SK110191A3 - Method of production of foreign proteins in streptomycets - Google Patents
Method of production of foreign proteins in streptomycets Download PDFInfo
- Publication number
- SK110191A3 SK110191A3 SK1101-91A SK110191A SK110191A3 SK 110191 A3 SK110191 A3 SK 110191A3 SK 110191 A SK110191 A SK 110191A SK 110191 A3 SK110191 A3 SK 110191A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- gene
- tendamistate
- protein
- amino acids
- fusion protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Description
Zpusob výroby cizích proteinu ve streptomycetách
Oblasť techniky
Z evropské patentové prihlášky s číslem zverejnení ( EP-A) 0 289 936 je známo, že se fúzní proteiny vyrobí tak, že se štruktúrni gen pro požadovaný protein kopuluje na 3'-konec kódujícího ŕetézce poprípade modifikovaného tendamistát-genu, tato génová štruktúra se pŕivede v hostiteľské buňce baktérií streptomyces k expresi a sekretovavý fúzní protein se izoluje z média.. Pri výhodné forme provedení se tendamistát-gen na 3'-konci zkrátí. Pro zkrácení se používaj í štépná místa pro reštrikční enzymy BstEII v oblasti tripletu 31 a 32, Stul v oblasti tripletu 43 a 44, jakož i Sau3A v oblasti tripletu 52 a 53.
Pri dalším vývoji této vynálezecké myšlenky bylo již navrženo, vyrobiť fúzní protein, ve kterém po podílu tendamistátu následuje zkrácený proinsulin, jehož C-ŕetézec sestává pouze z jednoho nebo dvou lysinových zbytku ( miniproinsulin) . Jako další pokračování vývoje bylo navrhováno, aby se v takovýchto fúzních proteinech zkrátil i podíl tendamistátu (evropská prihláška EP-A 0 367 163 zverejnená 9. 5. 1990) .
Nyní bylo s prekvapením zjišténo, že fúzní proteiny s velmi krátkým podílem tendamistátu jsou v buňce streptomycet stálé a vyplavuj! se do média. Takto získané fúzní proteiny se chovaj í v dúsledku velmi krátkeho ŕetézce tendamistatu jako zralé proteiny a existuj í všeobecné v médiu ve správne terciární štruktúre.
Z EP-A O 177 827 je známá syntetická signálni sekvence pro prenos proteínu do expresních systému, která je charakteristická tím, že DNA odpovídá v podstate pŕirozené signálni sekvenci, avšak vykazuje jedno nebo více stepných míst pro endonukleázy, která nejsou v pŕirozené DNA obsažena. Když se kopuluje gen pro proteín, který se má pŕenést, na takovou sekvenci DNA, zabuduje se tento fúzní gen do vektoru a tím transformuje hostiteľskou bunku, která transportuje exprimovaný protein z cytoplasmy, mohou se v prokaryotických a eukaryotických buňkách vyrobiť prokaryotické nebo virální proteiny. Na príkladu periplasmatického proteínu alkalické fosfatáty se ukazuje, že pŕí expresi v E. coli je výhodné, když se v návaznosti na pre-sekvenci dosadí kodony pro asi prvních 40 aminokyselín alkalické fosfatázy pred štruktúrni gen pro požadovaný protein. V mnohá pŕípadech však postačí také méné prídavných aminokyselín, napríklad asi 10, s výhodou asi 5. Odpovídající fúzní protein s opičím proiusulinem byl transportován asi z 90 % do periplasmatického prostoru.
Bylo již také navrhováno (WO 91/03 550 z 21. 3. 1991) vyrábét fúzní proteiny tak, že se konštruuje smésný oligonukleotid, který kóduje balastní podíl fúzního protein, tento oligonukleotid se vnese do vektoru tak, že je funkčné kopulován na regulační región a štruktúrni gen pro požadovaný protein, s takto získanou populací plasmidu se transformuj! vhodné hostitelské buňky a ty klony, které vykazuj í vysoký výtéžek fúzního proteínu, se selektuj í.
Oligonukleotid sestává pri tom s výhodou ze 4 až 12, zejména pak 4 až 8 tripletú.
Zkoušelo se rovnéž vyrobit fúzní proteiny s krátkym balastním podílem. Tak byla napríklad vyrobená génová fúze, která kóduje fúzní protein z prvních 10 aminokyselín β-galaktosidázy a somatostatinu. Ukázalo se však, že tento krátký fragment β-galaktosidázy nepostačí k tomu, aby chránil fúzní protein pred odbouráváním proteázami, vlastními hostiteli (US 4 366 246, 15, odstavec 2). V souladu s tím byly v EP-A 0 290 005 a 0 292 763 popsány fúzní proteiny, jejichž balastní podíl sestává z fragmentu β-galaktosidázy s více než 250 aminokyselinami.
Podstata vynálezu
Neočekávané bylo nyní zjišténo, že fúzní proteiny, sestávající z asi prvních 10 aminoterminálních aminokyselín tendamistátu a požadovaného proteínu, napríklad proinsulinu, jsou v hostitelských bunkách streptomycet stabilní a jsou sekretovány do média, ze kterého se mohou získat ve vysokých výtéžcích. Je prekvapující, že to platí i pro relativné malé proteiny jako jsou mini-proinsuliny.
Asi 10 aminokyselín pri tom znamená, že v úvahu pŕichází i méné aminokyselín, napríklad prvních 7 N-terminálních aminokyselín tendamistátu, ale s výhodou ne více než
10. Výhodné jsou fúzní proteiny, v jejichž podílu tendamistátu je v poloze 7 a/nebo 9 prolin (jako v prírodní sekvenci).
Samozrejmé je ale také možné, zvolit v souladu s již známymi nebo navrženými formami provedení vétší balastní podíl tendamistátu, pŕičemž se ale pŕirozené stále více a více ztrácí výhoda malého balastu.
Je možné a dokonce výhodné, když se pŕirozený sled aminokyselín podílu tendamistatu mení, tedy, když se aminokyseliny vymení, vypustí nebo se nezavedou tak jak se v pŕirozeném sledu aminokyseliny vyskytuj í. Dále je možné ménit sled aminokyselín v signálním peptidu.
Obvzlášté výhodné fúzní konstrukce se mohou snadno zjistit na základe vynálezecké myšlenky jednoduchými predbežnými pokusy.
Dále je také možné uskutečnit vynálezeckou myšlenku i v j iných grampozitivních bakteriálních buňkách, napríklad v buňkách bacillú nebo stafylokokú, za použití signálních sekvencí, které tito hostitelé rozeznají.
Fúzní proteiny, získané podie vynálezu, se vyskytuj! v médiu v rozpušténé forme, což poskytuje radu výhod pri dalším zpracování a čistení. Tak se muže provádét napríklad další enzymatické zpracování za odštépení balastního podílu bezprostredné s produktem sekrece, aniž by bylo nutné provádét postupy zpracování, které jsou nezbytné u nerozpustných fúzních proteinú. Je také možné provést pred dalším zpracováním nejdŕíve zakoncentrování nebo čistení, napríklad pomoci afinitní chromatografie, ale také ultrafiltraci, srážením, iontoméničovou chromatografii, adsorpční chromatograf ií, gelovou filtraci nebo vysokotlakou kapalinovou chromatograf ii.
Príklady provedení vynálezu
Vynález je blíže vysvétlen v nálsedujících pŕíkladech.
Výchozím materiálem pro plasmidové konstrukce je plasmid pKK500, který byl navržen v EP-A 0 367 163. Tento plasmid se liší od plasmidu pKK400, známého z EP-A 0 289 936, náhradou génu proinsulinu analogickým genem, který kóduje namísto uhlíkatého ŕetézce pouze aminokyselinu lysín, jakož i zavedením terminátotové sekvence, pripojující se k tomuto génu mini-proinsulinu . V následující tabulce 1 a 2 je znázornén gen mini-proinsulinu a sekvence terminátoru.
Tabulka 1
B1 10
ASN | SER | ASN | GLI | LIS | PHE | VAL | ASN | GLN | HIS | LEU | CIS | GLI | SER | HIS |
AAT | TCG | AAC | GGC | AAG | TTC | GTC | AAC | CAG | CAC | CTG | TGC | GGC | TCG | CAC |
GC | TTG | CCG | TTC | AAG | CAG | TTG | GTC | GTG | GAC | ACG | CCG | AGC | GTG | |
(EcoRI) | ||||||||||||||
20 | 30 | |||||||||||||
LEU | VAL | GLU | ALA | LEU | TIR | LEU | VAL | CIS | GLI | GLU | ARG | GLI | PHE | PHE |
CTC | GTG | GAG | GCC | CTC | TAC | CTG | GTG | TGC | GGG | GAG | CGC | GGC | TTC | TTC |
GAG | CAC | CTC | CGG | GAG | ATG | GAC | CAC | ACG | CCC | CTC | GCG | CCG | AAG | AAG |
C | A1 | 40 | ||||||||||||
TIR | THR | PRO | LYS | THR | LYS | GLY | ILE | VAL | GLU | GLN | CYS | CYS | THR | SER |
TAC | ACC | CCC | AAG | ACC | AAG | GGC | ATC | GTG | GAG | CAG | TGC | TGT | ACG | TCC |
ATG | TGG | GGG | TTC | TGG | TTC | CCG | TAG | CAC | CTC | GTC | ACG | ACA | TGC | AGG |
ILE | CYS | SER | LEU | TYR | GLN | LEU | GLU | ASN | TYR | CYS | ASN | STP | STP |
ATC | TGC | TCC | CTC | TAC | CAG | CTC | GAG | AAC | TAC | TGC | AAC | TAG | TAA |
TAG | ACG | AGG | GAG | ATG | GTC | GGA | CTC | TTG | ATG | ACG | TTG | ATC | ATT |
GTC | GAC | CTG | CAG | CCA |
CAG | CTG | GAC | GTC | GGT TCG A |
Sali (HindlII)
T a b u 1 k a 2
5'-OGATTAAACOGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGGA
GCTATTTGGCTATGTTAATTTCOGAGAAAACCTCGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTGCACCTAG-51
Plasmidy pKK400 a pKK500 obsahuj! v signálni sekvenci génu inhibitoru α-amylázy stepné místo XmalII (v oblasti tripletu -5 až -7).
Príklad 1
Plasmid pKK500 se otevŕe restrikčními enzymy EcoRI a XmalII a oddelí se velký fragment na 0.8% agarosovém gélu gelovou elektroforézou a izoluje se elektroelucí. Tento fragment se liguje fragmentem DNA (1) (SEQ ID NO :1) syntetizovaným fosforamiditovou metodou
-5 -1
Ala | Gly | Pro | Ala | Ser | Ala | |
5 'G | GCG | GGG | CCG | GCC | TCC | GCC |
3 ' | CCC | GGC | CGG | AGG | CGG |
(XmalII)
Asp | Thr | Thr | Val | Ser | Glu | Pro | |
GAC | ACG | ACC | GTC | TCC | GAG | CCG | 3 |
GTG | TGC | TGG | CAG | AGG | CTC | GGC TTA A | 5 |
(EcoRI) a ligační smés se transformuje v E. coli. Získa se plasmid pKK510. Tento kóduje preproinsulin, ve kterém na signálni sekvenci tendamistátu následuje prvnich 7 aminokyselín tendamistátu a potom ŕetézec mini-proinsulinu.
Príklad 2
Analogicky jako u zpúsobu prevedení plasmidu pHH400 na expresní plasmid pGFl, který je popsán v EP-A 0 289 936, se plasmid pKK510 pŕevede v expresní plasmid pKFl :
Izolovaná DNA plasmidu pKK510 se štepí restrikčními enzymy SpHI a SstI a izoluje se malý fragment s fúzním genem. Na trhu obvyklý expresní plasmid pIJ 702 /získatelný u firmy John Innes Foundation, Norwich, Anglie / se štepí stejnými enzymy a izoluje se velký fragment. Tyto oba isolované fragmenty se ligují, ligační smés se transformuje v S. lividans TK24 a z thiostrepton-resistentních bílých transformantu (to znamená neschopných tvoŕit melanin), se izoluje plasmid. Klony, které nesou vloženou informaci, se zkouší v tŕepané kultuŕe, zda jsou schopný tvoŕit fúzní proteíny.
Exprese kódovaného fúzního proteinu se provádí o sobé známym zpúsobem: transformovaný kmeň se inkubuje 4 dny pri teplote prevyšující 25 °C v tŕepací baňce a mycelium se oddelí odstŕedéním od kultivačního roztoku. Vytvorený fúzní pŕotein se muže v kultivačním médiu zviditelnit po elektroforéze 20 μιη filtrátu kultury v 15% polyakrylamidovém gélu obarvením ^COOMASSIE-modŕí jako prídavný pás proteinu, který se pri kontrolním pokusu neobjeví, na který byl kmeň pouze transformován pomoci pIJ 702.
Jestliže se filtrát kultury zpracovává lysylendoproteinázou, tak se muže prokázat gelovou elektroforézou Des-(B30)-Thr-insulin, který se verifikuje autentickou kontrolou.
Dále se muže fúzní protein ve filtrátu kultury prokázat protilátkami insulinu bučí v testu Immuno-Blot nebo insulin-RIA.
Príklad 3
Postupuje se jako v príkladu 1 a 2, použije se ale syntetický fragment/2/ se SEQ ID NO: 2.
-5 -1
Ala | Gly | Pro | Ala | Ser | Ala | |
5'G | CCG | GGG | CCG | GCC | TCC | GCC |
3 ' | CCC | GGC | CGG | AGG | CGG |
/XmalII/
Asp | Thr | Thr | Val | 5 Ser | Glu | Pro | Asp | Pro | |
GAC | ACG | ACC | GTC | TCC | GAG | CCC | GAC | CCG | 3 ' |
CTG | TGC | TGG | CAG | AGG | CTC | GGG | CTG | GGC TTA A | 5' |
/EcoRI/ a získaj í se tak plasnidy pKK320 poprípade pKF2.
Tyto plasmidy kóduj í fúzní protein, který se liší od proteinu podie príkladu 1 a 2 tím, že po prvních 7 aminokyselinách tendamistátu následuje asparagin (místo pŕirozené aminokyseliny alaninu) a potom devátá aminokyselina v tendamistátu, prolin. Výménou alaninu za asparagin se tedy zavede do balastního podílu fúzního proteinu dodatečný kladný náboj. Pŕikvapivé se získají asi o 20 až 30% vyšší výtéžky než podie príkladu 2.
Príklad 4
Postupuje se podie príkladu 1 a 2, ale použije se syntetický fragment /3/ se SEQ ID NO :3
-5 -1
Ala | Gly | Pro | Ala | Ser | Ala | |
5 'G | GCC | GGG | CCG | GCC | TCC | GCC |
3 ' | CCC | GGG | CGG | AGG | CGG |
/XmalII/
Asp | Thr | Thr | Val | Ser | Glu | Pro | Ala | Pro | |
GAC | ACG | ACC | GTC | TCC | GAG | CCC | GCA | CCG | 3 ' |
CTG | TGC | TGG | CAG | AGG | CTC | GGG | CGT | GGC TTA A | 5' |
pŕičemž se získaj í plasmidy pKK330, poprípade pKF3 . Tyto plasmidy se liší od plasmidú podie príkladu 1 a 2 tím, že kóduj í prvních 9 pŕirozených aminokyselín tendamistátu. Ve srovnání s pŕíkladem 2 se získaj í asi o 10 % vyšší výtéžky.
Príklad 5
Fúzní protein, kódovaný pKK500, obsahuje mezi podílem tendamistátu a B-ŕetézcem proinsulinu sekvenci linkeru, která kóduje aminokyseliny Asn-Ser.Asn-Gly-Lys . Náhrada tohoto koncového lysinu a lysinu, predstavujícího uhlíkatý ŕetézec, argininem, se provádí dále popsaným zpúsobem. Pri tom se upotrebí od singulárního štépného místa Styl v oblasi kodonu B30 až A1 v sekvenci proinsulinu.
Izolovaný plasmid DNA, pocházející z pKK500 se štepí pomoci Styl, natráví se pro odstránení presahujících koncú SI nukleázou a pŕebytečné nukleáza se extrahje fenolickým chloroformem. Linearizovaný plasmid se potom dále štepí pomoci EcoRI, velký fragment se oddélí elektroforeticky a izoluje elektroelucí. Tento fragment se liguje se syntetickým fragmentem/4/SEQ ID NO: 4/
BI 10
Asn | Ser | Asn | Gly | Arg | Phe | Val | Asn | Cln | His | Leu | Cys | Gly | Ser | His |
AAT | TCG | AAC | GGC | CGC | TTC | GTC | AAC | CAG | GAC | CTG | TGC | GGC | TCG | CAC |
GC | TTG | CCG | GCG | AAG | CAG | TTG | GTC | GTG | GAC | ACG | GGG | AGC | GTG |
/EcoRI/
- 11 20 30
Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe |
CTC | GTG | GAG | GCC | CTC | TAC | CTG | GTG | TGC | GGG | GAG | CGC | GGC | CTC | TTC |
GAG | CAC | CTC | CGG | GAG | ATG | GAC | CAC | ACG | CCC | CTC | CGC | CCG | AAG | AAG |
B/3C | i C/B31/ |
Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg |
TAC | ACC | CCC | AAG | ACC | CGC |
ATG | TGG | GGG | TTC | TGG | GGG |
a ligační smés se transfromuje v E. coli. Požadované klony se zkouší reštrikční analýzou získaného plasmidu, pŕičemž se upotrebí nové vzniklé štépné místo SstlI. Dále se celý fragment Sphl-SstI sekvencuje.
Pro expresi kódovaného fúzního proteínu se fragment pŕezkoušený sekvenční analýzou liguje ve vektoru pIJ 702, štépeného stejnými enzymy, pŕičemž vznikne expresní vektor pGF4.
Dukaz fúzního proteínu kódovaného pGF4 a sekretovaného se muže provádét jednak deskovým testem pomoci inhibitoru α-amylázy /EP A O 161 629/, príklad 3/ a jednak z média tŕepané kultury analogicky jako v príkladu 2.
Príklad 6
Jestliže se analogicky jako v príkladu 5 zavede fragment /4/ do vektoru pKK510, 520, 530, získaj í se vektory pKK610, 620 a 630. Vestavba takovýchto fragmentu Sphl-SstI se sekvencí kódovanou pro fúzní proteíny do vektoru pIJ 702 poskytne expresní vektory pKFll, 12 a 13.
Exprese sekretovaných fúzních proteinu se pŕezkouší podie príkladu 2.
Príklad 7
Pro zvýšení exprese derivátú plasmidu pIJ 702 se z tohoto natrávením pomoci PstI a Sphl odstráni promotor melaminu a nahradí se syntetickým fragmentem /5/ (SEQ ID NO : 5).
PstI Boli
20 30 40 50
CTGCAGTGATCAGGGGGAGCCTTGTGCGAATTTCČGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGG GACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC
Sphl
70 80
ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGC TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG
Tím vznikne tandemoná konstrukce ze syntetického promotoru a promotoru tendamistátu. Plasmid získá označení pGRUO.
Jestliže se v pGRUO po štepení pomoci Sphl a SstI použij í syntetické fragmenty/1/, /2/ /a /3/, tak rezultují expresní vektory pGR200, 210 a 220. Analogicky se získaj í s fragmentem /4/ expresní vektory pGR250, 260 a 270.
Príklad 8
Jestliže se má z preinsulinú vyrobiť kombinací trypsinu nebo stejné púsobícího enzýmu karboxypeptidázy B humánni insulin, je výhodné, v prúbéhu stepné reakce ryohle odštépit aminoterminální balastní podíl, aby se podporila ve smeru k B31 (Arg)-insulinu. K tomu se nabízí modifikace aminokyselín pred aminokyselinou Bl/Phe/:
Postupuje se podie príkladu 1 a otevŕe se plasmid pKK500 pomoci restrikčních enzmu EcoRI a DrálII. Púvodní fragment se potom nahradí pomoci fragmentu DNA /6/, syntetisovaného fosforamiditovou metodou (SEQ ID NO : 6).
BI
Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu | Cys | Gly | Ser | His | Leu | ||
5' | AAT | TCG | GCC | CGC | TTC | GTC | AAC | CAG | CAC | CTG | TGC | GGC | TCG | CAC | CTC | 3 |
3 ' | GC | CGG | GCG | AAG | CAG | TTG | GTC | GTG | GAC | ACG | CCG | AGC | GTG | 5 |
/EcoRI/ /DralII/
Klonování v E. coli a exprese ve Strptomyces lividans se provádí podie príkladu 1, popŕípadé príkladu 2. Rezultuje plasmid pKK640, poprípade expresní plasmid pKF14.
Analogicky se muže postupovať i s plasmidem, ktrý se získá podie príkladu 5 (po vestavbé fragmentu /4/). Získá se tak plasmid pKK650, popŕípadé pKF15.
Claims (8)
- * 1. Zpúsob výroby fúzních proteinu , vyznačující se t í m , že se štruktúrni gen ’ pro požadovaný protein kopuluje na kodony pro signálni sekvence a asi na prvních deset aminoterminálních aminokyselín tendamistátu, tato génová štruktúra se pŕivede ve streptomycetové hostiteľské buňce k expresi a sekretovaný fúzní protein se isoluje z média, pŕičemž tendamistátové génové sekvence mohou být modifikované.
- 2. Génová štruktúra, obsahujicí signálni sekvenci a asi prvních deset kodonú pro tendamistát a štruktúrni gen pro- j iný protein.*
- 3. Génová štruktúra podie nároku 2 , vyznačující se tím,žesesev podilu tendamistátu odstráni, vymení nebo pridaj í kodony pro aminokyseliny.
- 4. Génová štruktúra podie nároku 2 nebo 3 , vyznačující se tím, že mezi genem tenda “ mistátu a strukturním genem pro požadovaný protein je uspoŕádána sekvence linkeru.
- 5. Vektor, obsahující génovou strukturu podie nároku 2 , 3 nebo 4 .
- 6. Streptomycetová bunka, obsahující vektor podie nároku 5 .
- 7. Fúzní protein s podílem N-terminálních asi prvních deseti aminokyselín tendamistátu kopulovaným, poprípade preš mustkovou sekvenci, na požadovaný protein.
- „ 8. Použití fúzního proteinu podie nároku 7 , poprípade fúzního proteinu získatelného podie nároku 1 , pro výrobu * požadovaného proteinu.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4012818A DE4012818A1 (de) | 1990-04-21 | 1990-04-21 | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK110191A3 true SK110191A3 (en) | 1995-07-11 |
Family
ID=6404857
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1101-91A SK110191A3 (en) | 1990-04-21 | 1991-04-18 | Method of production of foreign proteins in streptomycets |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0453969B1 (sk) |
JP (1) | JP3319605B2 (sk) |
KR (1) | KR0168669B1 (sk) |
CN (1) | CN1049248C (sk) |
AT (1) | ATE142263T1 (sk) |
AU (1) | AU630287B2 (sk) |
BR (1) | BR9101587A (sk) |
CA (1) | CA2040810C (sk) |
CZ (1) | CZ285440B6 (sk) |
DE (2) | DE4012818A1 (sk) |
DK (1) | DK0453969T3 (sk) |
ES (1) | ES2093043T3 (sk) |
FI (1) | FI911882A (sk) |
GR (1) | GR3021040T3 (sk) |
HR (1) | HRP940770A2 (sk) |
HU (1) | HU210358B (sk) |
IE (1) | IE911322A1 (sk) |
IL (1) | IL97903A0 (sk) |
LT (1) | LT3686B (sk) |
LV (1) | LV10494B (sk) |
NO (1) | NO911557L (sk) |
NZ (1) | NZ237882A (sk) |
PL (2) | PL169596B1 (sk) |
PT (1) | PT97427B (sk) |
RU (1) | RU2055892C1 (sk) |
SK (1) | SK110191A3 (sk) |
TW (1) | TW213487B (sk) |
YU (1) | YU48435B (sk) |
ZA (1) | ZA912937B (sk) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100188800B1 (ko) * | 1990-09-05 | 1999-06-01 | 이센브룩, 라피세 | 프리프로인슐린을 인슐린으로 전환시키기 위한 효소적 방법 |
DK0600372T3 (da) | 1992-12-02 | 1997-08-11 | Hoechst Ag | Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer. |
EP0622376B1 (de) * | 1993-04-27 | 2001-08-08 | Hoechst Aktiengesellschaft | Amorphe monosphärische Formen von Insulinderivaten |
DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
CN1061375C (zh) * | 1996-07-19 | 2001-01-31 | 中国科学院上海生物工程研究中心 | 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白 |
ES2218622T3 (es) | 1996-07-26 | 2004-11-16 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada. |
DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
CN1298742C (zh) * | 2003-06-03 | 2007-02-07 | 上海新药研究开发中心 | 一种适合于高效表达的融合蛋白及其生产方法 |
RU2395296C1 (ru) * | 2009-02-19 | 2010-07-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" | Способ получения препарата проинсулина для перорального применения |
CN104818291A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-05 | 江南大学 | 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4366246A (en) | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
DE3418274A1 (de) | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
DE3714866A1 (de) * | 1987-05-05 | 1988-11-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
DE3715033A1 (de) | 1987-05-06 | 1988-11-17 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung von fusionsproteinen |
DE3716722A1 (de) | 1987-05-19 | 1988-12-01 | Hoechst Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen |
DE3843713A1 (de) * | 1988-04-25 | 1989-11-02 | Henkel Kgaa | Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung |
ES2081826T3 (es) * | 1988-11-03 | 1996-03-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos. |
-
1990
- 1990-04-21 DE DE4012818A patent/DE4012818A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-04-18 DE DE59108128T patent/DE59108128D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 AT AT91106268T patent/ATE142263T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-18 ES ES91106268T patent/ES2093043T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 YU YU69691A patent/YU48435B/sh unknown
- 1991-04-18 FI FI911882A patent/FI911882A/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-04-18 CZ CS911101A patent/CZ285440B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-04-18 DK DK91106268.5T patent/DK0453969T3/da active
- 1991-04-18 SK SK1101-91A patent/SK110191A3/sk unknown
- 1991-04-18 EP EP91106268A patent/EP0453969B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 NZ NZ237882A patent/NZ237882A/en unknown
- 1991-04-19 IE IE132291A patent/IE911322A1/en unknown
- 1991-04-19 PL PL91309698A patent/PL169596B1/pl unknown
- 1991-04-19 PT PT97427A patent/PT97427B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-04-19 CA CA002040810A patent/CA2040810C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 AU AU75154/91A patent/AU630287B2/en not_active Expired
- 1991-04-19 IL IL97903A patent/IL97903A0/xx unknown
- 1991-04-19 ZA ZA912937A patent/ZA912937B/xx unknown
- 1991-04-19 RU SU914895292A patent/RU2055892C1/ru active
- 1991-04-19 BR BR919101587A patent/BR9101587A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-04-19 NO NO91911557A patent/NO911557L/no unknown
- 1991-04-19 KR KR1019910006250A patent/KR0168669B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-04-19 HU HU911302A patent/HU210358B/hu unknown
- 1991-04-19 PL PL91289953A patent/PL169178B1/pl unknown
- 1991-04-20 JP JP11700691A patent/JP3319605B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-20 CN CN91102541A patent/CN1049248C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-28 TW TW080104141A patent/TW213487B/zh active
-
1993
- 1993-05-04 LV LVP-93-283A patent/LV10494B/xx unknown
- 1993-12-03 LT LTIP1523A patent/LT3686B/lt unknown
-
1994
- 1994-10-25 HR HRP-696/91A patent/HRP940770A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-09-13 GR GR960402399T patent/GR3021040T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5322930A (en) | Expression of recombinant polypeptides with improved purification | |
JP2521413B2 (ja) | シグナル配列をコ―ドしているdnaと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているdna | |
US4963495A (en) | Secretion of heterologous proteins | |
JP3043803B2 (ja) | 融合タンパク質、その調製及び用途 | |
CA1336329C (en) | Fusion proteins, a process for their preparation and their use | |
FI93734B (fi) | Menetelmä eukaryoottisen painolastiosan sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoisia tuotteita | |
US5496924A (en) | Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion | |
JPS63251095A (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
IL110829A (en) | A hybrid toxin that kills insects from Bacillus turgignis and a preparation that contains it | |
JPH10501695A (ja) | イーストにおいて発現されたn末端に伸長した蛋白質 | |
SK110191A3 (en) | Method of production of foreign proteins in streptomycets | |
EP0372005A1 (en) | Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells | |
US5426036A (en) | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes | |
EP0868523A1 (en) | Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell | |
CA1335357C (en) | Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells | |
FI97549C (fi) | Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa | |
CA2002062A1 (en) | Process for the preparation of an insulin precursor in streptomycetes | |
EP0314184B1 (en) | Expression plasmids | |
KR19990009995A (ko) | 신규한 인간성장호르몬방출인자-인간상피세포성장인자 융합유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬방출인자의 제조방법 |