HU210358B - Process for producing of a genetic structure, an expression vector and fused proteins - Google Patents

Process for producing of a genetic structure, an expression vector and fused proteins Download PDF

Info

Publication number
HU210358B
HU210358B HU911302A HU130291A HU210358B HU 210358 B HU210358 B HU 210358B HU 911302 A HU911302 A HU 911302A HU 130291 A HU130291 A HU 130291A HU 210358 B HU210358 B HU 210358B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
fusion protein
gene
sequence
fragment
Prior art date
Application number
HU911302A
Other languages
English (en)
Other versions
HU911302D0 (en
HUT57268A (en
Inventor
Klaus Peter Koller
Guenther Riess
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of HU911302D0 publication Critical patent/HU911302D0/hu
Publication of HUT57268A publication Critical patent/HUT57268A/hu
Publication of HU210358B publication Critical patent/HU210358B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás idegen proteinek előállítására streptomyces-ben.
Az EP-A 0 289 936 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentés szerint fúziós proteinek úgy állíthatók elő, hogy a kívánt proteint kódoló szerkezeti gént az adott esetben módosított tendamisztát-gén kódoló szálának 3’-végére kapcsolják, a kapott génszerkezetet streptomycetes-gazdasejtben kifejezik és a kiválasztott fúziós proteint a felülúszóból elkülönítik. Egy előnyös kiviteli mód szerint a tendamisztát-gén 3’-végét megkurtítják. Ehhez az alábbi restrikciós enzimek vágóhelyeit használják: BstEII (a 31. és 32. triplett táján), Stul (43. és 44. triplett) és Sau3 A (az 52. és 53. triplett tartományában).
E találmányi gondolat továbbfejlesztése során már javasolták olyan fúziós protein előállítását, amelyben a tendamisztát-részt rövidített proinzulin követi, olyan proinzulin, amelynek C-lánca csak egy vagy két lizin-csoportból áll („mini-proinzulin”). Egyéb továbbfejlesztésként olyan proteint javasoltak, amelyben a tendamisztát-rész is rövidített (1990. május 9-én 0 367 163 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentés).
Meglepő módon azt találtuk, hogy nagyon rövid tendamisztát-részt tartalmazó fúziós proteinek a streptomyces-sejtben stabilak és a közegbe kijutnak. Ezek a fúziós proteinek az igen rövid tendamisztát-lánc következtében „érett” proteinként viselkednek, a közegbe kijutnak, harmadlagos szerkezetük általában már a megfelelő.
A 0 177 827 sz. publikált európai szabadalmi bejelentésből ismert egy mesterségesen előállított jelzőszekvencia proteinek expressziós rendszerekben történő transzportjához, amelyre jellemző, hogy a DNS lényegében természetes jelzőszekvenciának felel meg, de egy vagy több endonukleáz-vágó helyet tartalmaz, amely a természetes DNS-ben nincs. Ha a transzportálni kívánt proteint kódoló gént ilyen DNS-szekvenciához kapcsolják, az így kapott fúziós gént vektorba építik és ezzel olyan gazdasejtet transzformáinak, amelyben a protein kifejeződik és a citoplazmából transzportálódik, akkor eukarióta, prokarióta vagy vírusos proteint lehet előállítani prokarióta és eukarióta sejtekben. Az alkálikus foszfatáz (egy periplazmás protein) példáján kimutatják, hogy E. coli-ben történő kifejezés esetén előnyös, ha a preszekvenciát követően az alkálikus foszfatáz kb. első 40 aminosavának kodonjait a kívánt protein elé teszik. Sok esetben kevesebb plusz-aminosav is elég, például 10, vagy előnyösen kb. 5. Egy ennek megfelelő, majom-proinzulinnel alkotott fúziós protein mintegy 90 %-a a periplazmás térbe transzportálódott.
A PCT/W091/03550 (1989. 08. 29.) és a PCT/US90/04840 (1990. 08. 28.) nemzetközi bejelentések szerint fúziós proteint úgy állítanak elő, hogy a fúziós protein ballasztrészét kódoló oligonukleotidet szerkesztenek és ezt az oligonukleotidet oly módon illesztik vektorba, hogy működőképesen egy szabályozó szakaszhoz, valamint a kívánt protein szerkezeti génjéhez kapcsolódik. A kapott plazmidpopulációval alkalmas gazdasejteket transzformáinak és a kódolt fúziós proteint nagy hozammal termelő kiónokat elkülönítik. Az oligonukleotid előnyösen 4-12, különösen előnyösen 4-8 triplettből áll.
Megkísérelték már rövid ballaszt-résszel rendelkező fúziós proteinek előállítását, így például olyan öszszetett gént szerkesztettek, amely a β-galaktozidáz első 10 aminosavából és szomatosztatinból álló fúziós proteint kódol. Kiderült azonban, hogy a rövid β-galaktozidáz-ffagmens nem volt képes arra, hogy a fúziós proteint a gazdasejt proteázai okozta lebontástól megvédje (4 366 246 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 15. hasábjának 2. bek.). Ennek megfelelően a 0 290 005 és a 0 292 763 sz. publikált európai szabadalmi bejelentések ballasztrészként 250-nél több aminosavat magába foglaló β-galaktozidázfragmenst tartalmazó fúziós proteinekre vonatkoznak.
Meglepő módon azonban olyan fúziós protein, amely a tendamisztát kb. első 10 aminoterminális aminosavából, valamint a kívánt proteinből áll, streptomyces gazdasejtekben stabil, a sejt a közegbe választja ki a proteint, ahonnan nagy hozammal nyerhető ki. Meglepő módon ez viszonylag kicsi proteinekre, így „miniproinzulinokra” is érvényes.
A „körülbelül 10 aminosav” terminusz itt azt jelenti, hogy 10-nél kevesebb aminosav is lehet, például a tendamisztát első 7 N-terminális aminosava, de előnyösen 10nél nem több. Előnyben részesítjük az olyan fúziós proteint, amelynek tendamisztát-részében a 7. és/vagy 9. helyen prolin van (akár a természetes szekvenciában). Természetesen a már ismert vagy javasolt kiviteli módoknak megfelelően nagyobb tendamisztát-ballasztrészt is választhatunk, ez esetben viszont a kisebb ballaszt előnyei többé-kevésbé elvesznek.
Lehetséges, sőt előnyös is, ha a tendamisztát-rész természetes aminosav-szekvenciáját megváltoztatjuk, azaz aminosavakat kicserélünk, kihagyunk vagy olyan aminosavakat beillesztünk, amelyek a természetes szekvenciában nem szerepelnek. A jelzópeptid aminosav-sorrendjét is változtathatjuk.
A találmányi gondolat ismeretében különösen előnyös fúziós szerkezeteket egyszerű előkísérletekkel határozhatunk meg.
A találmányi gondolatot más Gram-pozitív baktériumsejtekben, például Bacillus- vagy Staphylococcus-sejtekben valósíthatjuk meg, olyan jelzőszekvenciát alkalmazva, amelyet az említett gazdasejtek „felismernek”.
A találmány szerint előállított fúziós proteinek a közegben oldott formában vannak jelen, aminek a feldolgozás és a tisztítás szempontjából számos előnye van. így például feldolgozás nélkül a ballasztrészt mindjárt enzimesen lehasíthatjuk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a terméket feldúsítjuk vagy tisztítjuk, például affmitás-kromatográfiával, ultraszűréssel, kicsapással, ioncserélő kromatográfiával, adszorpciós kromatográfiával, gélszűréssel vagy nagynyomású folyadék kromatográfiával.
Az alábbi példákkal a találmányt közelebbről ismertetjük.
A plazmid-szerkezetek kiindulási anyaga a pKK500 jelű plazmid, amelyet a 0 367 163 sz. európai szabadalmi bejelentésben írnak le. Ez a plazmid a
HU 210 358 Β
289 936 sz. európai szabadalmi leírásban ismertetett pKK400 jelű plazmidtól abban különbözik, hogy proinzulin-gén helyett analóg gént tartalmaz, amelynek C-lánca azonban csupán a lizin aminosavat kódolja; további különbség, hogy e „mini-proinzulirí’gént terminátor-szekvenciát követi. A mini-proinzulin-gén, illetve a terminátor-szekvencia szerkezetét az 1/1 rajzlapon közöljük (a két szekvencia a 0 367 163 sz. európai szabadalmi bejelentésből származik.)
A pKK400 és a pKK500 plazmidok az a-amiláz-inhibitor jelzőszekvenciájában XmalII-vágóhelyet tartalmaznak (a -5. és -7. triplett közötti szakaszon).
1. példa
A pKK500 plazmidot EcoRI és XmalII restrikciós enzimekkel nyitjuk, a nagy fragmenst 0,8 %-os agarózgélen elektroforetikusan elválasztjuk és elektroeluálás5 sál elkülönítjük. Ezt a fragmenst a foszforamidit-módszerrel szintetizált, a mellékelt 1. táblázatban részletezett (1) jelű szerkezetű DNS-fragmenssel (SEQ ID NO:1) ligáljuk. A ligálás reakcióelegyével E. coli-t transzformálunk. Az így kapott pKK510 jelű plazmid olyan preproinzulint kódol, amelyben a tendamisztát jelzőszekvenciáját a tendamisztát első 7 aminosava, majd a mini-proinzulin-lánc követi.
1. táblázat
-5 Alá Gly Pro Alá Ser -1 Alá
5' i 3 GCC GGG CCG GCC TCC GCC
3' CCC GGC CGG AGG CGG
(XmalII)
Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCG 3'
CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A 5'
(EcoRI)
SEQ ID NO:1
2. példa
A 0 289 936 sz. európai szabadalmi bejelentésben leírták a pKK400 plazmid pGFl expressziós plazmiddá alakítását; ehhez analóg módon a pKK510 plazmidot pKFl expressziós plazmiddá alakítjuk:
A pKK510 elkülönített plazmid-DNS-át a Sphl és SstI restrikciós enzimekkel vágjuk, és a fúziós gént tartalmazó kisebb fragmenst izoláljuk. A kereskedelemben kapható pIJ702 expressziós plazmidot (kapható a John Innes Foundationnál, Norwich, Anglia) ugyanezekkel az enzimekkel vágjuk és a nagy fragmenst elkülönítjük. A két elkülönített fragmenst ligáljuk, a ligálás elegyével a S. Lividans TK 24 törzset transzformáljuk, és a tiostreptonnal szemben rezisztens, fehér (azaz melanintermelésre nem képes) transzformált mikroorganizmusokból a plazmidot izoláljuk. A beépített szakaszt hordozó kiónok fúziós proteintermelő képességét rázott tenyészetben vizsgáljuk.
A kódolt fúziós protein kifejeződése ismert módon történik: a transzformált törzset 4 napon keresztül
Alá Gly Pro Alá
5' G GCC GGG CCG GCC
3' CCC GGC CGG (XmalII) °C-on rázott lombikban tenyésztjük (eszközök, közeg lásd Biotechnology Vol. 7, 1989, 1055-1059), a micéliumot centrifugálással elválasztjuk, és a képződött fúziós proteint a szűrletben kimutatjuk. Ehhez i 20 μΐ szűrletet 15 %-os poliakrilamid-gélen elektroforetikusan alkotóivá bontjuk és a géllemezt COOMASSIE-kékkel festjük. A fúziós protein járulékos proteinsávként jelenik meg; ez a sáv csak pIJ 702 plazmiddal transzformált törzzsel végzett párhuzamos kísérlet esei tén nem jelenik meg.
Ha a tenyészet szűrletét lizil-endoproteinázzal kezeljük, gélelektroforetikus úton Dez-(B30)-Thr-inzulint mutathatunk ki, amelyet autentikus mintával összehasonlítva azonosítunk. A szűrletben a fúziós proteint i inzulin-antitestekkel, Immuno-BLOT vagy inzulinRIA (tesztmódszerek) segítségével is kimutathatjuk.
3. példa
Az 1. és 2. példa szerint járunk el, de az (1) képletű ί fragmens helyett a (2) képletű szintetikus fragmenst építjük be a plazmidba:
-1 SEQ ID NO:2
Ser Alá TCC GCC AGG CGG
Asp Thr Thr Val 5 Ser Glu Pro Asp Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG
CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CTG GGC TTA A
(EcoRI)
HU 210 358 Β és a pKK520, illetve pKF2 plazmidhoz jutunk. Ezek olyan fúziós proteint kódolnak, amelyben - az 1. és 2. példában bemutatottal ellentétben - a tendamisztát első 7 aminosavát aszparagin (a természetes aminosav alanin helyett) követi, és ezután a tendamisztát 9. amino- 5 sava, a prolin következik. Az alanin-aszparagin csere révén járulékos pozitív töltést vittünk be a fúziós protein ballasztrészébe. Meglepő módon a hozam - a 2.
példáéhoz viszonyítva - mintegy 20-30 %-kal magasabb.
4. példa
Az 1. és 2. példa szerint járunk el, de az (1) képletű fragmens helyett a (3) képletű szintetikus fragmenst építjük be a plazmidba:
-5 Alá Gly -1 Pro Alá Ser Alá (3)
5' G GCC GGG CCG GCC TCC GCC SEQ ID NO:3
3' CCC GGC CGG AGG CGG
(XmalII)
Asp Thr Thr Val 5 Ser Glu Pro Alá Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCG 3'
CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CGT GGC TTA A 5'
és a pKK530, illetve pKF3 plazmidokhoz jutunk. Ezek a tendamisztát első 9 természetes aminosavát kódolják. A 2. példára vonatkoztatva a hozam mintegy 20 %-kal magasabb.
5. példa
A pKK500 plazmid által kódolt fúziós protein a tendamisztát-rész és a proinzulin B-lánca között linkerszekvenciát (közbenső szakaszt) tartalmaz, amely az Asn-Ser-Asn-Gly-Lys szekvenciából áll. A lánc végén elhelyezkedő Lys, valamint a C-láncot képező Lys ar20 gininre történő kicserélése az alábbiak szerint történik. A proinzulin-szekvencia B30 és Al közötti kodonjainak tartományában lévő szinguláris Styl-vágóhelyet alkalmazzuk.
A pKK500 elkülönített DNS-át StyI enzimmel vág25 juk, a túlnyúló végek eltávolítására Sl-nukleázzal emésztjük, és a nukleáz feleslegét fenol és kloroform elegy ével extraháljuk. A kiegyenesített plazmidot EcoRI enzimmel utóvágjuk, a nagy fragmenst elektroforetikusan elválasztjuk és elektroeluálással elkülönítjük.
Ezt a fragmenst a (4) képletű szintetikus fragmenssel (SEQ ID NO:4) ligáljuk.
B1 10
Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His
AAT TCG AAC GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
GC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
(EcoRI)
20 30
Leu Val Glu Alá Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC
GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
B30 C(B31)
Tyr Thr Pro Lys Thr Arg (4)
TAC ACC CCC AAG ACC CGC (SEQ ID NO:4)
ATG TGG GGG TTC TGG GCG
A ligálás elegyével E. coli törzset transzformálunk. A kiónokat a bennük lévő plazmidok restrikciós elemzésével vizsgáljuk, az újonnan keletkezett SstlI-vágóhelyet használva. Az Sphl- és Sstl-vágóhelyek közötti teljes szekvenciát szekvenciaelemzésnek vetjük alá.
A kódolt fúziós protein előállítására a szekvenciaelemzéssel vizsgált fragmenst a nála használt enzimekkel vágott pU702 vektorral ligáljuk, aminek során a pGF4 expressziós vektorhoz jutunk.
A pGF4 plazmid által kódolt, majd termelt fúziós protein kimutatása egyrészt az α-amilázinhibitor lemezteszttel (lásd 0 161 629 sz. európai szabadalmi bejelentés 3. példája), vagy a 2. példában megadott módon a rázott tenyészet szűrletében történhet.
6. példa
Ha az 5. példában leírtak szerint a (4) képletű fragmenst a pKK510, 520 és 530 plazmidokba építjük, a pKK610,620 illetve 630 vektorokhoz jutunk. Az azokból kivett, a fúziós proteint kódoló SphI-Sstl-fragmenst a pU702 vetorba illesztve a pKFll, 12 és 13 jelű expreszsziós vektorokat kapjuk. A kiválasztott fúziós proteinek meglétét a 2. példában leírtak szerint ellenőrizzük.
7. példa
A pU702 plazmid származékainak jobb kifejeződése érdekében a melaninpromotort PstI és Sphl enzimekkel végzett emésztés útján eltávolítjuk, helyette az alábbi (5) képletű szintetikus szekvenciát illesztjük bele:
HU 210 358 Β
Pstl BCII
20 30 40 50
CTGCAGTGATCAGGGGGACCCTTGTGCGAATTTCCGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGG GACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC
Sphl
70 80
ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGC
TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG (5) így a szintetikus promotorból és a tendamisztát-promotorból tandem-szerkezet lesz. A plazmid neve: pGRllO.
A pGRllO plazmidot Sphl és SstI enzimekkel vágjuk, és az (1), (2), illetve (3) képletű szintetikus fragmenst illesztjük bele, így a pGR200, 210 és 220 plazmidot kapjuk. Analóg módon a (4) képletű fragmenssel a pGR250, 260 és 270 expressziós vektorokat kapjuk.
8. példa
Ha inzulin-prekurzorból humáninzulint kívánunk 20 előállítani tripszin vagy tripszin jellegű enzim és B-karboxidáz kombinációjával végzett enzimes bontás útján, akkor előnyös, ha az aminoterminális ballasztrészt gyorsan hasítjuk le, így a B31(Arg)-inzulin felé vezető reakciót elősegítve. Ez a BI aminosav (Phe) előtti aminosavak módosításával lehetséges: Az 1. példa szerint a pKK500 plazmidot EcoRI és DralII enzimekkel nyitjuk, és az eredeti fragmenst a foszforamidit-módszerrel előállított (6) képletű mesterséges DNS-fragmenssel (SEQ ID NO:6) helyettesítjük.
Asn Ser Alá Arg BI Phe Val
ATT TCG GCC CGC TTC GTC
GC CGG GCG AAG CAG
(EcoRI)
Asn Gin AAC CAG TTG GTC (5)
His Leu Cys Gly Ser His Leu
CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC 3
GTG GAC ACG CCG AGC GTG 5
(DralII)
E. coli-ban végzett klónozás, majd streptomyces-ben végzett kifejeződés az 1. és 2. példa szerint a pKK640 plazmidhoz illetve a pKF14 expressziós plazmidhoz vezet.
Hasonlóképpen az 5. példa szerint a (4) képletű fragmenst tartalmazó plazmiddal is járhatunk el, így a pKK650 illetve a pKF15 plazmidot kapunk.

Claims (4)

1. Eljárás génszerkezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy tendamisztát gén jelzőszekvenciáját és első 7-10. aminoterminális aminosavának kodonjait, mely első 7-10 aminosav egyes kodonjait adott esetben kicseréljük, adott esetben linkerszekvencia közbeiktatásával más protein szerkezeti génjéhez kapcsoljuk.
2. Eljárás expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított génszerkezetet streptomyces-vektorba építjük.
3. Eljárás streptomyces sejt transzformálására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított expressziós vektort a sejtbejuttatjuk.
4. Eljárás fúziós proteinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerint transzformált streptomyces sejteket folyékony tápközegben tenyésztjük, és a tápközegbe kiválasztott fúziós proteint a tápközegből elkülönítjük.
HU911302A 1990-04-21 1991-04-19 Process for producing of a genetic structure, an expression vector and fused proteins HU210358B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4012818A DE4012818A1 (de) 1990-04-21 1990-04-21 Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU911302D0 HU911302D0 (en) 1991-10-28
HUT57268A HUT57268A (en) 1991-11-28
HU210358B true HU210358B (en) 1995-04-28

Family

ID=6404857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU911302A HU210358B (en) 1990-04-21 1991-04-19 Process for producing of a genetic structure, an expression vector and fused proteins

Country Status (29)

Country Link
EP (1) EP0453969B1 (hu)
JP (1) JP3319605B2 (hu)
KR (1) KR0168669B1 (hu)
CN (1) CN1049248C (hu)
AT (1) ATE142263T1 (hu)
AU (1) AU630287B2 (hu)
BR (1) BR9101587A (hu)
CA (1) CA2040810C (hu)
CZ (1) CZ285440B6 (hu)
DE (2) DE4012818A1 (hu)
DK (1) DK0453969T3 (hu)
ES (1) ES2093043T3 (hu)
FI (1) FI911882A (hu)
GR (1) GR3021040T3 (hu)
HR (1) HRP940770A2 (hu)
HU (1) HU210358B (hu)
IE (1) IE911322A1 (hu)
IL (1) IL97903A0 (hu)
LT (1) LT3686B (hu)
LV (1) LV10494B (hu)
NO (1) NO911557L (hu)
NZ (1) NZ237882A (hu)
PL (2) PL169596B1 (hu)
PT (1) PT97427B (hu)
RU (1) RU2055892C1 (hu)
SK (1) SK110191A3 (hu)
TW (1) TW213487B (hu)
YU (1) YU48435B (hu)
ZA (1) ZA912937B (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI103805B (fi) * 1990-09-05 1999-09-30 Hoechst Ag Menetelmä preproinsuliinien hydroloimiseksi
DK0600372T3 (da) 1992-12-02 1997-08-11 Hoechst Ag Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer.
ES2161726T3 (es) * 1993-04-27 2001-12-16 Hoechst Ag Formas amorfas monoesfericas de derivados de insulina.
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
CN1061375C (zh) * 1996-07-19 2001-01-31 中国科学院上海生物工程研究中心 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白
DK0821006T3 (da) 1996-07-26 2004-08-16 Aventis Pharma Gmbh Insulinderivater med öget zinkbinding
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
WO2004106525A1 (fr) * 2003-06-03 2004-12-09 Shanghai Centre Of Research & Development Of New Drugs Proteine de fusion pouvant etre exprimee tres efficacement et son procede de production
RU2395296C1 (ru) * 2009-02-19 2010-07-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" Способ получения препарата проинсулина для перорального применения
CN104818291A (zh) * 2015-05-08 2015-08-05 江南大学 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
DE3418274A1 (de) 1984-05-17 1985-11-21 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten
DE3707150A1 (de) * 1987-03-06 1988-09-15 Hoechst Ag Tendamistat-derivate
DE3714866A1 (de) * 1987-05-05 1988-11-24 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten
DE3715033A1 (de) 1987-05-06 1988-11-17 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung von fusionsproteinen
DE3716722A1 (de) 1987-05-19 1988-12-01 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen
DE3843713A1 (de) * 1988-04-25 1989-11-02 Henkel Kgaa Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung
ES2081826T3 (es) * 1988-11-03 1996-03-16 Hoechst Ag Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos.

Also Published As

Publication number Publication date
NO911557D0 (no) 1991-04-19
SK110191A3 (en) 1995-07-11
LT3686B (en) 1996-01-25
HU911302D0 (en) 1991-10-28
PL289953A1 (en) 1991-11-04
IL97903A0 (en) 1992-06-21
CA2040810C (en) 2001-07-24
EP0453969A1 (de) 1991-10-30
JPH04228086A (ja) 1992-08-18
TW213487B (hu) 1993-09-21
CN1055952A (zh) 1991-11-06
CZ285440B6 (cs) 1999-08-11
IE911322A1 (en) 1991-10-23
LV10494B (en) 1996-02-20
KR910018551A (ko) 1991-11-30
HUT57268A (en) 1991-11-28
HRP940770A2 (en) 1997-06-30
AU630287B2 (en) 1992-10-22
CA2040810A1 (en) 1991-10-22
ATE142263T1 (de) 1996-09-15
GR3021040T3 (en) 1996-12-31
NO911557L (no) 1991-10-22
RU2055892C1 (ru) 1996-03-10
DK0453969T3 (hu) 1997-02-10
FI911882A0 (fi) 1991-04-18
JP3319605B2 (ja) 2002-09-03
CN1049248C (zh) 2000-02-09
LV10494A (lv) 1995-02-20
PL169178B1 (pl) 1996-06-28
PT97427A (pt) 1992-01-31
YU48435B (sh) 1998-07-10
ES2093043T3 (es) 1996-12-16
DE4012818A1 (de) 1991-10-24
EP0453969B1 (de) 1996-09-04
LTIP1523A (en) 1995-06-26
ZA912937B (en) 1991-12-24
KR0168669B1 (ko) 1999-01-15
FI911882A (fi) 1991-10-22
BR9101587A (pt) 1991-12-10
YU69691A (sh) 1995-12-04
PL169596B1 (pl) 1996-08-30
NZ237882A (en) 1993-12-23
AU7515491A (en) 1991-10-24
CZ110191A3 (en) 1993-08-11
DE59108128D1 (de) 1996-10-10
PT97427B (pt) 1998-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2521413B2 (ja) シグナル配列をコ―ドしているｄｎａと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているｄｎａ
US4963495A (en) Secretion of heterologous proteins
DE60208343T2 (de) FUSIONSPROTEINE aus hirudin und proinsulin oder insulin
EP0448093B1 (de) Sekretion von Hirudinderivaten
CA2192943A1 (en) N-terminally extended proteins expressed in yeast
Bremer et al. Cloned structural gene (ompA) for an integral outer membrane protein of Escherichia coli K-12: localization on hybrid plasmid pTU100 and expression of a fragment of the gene
HUT76674A (en) Enhanced secretion of polypeptides
HU210358B (en) Process for producing of a genetic structure, an expression vector and fused proteins
DD155004A5 (de) Verfahren zur herstellung eines dns-transfervektors
EP0797671A1 (en) A process of producing extracellular proteins in bacteria
CA2000309A1 (en) Recombinant pdgf and methods for production
RU2144957C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPINS07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА
US5426036A (en) Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
DE3786870T2 (de) Methode zur Herstellung von Proteinen.
FI97549C (fi) Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa
WO1986005805A1 (en) A dna sequence
EP0342658A1 (en) Biosynthetic process for the preparation of chemical compounds
EP0495398A1 (de) Rekombinante IgA-Protease
JPS63230095A (ja) テンダミスタット誘導体
JP3489865B2 (ja) ヒト成長ホルモンの製造法
VÉRTESY et al. Disulphide bridge formation of proinsulin fusion proteins during secretion in Streptomyces
AT389891B (de) Verfahren zur herstellung von menschlichem proinsulin
JPH04295499A (ja) 抗ウイルス性タンパク質
WO1989002462A1 (en) Recombinant plasmids for producing human adrenocorticotropic hormone (acth)
JPH05244954A (ja) ウサギコルチコスタチンをコードするｄｎａ配列