PT97427B - Processo para a preparacao de proteinas de fusao de tendamistato em estreptomicetas - Google Patents

Processo para a preparacao de proteinas de fusao de tendamistato em estreptomicetas Download PDF

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Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Klaus-Peter Koller e Dr. Gunter Riess, residen tes na República Federal Alemã, para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DE TENDAMISTATO EM ESTRÉPTOMICETAS.
DESCRIÇÃO
Por meio da memória descritiva de Patente Euro peia com o número de publicação (EP-A) 0 289 936 ê conhecida a maneira como se pode obter proteínas de fusão acoplando o gene estrutural para a proteína desejada na extremidade 3' da fita gue codifica o gene de tendamistato eventualmente modificado, provocando a expressão desta estrutura do gene em uma célula ho£ pedeira de Estréptomicetas e isolando a partir do sobrenadante a proteína de fusão segregada. Em uma forma de realisação preferida, o'gene de tendamistato ê encurtado na extremidade 3'. Para o encurtamento são usados os lugares de corte para as enzimas de restrição BstElI na zona dos tripletos 31 e 32, StuI na região dos tripletos 43 e 44 assim como Sau3A na região dos tripletos 52 e 53.
Na continuação do desenvolvimento desta ideia da referida invenção, jã foi sugerido produzir-se uma proteína de fusão na qual â fracção de tendamistato se segue uma prõ-insu • lina encurtada, cuja cadeia de carbono consiste simplesmente em
um ou dois radicais de lisina (mini-pró-insulina). Como ulterior continuação do desenvolvimento foi sugerido que nessas proteínas de fusão a fracção de tendamistato também estivesse encur tada (EP-A 0367 163, publicada em 09 de Maio de 1990).
A Requerente descobriu agora, surpreendentemente que proteínas de fusão com uma fracção de tendamistato mui to curta são estáveis nas células de Estreptomicetas e são descarregadas para dentro do meio. As proteínas de fusão assim obti das comportam-se, devido â cadeia de tendamistato muito curta, como proteínas maduras e em geral, existem no meio com a estru tura terciária correcta.
A partir da memória descritiva da Patente Euro peia EP-A 0 177 827 é conhecida uma sequência de sinalização sin têtica para o transporte de proteínas em sistemas de expressão, que se caracteriza pelo facto de o DNA corresponder substancialmente a uma sequência de sinalização natural, mas possui um ou mais sítios de corte para endonucleases, que não são contidos no DNA natural. Quando o gene para a proteína a ser transportada é acoplado a uma tal sequência de DNA, incorpora-se este gene de fusão em um vector e transforma-se desta maneira uma célula hospedeira, que transporta para fora do citoplasma a proteína expressa, é possível obter proteínas eucarióticas, procarióticas ou virais em células procarióticas e eucarióticas. No exemplo da fosfatase alcalina da proteína periplasmãtica, demonstra-se que é vantajoso, no caso da expressão em E.coli, colocar a seguir à pré-sequência os codões para os aproximadamente primeiros 40 ami noãcidos da fosfatase alcalina antes do gene estrutural para a proteína desejada. Em muitos casos, porém, também bastam menos aminoácidos adicionais, por exemplo, cerca de 10, vantajosamente cerca de 5. Uma proteína de fusão correspondente com prõ-insulina de macaco foi inserida, em cerca de 90%, para dentro do espaço periplástico.
Também jã foi reivindicada (pedido de Patente de Invenção PCT com o Numero WO 91/03550, publicado em 21 de Mar ço de 1991) a preparação de proteínas de fusão construindo um oligonucleótido misto, que codifica a fracção de lastro da proteí na de fusão, introduzindo este oligonucleótido em um vector de tal maneira, que ele seja funcionalmente acoplado a uma região
de regulação e ao gene estrutural da proteína pretendida, transformando com esta população de plasmídeos assim obtida células hospedeiras adequadas a seleccionando os clones que apresentam um elevado rendimento em proteína de fusão codificada. 0 oligonucleõtido, neste caso, de preferência, consiste em 4 atê 12, es pecialmente, 4 atê 8 tripletos.
Já se tentou obter proteínas de fusão com uma curta parte do lastro. Assim, foi obtida, por exemplo, uma fusão de genes, que codifica uma proteína de fusão dos primeiros 10 aminoãcidos da beta-galactosidase e somatostatina. Verificou-se, porém, que este fragmento de beta-galactosidase curto não ê sufi ciente para proteger a proteína de fusão contra a desagregação pelas proteases próprias do hospedeiro (Patente de Invenção Norte-Americana US-A 4 366 246, coluna 15, parágrafo 2). Correspondentemente foram descritas, nas Patentes de Invenção Europeias EP-A 0 290 005 e 0 292 763, proteínas de fusão, cuja parte de lastro consiste num fragmento de beta-galactosidase com mais do que 250 aminoácidos.
Inesperadamente, porém, proteínas de fusão dos cerca de 10 primeiros aminoácidos da extremidade de amino de ten damistato e uma proteína pretendida, por exemplo, uma prõ-insuli na, são estáveis em células hospedeiras de estreptomicetas e são segregadas para dentro do meio de cultura, do qual podem ser obtidas com elevados rendimentos. Surpreendentemente, isto é também válido para proteínas relativamente pequenas tais como mini -pró-insulinas.
A expressão cerca de 10 aminoácidos, tal como ê empregada pretende significar na presente meõria descritiva que também são adequados menos aminoácidos, por exemplo, os 7 primeiros aminoácidos da extremidade do tendamistato mas de preferência não sãõ mais do que 10. Proteínas de fusão, em cuja par te de tendamistato se encontra prolina na posição 7 e/ou 9 (tal como na sequência natural) são as preferidas.
No entanto, naturalmente, também ê possível, de acordo com as formas de realização jã conhecidas ou sugeridas escolher uma maior parte de lastro de tendamistato, diminuindo naturalmente mais e mais a vantagem do reduzido lastro.
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RiWnju tj.nuwi’
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É possível, e atê mesmo vantajoso, variar a sequência natural de aminoácidos da parte de tendamistato, isto ê, trocar, suprimir ou introduzir aminoácidos que não aparecem na sequência natural de aminoácidos. Além disso, é possível variar a sequência de aminoácidos no peptido de sinalização.
As construções de fusão espeeialmente vantajosas podem ser facilmente determinadas por simples ensaios prévios com o conhecimento da ideia em que se baseia a invenção.
Além disso, ê possível realizar a ideia de base da invenção em outras células de bactérias gram-positivas, por exemplo, em células de bacilos ou estafilicocos, com a utili zação de sequências de sinalização que são reconhecidas por estes hospedeiros.
As proteínas de fusão, obtidas de acordo com a presente invenção, encontram-se presentes no meio sob a forma dissolvida, o que proporciona muitas vantagens na continuação do processamento e da purificação. Desta forma, pode-se realizar, por exemplo, uma continuação do processamento por via enzimãtica com eliminação da parte de lastro directamente com o produto de secreção, sem ter de se realizar operações de processamento como ê necessário no caso de proteínas de fusão insolúveis. Também se pode realizar, antes da continuação do processamento, inicialmen te uma concentração ou uma purificação, por exemplo, por meio de cromatografia de afinidade, mas também uma ultrafiltração, preci pitação, cromatografia de permuta de iões, cromatografia de adsorção, filtração através de gel ou cromatografia uma fase líqui da sob alta pressão.
Nos exemplos seguintes a invenção ê esclarecida, mais pormenorizadamente.
Q material de partida para as construções do plasmídeo ê o plasmídeo pKK500, que foi sugerido na Patente de Invenção Europeia EP-A 0 367 163. Este plasmídeo distingue-se do plasmídeo pKK400 conhecido por meio da Patente de Invenção Europeia EP-A 0 289 936 pela substituição do gene de prõ-insulina por um gene análogo, que em vez da cadeia de carbono somente eodifica o aminoácido lisina, assim como pela introdução de uma se quência terminadora em seguida a este gene de mini-prõ-insulina,
As Tabelas 1 e 2 da Patente de Invenção Europeia EP-A 0 367 163, nas quais estã reproduzido o gene de miniprô-insulina ou a sequência terminadora, estão incluídas em ane xo como suplemento da presente memória descritiva.
Os plasmídeos pKK400 e pKK500 contêm na sequen cia de sinalização do gene inibidor de alfa-amilase um sítio de corte XmalII (na região dos tripletos -5 atê -7).
Exemplo 1 plasmídeo pKK500 ê aberto com as enzimas de restrição EcoRI e XmalII e o fragmento grande ê separado em um gel de agarose a 0,8¾ por meio de electroforese em gel e isolado por electro-eluição. Este fragmento ê ligado com o fragmento de DNA (1) (SEQ ID NO: 1) sintetizado pelo processo de fosforoamidi ta:
Ala Gly Pro Ala Ser Ala
5' G GCC GGG CCG GCC TCC GCC
3' CCC GGC CGG AGG CGG
(XmalII)
Asp Thr Thr Vai Ser Glu Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCG 3'
CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A 5'
(ECORI) e a mistura de ligação é transformada em E. coli. Obtêm-se o plasmídeo pKK510. Este codifica uma prê-prõ-insulina, na qual à sequência de sinalização do tendamistato se seguem os primeiros 7 aminoácidos de tendamistato e, em seguida, a cadeia de mini-pró-insulina.
Exemplo 2
Analogamente ao processo descrito na Patente de iNvenção Europeia EP-A 0 289 936 para a transformação do pias mídeo pKK400 no plasmídeo de expressão pGFl, o plasmídeo pKK510 é transformado no plasmídeo de expressão pKFl.
O ADN do plasmídeo de pKK510 isolado ê cortado com as enzimas de restrição Sphl e Sstl e o pequeno fragmento st*
2SSSSB8® ,·Χ'
com ο gene de fusão õ isolado. 0 plasmídeo de expressão pIJ 702 usual no comercio (que pode ser obtido em John Innes Foundation, Norwich, Inglaterra) ê cortado com as mesmas enzimas e o fragmen to grande é isolado. Estes dois fragmentos isolados são ligados, a mistura de ligação ê transformada em S.lividans tK24 e a partir dos transformantes resistentes a tiostreptona, brancos (isto ê, que não são capazes de formação de melanina) é isolado o pla£ mídeo. Clones, que trazem o inserto incorporado, são examinados em cultura em sacudidor.
A expressão da proteína de fusão codificada ê realizada de maneira em si conhecida. Incuba-se a estirpe transformada durante 4 dias a 259C em balão sacudido e separa-se o mi célio da solução de cultura por meio de centrifugação; pode-se tornar visível a proteína de fusão, formada no sobrénadanté da cultura, apôs electroforese de filtrado de cultura 20 pm em um gel de poliacrilamida a 15%, por coloração com 'Azul COOMASSIE como bandas de proteína adicionais, que não ocorre em um ensaio de controlo, no qual a estirpe somente foi transformada com pIJ 702.
Trata-se o filtrado da cultura com endoproteinase de lisilo; pode assim evidenciar-se a presença de Des-(B30) -Thr-Insulina por electroforese em gel que ê verificado por um controlo autêntico.
Alem disso, pode-se demonstrar a presença de proteína de fusão no filtrado de cultura com anti-corpos de insu lina òu por meio da mancha de imunidade ou de ensaio de rádio-imunidade (.R/A) de insulina.
Exemplo 3
Procede-se de acordo com os Exemplo 1 e 2, mas usando o fragmento sintético (2) com a SEQ
SEQ ID NO:2 -5 ala Gly Pro Ala Ser Ala 5' G GCC GGG CCG GCC TCC GCC 3’ ' CCC GGC CGG AGG CGG (XmalII)
Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG 3'
CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CTG GGC TTA A 5'
(EcoRI)
Obtêm-se os plasmídeos pKK320 ou pKF2.
Estes plasmídeos codificam uma proteína de fusão, que se distingue da proteína de acordo com os Exemplos 1 e 2 e pelo facto de, aos primeiros 7 aminoácidos do tendamistato, se seguir asparagina (em vez do aminoãcido natural alanina) e, em seguida, o nono aminoãcido do tendamistato, prolina. Pela troca de alanina por aspargina ê, portanto, introduzida uma carga posi tiva adicional na parte de lastro da proteína de fusão. Surpreendentemente obtêm-se rendimentos aproximadamente 20 atê 30% mais elevados do que de acordo com o Exemplo 2.
Exemplo 4
Procede-se de acordo com o Exemplo 1 e 2, mas usando o fragmento sintético (3) com a SEQ ID NO:3
Ala Gly Pro Ala Ser Ala
5' G GCC GGG CCG GCC TCC GCC
3’ CCC GGC CGG AGG CGG (Xmaiii)
Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Ala Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCG 3’
CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CGT GGC TTA A 5'
Obtêm-se os plasmídeos pKK330 ou pKF3. Estes plasmídeos distinguem-se dos plasmídeos dos Exemplos 1 e 2 pelo facto de codificarem os primeiros 9 aminoácidos naturais do tendamistato. Em comparação com o Exemplo 2, são obtidos rendimentos aproximadamente 10% mais elevados.
Exemplo 5
A proteína de fusão codificada por pKK500 contêm entre a parte de tendamistato e a cadeia B da prô-insulina uma sequência de ligação que codifica os aminoãcidos Asn-Ser-Asn -Gly-Lys. A substituição deste grupo de Lys terminal e de Lys que representa a cadeia de C por Arg e realizada como descrito
a seguir. Neste caso, ê utilizado o sítio de corte Styl no domínio de codões B30 a Al na sequência de pró-insulina.
ADN de plasmideo isolado de pKK500 ê cortado com Styl, digerido com SI nuclease para a eliminação das extremidades salientes e a nuclease em excesso ê extraída com fenol-clorofórmio. 0 plasmideo linearizado é cortado, em seguida, pos teriormente com EcoRl, o fragmento grande ê separado electrofore tieamente e isolado por electroeluição. Este fragmento ê ligado com o fragmento sintético (4) (SEQ ID NO:4)
Bl 10
Asn Ser Asn Gly Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His
AAT TCG AAC GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
GC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
(EcoRl)
20
Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC
GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
B30 C (B31)
Tyr Thr Pro Lys Thr Arg
TAC ACC CCC AAG ACC CGC
ATG TGG GGG TTC TGG GCG
e a mistura de ligação ê transformada em E. coli. Os clones pretendidos são ensaiados por meio de análise de restrição do plasmídeo contido, sendo utilizado o sítio de corte de SstII recêm-formado. Alem disso, o fragmento de Sphl-SstI completo ê sequen ciado.
Para a expressão da proteína de fusão codifica da, o fragmento ensaiado por análise de sequência ê ligado com o vector pIJ 702 cortado com as mesmas enzimas, obtendo-se o vector de expressão pGF4.
A demonstração da presença da proteína de fusão codificada por pGF4 e segregada pode ser realizada, por um lado, por meio do ensaio com a placa de inibidor de alfa-amilase (Patente de Invenção Europeia EP A 0 161 629, Exemplo 3) e, por outro lado, do sobrenadante da cultura por sacudimento analogamente ao Exemplo 2.
- 8 ^2
ί
Exemplo 6
Inserindo analogamente ao Exemplo 5 o fragmento (4) nos vectores pKK510, 520 e 530, obtêm-se os vectores pKK 610, 620 e 630. A inclusão dos respectivos fragmentos Sphl-SstI com a sequência que codifica as proteínas de fusão no vector pIJ 702 fornece aos vectores de expressão pKFll, 12 e 13. A expressão das proteínas de fusão segregadas ê examinada de acordo com o Exemplo 2.
Exemplo 7
Para o aumento da expressão de derivados do plasmídeo pIJ 702, elimina-se deste o promotor de melanina por meio de digestão com Pstl e Sphl e substitui-se pelo fragmento Sintético (5) (SEQ ID NO:5)
Pstl Bell
20 30 40 50
CTGCAGTGATCAGGGGGACeCTTGTGCGAATTTCCGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGG GACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC
Sphl
ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGC
TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG
Desta forma, obtêm-se uma construção em Tandem do promotor sintê tico e de tendamistato. 0 plasmídeo recebe a designação de pGRllO
Se em pGRllO são inseridos, após o corte com Sphl e SstI, os fragmentos sintéticos (1), (2) e (3), então resultam os vectores de expressão pGR200, 210 e 220. Analogamente obtêm-se, com o fragmento (4), os vectores de expressão pGR250, 260 e 270.
Exemplo 8
Se se pretende obter insulina humana, a partir dos percursores de insulina, pela combinação de tripsina ou uma enzima, com o mesmo efeito e carboxipeptidase B, ê vanlajoso elimi nar por dissociação, no decorrer da reacção de dissociação, rapidamente a parte de lastro da extremidade de amino a fim de favorecer a reacção de dissociação em direcção a B31 (Arg)-insuli9
na. Neste caso, ê usada uma modificação dos aminoácidos antes do aminoácido Bl (Phe).
Procede-se de acordo com o Exemplo 1 e abre-se o plasmídeo pKK 500 com as enzimas de restrição EcoRI e DralII.
fragmento original e então substituido pelo fragmento de DNA (6) (SEQ ID NO:6) sintetizado pelo processo de fosfoamidito
Asn Ser Ala Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu
5' AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC
3' GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
(EcoRI) (DralII)
A clonagem em E. coli e expressão em Streptomy ces lividans realizam-se de acordo com o Exemplo 1 ou com o Exem pio 2. Resultam o plasmídeo pKK640 ou o plasmídeo de expressão PKF14.
É também possível proceder-se analogamente com o plasmídeo, que ê obtido de acordo com o Exemplo 5 (após inserção do fragmento (4)). Qbtêm-se assim os plasmídeos pKK650 ou PKF15.
Suplemento (do EP-A 0 367 163): Tabela 1
B 10
ASN SER ASN GLY LYS PHE VAL ASN GLN HIS LEU CYS GLY SER HIS
AAT TCG AAC GGC AAG TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
(EcoRI)
20 30
LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE PHE
CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC 6GC TTC TTC
GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
C A1 40
TYR THR PRO LYS THR LYS GLY ILE VAL GLU GLN CYS CYS THR SER
TAC ACC CCC AAG ACC AAG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC
ATG TGG GGG TTC TGG TTC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG
ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STP
ATC TCG TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA
TAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT
GTC GAC CTG CAG CCA
CAG CTG GAC GTC GGT TCG A
Sall (HindlII)
Tabela 2
5' -CGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACG TGGATC
GCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTTCGGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTG CACCTAG-5’

Claims (1)

  1. Processo para a preparação de proteínas de fusão de tendamistató em estreptomieetas, caracterizado por se acoplar o gene dessa estrutura da proteína pretendida aos codões da sequência de sinalização e aproximadamente os dez primeiros aminoácidos aminoterminais de tendamistató, se introduzir e se levar esta estrutura genética a ser expressa em células hospedei ras de estreptomieetas e do sobrenadante se isolar a proteína de fusão nelas segregada, podendo as sequências do gene de tendamis tato ser modificadas.
    - 2a Processo para a obtenção de uma estrutura genética, caracterizado por se acoplar a sequência de sinalização e os aproximadamente dez primeiros codões para tendamistató ao gene estrutural para uma outra proteína.
    - 3a Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de, na fracção de tendamistato, terem sido suprimidos, trocados ou adicionados codões para aminoãcidos.
    - 4a Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo facto de, entre o gene de tendamistato e o gene estrutural para a proteína pretendida, ser inserida uma sequência ligadora.
    - 5a Proeesso para a obtenção de um vector híbrido, caracterizado por se introduzir uma estrutura genética de acordo com as reivindicações 2, 3 ou 4 em um vector de estreptomicetas.
    - 6a Processo para a transformação de uma célula de estreptomicetas, caracterizado por, nesta célula, se introduzir um vector de acordo com a reivindicação 5.
    A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 21 de Abril de 1990, sob ο N9 P 40 12 818.0.
    Lisboa, 19 de Abril de 1991,
PT97427A 1990-04-21 1991-04-19 Processo para a preparacao de proteinas de fusao de tendamistato em estreptomicetas PT97427B (pt)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100188800B1 (ko) * 1990-09-05 1999-06-01 이센브룩, 라피세 프리프로인슐린을 인슐린으로 전환시키기 위한 효소적 방법
DK0600372T3 (da) 1992-12-02 1997-08-11 Hoechst Ag Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer.
EP0622376B1 (de) * 1993-04-27 2001-08-08 Hoechst Aktiengesellschaft Amorphe monosphärische Formen von Insulinderivaten
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
CN1061375C (zh) * 1996-07-19 2001-01-31 中国科学院上海生物工程研究中心 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白
ES2218622T3 (es) 1996-07-26 2004-11-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada.
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
CN1298742C (zh) * 2003-06-03 2007-02-07 上海新药研究开发中心 一种适合于高效表达的融合蛋白及其生产方法
RU2395296C1 (ru) * 2009-02-19 2010-07-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" Способ получения препарата проинсулина для перорального применения
CN104818291A (zh) * 2015-05-08 2015-08-05 江南大学 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
DE3418274A1 (de) 1984-05-17 1985-11-21 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten
DE3707150A1 (de) * 1987-03-06 1988-09-15 Hoechst Ag Tendamistat-derivate
DE3714866A1 (de) * 1987-05-05 1988-11-24 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten
DE3715033A1 (de) 1987-05-06 1988-11-17 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung von fusionsproteinen
DE3716722A1 (de) 1987-05-19 1988-12-01 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen
DE3843713A1 (de) * 1988-04-25 1989-11-02 Henkel Kgaa Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung
ES2081826T3 (es) * 1988-11-03 1996-03-16 Hoechst Ag Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos.

Also Published As

Publication number Publication date
KR0168669B1 (ko) 1999-01-15
JP3319605B2 (ja) 2002-09-03
NZ237882A (en) 1993-12-23
LTIP1523A (en) 1995-06-26
TW213487B (pt) 1993-09-21
FI911882A0 (fi) 1991-04-18
LT3686B (en) 1996-01-25
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AU630287B2 (en) 1992-10-22
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HU911302D0 (en) 1991-10-28
HU210358B (en) 1995-04-28
NO911557D0 (no) 1991-04-19
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CZ110191A3 (en) 1993-08-11
GR3021040T3 (en) 1996-12-31
LV10494A (lv) 1995-02-20
DE4012818A1 (de) 1991-10-24
YU69691A (sh) 1995-12-04
DK0453969T3 (pt) 1997-02-10
RU2055892C1 (ru) 1996-03-10
YU48435B (sh) 1998-07-10
CA2040810A1 (en) 1991-10-22
HRP940770A2 (en) 1997-06-30
EP0453969B1 (de) 1996-09-04
ZA912937B (en) 1991-12-24
SK110191A3 (en) 1995-07-11
IE911322A1 (en) 1991-10-23
FI911882A (fi) 1991-10-22
CA2040810C (en) 2001-07-24
PL169178B1 (pl) 1996-06-28
BR9101587A (pt) 1991-12-10
KR910018551A (ko) 1991-11-30
LV10494B (en) 1996-02-20
IL97903A0 (en) 1992-06-21
PL289953A1 (en) 1991-11-04
EP0453969A1 (de) 1991-10-30
JPH04228086A (ja) 1992-08-18
DE59108128D1 (de) 1996-10-10
ATE142263T1 (de) 1996-09-15
AU7515491A (en) 1991-10-24
ES2093043T3 (es) 1996-12-16
PL169596B1 (pl) 1996-08-30
PT97427A (pt) 1992-01-31
HUT57268A (en) 1991-11-28
CN1049248C (zh) 2000-02-09

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