LT3686B - Process for preparing fused proteins, gene structure, process for transformation of hybride and streptomycetes cells - Google Patents

Process for preparing fused proteins, gene structure, process for transformation of hybride and streptomycetes cells Download PDF

Info

Publication number
LT3686B
LT3686B LTIP1523A LTIP1523A LT3686B LT 3686 B LT3686 B LT 3686B LT IP1523 A LTIP1523 A LT IP1523A LT IP1523 A LTIP1523 A LT IP1523A LT 3686 B LT3686 B LT 3686B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
gene
protein
tandem
fragment
cac
Prior art date
Application number
LTIP1523A
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus Peter Koller
Guenther Riess
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of LTIP1523A publication Critical patent/LTIP1523A/xx
Publication of LT3686B publication Critical patent/LT3686B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Išradimas priskiriamas biotechnologijos sričiai ir susijęs su sujungtų baltymų, geno struktūros ir hibrido gavimo būdu bei streptomicetų ląstelių transformavimo būdu.
Žinomas sujungtų baltymų gavimo būdas, kai modifikuoto tandeminio geno būtinumo atveju pageidaujamo baltymo struktūrinį geną prijungia prie koduojančio siūlo 3’-galo, šitą geno struktūrą ekspresuoja į streptomicetų lęsteles-šeimininkus ir iš supernatanlinio skysčio išskiria sekretuotą sujungtą baltymą (EP- Nr. A 0289936). Geriausiame variante tandeminis genas sutrumpinamas 3’-gale. Sutrumpinimui panaudojamos restrikcinių fermentų BstEII tripletų 31 ir 32 srityje, StuI tripletų 43 ir 44 srityje, o taip pat Sau3 A tripetų 52 ir 53 srityje skaidymo vietos.
Toliau tobulinant šią idėją, buvo pasiūlyta gauti sujungtą baltymą, kurio tandeminėje dalyje yra sutrumpintas proinsulinas, kurio C-grandinė sudaryta tiktai iš vienos arba dviejų lizino liekanų (“mini-proinsulinas”). Toliau buvo pasiūlyta panašiuose sujungtuose baltymuose taip pat trumpinti tandeminę dalį (EP- Nr. A 367163 ).
Pastaruoju metu netikėtai surasta, kad sujungti baltymai su labai trumpa tandemine dalimi streptomicetų ląstelėje yra stabilūs ir išsiskiria į terpę. Tokiu būdu gauti sujungti baltymai dėl labai trumpos tandeminės grandinės elgiasi kaip “subrendę” baltymai ir terpėje egzistuoja taisyklingos tretinės struktūros pavidalu.
Iš EP- Nr.A 0177827 žinoma sintetinė signalinė DNR seka baltymų transportui į ekspresijos sistemas, kuri skiriasi tuo, kad ši DNR iš esmės atitinka gamtinę signalinę seką, bet turi vieną arba keletą endonukleazių skaidymo vietų, kurių nėra gamtinėje DNR. Jeigu transportuojamo baltymo genas prijungiamas prie tokios DNR sekos, šis sujungtas genas įstatomas į vektorių ir tokiu būdu transformuojama ląstelė-šeimininkas, kuri transportuoja išsiskyrusį baltymą iš citoplazmos,ir taip galima gauti eukariotinius, prokariotinius arba virusinius baltymus prokariotinėse ir eukariotinėse ląstelėse. Periplazminio baltymo - šarminės fosfatazės pavyzdžiu parodyta, kad E.coli ekspresijoje pageidautina, kad jis būtų įvestas po maždaug 40 pirmųjų šarminės fosfatazės aminorūgščių kodonų sekos prieš pageidaujamo baltymo struktūrinį geną.Tačiau daugeliu atvejų pakanka mažesnio papildomų aminorūgščių skaičiaus, pavyzdžiui 10, dar geriau apie 5. Atitinkamas sujungtas baltymas su beždžionių proinsulinu maždaug iki 90 % transportuojasi į periplazminę erdvę.
Pasiūlytas sujungtų baltymų gavimo būdas, konstruojant mišrų oligonukleotidą, kuris koduoja sujungto baltymo balastinę dalį (PCT Nr. 91/03550 ).Šis oligonukleotidas įvedamas į vektorių tokiu būdu, kad jis būtų funkcionaliai sujungtas su reguliacijos sritimi ir norimo baltymo struktūriniu genu; taip gauta plazmidės populiacija transformuojamos tinkamos ląstelės-šeimininkai ir selekcionuojami tie klonai, kurie turi didelę koduoto sujungto baltymo išeigą. Šiuo atveju oligonukleotidas susideda daugiausia iš 4-12, ypatingais atvejais - iš 4-8 tripletų.
Bandyta gauti sujungtus baltymus su trumpa balastine dalimi. Pavyzdžiui, buvo gautas genų sujungimas, kuris koduoja sujungtą baltymą iš β-galaktozidazės pirmųjų 10 aminorūgšeių ir somatostatino. Tačiau pasirodė, kad šio trumpo β-galaktozidzės fragmento nepakanka, kad sujuntas baltymas būtų apgintas nuo šeimininko proteazių (US-A 4306246, 15 skiltis, 2 pastraipa). Išeinant iš to, EP- Nr.A 0290005 ir EP-Nr.A 0292763 aprašyti sujungti baltymai, kurių balastinė dalis sudaryta iš β-galaktozidazės fragmento, susidedančio iš 250 aminorūgšeių.
Vistik dabartiniu metu sujungti baltymai, sudaryti iš tandemo pirmųjų maždaug 10 N-galinių aminorūgšeių ir pageidaujamo baltymo, pavyzdžiui, proinsulino, netikėtai pasirodė stabilūs streptomicetų ląstelėse-šeimininkuose ir galintys išsiskirti į terpę, iš kurios jie gali būti išskirti su didele išeiga. Tai turi reikšmės palyginus nedideliems baltymams, tokiems kaip “mini-proinsulinai”.
''Maždaug 10 aminorūgšeių” reiškia, kad turima galvoje ir mažesnis aminorūgšeių skaičius, pavyzdžiui, pirmosios 7 tandemo N-galo aminorūgštys, bet optimaliausia - ne daugiau 10. Optimalus variantas - kai sujungtų baltymų tandeminėje dalyje 7-je ir/arba 9je padėtyse (kaip ir gamtinėje sekoje) yra prolinas.
Savaime aišku, pagal žinomus ir siūlomus variantus (EP- Nr.A 0367163)galima rinktis didele tandemine balastinę dalį, žinoma tuo pačiu vis labiau mažėja nedidelio “balasto” pranašumas.
Galima ir net rekomenduotina varijuoti tandeminės dalies gamtinę 7-10-tos padėties aminorūgšeių seką, t.y. pakeisti nesančiomis gamtinėje sekoje aminorūgštimis. Be to, galima varijuoti aminorūgšeių seką signaliniame peptide.
Išradimo esmė ta, kad paprastų preliminarinių bandymų dėka gali būti lengvai nustatomos ypatingai tinkamos sujungtos konstrukcijos.
Be to, išradimo idėjos gali būti įgyvendintos kitose gram-teigiamų bakterijų ląstelėse, pavyzdžiui bacilų arba stafilokokų ląstelėse,panaudojant signalines sekas, kurias “atpažįsta” šie šeimininkai.
Sujungti baltymai, gauti pagal šį išradimą, yra ištirpę terpėje, o tai yra labai patogu toliau apdorojant ir valant. Pavyzdžiui, galima vykdyti fermentinį apdorojimą betarpiškai su sekreeinio produkto pagalba, atskiriant balastinę dalį ir išvengiant apdorojimo stadijų, reikalingų netirpių sujungtų baltymų atveju. Prieš tolesnį apdorojimą, galima kondensuoti arba valyti, pavyzdžiui, afininės chromatografijos, o taip pat ultrafiltracijos, nusodinimo, jonų kaitos, adsorbcinės chromatografijos, gelfiltacijos arba aukšto slėgio skysčio chromatografijos būdu.
Poliau aprašomi pavyzdžiai išsamiau paaiškina išradimą.
Konstruojant plazmidę, pradine medžiaga imta plazmidė pKK500, pasiūlyta EP-A 0367163. Ši plazmidė skiriasi nuo žinomos iš EP-Nr.A 0289936 plazmidės pKK400 tuo, kad proinsulino genas yra pakeistas analogišku genu, kuris vietoj C-grandinės koduoja tik aminorūgštį li'/.ina, o taip pat ir tuo, kad po šio “mini-proinsulino” geno yra įvestas terminatorius. Kaip priedas prie aprašymo, duodamos 1 ir 2 lentelės iš EP-A 0367163, kuriose atvaizduotas mini-proinsulino” genas, atitinkamai, terminatorius.
Plazmidės pKK400 ir pKK500 inhibuojančio α-amilazę geno signalinėje sekoje turi XmaIII skaidymo vietą (tripleto 5-7 srityje).
pavyzdys
Plazmide pKK500 sukarpo restrikciniais fermentais EcoRI ir XmaIII ir gelio elektrol'orezės būdu ant 0,8 %-nio agarozės gelio išskiria didelį fragmentą, kurį po to atskiria elektroeliueijos pagalba. Šį fragmentą liguoja su DNR fragmentu (1), susintetintu fosforamidatiniu būdu (SEQ ID NO:1) ir liguotą mišinį transformuoja į E.coli.
-5 -1
Ala Gly Pro Ala Ser Ala 5’ C, GCC GGG GGC GCC TCC GCC 3’ CCC GGC CGG AGG CGG (XmaIII)
Asp Thr Thr Vai Ser Glu Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCG 3’
CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGCTTA A 5’ (EeoRI)
Gauna plazmidę pKK510. Ji koduoja pre-proinsuliną, kuriame po signalinės tandemo sekos eina pirmosios 7 aminorūgštys ir po to mini-proinsulino grandinė.
pavyzdys
Analogiškai aprašytam EP-A 0289936 plazmidės pKK400 pakeitimo į ekspresijos plazmide pGFl būdui, plazmidę pKK510 paverčia ekspresijos plazmide pKFl:
izoliuotą DNR-plazmidę pKK510 sukarpo restrikcinių fermentų Sphl ir SstI pagalba ir atskiria nedidelį fragmentą su sujungtu genu. Parduodamą ekspresijos plazmidę pIJ 702 (John Innes Foundation, Norwich, Anglija) sukarpo tų pačių fermentų pagalba ir atskiria didelį fragmentą. Šiuos abu izoliuotus fragmentus liguoja, liguotą mišinį transformuoja į 5. lividans TK24 ir iš tiostrepton-rezistentų, baltų (t.y. nesugebančių gaminti melanino) transformantų išskiria plazmidę.Klonus, kurie turi įvestą intarpą, augina pastoviai purtomoje kultūroje ir tiria sujungtų baltymų susidarymą.
Koduoto sujungto baltymo ekspresija vyksta žinomu būdu. Jeigu transformuotą štamą inkubuoja 4 dienas purtyklėje esančiose kolbose aukštesnėje nei 25 oC temperatūroje ir centrifugavimu atskiria micelį nuo kultivavimo skysčio, tai dėka nudažymo COOMASSIE-mėliu, gaunant papildomą baltymo juostą, kuri neišryškėja kontroliniame eksperimente, kuriame štamas transformuotas tik pIJ 702 pagalba, susidariusį sujungtą baltymą galima aptikti po elektroforezės 20 pm supernatantiniame skystyje ir kultivavimo skysčio filtrate 15 %-niame poliakrilamido gelyje.
Jei kultivavimo skysčio filtratą paveikia lizilendoproteinaze, tai gelio elektroforezės būdu galima aptikti I)es-(B30)-Thr-insuliną, kurį patvirtina autentiška kontrolė.
Toliau, insulino antikūnų pagalba arba imunoblokavimo keliu, arba radioimuninės insulino analizės pagalba kultivavimo skysčio filtrtae galima aptikti sujungtą baltymą.
pavyzdys
Pagal 1 ir 2 pavyzdžiuose aprašytas metodikas, tik panaudojant sintetinį fragmentą (2) su SEO II) N():2
-5 -1
Ala Gly Pro Ala Ser Ala
5’ G GCC GGG ccg gcc tcc gcc 3’ CCC GGC CGG AGG CGG (XmaIH)
Asp Okr Thr Vai Ser Glu Pro Asp Pro G AG ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG 3’
CFG IX i C TGG CAG AGG CTC GGG CTG GGC TTA A 5’ (EcoRI) gauna atitinkamai plazmides pKK320 irpKF2.
Šios plazmidės koduoja sujungtą baltymą, kuris skiriasi nuo aprašyto 1 ir 2 pavyzdžiuose tuo, kad po pirmųjų 7 tandemo aminorūgščių seka asparaginas (vietoj gamtinės aminorūgšties - alanino), o devintoji aminorūgštis tandeme yra prolinas. Taigi, dėl alanino pakeitimo asparaginu įvedamas papildomas teigiamas krūvis į sujungto baltymo balastine dalį. Netikėtai, galinama 20-30 % daugiau norimo produkto negu 2 pavyzdyje.
pavyzdys
Pagal 1 ir 2 pavyzdžiuose aprašytas metodikas, bet panaudojant sintetinį fragmentą (3) su SEO II) N():3
-5 -1
Ala Gly Pro Ala Ser Ala
5’ G GCC GGG CCG GCC TCC GCC 3 CCC GGC CGG AGG CGG (XmaIII)
Asp Thr Thr Va] Ser Glu Pro Ala Pro
GAC ACC. ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCG 3’
C1C ICC TCC CAC ACC CTCi CCG CCT CCC TTA A 5’ gauna atitinkamai plazmides pKK320 ir pKF3. Šios plazmidės skiriasi nuo plazmidžių, gautų l ir 2 pavyzdžiuose, tuo, kad jos koduoja tandeme pirmąsias 9 gamtines aminorūg.štis. Lyginant su 2 pavyzdžiu, išeiga beveik 10 % didesnė.
pavyzdys
Sujungtas baltymas, koduotas pKK500, tarp tandeminės dalies ir proinsulino Bgrandinės turi Iinkerinę seką, kuri koduoja aminorūgštis Asn-Ser-Asn-Gly-Lys. Galinį Lys ir sudarantį C-grandinę Lys pakeičia žemiau aprašytu būdu. Tam tikslui proinsulino sekoje kodono B30 iki Al srityje naudojama vienintelė kirpimo vieta Styl.
Išskirtą DNR-plazmidę pKK500 sukarpo Styl pagalba, išsikišusių galų pašalinimui paveikia SI nukleaze, kurios perteklių išekstrahuoja fenolio ir chloroformo mišiniu. Gautą linijine plazmide vėl karpo EcoRI, elektroforezės būdu atskiria didyjį fragmentą ir elektroeliueijos keliu jį išskiria. Šį fragmentą liguoja su sintetiniu fragmentu (4) (SEQ ID NO:4)
BĮ 10
Asn Ser Asn Gly Arg Phe Vai Asn Cln His Leu Cys Cly Ser His ATI 'TCC. AAC CCC CCC TTC. CCT AAC CAG CAC. CTG TCC GGC TCC CAC
CC'ITCCCC GCC AAC CAC TTG GTC CTG GAC ACG CCG AGC GTC (EcoRI)
30
Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe ere C'l'G CAC. CCC CTC TAC CTG CTG TCC CCC CAC CCC GGC TTC TTC
CAC CAC ere CCC CAC ATC CAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAC AAC
B30 C(B31)
Tyr Thr Pro Lys Thr Arg
TAC ACC CCC AAC ACC CCC
ATG TGG GGG I I C TCC CCC ir po ligavimo mišinį transformuoja į E.coli. Pageidaujamus klonus tikrina turimos plazmidės restrikeinės analizės būdu ir panaudojama naujai susidariusi SstlI kirpimo vieta. Toliau sekvenuojamas visas SphI-Sstl-fragmentas.
Koduoto sujungto baltymo ekspresijai fragmentas, ištyrus jo seką, liguojamas į vektorių pIJ 702. sukarpytą tų pačių fermentų ir gaunamas ekspresijos vektorius pGF4.
Koduotą pGF4 ir sekretuotą sujungtą baltymą galima nustatyti, pirma, testo ant plokštelių su a-amilazės inhibitoriumi pagalba (EP-A 0161629, 3 pavyzdys) ir, antra, analogiškai 2 pavyzdžiui, iš auginamos pastoviai purtant kultūros supernatantinio skysčio.
pavyzdys
Jeigu pagal 5 pavyzdyje aprašytą metodiką fragmentas (4) įvedamas į vektorius pKK51(), 520 ir 530, tai gaunami vektoriai pKK610, 620 ir 630. Sujungtus baltymus koduojančios sekos pagalba įmontuoti atitinkamai SphI-Sstl-fragmentai į vektorių pIJ 702 duoda ekspresijos vektorius pKFll, 12 ir 13. Sekretuotų sujungtų baltymų ekspresija patikrinama pagal 2 pavyzdį.
pavyzdys
Plazmidės pIJ 702 produktų ekspresijos padidinimui, iš jos PstI ir Sphl pagalba pašalinamas melanininis promotorius ir pakeičiamas fragmentu (5) (SEQ ID NO:5)
PstI Bell
K) 20 30 40 50
CTG( :a< ’.TGATt :ac k k ;gg acccttgtgcc;aatttgcgttacgggtttgggtggtaggg GACGTCATCAC iTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC
Sphl
70 80
ACG( ?AG( X X i AAC AC iG A( iGGCCCAGCATGC TGC X i'IT i('.C ’.(TT(' ΊΧ X YCC GGGGTCGTACG
Taip iš sintetinio ir tandeminio promotorių gaunama tandeminė konstrukcija. Plazmidė pavadinta pGRl 10.
Jeigu į pGR.110 po kirpimo su Sphl ir SstI įstatomi sintetiniai fragmentai (1), (2) ir (3), gaunami ekspresijos vektoriai pGR200, 210 ir 220. Analogišku būdu fragmento (4) pagalba gaunami ekspresijos vektoriai pGR250, 260 ir 270.
pavyzdys
Jeigu tripsino arba panašiai veikiančio fermento ir karboksipeptidazės B kombinacijos keliu iš insulino pirmtakų reikia gauti žmogaus insuliną, tai geriau atskyrimo reakcijos eigoje greitai atskirti balastinę dalį su amino galais, kad būtų paskatinamos skaidymo reakcijos B31 (Arg)-insulino kryptimi. Tam tikslui siūloma aminorūgščių prieš aminorūgštį BĮ (Phe) modifikacija.
Pagal 1 pavyzdyje aprašytą metodiką plazmidę pKK500 sukarpo restrikcinių fermentų EeoRI ir DralII pagalba. Po to pirminį fragmentą fosforamiditiniu metodu pakeičia į sintetinį DNR-fragmentą (6) (SEQ ID NO:6)
BĮ
Asn Ser Ala Arg Phe Vai Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu 5’ ΑΛΊ' TGG (K ’(’ ('GG TTC GTC AAG CAG CAC CGT TGC GGC TCG CAC CTC 3’
3' GG (X >G (’iGG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG 5’ (EeoRI) (DralII)
Klonavimą E.coli ląstelėse ir ekspresiją Streptomyccs lividcins ląstelėse atlieka pagal atitinkamai 1 ir 2 pavyzdžius. Gauna atitinkamai plazmides pKK640 ir pKF14.
Analogiškai galima elgtis su plazmidę, kurią gauna pagal 5 pavyzdį (įstačius fragmentą (4)).Taip gaunamos atitinkamai plazmides pKK650 ir pKF15.
PRIEDAS (iš EP-A 0367163) lentelė
BĮ
K)
Asn Ser Asn AATTCG AAC GC TTG (EcoRI) Gly GGC (’(’G Lys AAG TTC Phe TTC AAG Vai Asn GTC AAC CAG TTG Gln CAG GTC His CAC GTG Leu CTG GAC Cys TGC ACG Gly GGC CCG Ser TCG AGC His CAC GTG
20 30
Leu Vai Glu Ala Eeu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
CTC GTG ΟΛΟ GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC
G AG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
C Al 40
Tvr Thr Pro Lys Thr Lys Gly Ile Vai Glu Gln Cys cys Thr Ser
TAC ACC CCC AAG ACC AAG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC
ATG TGG GGC i ttc TGG TTC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG
Ile Cys Ser Eeu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Stp Stp
ATC’ TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA
TAG GTC CAG ACG AGG GAC ere CFG GAC GAG ATG GTC’ CAG CCA CTG GGT TCG GAG A CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT
(HindlII)
Salį lentelė
5’-C( i ATAAACCC i ATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAG A (iCl ’ΛΤΓΓί ϊ( iCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCT
TTTTCAACGTY i( i ATC
AAAAC ί ΊΊΧICACCTAG-5’
SEO II) NO:1 SEKOS TIPAS:
SEKOS ILGIS: GRANDINĖS FORMA: TOPOLOGIJA: FRAGMENTO TIPAS:
nukleotidas su atitinkamu baltymu bazės dviguba grandinė su išsilaikančia atpažinimo seka linijinė vidinis fragmentas
KILMĖ sintetinė DNR
G GGG GGG CGG GCC TCC GCC GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCG
GGC’ GGG GGG AGG CGG CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A
Ala Gly Pro Ala Ser Ala Asp Thr Thr Vai Ser Glu Pro Asn
SEO II) N():2 SEKOS TIPAS:
SEKOS ILGIS: GRANDINĖS FORMA TOPOLOGIJA: FRAGMENTO TIPAS: KILMĖ:
nukleotidas su atitinkamu baltymu bazių dviguba grandinė su išsilaikančia atpažinimo seka linijinė vidinis fragmentas sintetinė DNR
G GGG
GGG CCG GCC TCC GCC GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC GGG GGG CGG AGG CGG CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CTG
Ala (ily Pro Ala -5
CCG TTTA
GGG
Ser Ala Asp Thr Thr Vai Ser Glu Pro Asp 1 5
Pro Asn 10
SEO ID NO:3 SEKOS l’IPAS:
SEKOS ILGIS: GRANDINĖS FORMA: TOPOLOCiIJA: FRAGMENTO TIPAS: KILMĖ:
nukleotidas su atitinkamu baltymu bazių dviguba grandinė su išsilaikančia atpažinimo seka linijinė vidinis fragmentas sintetinė DNR
C GGG GGG GGG GCC' TGC GCC GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA
CTG GGC ' CGG AGG CGG CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CGT
Ala (ily Pro Ala Ser Ala Asp Thr Thr Vai Ser Glu Pro Ala
-5 1 5
GGG-
()('.(’ T 1Ά A
Pro Asn
SEQ ID NO:4
SEKOS TIPAS: nukleotidas su atitinkamu baltymu
SEKOS II.(iIS: 108 bazės
GRANDINĖS FORMA: dviguba grandinė su išsilaikančia atpažinimo seka
TOPOLOGIJA: linijinė
FRAGMENTO TIPAS: vidinis fragmentas
KII.MĖ: sintetinė DNR
ATT TCG AAG GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
Asn GC TIG Ser Asn CCG Gly GCG AAG CAG TTG GTC. GTG GAC ACG CCG AGC GTG
Arg 5 Phe Vai Asn Gln His 1C Leu 1 Cys Gly Ser His 15
CTC GTG GAC. GCC CTC TAC. CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC. TTC TTC
G AG CAC CTC CGG GAG ATG GAC. CAC AGG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
25 30
TAC ACC CCC AAG ACC CGC
ATG ’l'GG GGG TTC TGG GCG
Tyr I h r Pro lys Thr Arg 35
SEO ID NO:5
SEKOS TIPAS: nukleotidas su
SEKOS ILGIS: 86 bazėm
GRANDINES FORMA: TOPOLOGIJA: FRAGMENTO TIPAS: KILMĖ:
dviguba grandinė linijinė vidinis fragmentas sintetinė DNR
CTGCAGTGAT CAGGGGGACC CTTGTGCGAA TTTCCGTTAC GGGTTTGGGT 50 GGTAGGGAGG CACCCGAAGA GGAGGCCCCA GCATGC 86
SEO ID NO:6
SEKOS TIPAS: nukleotidas su atitinkamu baltymu
SEKOS II,GIS: 45 bazės
GRANDINĖS FORMA: dviguba grandinė su išsilaikančia atpažinimo seka
TOPOLOGIJA: linijinė
FRAGMENTO ŪPAS: vidinis fragmentas
KILMĖ: sintetinė DNR
AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC GC CGG GCG AAC! CAG TTG GTC GTG GAC. ACG CCG AGC GTG
Asn Ser Ala Arg Phe Vai Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu

Claims (6)

1. Sujungtų baltymų gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad pageidaujamo baltymo struktūrinį genų suriša su signalinės sekos kodonu ir tandemo pirmomis maždaug' dešimtimi aminorūgštimis, šią geno struktūrą įveda į streptomicetų ląsteles-šeimininkus ekspresijai ir sekretuotą sujungtą baltymą išskiria iš supernatantinio skysčio, ir tandeminio geno sekos gali būti modifikuotos.
2. (ieno struktūros gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad signalinę seką ir ir maždaug dešimt pirmų tandemo kodonų suriša su kito baltymo struktūriniu genu.
3. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad tandeminėje dalyje praleidžia, pakeičia arba įveda į ją aminorūgščių kodonus.
4. Būdas pagal 2 arba 3 punktą, b esiskiriantis tuo, kad tarp tandeminio geno ir pageidaujamo baltymo struktūrinio geno įvesda linkerinę seką.
5. Hibrido gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad geno struktūrą pagal 2, 3 arba 4 punktą įveda į streptomicetinį vektorių.
6. Streptomicetų ląstelių transformavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į šias ląsteles vektorių įveda pagal 5 punktą.
LTIP1523A 1990-04-21 1993-12-03 Process for preparing fused proteins, gene structure, process for transformation of hybride and streptomycetes cells LT3686B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4012818A DE4012818A1 (de) 1990-04-21 1990-04-21 Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1523A LTIP1523A (en) 1995-06-26
LT3686B true LT3686B (en) 1996-01-25

Family

ID=6404857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1523A LT3686B (en) 1990-04-21 1993-12-03 Process for preparing fused proteins, gene structure, process for transformation of hybride and streptomycetes cells

Country Status (29)

Country Link
EP (1) EP0453969B1 (lt)
JP (1) JP3319605B2 (lt)
KR (1) KR0168669B1 (lt)
CN (1) CN1049248C (lt)
AT (1) ATE142263T1 (lt)
AU (1) AU630287B2 (lt)
BR (1) BR9101587A (lt)
CA (1) CA2040810C (lt)
CZ (1) CZ285440B6 (lt)
DE (2) DE4012818A1 (lt)
DK (1) DK0453969T3 (lt)
ES (1) ES2093043T3 (lt)
FI (1) FI911882L (lt)
GR (1) GR3021040T3 (lt)
HR (1) HRP940770A2 (lt)
HU (1) HU210358B (lt)
IE (1) IE911322A1 (lt)
IL (1) IL97903A0 (lt)
LT (1) LT3686B (lt)
LV (1) LV10494B (lt)
NO (1) NO911557L (lt)
NZ (1) NZ237882A (lt)
PL (2) PL169596B1 (lt)
PT (1) PT97427B (lt)
RU (1) RU2055892C1 (lt)
SK (1) SK110191A3 (lt)
TW (1) TW213487B (lt)
YU (1) YU48435B (lt)
ZA (1) ZA912937B (lt)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI103805B1 (fi) * 1990-09-05 1999-09-30 Hoechst Ag Menetelmä preproinsuliinien hydroloimiseksi
DK0600372T3 (da) 1992-12-02 1997-08-11 Hoechst Ag Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer.
ATE203998T1 (de) * 1993-04-27 2001-08-15 Hoechst Ag Amorphe monosphärische formen von insulinderivaten
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
CN1061375C (zh) * 1996-07-19 2001-01-31 中国科学院上海生物工程研究中心 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白
DK0821006T3 (da) 1996-07-26 2004-08-16 Aventis Pharma Gmbh Insulinderivater med öget zinkbinding
RU2122581C1 (ru) * 1997-11-27 1998-11-27 Закрытое акционерное общество "Фосфосорб" Штамм escherichia coli xli-blue/pinsr - продуцент препроинсулина
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
RU2162102C1 (ru) * 1999-09-08 2001-01-20 Головков Алексей Леонардович Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок с проинсулином человека (варианты)
US7795384B2 (en) 2003-06-03 2010-09-14 Shanghai Centre Of Research & Development Of New Drugs Fusion protein suitable for high efficiency expression and the production method thereof
RU2395296C1 (ru) * 2009-02-19 2010-07-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" Способ получения препарата проинсулина для перорального применения
CN104818291A (zh) * 2015-05-08 2015-08-05 江南大学 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
EP0161629A1 (de) 1984-05-17 1985-11-21 Hoechst Aktiengesellschaft Signalpeptid für die Exkretion von Peptiden in Streptomyceten
EP0290005A2 (de) 1987-05-06 1988-11-09 Andreas Dr. Plückthun Verfahren zur Herstellung eines genetisch codierbaren Polypeptids
EP0289936A2 (de) 1987-05-05 1988-11-09 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen in Streptomyceten
EP0292763A2 (de) 1987-05-19 1988-11-30 Hoechst Aktiengesellschaft Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Angiogeninen
EP0367163A2 (de) 1988-11-03 1990-05-09 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3707150A1 (de) * 1987-03-06 1988-09-15 Hoechst Ag Tendamistat-derivate
DE3843713A1 (de) * 1988-04-25 1989-11-02 Henkel Kgaa Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
EP0161629A1 (de) 1984-05-17 1985-11-21 Hoechst Aktiengesellschaft Signalpeptid für die Exkretion von Peptiden in Streptomyceten
EP0289936A2 (de) 1987-05-05 1988-11-09 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung von Fremdproteinen in Streptomyceten
EP0290005A2 (de) 1987-05-06 1988-11-09 Andreas Dr. Plückthun Verfahren zur Herstellung eines genetisch codierbaren Polypeptids
EP0292763A2 (de) 1987-05-19 1988-11-30 Hoechst Aktiengesellschaft Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Angiogeninen
EP0367163A2 (de) 1988-11-03 1990-05-09 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten

Also Published As

Publication number Publication date
HRP940770A2 (en) 1997-06-30
JPH04228086A (ja) 1992-08-18
HU210358B (en) 1995-04-28
PT97427A (pt) 1992-01-31
PL289953A1 (en) 1991-11-04
CZ110191A3 (en) 1993-08-11
EP0453969A1 (de) 1991-10-30
AU630287B2 (en) 1992-10-22
PT97427B (pt) 1998-08-31
CA2040810C (en) 2001-07-24
FI911882A7 (fi) 1991-10-22
HU911302D0 (en) 1991-10-28
JP3319605B2 (ja) 2002-09-03
KR910018551A (ko) 1991-11-30
ES2093043T3 (es) 1996-12-16
LV10494B (en) 1996-02-20
RU2055892C1 (ru) 1996-03-10
EP0453969B1 (de) 1996-09-04
YU69691A (sh) 1995-12-04
NO911557L (no) 1991-10-22
AU7515491A (en) 1991-10-24
KR0168669B1 (ko) 1999-01-15
YU48435B (sh) 1998-07-10
FI911882A0 (fi) 1991-04-18
HUT57268A (en) 1991-11-28
DK0453969T3 (lt) 1997-02-10
LV10494A (lv) 1995-02-20
GR3021040T3 (en) 1996-12-31
CN1049248C (zh) 2000-02-09
PL169596B1 (pl) 1996-08-30
ZA912937B (en) 1991-12-24
CA2040810A1 (en) 1991-10-22
FI911882L (fi) 1991-10-22
LTIP1523A (en) 1995-06-26
ATE142263T1 (de) 1996-09-15
IL97903A0 (en) 1992-06-21
DE59108128D1 (de) 1996-10-10
CZ285440B6 (cs) 1999-08-11
TW213487B (lt) 1993-09-21
IE911322A1 (en) 1991-10-23
BR9101587A (pt) 1991-12-10
CN1055952A (zh) 1991-11-06
PL169178B1 (pl) 1996-06-28
SK110191A3 (en) 1995-07-11
NZ237882A (en) 1993-12-23
NO911557D0 (no) 1991-04-19
DE4012818A1 (de) 1991-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4963495A (en) Secretion of heterologous proteins
JP3730255B2 (ja) イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質
EP0198015B2 (en) Production of streptavidin-like polypeptides
US6500645B1 (en) N-terminally extended proteins expressed in yeast
AU754435B2 (en) Modified E. coli enterotoxin II signal peptide and a microorganism expressing a fusion protein of said peptide and a heterologous protein
FI86887C (fi) Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning
JPH0779710B2 (ja) 酵母による組換ポリペプチドの製造方法
JP2001527387A (ja) 合成リーダーペプチド配列
IL95495A (en) Fusion proteins their preparation and use
LT3686B (en) Process for preparing fused proteins, gene structure, process for transformation of hybride and streptomycetes cells
JPS62164695A (ja) Ｇｍ−ｃｓｆタンパク質、その誘導体、このタイプのタンパク質の調製及びそれらの用途
NZ238095A (en) Dna coding for signal peptide, vectors and preparation of desired proteins using the signal peptide
JPH04502851A (ja) 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム
JPH10511845A (ja) 細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法
WO1988007079A1 (en) Expression of heterologous genes in streptomyces species
EP0225860B1 (en) A method to export gene products to the growth medium of gram negative bacteria
EP0352073A1 (en) Vectors, cells transformed thereby, and their use in producing heterologous polypeptides
US5426036A (en) Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
WO1984000380A1 (en) Vector
FI97549B (fi) Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa
EP0314184B1 (en) Expression plasmids
KR940004543B1 (ko) 이.콜라이의 trp 발현 시스템을 갖는 벡터를 제조하는 방법
CA2064577A1 (en) Modified proteases and their use in foodstuffs
KR930001388B1 (ko) 면역 글로불린의 Fc 부분의 변형된 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA를 이용한 새로운 융합 발현벡터의 제조방법
WO1995010620A1 (en) A plasmid vector useful for the expression of a foreign dna sequence