PL169596B1 - Sposób wytwarzania struktury genu PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania struktury genu PL PL

Info

Publication number
PL169596B1
PL169596B1 PL91309698A PL30969891A PL169596B1 PL 169596 B1 PL169596 B1 PL 169596B1 PL 91309698 A PL91309698 A PL 91309698A PL 30969891 A PL30969891 A PL 30969891A PL 169596 B1 PL169596 B1 PL 169596B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
linker
gene
tendamistat
plasmid
ctc
Prior art date
Application number
PL91309698A
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus-Peter Koller
Guenther Rieb
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of PL169596B1 publication Critical patent/PL169596B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania struktury genu, znamienny tym, ze sekwencje sygnalowa i okolo dziesiec pierwszych kodonów sekwencji lacznikowej sprzega sie z genem struktu- ralnym innego bialka. P L 169596 B 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania struktury genu.
Z europejskiego zgłoszenia patentowego opublikowanego pod numerem (EP-A) 0 289 936 wiadomo, że fuzje białkowe wytwarza się w ten sposób, że gen strukturalny pożądanego białka sprzęga się na końcu 3' kodującej nici ewentualnie zmodyfikowanego genu odcinka łącznikowego (Tendamistat-Gen), tę strukturę genową doprowadza się do ekspresji w Streptomyces jako komórce gospodarza i wydzieloną fuzję białkową izoluje się z podłoża. Wyróżnia się sposób, w którym gen odcinka łącznikowego (Tendamistat-Gen) zostaje skrócony na końcu 3'. Celem skrócenia ustala się miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych w zakresie trypletu 31 i 32 dla BstEII, w zakresie trypletu 43 i 44 dla StuI, oraz w zakresie trypletu 52 i 53 dla Sau3A.
Rozwijając dalej koncepcję tego wynalazkujuż zakłada się, aby wytwarzać fuzję białkową, w której po części łącznikowej (Tendamistat-Anteil) następuje skrócona proinsulina, której łańcuch C składa się tylko z jednej lub dwu reszt liztyny (miniproinsulina). Jako dalsze rozwinięcie założono, że w tego rodzaju fuzjach białkowych również część łącznikowa (Tendamistat-Anteil) jest skrócona (zgłoszenie patentowe opublikowane 9.5.1990, EP-A 0 367 163).
Obecnie stwierdzono nieoczekiwanie, że fuzje białkowe z bardzo krótką częścią łącznikową (Tendamistat-Anteil) w komórkach Streptomyces są stabilne i są wyrzucane do podłoża. Tak otrzymane fuzje białkowe, z powodu bardzo krótkiego łańcucha łącznikowego (Tendamistat-Kette), zachowują się jak dojrzałe białka i występują w podłożu ogólnie biorąc we właściwej strukturze trzeciorzędowej.
Sposób wytwarzania struktury genu według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencję sygnałową i około dziesięć pierwszych kodonów sekwencji łącznikowej (Tendamistat) sprzęga się z genem strukturalnym innego białka.
Korzystnie w sekwencji łącznikowej (Tendamistat-Anteil) kodony dla aminokwasów zostają usunięte, wymienione albo dodane. Między gen sekwencji łącznikowej (Tendamistatgen) i gen strukturalny pożądanego białka wprowadza się sekwencję łączącą.
Ze zgłoszenia patentowego EP-A 177 827 znana jest syntetyczna sekwencja sygnałowa dla transportu białek w układach ekspresji, która odznacza się tym, że DNA zasadniczo odpowiada naturalnej sekwencji sygnałowej, ale wykazuje jedno lub więcej miejsc cięcia dla endonukleaz, których nie zawiera naturalny DNA. Jeśli z taką sekwencją DNA sprzęgnie się gen białka, które ma podlegać transportowi, a następnie ten fuzyjny gen wbuduje się do wektora, którym transformuje się komórkę gospodarza i to wytworzone białko transportuje z cytoplazmy, można w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych wytwarzać białka eukariotów, prokariotów i wirusów. Na przykładzie białka periplazmatycznego fosfatazy zasadowej wykazano, że przy ekspresji w E.coli jest korzystne na końcu presekwencji umieścić kodony dla około 40 pierwszych aminokwasów fosfatazy zasadowej, przed genem strukturalnym pożądanego białka. W wielu przypadkach wystarcza jednak mniejsza liczba dodatkowych aminokwasów, na przy169 596 kład około 10, korzystnie około 5. Odpowiednia fuzja białkowa z proinsuliną małpią jest transportowana do około 90% do przestrzeni periplazmatycznej.
Zaproponowano już także (zgłoszenie patentowe US 07/399,874 z 29.8.1989; PCT/US 90/04840 z 28.8.1990), aby wytwarzać fuzje białkowe w ten sposób, że, konstruuje się mieszany oligonukleotyd kodujący część balastową fuzji białkowej, ten oligonukleotyd wprowadza się do wektora tak, że jest on funkcjonalnie sprzężony z regionem regulatorowym i genem · strukturalnym pożądanego białka, przy pomocy tak otrzymanej populacji plazmidów transformuje się odpowiednie komórki gospodarza i selekcjonuje się ich klony o wysokiej wydajności kodowanej fuzji białkowej. Oligonukleotyd składa się przy tym przeważnie z 4 do 12 trypletów, w szczególności 4 do 8.
Zbadano już także wytwarzanie fuzji białkowych z krótką częścią balastową. Na przykład wytworzono fuzję genową kodującą fuzję białkową z 10 pierwszych aminokwasów β-galaktozydazy i samotostatyny. Okazało się jednak, że ten krótki fragment β-galaktozydazy nie wystarczył, aby ochronić fuzję białkową przed rozłożeniem przez proteazy gospodarza (zgłoszenie patentowe US-A 4 366 246, kolumna 15, akapit 2) W związku z tym w zgłoszeniu patentowym EP-A 0 290 005 i 0 292 763 opisano fuzje białkowe, których część balastowa fragmentu β-galaktozydazy zawiera więcej niż 250 aminokwasów.
Nieoczekiwaniejednak, obecnie fuzje białkowe z około 10 pierwszych aminoterminalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat) i pożądanego białka, na przykład proinsuliny, są w komórkach Streptomyces jako gospodarzu stabilne i są wydzielane do podłoża, z którego możnaje otrzymać z wysoką wydajnością. Niespodziewanie dotyczy to także względnie małych białek jak mini-proinsulina.
Około 10 aminokwasów oznacza przy tym, ze wchodzi w grę także mniejsza liczba aminokwasów, na przykład pierwszych 7 N-końcowych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat), ale w szczególności nie więcej niż 10. Szczególnie korzystne są fuzje białkowe, które w swojej części łącznikowej (Tendamistat-Anteil) mają w pozycji 7 i/lub 9 prolinę (jak w sekwencji naturalnej). Oczywiście jest również możliwe, zgodnie z już znanymi lub proponowanymi sposobami wytwarzania, dobrać większą część balastową sekwencji łącznikowej (Tendamistat), przy czym naturalnie traci się korzyść wynikającą z niewielkiego balastu.
Jest możliwe a nawet korzystne zmieniać naturalną kolejność aminokwasów w sekwencji łącznikowej (Tendamistat), także wymieniać i usuwać aminokwasy, albo wprowadzać aminokwasy nie występujące w naturalnej sekwencji. Jest dalej możliwe zmieniać sekwencję aminokwasów w peptydzie sygnałowym.
Szczególnie pomyślne konstrukcje fuzji białkowych można, znając myśl wynalazku, łatwo ustalić w doświadczeniach wstępnych.
Można również zrealizować ideę wynalazku w innych Gram-dodatnich komórkach bakteryjnych, na przykład w komórkach Bacillus lub Straphylococcus, stosując sekwencje sygnałowe, które są rozpoznawane przez tych gospodarzy.
Fuzje białkowe otrzymane według wynalazku występują w podłożu w postaci rozpuszczonej, co daje szereg korzyści przy dalszej obróbce i oczyszczaniu. Tak na przykład dalsza obróbka enzymatyczna z odszczepieniem części balastowej może nastąpić bezpośrednio w stosunku od produktu wydzielania, bez konieczności obróbki wstępnej, jak to ma miejsce w przypadku fuzji białkowych nierozpuszczonych. Przed dalszą obróbką może więc nastąpić zatężenie lub oczyszczanie, na przykład przez chromatografię powinowactwa ale także ultrafiltrację, wytrącenie, chromatografię jonowymienioną, chromatografię adsorpcyjną, sączenie molekularne lub wysokociśnieniową chromatografię cieczową.
W niżej podanych przykładach wynalazek jest objaśniony bliżej.
Materiałem wyjściowym do konstrukcji plazmidów jest plazmid pKK500, podany w opisie patentowym EP-A 0 367 163. Plazmid ten różni się od opisanego w zgłoszeniu patentowym EP-A 0 289 936 plazmidu pKK400 tym, ze gen proinsuliny jest zastąpiony przez gen analogiczny, który zamiast łańcucha C koduje tylko aminokwas lizynę, oraz tym, że sekwencja terminatora jest włączona na końcu tego genu mini-proinsulmy. Tablice I i II w zgłoszeniu patentowym EP-A 0 367 163, w których gen miniproinsuliny względnie sekwencja terminatora są podane, są jako uzupełnienie załączone do opisu.
169 596
Plazmidy pKK400 i pKK500 zawierają w sekwencji sygnałowej genu inhibitora α-amylazy miejsce cięcia XmaIII ( w zakresie trypletów -5 do -7).
Przykład I. Plazmid pKK 500 zostaje otwarty przy pomocy enzymów restrykcyjnych EcoRI i XmaIII i duży fragment oddziela się przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym, po czym izoluje przez elektroelucję. Ten fragment poddaje się ligacji z fragmentem DNA zsyntetyzowanym metodą fosforaminową (1) (SEQ ED NO: 1) i mieszaninę ligacyjną transformuje się w E.coli.
Ala -5 Cly Pro Ala Ser -1 Ala
5' C GCC CCC CC^<3 CCC TCC
3' CCC CCC CCC ΑβΘ CCC
(XmaIII)
Asp Thr Thr Val Ser Clu Pro
CAC ACC ACC CTC TCC CAC CCG 3
CTC TCC TGG CAC AGG CTC GGC TTA A 5
(EcoRI)
Otrzymuje się plazmid pKK510. Koduje on pre-proinsulinę, w której po sekwencji sygnałowej odcinka łącznikowego (Tendamistat) następują pierwsze 7 aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat) i łańcuch mini-proinsuliny.
Przykład Π. Analogicznie do opisanego w zgłoszeniu patentowym EP-A 0 289 963 sposobu przeprowadzenia plazmidu pKK400 w plazmid ekspresji pGF1, plazmid pKK510 przeprowadza się w plazmid ekspresji pKF1:
DNA izolowany z plazmidu pKK510 tnie się enzymami restrykcyjnymi SphI i SatI i izoluje się mały fragment z genem fuzji. Dostępny handlowo plazmid ekspresji pIJ 702 (do nabycia w John Innes Foundation, Norwich, Anglia) tnie się tymi samymi enzymami i izoluje duży fragment. Oba te izolowane fragmenty poddaje się ligacji, mieszaninę ligacyjną transformuje się w S.lividans TK24, i izoluje się plazmid z transformantów opornych na tiostrepton, białych (to znaczy niezdolnych do wytwarzania melaniny). Klony zawierające wprowadzoną insercję bada się w hodowlach wstrząsanych na wytwarzanie fuzji białkowej.
Ekspresja kodowanej fuzji białkowej następuje w znany sposób: transformowany szczep inkubuje się w kolbach wstrząsanych przez 4 dni w temperaturze 25°C i grzybnię oddziela się od podłoża hodowlanego przez wirowanie; wytworzoną fuzję białkową w podłożu po elektroforezie 20 μΐ przesączu podłoża w 15% żelu poliakrylamidowym uwidacznia się przez wybarwienie błękitem rCOOMASSIE jako dodatkowy prążek białkowy, który nie występuje w doświadczeniu kontrolnym, w którym szczep transformuje się tylko pIJ 702.
Jeśli przesącz podłoża potraktować endoproteazą lizylową, można wykazać elektroforezą w żelu Des- (B30)-Thr-msulinę, którą weryfikuje się w autentycznej kontroli.
Następnie można w przesączu podłoża fuzję białkową wykazać przy pomocy przeciwciał przeciw insulinie albo w immunoblot albo w RIA.
Przykład ID. Postępuje się jak w przykładzie I i Π, ale syntetyczny fragment (2) umieszcza się z SEQ NO:2 i tak otrzymuje się plazmidy pKK320 względnie pKF2.
Ala -5 Ala Ser -1 Ala
Cly Pro
5' G GCC GCC CCG GCC TCC CCC
3' CCC CCC CCC ACC CCC
(XmaIII)
Asp Thr Thr? Val Ssrr Clu Pro Asp Ppo
CAC ACG ACC CTC TTC CAC CCC CAC CCG 3
CTC TGC TTG CAC AGG CTC GGG CTC CGC TTA A 5
(EcoRI)
169 596
Plazmidy te kodują fuzję białkową, która różni się od tej z przykładu I i II tym, że po pierwszych 7 aminokwasach sekwencji łącznikowej (Tendamistat) następuje asparagina (w miejsce naturalnego aminokwasu alaniny) a po niej dziewiąty aminokwas w sekwencji łącznikowej (Tendamistat) - prolina. Przez wymianę alaniny na asparaginę, do części balastowej fuzji białkowej zostaje wprowadzony dodatkowy ładunek dodatni. Niespodziewanie otrzymuje się wydajność o około 20 do 30% wyższą niż w przykładzie II.
Przykład IV. Postępuje się według przykładu I i II, ale syntetyczny fragment (3) umieszcza się w SEQ ID NO:3 i tak otrzymuje się plazmidy pKK330 względnie pKF3.
Ala Gly Pro Ala
5' G GCC GGG CCG GCC
3' CCC GGC CGG
(XmaIII)
5
Asp THr Thr Val Ser Glu
GAC ACG ACC GTC TCC CGCG
CTG TGCC TGG CAG AGG CTC
Ser Ala
TCC GCC
AGG CGG
Pro Ala Poo
CCC GCA ^<GG 3
GGG CGT GGC TTA A 5
Plazmidy te różnią się od tych według przykładu I i II tym, że kodują pierwszych 9 naturalnych aminokwasów sekwencji łącznikowej (Tendamistat). W porównaniu z przykładem II otrzymuje się wydajność o około I0%o wyższą.
Przykład V. Fuzja białkowa kodowana przez pKK500 zawiera między częścią łącznikową (Tendamistat-Anteil) i łańcuchem B proinsuliny sekwencję łączącą, która koduje aminokwasy Asn-Ser-Asn-Gly-Lys. Zastąpienie tej stojącej na końcu Lys, oraz Lys reprezentującej łańcuch C, przez Arg następuje jak opisano niżej. Posłużono się przy tym pojedynczym miejscem StyI w zakresie kodonów B30 do AI w sekwencji proinsuliny.
DNA izolowany z plazmidu pKK500 tnie się StyI, trawi się nukleazą SIdla usunięcia wystających końców i nadmiar nukleazy ekstrahuje się fenolem-chloroformem. Linearny plazmid następnie tnie się EcoRI, duży fragment oddziela się elektroforetycznie i izoluje przez elektroelucję. Ten fragment poddaje się ligacji z syntetycznym fragmentem (4) (SEQ ID NO:4) i mieszaninę ligacyjną transformuje się w E.coli.
B1 10
Asn Ser Asn G CA?g Phe Val Asn Gln His Leu Cyn Gly Ser His
AAT TCG ACC GGG GCC TTT GTC lc^c: CCG CAC CTG TGC GGT TCG CAC
GC TTG TCG GCG AAG CAG TTG GTT GTG GAT ATG CCG CBC GTG
(EcoRI)
20 30
Leu Val Glu GAl Llu Tyr Llu Val Cyn Gly Glu Arg Gly Phe Phe
CTC GTG GAC GGC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTT TTC
GAG CAC CTC GCG GAG ATG GG.C CAC ACG CCC CTC GCG CCG CAG ACG
B30 C (B31)
. v- xyr Thr Prr Lyy CTii? Crg
TAC ACC CCC AAG ACC CGC
ATG TGG GGG TTC TGG GCG
169 596
Pożądane klony sprawdza się analizą restrykcyjną zawartych w nich plazmidów, przy czym używa się nowo powstałego miejsca cięcia SatII. Następnie całkowity fragment SpHI-SstI poddaje się sekwencjonowaniu.
Dla ekspresji kodowanej fuzji _ białkowej, fragment sprawdzony analizą sekwencyjną poddaje się ligacji z pociętym tymi samymi enzymami wektora pIJ 702, przy czym powstaje wektor ekspresji pGF4.
Badanie kodowanej przez pGF4 i wydzielanej fuzji białkowej z jednej strony można przeprowadzić testem płytkowym inhibitora α-amylazy (zgłoszenie patentowe EP-A 0161 629, przykład III), a z drugiej strony można wykonać w podłożu hodowli wstrząsanej analogicznie jak w przykładzie II.
Przykład VI. Jeśli analogicznie jak w przykładzie V fragment (4) wbuduje się do wektorów pKK510, 520 i 530, otrzymuje się wektory pKK610, 620 i 630. Wbudowanie każdorazowo fragmentów SphI-SstI z sekwencją kodującą fuzje białkowe do wektora pIJ 702 daje wektory ekspresji pKF11, 12 i 13. Ekspresję wydzielanych fuzji białkowych sprawdza się według przykładu II.
Przykład VII. Dla zwiększenia ekspresji pochodnych plazmidu pIJ 702, usuwa się z niego promotor melaniny przez trawienie PstI i SphI i zastępuje syntetycznym fragmentem (5) (SEQ ID NO:%). PstI BcI
20 30 40 50
CTGCAGTGATCAGGGGGACCCTTGTGCGAATTTCCGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGG
GACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC
SphI
70 80
ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGcATGC
TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG
Powstaje w ten sposób konstrukcja tandemowa z promotora syntetycznego i łącznikowego (Tendamistat). Plazmid jest oznaczony pGR110.
Jeśli do pGR110, po cięciu SphI i SstI, wprowadzi się syntetyczne fragmenty (1), (2) i (3), powstają w wyniku wektory ekspresji pGR2(X), 210 i 220. Podobnie z fragmentem (4) otrzymuje się wektory ekspresji pGR250, 260 i 270.
Przykład VIII. Przy wytwarzaniu ludzkiej insuliny z prekursorów insuliny przez kombinację trypsyny lub innego tak samo działającego enzymu i karboksypeptydazy B jest korzystne, w przebiegu reakcji rozszczepiania, szybko odszczepić aminoterminalną część balastową, aby promować reakcję rozszczepienia w kierunku B31 (Arg)-insuliny. Do tego odpowiednia jest modyfikacja aminokwasów przed aminokwasem B1 (Phe):
Postępuje się według przykładu I i otwiera się plazmid pKK500 enzymami restrykcyjnymi EcoRI i DraIII. Pierwotny fragment zostaje następnie zastąpiony fragmentem DNA (6) (SEQ ID NO:6) zsyntetyzowanym metodą fosforaminową.
Asn Ser Ala .Arg Phe Val Asn
5' AAT gCG gCC CGC TTC GTC AAC
3' GC CGG GCG AAG CAG TTG (EcoRI)
Gin His Leu Cys Gly Ser His Łeu
CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC 3'
GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG 5 ' (DraIII)
Klonowanie w E.coli i ekspresja w Streptomyces lividans następują według przykładu I względnie II. W wyniku powstają plazmid pKK640 względnie plazmid ekspresji pKF14.
Analogicznie można postępować z plazmidem otrzymanym według przykładu V (po wbudowaniu fragmentu (4)). Otrzymuje się plazmidy pKK650 względnie pKF15.
169 596
Załącznik z opisu patentowego EP-A 0 367 163
Tabela 1
ASN SER ASN GLY LYS B‘ PHE VAL ASN GLN 10 HIS LEU CYS GLY SER HIS
AAT TCG AAC GGC AAG TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
(EcoRI)
LEU VAL GLU ALA 20 LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE 30 PHE
CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC
GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
TYR THR PRO LYS THR C LYS A1 GLY ILE VAL 40 GLU GLN CYS CYS THR SER
TAC ACC CCC AAG ACC AAG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC
ATG TGG GGG TTC TGG TTC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG
ILE CYS SER LEU 50 TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STP
ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA
TAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT
GTC CAG GAC CTG CTG GAC CAG GTC CCA GGT TCG A
Sali (HindIII)
Tabela 2 ' -CGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGGATC
GCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTGCACCTAG-5
169 596
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł

Claims (3)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania struktury genu, znamienny tym, że sekwencję sygnałową i około dziesięć pierwszych kodonów sekwencji łącznikowej sprzęga się z genem strukturalnym innego białka.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w sekwencji łącznikowej kodony dla aminokwasów zostają usunięte, wymienione albo dodane.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że między gen sekwencji łącznikowej i gen strukturalny pożądanego białka wprowadza się sekwencję łączącą.
PL91309698A 1990-04-21 1991-04-19 Sposób wytwarzania struktury genu PL PL PL169596B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4012818A DE4012818A1 (de) 1990-04-21 1990-04-21 Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL169596B1 true PL169596B1 (pl) 1996-08-30

Family

ID=6404857

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL91309698A PL169596B1 (pl) 1990-04-21 1991-04-19 Sposób wytwarzania struktury genu PL PL
PL91289953A PL169178B1 (pl) 1990-04-21 1991-04-19 Sposób wytwarzania fuzji bialkowych PL PL

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL91289953A PL169178B1 (pl) 1990-04-21 1991-04-19 Sposób wytwarzania fuzji bialkowych PL PL

Country Status (29)

Country Link
EP (1) EP0453969B1 (pl)
JP (1) JP3319605B2 (pl)
KR (1) KR0168669B1 (pl)
CN (1) CN1049248C (pl)
AT (1) ATE142263T1 (pl)
AU (1) AU630287B2 (pl)
BR (1) BR9101587A (pl)
CA (1) CA2040810C (pl)
CZ (1) CZ285440B6 (pl)
DE (2) DE4012818A1 (pl)
DK (1) DK0453969T3 (pl)
ES (1) ES2093043T3 (pl)
FI (1) FI911882A (pl)
GR (1) GR3021040T3 (pl)
HR (1) HRP940770A2 (pl)
HU (1) HU210358B (pl)
IE (1) IE911322A1 (pl)
IL (1) IL97903A0 (pl)
LT (1) LT3686B (pl)
LV (1) LV10494B (pl)
NO (1) NO911557L (pl)
NZ (1) NZ237882A (pl)
PL (2) PL169596B1 (pl)
PT (1) PT97427B (pl)
RU (1) RU2055892C1 (pl)
SK (1) SK110191A3 (pl)
TW (1) TW213487B (pl)
YU (1) YU48435B (pl)
ZA (1) ZA912937B (pl)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100188800B1 (ko) * 1990-09-05 1999-06-01 이센브룩, 라피세 프리프로인슐린을 인슐린으로 전환시키기 위한 효소적 방법
DK0600372T3 (da) 1992-12-02 1997-08-11 Hoechst Ag Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer.
EP0622376B1 (de) * 1993-04-27 2001-08-08 Hoechst Aktiengesellschaft Amorphe monosphärische Formen von Insulinderivaten
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
CN1061375C (zh) * 1996-07-19 2001-01-31 中国科学院上海生物工程研究中心 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白
ES2218622T3 (es) 1996-07-26 2004-11-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada.
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
CN1298742C (zh) * 2003-06-03 2007-02-07 上海新药研究开发中心 一种适合于高效表达的融合蛋白及其生产方法
RU2395296C1 (ru) * 2009-02-19 2010-07-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" Способ получения препарата проинсулина для перорального применения
CN104818291A (zh) * 2015-05-08 2015-08-05 江南大学 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
DE3418274A1 (de) 1984-05-17 1985-11-21 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten
DE3707150A1 (de) * 1987-03-06 1988-09-15 Hoechst Ag Tendamistat-derivate
DE3714866A1 (de) * 1987-05-05 1988-11-24 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten
DE3715033A1 (de) 1987-05-06 1988-11-17 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung von fusionsproteinen
DE3716722A1 (de) 1987-05-19 1988-12-01 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen
DE3843713A1 (de) * 1988-04-25 1989-11-02 Henkel Kgaa Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung
ES2081826T3 (es) * 1988-11-03 1996-03-16 Hoechst Ag Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos.

Also Published As

Publication number Publication date
KR0168669B1 (ko) 1999-01-15
JP3319605B2 (ja) 2002-09-03
NZ237882A (en) 1993-12-23
LTIP1523A (en) 1995-06-26
TW213487B (pl) 1993-09-21
FI911882A0 (fi) 1991-04-18
LT3686B (en) 1996-01-25
CZ285440B6 (cs) 1999-08-11
AU630287B2 (en) 1992-10-22
NO911557L (no) 1991-10-22
HU911302D0 (en) 1991-10-28
HU210358B (en) 1995-04-28
NO911557D0 (no) 1991-04-19
CN1055952A (zh) 1991-11-06
CZ110191A3 (en) 1993-08-11
GR3021040T3 (en) 1996-12-31
LV10494A (lv) 1995-02-20
DE4012818A1 (de) 1991-10-24
YU69691A (sh) 1995-12-04
DK0453969T3 (pl) 1997-02-10
RU2055892C1 (ru) 1996-03-10
YU48435B (sh) 1998-07-10
CA2040810A1 (en) 1991-10-22
HRP940770A2 (en) 1997-06-30
EP0453969B1 (de) 1996-09-04
ZA912937B (en) 1991-12-24
SK110191A3 (en) 1995-07-11
IE911322A1 (en) 1991-10-23
FI911882A (fi) 1991-10-22
CA2040810C (en) 2001-07-24
PL169178B1 (pl) 1996-06-28
BR9101587A (pt) 1991-12-10
KR910018551A (ko) 1991-11-30
LV10494B (en) 1996-02-20
IL97903A0 (en) 1992-06-21
PL289953A1 (en) 1991-11-04
EP0453969A1 (de) 1991-10-30
JPH04228086A (ja) 1992-08-18
DE59108128D1 (de) 1996-10-10
ATE142263T1 (de) 1996-09-15
AU7515491A (en) 1991-10-24
ES2093043T3 (es) 1996-12-16
PT97427A (pt) 1992-01-31
PT97427B (pt) 1998-08-31
HUT57268A (en) 1991-11-28
CN1049248C (zh) 2000-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6204246B1 (en) Hybrid toxin
Freudl et al. Cell surface exposure of the outer membrane protein OmpA of Escherichia coli K-12
JP3210315B2 (ja) プロテアーゼ欠損
US4963495A (en) Secretion of heterologous proteins
JP4243104B2 (ja) 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質
US5496924A (en) Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion
JPH05501799A (ja) 融合タンパク質、その調製及び用途
CA1339894C (en) Fusion proteins with a eukaryotic ballast portion
PL169596B1 (pl) Sposób wytwarzania struktury genu PL PL
Betton et al. In vivo assembly of active maltose binding protein from independently exported protein fragments.
EP0797671A1 (en) A process of producing extracellular proteins in bacteria
US6780408B1 (en) Genes encoding hybrid bacillus thuringiensis toxins
US5171673A (en) Expression of heterologous dna using the bacillus coagulans amylase gene
US5643791A (en) Characterization and structure of an endodglucanase gene of Cellulomonas fimi
EP0868523A1 (en) Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell
US5426036A (en) Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
AU612144B2 (en) A process for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
EP0314184B1 (en) Expression plasmids
CA1341067C (en) Construction of synthetic dna and its use in large polypeptide synthesis
JPH04295499A (ja) 抗ウイルス性タンパク質
WO1990000610A1 (en) New expression vectors