HU210358B - Process for producing of a genetic structure, an expression vector and fused proteins - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás idegen proteinek előállítására streptomyces-ben.

Az EP-A 0 289 936 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentés szerint fúziós proteinek úgy állíthatók elő, hogy a kívánt proteint kódoló szerkezeti gént az adott esetben módosított tendamisztát-gén kódoló szálának 3’-végére kapcsolják, a kapott génszerkezetet streptomycetes-gazdasejtben kifejezik és a kiválasztott fúziós proteint a felülúszóból elkülönítik. Egy előnyös kiviteli mód szerint a tendamisztát-gén 3’-végét megkurtítják. Ehhez az alábbi restrikciós enzimek vágóhelyeit használják: BstEII (a 31. és 32. triplett táján), Stul (43. és 44. triplett) és Sau3 A (az 52. és 53. triplett tartományában).

E találmányi gondolat továbbfejlesztése során már javasolták olyan fúziós protein előállítását, amelyben a tendamisztát-részt rövidített proinzulin követi, olyan proinzulin, amelynek C-lánca csak egy vagy két lizin-csoportból áll („mini-proinzulin”). Egyéb továbbfejlesztésként olyan proteint javasoltak, amelyben a tendamisztát-rész is rövidített (1990. május 9-én 0 367 163 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentés).

Meglepő módon azt találtuk, hogy nagyon rövid tendamisztát-részt tartalmazó fúziós proteinek a streptomyces-sejtben stabilak és a közegbe kijutnak. Ezek a fúziós proteinek az igen rövid tendamisztát-lánc következtében „érett” proteinként viselkednek, a közegbe kijutnak, harmadlagos szerkezetük általában már a megfelelő.

A 0 177 827 sz. publikált európai szabadalmi bejelentésből ismert egy mesterségesen előállított jelzőszekvencia proteinek expressziós rendszerekben történő transzportjához, amelyre jellemző, hogy a DNS lényegében természetes jelzőszekvenciának felel meg, de egy vagy több endonukleáz-vágó helyet tartalmaz, amely a természetes DNS-ben nincs. Ha a transzportálni kívánt proteint kódoló gént ilyen DNS-szekvenciához kapcsolják, az így kapott fúziós gént vektorba építik és ezzel olyan gazdasejtet transzformáinak, amelyben a protein kifejeződik és a citoplazmából transzportálódik, akkor eukarióta, prokarióta vagy vírusos proteint lehet előállítani prokarióta és eukarióta sejtekben. Az alkálikus foszfatáz (egy periplazmás protein) példáján kimutatják, hogy E. coli-ben történő kifejezés esetén előnyös, ha a preszekvenciát követően az alkálikus foszfatáz kb. első 40 aminosavának kodonjait a kívánt protein elé teszik. Sok esetben kevesebb plusz-aminosav is elég, például 10, vagy előnyösen kb. 5. Egy ennek megfelelő, majom-proinzulinnel alkotott fúziós protein mintegy 90 %-a a periplazmás térbe transzportálódott.

A PCT/W091/03550 (1989. 08. 29.) és a PCT/US90/04840 (1990. 08. 28.) nemzetközi bejelentések szerint fúziós proteint úgy állítanak elő, hogy a fúziós protein ballasztrészét kódoló oligonukleotidet szerkesztenek és ezt az oligonukleotidet oly módon illesztik vektorba, hogy működőképesen egy szabályozó szakaszhoz, valamint a kívánt protein szerkezeti génjéhez kapcsolódik. A kapott plazmidpopulációval alkalmas gazdasejteket transzformáinak és a kódolt fúziós proteint nagy hozammal termelő kiónokat elkülönítik. Az oligonukleotid előnyösen 4-12, különösen előnyösen 4-8 triplettből áll.

Megkísérelték már rövid ballaszt-résszel rendelkező fúziós proteinek előállítását, így például olyan öszszetett gént szerkesztettek, amely a β-galaktozidáz első 10 aminosavából és szomatosztatinból álló fúziós proteint kódol. Kiderült azonban, hogy a rövid β-galaktozidáz-ffagmens nem volt képes arra, hogy a fúziós proteint a gazdasejt proteázai okozta lebontástól megvédje (4 366 246 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 15. hasábjának 2. bek.). Ennek megfelelően a 0 290 005 és a 0 292 763 sz. publikált európai szabadalmi bejelentések ballasztrészként 250-nél több aminosavat magába foglaló β-galaktozidázfragmenst tartalmazó fúziós proteinekre vonatkoznak.

Meglepő módon azonban olyan fúziós protein, amely a tendamisztát kb. első 10 aminoterminális aminosavából, valamint a kívánt proteinből áll, streptomyces gazdasejtekben stabil, a sejt a közegbe választja ki a proteint, ahonnan nagy hozammal nyerhető ki. Meglepő módon ez viszonylag kicsi proteinekre, így „miniproinzulinokra” is érvényes.

A „körülbelül 10 aminosav” terminusz itt azt jelenti, hogy 10-nél kevesebb aminosav is lehet, például a tendamisztát első 7 N-terminális aminosava, de előnyösen 10nél nem több. Előnyben részesítjük az olyan fúziós proteint, amelynek tendamisztát-részében a 7. és/vagy 9. helyen prolin van (akár a természetes szekvenciában). Természetesen a már ismert vagy javasolt kiviteli módoknak megfelelően nagyobb tendamisztát-ballasztrészt is választhatunk, ez esetben viszont a kisebb ballaszt előnyei többé-kevésbé elvesznek.

Lehetséges, sőt előnyös is, ha a tendamisztát-rész természetes aminosav-szekvenciáját megváltoztatjuk, azaz aminosavakat kicserélünk, kihagyunk vagy olyan aminosavakat beillesztünk, amelyek a természetes szekvenciában nem szerepelnek. A jelzópeptid aminosav-sorrendjét is változtathatjuk.

A találmányi gondolat ismeretében különösen előnyös fúziós szerkezeteket egyszerű előkísérletekkel határozhatunk meg.

A találmányi gondolatot más Gram-pozitív baktériumsejtekben, például Bacillus- vagy Staphylococcus-sejtekben valósíthatjuk meg, olyan jelzőszekvenciát alkalmazva, amelyet az említett gazdasejtek „felismernek”.

A találmány szerint előállított fúziós proteinek a közegben oldott formában vannak jelen, aminek a feldolgozás és a tisztítás szempontjából számos előnye van. így például feldolgozás nélkül a ballasztrészt mindjárt enzimesen lehasíthatjuk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a terméket feldúsítjuk vagy tisztítjuk, például affmitás-kromatográfiával, ultraszűréssel, kicsapással, ioncserélő kromatográfiával, adszorpciós kromatográfiával, gélszűréssel vagy nagynyomású folyadék kromatográfiával.

Az alábbi példákkal a találmányt közelebbről ismertetjük.

A plazmid-szerkezetek kiindulási anyaga a pKK500 jelű plazmid, amelyet a 0 367 163 sz. európai szabadalmi bejelentésben írnak le. Ez a plazmid a

HU 210 358 Β

289 936 sz. európai szabadalmi leírásban ismertetett pKK400 jelű plazmidtól abban különbözik, hogy proinzulin-gén helyett analóg gént tartalmaz, amelynek C-lánca azonban csupán a lizin aminosavat kódolja; további különbség, hogy e „mini-proinzulirí’gént terminátor-szekvenciát követi. A mini-proinzulin-gén, illetve a terminátor-szekvencia szerkezetét az 1/1 rajzlapon közöljük (a két szekvencia a 0 367 163 sz. európai szabadalmi bejelentésből származik.)

A pKK400 és a pKK500 plazmidok az a-amiláz-inhibitor jelzőszekvenciájában XmalII-vágóhelyet tartalmaznak (a -5. és -7. triplett közötti szakaszon).

1. példa

A pKK500 plazmidot EcoRI és XmalII restrikciós enzimekkel nyitjuk, a nagy fragmenst 0,8 %-os agarózgélen elektroforetikusan elválasztjuk és elektroeluálás5 sál elkülönítjük. Ezt a fragmenst a foszforamidit-módszerrel szintetizált, a mellékelt 1. táblázatban részletezett (1) jelű szerkezetű DNS-fragmenssel (SEQ ID NO:1) ligáljuk. A ligálás reakcióelegyével E. coli-t transzformálunk. Az így kapott pKK510 jelű plazmid olyan preproinzulint kódol, amelyben a tendamisztát jelzőszekvenciáját a tendamisztát első 7 aminosava, majd a mini-proinzulin-lánc követi.

1. táblázat

	-5 Alá Gly Pro	Alá	Ser	-1 Alá
5' i	3 GCC GGG	CCG	GCC	TCC	GCC
3'	CCC	GGC	CGG	AGG	CGG
	(XmalII)
Asp	Thr Thr	Val	Ser	Glu	Pro
GAC	ACG ACC	GTC	TCC	GAG	CCG	3'
CTG	TGC TGG	CAG	AGG	CTC	GGC TTA A	5'

(EcoRI)

SEQ ID NO:1

2. példa

A 0 289 936 sz. európai szabadalmi bejelentésben leírták a pKK400 plazmid pGFl expressziós plazmiddá alakítását; ehhez analóg módon a pKK510 plazmidot pKFl expressziós plazmiddá alakítjuk:

A pKK510 elkülönített plazmid-DNS-át a Sphl és SstI restrikciós enzimekkel vágjuk, és a fúziós gént tartalmazó kisebb fragmenst izoláljuk. A kereskedelemben kapható pIJ702 expressziós plazmidot (kapható a John Innes Foundationnál, Norwich, Anglia) ugyanezekkel az enzimekkel vágjuk és a nagy fragmenst elkülönítjük. A két elkülönített fragmenst ligáljuk, a ligálás elegyével a S. Lividans TK 24 törzset transzformáljuk, és a tiostreptonnal szemben rezisztens, fehér (azaz melanintermelésre nem képes) transzformált mikroorganizmusokból a plazmidot izoláljuk. A beépített szakaszt hordozó kiónok fúziós proteintermelő képességét rázott tenyészetben vizsgáljuk.

A kódolt fúziós protein kifejeződése ismert módon történik: a transzformált törzset 4 napon keresztül

Alá Gly Pro Alá

5' G GCC GGG CCG GCC

3' CCC GGC CGG (XmalII) °C-on rázott lombikban tenyésztjük (eszközök, közeg lásd Biotechnology Vol. 7, 1989, 1055-1059), a micéliumot centrifugálással elválasztjuk, és a képződött fúziós proteint a szűrletben kimutatjuk. Ehhez i 20 μΐ szűrletet 15 %-os poliakrilamid-gélen elektroforetikusan alkotóivá bontjuk és a géllemezt COOMASSIE-kékkel festjük. A fúziós protein járulékos proteinsávként jelenik meg; ez a sáv csak pIJ 702 plazmiddal transzformált törzzsel végzett párhuzamos kísérlet esei tén nem jelenik meg.

Ha a tenyészet szűrletét lizil-endoproteinázzal kezeljük, gélelektroforetikus úton Dez-(B30)-Thr-inzulint mutathatunk ki, amelyet autentikus mintával összehasonlítva azonosítunk. A szűrletben a fúziós proteint i inzulin-antitestekkel, Immuno-BLOT vagy inzulinRIA (tesztmódszerek) segítségével is kimutathatjuk.

3. példa

Az 1. és 2. példa szerint járunk el, de az (1) képletű ί fragmens helyett a (2) képletű szintetikus fragmenst építjük be a plazmidba:

-1 SEQ ID NO:2

Ser Alá TCC GCC AGG CGG

Asp	Thr	Thr	Val	5 Ser	Glu	Pro	Asp	Pro
GAC	ACG	ACC	GTC	TCC	GAG	CCC	GAC	CCG
CTG	TGC	TGG	CAG	AGG	CTC	GGG	CTG	GGC TTA A
(EcoRI)

HU 210 358 Β és a pKK520, illetve pKF2 plazmidhoz jutunk. Ezek olyan fúziós proteint kódolnak, amelyben - az 1. és 2. példában bemutatottal ellentétben - a tendamisztát első 7 aminosavát aszparagin (a természetes aminosav alanin helyett) követi, és ezután a tendamisztát 9. amino- 5 sava, a prolin következik. Az alanin-aszparagin csere révén járulékos pozitív töltést vittünk be a fúziós protein ballasztrészébe. Meglepő módon a hozam - a 2.

példáéhoz viszonyítva - mintegy 20-30 %-kal magasabb.

4. példa

Az 1. és 2. példa szerint járunk el, de az (1) képletű fragmens helyett a (3) képletű szintetikus fragmenst építjük be a plazmidba:

-5 Alá Gly	-1 Pro Alá Ser Alá	(3)
5' G GCC	GGG	CCG	GCC	TCC	GCC	SEQ ID NO:3
3'	CCC	GGC	CGG	AGG	CGG

(XmalII)

Asp	Thr	Thr	Val	5 Ser	Glu	Pro	Alá	Pro
GAC	ACG	ACC	GTC	TCC	GAG	CCC	GCA	CCG	3'
CTG	TGC	TGG	CAG	AGG	CTC	GGG	CGT	GGC TTA A	5'

és a pKK530, illetve pKF3 plazmidokhoz jutunk. Ezek a tendamisztát első 9 természetes aminosavát kódolják. A 2. példára vonatkoztatva a hozam mintegy 20 %-kal magasabb.

5. példa

A pKK500 plazmid által kódolt fúziós protein a tendamisztát-rész és a proinzulin B-lánca között linkerszekvenciát (közbenső szakaszt) tartalmaz, amely az Asn-Ser-Asn-Gly-Lys szekvenciából áll. A lánc végén elhelyezkedő Lys, valamint a C-láncot képező Lys ar20 gininre történő kicserélése az alábbiak szerint történik. A proinzulin-szekvencia B30 és Al közötti kodonjainak tartományában lévő szinguláris Styl-vágóhelyet alkalmazzuk.

A pKK500 elkülönített DNS-át StyI enzimmel vág25 juk, a túlnyúló végek eltávolítására Sl-nukleázzal emésztjük, és a nukleáz feleslegét fenol és kloroform elegy ével extraháljuk. A kiegyenesített plazmidot EcoRI enzimmel utóvágjuk, a nagy fragmenst elektroforetikusan elválasztjuk és elektroeluálással elkülönítjük.

Ezt a fragmenst a (4) képletű szintetikus fragmenssel (SEQ ID NO:4) ligáljuk.

B1 10

Asn

Ser

Asn

Gly

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

AAT

TCG

AAC

GGC

CGC

TTC

GTC

AAC

CAG

CAC

CTG

TGC

GGC

TCG

CAC

GC

TTG

CCG

GCG

AAG

CAG

TTG

GTC

GTG

GAC

ACG

CCG

AGC

GTG

(EcoRI)

20

30

Leu

Val

Glu

Alá

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

CTC

GTG

GAG

GCC

CTC

TAC

CTG

GTG

TGC

GGG

GAG

CGC

GGC

TTC

TTC

GAG

CAC

CTC

CGG

GAG

ATG

GAC

CAC

ACG

CCC

CTC

GCG

CCG

AAG

AAG

B30

C(B31)

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

(4)

TAC

ACC

CCC

AAG

ACC

CGC

(SEQ

ID NO:4)

ATG

TGG

GGG

TTC

TGG

GCG

A ligálás elegyével E. coli törzset transzformálunk. A kiónokat a bennük lévő plazmidok restrikciós elemzésével vizsgáljuk, az újonnan keletkezett SstlI-vágóhelyet használva. Az Sphl- és Sstl-vágóhelyek közötti teljes szekvenciát szekvenciaelemzésnek vetjük alá.

A kódolt fúziós protein előállítására a szekvenciaelemzéssel vizsgált fragmenst a nála használt enzimekkel vágott pU702 vektorral ligáljuk, aminek során a pGF4 expressziós vektorhoz jutunk.

A pGF4 plazmid által kódolt, majd termelt fúziós protein kimutatása egyrészt az α-amilázinhibitor lemezteszttel (lásd 0 161 629 sz. európai szabadalmi bejelentés 3. példája), vagy a 2. példában megadott módon a rázott tenyészet szűrletében történhet.

6. példa

Ha az 5. példában leírtak szerint a (4) képletű fragmenst a pKK510, 520 és 530 plazmidokba építjük, a pKK610,620 illetve 630 vektorokhoz jutunk. Az azokból kivett, a fúziós proteint kódoló SphI-Sstl-fragmenst a pU702 vetorba illesztve a pKFll, 12 és 13 jelű expreszsziós vektorokat kapjuk. A kiválasztott fúziós proteinek meglétét a 2. példában leírtak szerint ellenőrizzük.

7. példa

A pU702 plazmid származékainak jobb kifejeződése érdekében a melaninpromotort PstI és Sphl enzimekkel végzett emésztés útján eltávolítjuk, helyette az alábbi (5) képletű szintetikus szekvenciát illesztjük bele:

HU 210 358 Β

Pstl BCII

20 30 40 50

CTGCAGTGATCAGGGGGACCCTTGTGCGAATTTCCGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGG GACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC

Sphl

70 80

ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGC

TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG (5) így a szintetikus promotorból és a tendamisztát-promotorból tandem-szerkezet lesz. A plazmid neve: pGRllO.

A pGRllO plazmidot Sphl és SstI enzimekkel vágjuk, és az (1), (2), illetve (3) képletű szintetikus fragmenst illesztjük bele, így a pGR200, 210 és 220 plazmidot kapjuk. Analóg módon a (4) képletű fragmenssel a pGR250, 260 és 270 expressziós vektorokat kapjuk.

8. példa

Ha inzulin-prekurzorból humáninzulint kívánunk 20 előállítani tripszin vagy tripszin jellegű enzim és B-karboxidáz kombinációjával végzett enzimes bontás útján, akkor előnyös, ha az aminoterminális ballasztrészt gyorsan hasítjuk le, így a B31(Arg)-inzulin felé vezető reakciót elősegítve. Ez a BI aminosav (Phe) előtti aminosavak módosításával lehetséges: Az 1. példa szerint a pKK500 plazmidot EcoRI és DralII enzimekkel nyitjuk, és az eredeti fragmenst a foszforamidit-módszerrel előállított (6) képletű mesterséges DNS-fragmenssel (SEQ ID NO:6) helyettesítjük.

Asn	Ser	Alá	Arg	BI Phe	Val
ATT	TCG	GCC	CGC	TTC	GTC
	GC	CGG	GCG	AAG	CAG

(EcoRI)

Asn Gin AAC CAG TTG GTC (5)

His	Leu	Cys	Gly	Ser	His Leu
CAC	CTG	TGC	GGC	TCG	CAC CTC	3
GTG	GAC	ACG	CCG	AGC	GTG	5
					(DralII)

E. coli-ban végzett klónozás, majd streptomyces-ben végzett kifejeződés az 1. és 2. példa szerint a pKK640 plazmidhoz illetve a pKF14 expressziós plazmidhoz vezet.

Hasonlóképpen az 5. példa szerint a (4) képletű fragmenst tartalmazó plazmiddal is járhatunk el, így a pKK650 illetve a pKF15 plazmidot kapunk.

Claims (4)

1. Eljárás génszerkezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy tendamisztát gén jelzőszekvenciáját és első 7-10. aminoterminális aminosavának kodonjait, mely első 7-10 aminosav egyes kodonjait adott esetben kicseréljük, adott esetben linkerszekvencia közbeiktatásával más protein szerkezeti génjéhez kapcsoljuk.

2. Eljárás expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított génszerkezetet streptomyces-vektorba építjük.

3. Eljárás streptomyces sejt transzformálására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított expressziós vektort a sejtbejuttatjuk.

4. Eljárás fúziós proteinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerint transzformált streptomyces sejteket folyékony tápközegben tenyésztjük, és a tápközegbe kiválasztott fúziós proteint a tápközegből elkülönítjük.