドを調製した。このプラスミドを４９４ｂ
ｐＰｖｕＩＩフラグメントおよび１０９ｂｐＸｂａＩ、
ＰｖｕＩＩフラグメントの存在についてスクリーニング
した。分析した１２個のうち１個がこれらのフラグメン
トを持っていた。このフラグメントをＸｂａＩサイトか
らＰｖｕＩＩサイトまで配列化し、牛成長ホルモンにつ
いて放射免疫分析で試験した。これは、放射免疫分析に
おいて陽性であることが解り、正しい配列を持ってい
た。このプラスミドはｐＮＭ７８９（第１２図の１２
９）と命名された。牛成長ホルモンについて標準的な放
射免疫分析法により定量的に発現を測定したところ、細
胞当り少くとも１０５分子が存在することが解った。プ
ラスミドｐＮＭ７８９（第１３図の１２９）は、牛成長
ホルモンに完全に変換するには１つのアミノ酸コドンを
変換する必要がある。これはｐＮＭ７８９の２８ｂｐの
ＰｖｕＩＩからＢａｍＨＩフラグメントを除去し、以下
の配列であって第１３図の１３０に示す合成２本鎖フラ
グメント（上の鎖１３ｂｐ、下の鎖１７ｂｐ）で置換え
ることにより達成される： ｐＮＭ７８９（１０μｇ）をＰｖｕＩＩ緩衝液２００μ
ｌ中、１単位のＰｖｕＩＩを用いて３７℃で５分間消化
する。６５℃で１０分間加熱してこの酵素を非活性化す
る。このサンプルをＢａｍＨＩ緩衝液を加えて３００μ
ｌに希釈し、１０単位のＢａｍＨＩを用いて３７℃で１
時間完全に消化する。次いでアルカリホスファターゼ５
単位を添加し、６５℃で１時間インキュベートする。Ｄ
ＮＡフラグメントを１％のアガロースゲル上で分離し、
シングルカットのプラスミドサイズのＤＮＡフラグメン
ト（第１３図の１３１）を精製する。この２／１０μｇ
を、リガーゼ緩衝液２０μｌ中、Ｔ４リガーゼ２単位を
用いて合成フラグメント５ピカモルと４℃で一夜連結さ
せる。形質転換および既述したＢｉｒｎｂｏｉｍプラス
ミド単離法に従い、適当なサイズのＰｖｕＩＩフラグメ
ント（４９４ｂｐ）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩフラグ
メント（６２８ｂｐ）を含むいくつかのプラスミドを選
択する。これらのうち少くとも２つの配列をＢａｍＨＩ
サイトから唯一のＳｍａＩサイトまで測定し、所望の配
列（第１３図の１３２）を持った１つを選択した。
第１図〜第４図は本発明のクローニングベクターの組み
立てに使用する出発物質および中間体の製造の模式図、
第５図は、第１〜４図と一緒になって、メチオニルヒト
成長ホルモン製造用クローニングベクターの組み立てを
示す模式図、第６〜第８図は、第１〜５図と一緒になっ
て、メチオニル牛成長ホルモン製造用クローニングベク
ターの組み立てを示す模式図、第９図は第１〜５図と一
緒になって、メチオニルヒト成長ホルモンの製造に有用
なクローニングベクターの変異体の組み立てを示す模式
図、第１０図は、第１〜４図と一緒になって、ヒト成長
ホルモンの製造に有用な第２の態様のクローニングベク
ターの組み立てを示す模式図、第１１図〜第１３図は、
第１０図および第１〜４図と一緒になって、牛成長ホル
モンの製造に有用な第２の態様のクローニングベクター
の組み立てを示す模式図である。
立てに使用する出発物質および中間体の製造の模式図、
第５図は、第１〜４図と一緒になって、メチオニルヒト
成長ホルモン製造用クローニングベクターの組み立てを
示す模式図、第６〜第８図は、第１〜５図と一緒になっ
て、メチオニル牛成長ホルモン製造用クローニングベク
ターの組み立てを示す模式図、第９図は第１〜５図と一
緒になって、メチオニルヒト成長ホルモンの製造に有用
なクローニングベクターの変異体の組み立てを示す模式
図、第１０図は、第１〜４図と一緒になって、ヒト成長
ホルモンの製造に有用な第２の態様のクローニングベク
ターの組み立てを示す模式図、第１１図〜第１３図は、
第１０図および第１〜４図と一緒になって、牛成長ホル
モンの製造に有用な第２の態様のクローニングベクター
の組み立てを示す模式図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジェイムズ・ポール・バーネット，ジュニ ア アメリカ合衆国インディアナ46250、イン ディアナポリス、ブルックビュー・レイン 7641番 (72)発明者 ラマモールシー・ベレガーエ アメリカ合衆国インディアナ46260、イン ディアナポリス、モホーク・レイン7821番 (72)発明者 ハンセン・マクスウェル・シウング アメリカ合衆国インディアナ46260、イン ディアナポリス、ウェスト・エイティーエ イトゥス・ストリート108番
Claims (3)
- 【請求項１】 Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−成長ホルモン。 - 【請求項２】 成長ホルモンがヒト成長ホルモンである
請求項１記載の成長ホルモン前駆体。 - 【請求項３】 成長ホルモンが牛成長ホルモンである請
求項１記載の成長ホルモン前駆体。
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|---|---|---|---|
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| US381992 | 1982-05-25 | ||
| US382051 | 1999-08-24 |
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|---|---|---|---|
| JP58092197A Expired - Lifetime JPH0759193B2 (ja) | 1982-05-25 | 1983-05-24 | 外来性蛋白質発現用クロ−ニングベクタ− |
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| JP58092197A Expired - Lifetime JPH0759193B2 (ja) | 1982-05-25 | 1983-05-24 | 外来性蛋白質発現用クロ−ニングベクタ− |
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| JP (2) | JPH0759193B2 (ja) |
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1983
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1992
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Patent Citations (3)
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
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