KR0168669B1 - 스트렙토마이세스에서의 외래 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 텐다미스타트의 시그날 서열과 처음 약 10개의 아미노산 뿐만 아니라 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자 구조물을 스트렙토마이세스 숙주세포 내에서 고 수율로 발현시키고, 융합 단백질이 배지내로 분비되도록 하는, 스트렙토 마이세스 내에서 외래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

스트렙토마이세스에서의 외래 단백질의 제조방법

본 발명은 스트렙토마이세스(streptomyces)내에서 외래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

공개번호(EP-A) 0,289,936호의 유럽 특허 출원은, 목적하는 단백질에 대한 구조 유전자를 임의로 변형시킨 텐다미스타트 유전자(tendamistat gene)의 암호화 쇄의 3'-말단에 커플링시키고, 이 유전적 구조를 스트렙토마이세스 숙주 세포내에서 발현시키며, 상등액으로부터 분비된 융합 단백질을 분리함으로써 융합 단백질을 제조하는 것을 기술하고 있다. 바람직한 양태중에서 이 텐다미스타트 유전자는 3'-말단에서 트렁케이트(truncate)된다. 트렁케이트를 위해, 트리플렛 31 및 32의 영역내 제한 효소 BstEII에 대한 절단부위, 트리플렛 43과 44영역내 StuI 절단부위 및 트리플렛 52와 53영역내 Sau3A 절단부위가 사용된다.

본 발명 개념의 좀 더 발전된 면에서는, 텐다미스트부분에 뒤따르는 트렁케이트된 프로인슐린[이의 C-쇄는 단지 1개 또는 2개의 라이신 잔기로만 구성됨(미니 프로인슐린)]이 존재하는 융합 단백질을 제조하는 것이 기술된 바 있다. 다른 더 발전된 면에서 제안된 것은 이런 타입의 융합 단백질에서 덴다미스타트 부분까지도 트렁케이트되는 것이다[참조: 1990년 5월 9일 공개된 EP-A 제0,367,163호].

놀랍게도, 본 발명에 이르러 대단히 짧은 덴다미스타트부분을 갖는 융합 단백질이 스트렙토마이세스 세포내에서 안정하며 배지로 분비된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 방법에서 수득한 융합 단백질은, 이의 대단히 짧은 덴다미스타트 쇄로 인해 완전 단백질과 같이 행동하며 일반적으로 배지중에서 완전한 3차 구조로서 존재한다.

EP-A 제0,177,827호는 발현 시스템중에서 수송단백질을 위한 합성 유전자 시그날 서열을 기술하고 있으며, 여기에서 DNA는 실질적으로 천연 시그날 서열과 동일하지만, 이는 천연의 DNA중에는 포함되어 있지 않은, 엔도뉴클레아제에 대한 하나이상의 분해 부위를 갖고 있다. 이러한 DNA 서열과 수송될 단백질에 대한 유전자가 커플링될 때, 이 융합 유전자는 벡터내로 통합되며, 발현된 단백질을 세포질 밖으로 운반하는 숙주세포는 이로써 형질전환되므로 원핵 및 진핵세포내에서 진핵성, 원핵성 또는 바이러스성 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를들어, 이. 콜라이 내에서의 발현에 있어서는, 주변세포질의 단백질 알칼린 포스파티제를 사용하여, 알칼린 포스파타제의 처음 약40개 아미노산에 대한 코돈을, 예비 목적하는 단백질에 대한 구조 유전자의 전방-서열 및 상부에 위치시키는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 많은 경우에는 훨씬 소량의 추가 아미노산, 예를들어, 약 10, 바람직하게는 약 5개의 아미노산이면 충분하다. 유인원 프로인슐린을 가진 상응하는 융합 단백질의 약 90%는 주변 세포질 공간으로 수송된다.

또한, 융합 단백질의 밸러스트 부분(ballast portion)을 암호화한 혼합된 올리고뉴클레오티드를 작제하고, 올리고뉴클레오티드를 목적하는 단백질에 대한 조절영역 및 구조 유전자에 작용적으로 커플링되도록 하는 방식으로 벡터내에 도입하고, 이런 방법에 따라 수득된 플라스미드 집단으로 적절한 숙주 세포를 형질전환시킨 다음 고 수율의 암호화된 융합 단백질을 생산하는 클론을 선별함으로써 융합단백질을 제조하는 것이 제안된 바 있다[참조: 1991년 3월 21일 공개된 WO 제 91/03550호]. 이 올리고뉴클레오티드는 이 경우 바람직하게는 4 내지 12개, 특히 4 내지 8개의 트리플렛으로 이루어져 있다.

이미, 짧은 밸러스트 부분으로 융합 단백질을 제조하려는 시도가 있어 왔다. 그러므로, 예를들어 β-갈락토시다제와 소마토스타틴의 처음 10개의 아미노산으로부터의 융합 단백질을 암호화한 유전자 융합물이 제조된 바 있다. 그러나, 이런 짧은 β-갈락토시다제 단편은, 내인성 숙주 프로테아제에 의한 분해로 부터 융합 단백질을 보호하는데 충분치 못함이 밝혀졌다[참조: US-A 제 4,366,246호, 15란 제2단].

그에따라, 밸러스트 부분이 250개 이상의 아미노산을 가진 β-갈락토시다제 단편으로 이루어진 융합 단백질이 EP-A 제0,290,005호와 제 0,292,763호에 기술되어 있다.

그러나, 텐다미스타트와 목적하는 단백질의 융합 단백질(예: 프로인슐린)의 처음 10개 아미노말단 아미노산은 실제로 예상보다 스트렙토마이세스 숙주 세포내에서 안정하여 배지내로 분비되는데, 이로부터 이들은 고 수율로 분리될 수 있다.

놀랍게도, 이 같은 사실은 미니-프로인슐린과 같은 비교적 작은 단백질에 대해서도 마찬가지이다.

약 10개의 아미노산이란 이런 경우, 심지어 적은 수의 아미노산, 예를들어 텐다미스타트의 7개 N-말단 아미노산도 적절하지만, 그러나 바람직하게는 10개 이하라는 것을 나타낸다. 텐다미스타트 부분의 프톨린이 7번 위치 및/또는 9번 위치(천연서열에서와 같이)에 존재하는 융합 단백질이 바람직하다. 그러나, 이미 공지되거나 또는 제안된 양태에 따라 보다 큰 텐다미스타트 밸러스트 부분을 선택하는 것이 물론 가능하며, 낮은 밸러스트의 장점은 물론 점차 상실된다.

텐다미스타트 부분의 천연 아미노산 서열을 변화시키는 것, 다시 말해서, 아미노산을 대체하거나 또는 결실시키거나 또는 천연의 아미노산 서열에서는 발생되지 않는 아미노산을 삽입하는 것이 또한 가능하며 심지어 유리할 수 있다. 게다가, 단일 펩티드내 아미노산 서열을 변화시키는 것이 가능하다.

만일, 본 발명의 개념이 공지된다면, 특히 유익한 융합작제물이 간단한 예비 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 예를들어 바실러스(Bacillus) 또는 스타필로코커스(Staphylococcus) 세포와 같은 다른 그람-음성 세균 세포내에서도, 이들 숙주에 의해 인지되는 시그날 서열을 사용하여 본 발명의 개념을 실현하는 것이 가능하다.

본 발명에 따라 수득된 융합 단백질은 배지중에서 용해된 상태로 존재하며, 이는 가종 및 정제에 있어 많은 장점이 있다. 따라서, 밸러스트 부분을 절단하는 효소적 공정은, 예를들어, 직접적으로 분비생성물상에서 일어날 수 있으며 불용성 융합 단백질에 대해 필요한 것과 같은 후처리 단계는 수행할 필요가 없다. 또한, 더 이상의 가공전에 먼저, 예를들어 친화 크로마토그래피 뿐만 아니라 한외여과, 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 겔 여과 또는 고압 액체 크로마토그래피와 같은 농축 또는 정제 공정을 수행할 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예에서 좀더 상세히 설명된다.

플라스미드 작제에 필요한 출발물질은 EP-A 제0,367,163호에 제안되어 있는 플라스미드 pKK 500이다. 이 플라스미드는, 프로인슐린 유전자가, C쇄 대신에, 단순히 아미노산 라이신만을 암호화한 유사한 유전자에 의해 대체되어 있으며, 터미네이터 서열(terminator sequence)이 이 미니-프로인슐린 유전자의 바로 하부에 삽입되었다는 점에서, EP-A 제0,289,936호에 공지된 플라스미드 pKK 400과는 상이하다. 미니-프로인슐린 유전자와 터미네이터 서열이 각각 나타나 있는, EP-A 제0,367,163호로부터의 표1 및 2가 설명의 부록으로 수록되어 있다.

플라스미드 pKK 400과 pKK 500은 α-아말라제 억제 유전자의 시그날 서열중에 XmaIII 절단 부위를 포함한다(트리플렛 -5 내지 -7의 영역내에).

[실시예 1]

제한 효소 EcoRI와 XmaIII로 플라스미드 pKK 500을 개환시키고 큰 단편은 0.8% 아가로스겔 상에서 겔 전기영동으로 분리하여 전기 용출로 분리시킨다. 이 단편을, 포스포르아미디트 방법으로 합성한 DNA 단편(1) (서열확인번호:1)과 연결시키고, 이 연결 혼합물을 이. 콜라이내로 형질전환시킨다. 플라스미드 pKK 510이 수득된다.

이 플라스미드는 프레프로인슐린을 암호화하고 있으며 여기에서 텐다미스트의 시그날 서열은 미니-프로인슐린 쇄가 뒤따르는 텐다미스타트의 처음 7개 아미노산 다음에 연속된다.

[실시예 2]

플라스미드 pKK 400을 발현 플라스미드 pGF1으로 이전시키는, EP-A 제0,289,936호에 기술된 방법과 유사하게, 플라스미드 pKK 510을 발현 플라스미드 pKF1내로 이전시킨다:

pKK 510의 분리된 플라스미드 DNA를 제한 효소 SphI과 SstI으로 분해하고 융합 유전자를 가진 소 단편을 분리한다. 시판되는 발현 플라스미드 pIJ 702(영국, 노르위치 소재의 존인스 파운데이션에서 입수)를 동일한 효소로 분해하고 큰 단편을 분리한다. 이들 2개의 분리된 단편을 연결시키고, 연결 혼합물을 에스. 리비단스(S. lividans) TK24내에 형질전환시키고 플라스미드를 티오스트렙톤-내성 백색(다시 말해서 멜라닌을 형성할 수 없는) 형질전환체로부터 분리한다. 도입된 삽입체를 지닌 클론을 진탕 배양도중 융합 단백질의 형성에 대해 시험한다.

이 암호화된 융합 단백질은 공지된 방법으로 발현시킨다: 즉, 형질전환된 균주를 25℃이상에서 4일 동안 진탕 플라스크내에 배양시키고, 이들 배양액으로부터 원심분리에 의해 균사를 제거하는 경우, 15% 폴리아크릴아미드 겔중에서 배양여액 20μl를 전기영동한 다음, 균주를 단지 pIJ 702로만 형질전환시킨 대조군 실험중에서는 나타나지 않는, 추가의 단백질 밴드로서 배양 상등액중에서 형성된 융합 단백질을 꼬마지에 블루(COOMASSIE Blue) 염색에 의해 가시화하는 것이 가능하다.

배양 여액을 라이실 엔도프로테인아제로 처리하는 경우, 겔 전기영동상에서 정확한 조절에 의해 확증될 수 있는, de-(B30)-Thr-인슐린을 검출하는 것이 가능하다.

또한, 배양 여액중의 융합 단백질을 면역블룻중에서 인슐린 항체를 사용하거나 인슐린 RIA를 사용하여 검출하는 것이 가능하다.

[실시예 3]

실시예 1과 2에 따른 공정을 수행하나 서열확인번호:2를 갖는 합성 단편(2)을 사용하며

이런 방법으로 플라스미드 pKK 320 및 pKF 2가 각각 수득된다. 이들 플라스미드는, 텐다미스타트의 처음 7개 아미노산에 (본래의 아미노산 알라닌 대신에) 아스파라긴이 이어지고 이에는 다시 텐다미스타트중의 아홉번째 아미노산인 프롤린이 이어지고 있다는 점에서 실시예 1 및 2와는 상이한 융합 단백질을 암호화하고 있다. 알라닌을 아스파라긴으로 교환함으로써, 추가의 양 전하가 융합 단백질의 밸러스트 부분내에 도입되게 된다. 놀랍게도, 실시예 2에서 보다 약 20 내지 30% 높은 수율이 수득된다.

[실시예 4]

실시예 1과 2에 따른 공정을 사용하되, 서열확인번호:3을 갖는 합성 단편(3)을 사용하여, 플라스미드 pKK 330 및 pKF 3이 각각 수득된다.

이들 플라스미드는 텐다미스타트의 처음 9개 천연 아미노산을 암호화한다는 점에서 실시예 1 및 2의 플라스미드와는 상이하다. 실시예 2와 비교하여, 약 10% 높은 수율이 수득된다.

[실시예 5]

pKK 500에 의해 암호화된 융합 단백질은 텐다미스타트 부분과 프로인슐린의 B쇄 사이에 아미노산 Asn-Ser-Asn-Gly-Lys를 암호화하는 링커 서열을 포함한다. 말단 Lys 및 C쇄를 나타내는 Lys는 하기에서와 같이 Arg로 대체된다. 이 과정에서, 프로인슐린 서열중의 코돈 B30 내지 A1 영역중의 단일 StyI 절단부위가 사용된다.

pKK 500으로부터 분리된 플라스미드 DNA를 StyI을 사용하여 절단하고 돌출된 말단을 제거하기 위해 S1 뉴클레아제로 분해시키며 잉여의 뉴클레아제는 페놀-클로로포름을 사용하여 추출한다. 그후 선형화된 플라스미드를 EcoRI으로 연속하여 절단하고 큰 단편은 전기-영동적으로 분리제거하며 전기용출로 분리시킨다. 이 단편은 합성 단편(4)(서열확인번호:4)와 연결시키고 연결 혼합물을 이. 콜라이 내로 형질전환시킨다.

새로이 생성된 SstII 분해부위를 사용하여, 포함된 플라스미드의 제한 분석으로 목적하는 클론을 시험한다. 또한, 전체 SphI-SstI 단편을 서열분석한다.

암호화된 융합 단백질을 발현시키기 위해, 서열분석으로 체크한 바 있는 단편을 동일한 효소로 절단한 벡터 pIJ 702내로 연결시키면, 발현벡터 pGF 4가 생성된다.

한편, pGF4에 의해 암호화되어 분비된 융합 단백질은, α-아말리제 억제제 플레이트 시험(EP-A 0,161,629, 실시예 3참조)으로 검출할 수 있으며, 또 다른 한편으로, 실시예 2와 유사한 진탕 배양의 상등액으로부터 검출할 수도 있다.

[실시예 6]

실시예 5와 동일하게, 단편(4)가 벡터 pKK 510, 520 및 530내로 삽입되는 경우, 벡터 pKK 610, 620 및 630이 수득된다. 융합 단백질에 대한 암호화 서열을 가진 각각의 SphI-SstI 단편을 벡터 pIJ 702내로 도입시키면, 발현 벡터 pKF 11, 12 및 13이 생성된다. 분비된 융합 단백질의 발현은 실시예 2와 유사하게 시험한다.

[실시예 7]

플라스미드 pIJ 702 유도체의 발현을 증가시키기 위해, PstI 및 SphI을 사용한 분해로써 이로부터 멜라닌 프로모터를 제거시키고 다음의 합성 단편(5)(서열확인번호:5)로 대체한다.

이렇게 하여 합성 프로모터와 텐다미스타트 프로모터의 텐덤 작제물이 수득된다. 이 플라스미드를 pGR 110으로 칭한다.

SphI 및 SstI으로 합성 단편(1), (2) 및 (3)을 절단한 후 pGR 110내에 삽입시키는 경우, 발현 벡터 pGR 200, 210 및 220이 수득된다. 유사한 방법으로, 단편(4)를 사용하여, 발현 벡터 pGR 250, 260 및 270을 수득한다.

[실시예 8]

트립신 또는 이와 동일한 효과를 갖는 효소와 카복시 펩티다제 B를 합하여 인슐린 전구체로부터 사람 인슐린을 제조하고자 하는 경우, B31(Arg)-인슐린을 생성케 하는 분해 반응이 우세하도록 하기 위해 밸러스트 부분을 분해반응 동안에 신속히 분해하여 제거하는 것이 유리하다. 이를 위해, 아미노산 B1(Phe)의 아미노산 상부를 변형시킴이 적절하다:

이 방법은 실시예 1과 유사하며 플라스미드 pKK 500은 제한효소 EcoRI 및 DraIII를 사용하여 개환시킨다. 그후 이 원래의 단편을 포스포르아미디트 방법으로 합성한 DNA 단편(6)(서열확인번호:6)으로 대체한다.

이. 콜라이 내로의 클로닝과 스트렙토마이세스 리비단스 내에서의 발현을, 각각 실시예 1과 실시예 2에 따라 수행한다. 플라스미드 pKK 640과 발현 플라스미드 pKF 14가 생성된다.

실시예 5에 따라 수득된 플라스미드는[단편(4)와 통합한 후] 유사한 방법으로 처리할 수 있다. 이 방법으로 플라스미드 pKK 650과 pKF 15가 수득된다.

부록 (EP-A제 0.367, 163호로 부터);

Claims (8)

1. 목적하는 단백질에 대한 구조 유전자를 텐다미스타트(tendamistat)의 시그날 서열 및 처음 약 10개의 아미노-말단 아미노산에 대한 코돈(여기에서, 텐다미스타트 유전자 서열은 변형시킬 수 있다)에 커플링시키고, 이 유전자 구조물을 스트렙토마이세스 숙주세포내에서 발현시킨 다음, 분비된 융합 단백질을 상등액으로부터 분리시킴을 포함하는, 융합 단백질의 제조방법.
2. 텐다미스타트의 시그날 서열 및 처음 약 10개의 코돈 및 다른 단백질에 대한 구조 유전자를 포함하는 유전자 구조물.
3. 제2항에 있어서, 아미노산에 대한 코돈이 텐다미스타트부분내에서 결실되거나, 교환되거나 또는 부가된 유전자 구조물.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 링커 서열이 텐다미스타트 유전자와 목적하는 단백질의 구조 유전자 사이에 배열되어 있는 유전자 구조물.
5. 제2항, 제3항 또는 제4항에 따른 유전자 구조물을 포함하는 벡터.
6. 제5항에 따른 벡터를 포함하는 스트렙토마이세스 세포.
7. 텐다미스타트의 처음 약 10개의 아미노산의 N-말단 부분이, 경우에 따라 브릿지 서열을 통해, 목적하는 단백질에 커플링된 융합 단백질.
8. 목적하는 단백질을 제조하기 위한, 제7항에 따른 융합 단백질 또는 제1항에 따른 방법에 의해 수득가능한 융합 단백질의 용도.