JPH04295499A - 抗ウイルス性タンパク質 - Google Patents

抗ウイルス性タンパク質

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JPH04295499A
JPH04295499A JP3083456A JP8345691A JPH04295499A JP H04295499 A JPH04295499 A JP H04295499A JP 3083456 A JP3083456 A JP 3083456A JP 8345691 A JP8345691 A JP 8345691A JP H04295499 A JPH04295499 A JP H04295499A
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lys
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Noriyuki Habuka
典之 羽深
Masashi Miyano
雅司 宮野
Takashi Matsumoto
隆志 松本
Masakata Noma
野間　正名
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Japan Tobacco Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オシロイバナ抗ウイル
ス性タンパク質（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ　Ａｎｔｉｖｉｒ
ａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　；以下ＭＡＰと略称する））の
変異体に関し、特にその試験管内におけるタンパク質合
成の阻害活性が、天然のＭＡＰに比べより向上したもの
に係わる。
【０００２】
【従来の技術】本件出願人は、先にオシロイバナ属の植
物から新規な塩基性タンパク質を単離し、さらに、この
タンパク質が複数の植物ウイルスに対して抗ウイルス作
用を示すことを見出し、このタンパク質をＭＡＰと命名
した。このＭＡＰについては、既に特許出願済である（
特公昭６３−６１３１７）。また、このＭＡＰの全アミ
ノ酸配列の決定、決定されたアミノ酸配列に基づく遺伝
子の全合成、およびこの全合成遺伝子を用いる、大腸菌
の培地中への分泌生産系の構築についても特許出願済で
ある（特開平２−１８６９８８　　、特願平１−２１０
７６７）。
【０００３】ところでＭＡＰは、植物、微生物に広く存
在するリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）の一種
であり、リボソームＲＮＡを基質とした場合に極めて特
異性の高いＲＮＡ　　Ｎ−　グリコシダーゼ活性を示し
、またこの活性によりリボソームが不活性化されてタン
パク質の合成が阻害されることが知られている。このタ
ンパク質合成阻害活性は、細胞内ではきわめて強い毒と
なる。現在、これを逆に利用して、ＲＩＰの一種である
ヒマ植物由来のリシンＡ鎖などを種々の抗体と結合させ
て選択性の高いイムノトキシンを開発し、ミサイル療法
のひとつとして利用しようとする開発が進んでいる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところが、このような
タンパク性の毒は抗原性が高く、生体中でこの毒に対す
る抗体が産生され、長期間の投用においては生体に対し
て悪影響が出る可能性がある。したがって、毒タンパク
質としての数多くの異なる特性を有する候補が要求され
る。
【０００５】このような条件の下においても、ＭＡＰは
イムノトキシン用毒素としてきわめて有望な候補の一つ
であるが、そのタンパク質合成阻害活性は、例えばウサ
ギ網状赤血球の系に対して、リシンＡ鎖の　１／３０程
度しかない。
【０００６】一方、近年遺伝子操作を駆使したタンパク
質工学の発展はめざましく、天然のタンパク質のアミノ
酸配列を変換することにより、本来それが有する活性を
変化させたタンパク質を生産する例も数多く知られてい
る。その中でもタンパク質分子内のジスルフィド結合（
Ｓ−Ｓ結合）が、タンパク質分子の構造の柔軟性に対し
て強く係わってきていることも明らかとなってきており
、このＳ−Ｓ結合の有無でその活性が大きく変化するこ
とも知られている（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ　ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ　３４２、　２９１−２９３（１９８９）；Ｍａｔ
ｓｕｍｕｒａ　ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ　　８６　、６５６２−６５６６（１９８９
）；濱口浩三、生化学　１、　１−１３　（１９９１）
；　Ｐａｃｅ　、バイオトレンド　２−４、　１０５−
１１０（１９９０））。
【０００７】このような背景を考慮するとき、ＭＡＰ遺
伝子を駆使した、より付加価値の高いタンパク質、特に
タンパク質合成阻害活性の高い新規タンパク質の構築が
期待される。
【０００８】したがって、この発明は、ＭＡＰを基にし
てより付加価値の高いタンパク質、特にはタンパク質合
成阻害活性がより高いタンパク質を提供することを目的
とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため鋭意研究を重ねた結果、ＭＡＰが有する
Ｓ−Ｓ結合に関与する２つのシステイン残基をセリン残
基に変更することにより、ＭＡＰよりもタンパク質合成
阻害活性が高いＭＡＰ変異体が得られることを見出した
。すなわち、本発明による抗ウイルス性タンパク質は、
後掲の配列表における配列番号１に示されるアミノ酸配
列を有するＭＡＰ変異体である。
【００１０】このシステイン結合の存在しないＭＡＰ変
異体（以下、ＭＡＰ−Ｈと称することがある）は、例え
ば、ＭＡＰ遺伝子上でシステインをコ−ドするコドンを
セリンをコ−ドするコドンに改め、この遺伝子をＭＡＰ
分泌ベクタ−に挿入し、さらにこのベクタ−を大腸菌等
の宿主に導入することにより産生させることができる。
【００１１】ＭＡＰ遺伝子はＭＡＰをコ−ドする遺伝子
であるが、一般に、アミノ酸とそのアミノ酸をコ−ドす
るコドンとが１：１に対応することはなく、１つのアミ
ノ酸を指定するコドンが２〜６種類存在する。したがっ
て、ＭＡＰ遺伝子も多種存在し、そのシステインをコ−
ドするコドンをセリンをコ−ドするコドンに置換えた組
換え体遺伝子も同様に多種存在する。上述のように、こ
の組換え体遺伝子を宿主細胞に導入して本発明の抗ウイ
ルス性タンパク質を産生させる場合には、これら全ての
組換え体遺伝子を用いることができる。しかしながら、
ある特定のアミノ酸をみた場合、そのアミノ酸をコ−ド
する数種のコドンの使用頻度に生物種特有の偏りがある
ことが知られており、これを考慮すると、宿主が大腸菌
である場合には、後掲の配列表における配列番号２に示
される塩基配列を有する遺伝子を用いることが好ましい
。
【００１２】ＭＡＰのアミノ酸配列を基にしたＭＡＰ遺
伝子の構築については前述の特願昭６３−９３４９４号
に詳細に記載されており、この方法に従い、システイン
をコ−ドするコドンをセリンをコ−ドするコドンに置換
えることにより本発明の抗ウイルス性タンパク質をコ−
ドする全合成遺伝子を得ることができる。また、上記方
法により構築された全合成ＭＡＰ遺伝子を含むベクタ−
を有する大腸菌形質転換体がすでに工業技術院微生物工
業技術研究所特許微生物寄託センタ−に寄託されている
（寄託番号：　９９１３　号）。したがって、この形質
転換体より全合成ＭＡＰ遺伝子を抽出し、システインを
コ−ドするコドンのみをセリンをコ−ドするコドンに置
換えることにより本発明の抗ウイルス性タンパク質をコ
−ドする遺伝子を得ることもできる。
【００１３】以下、寄託された大腸菌形質転換体から抽
出した全合成ＭＡＰ遺伝子を用いる場合を例に挙げて、
本発明の抗ウイルス性タンパク質の調製方法を詳細に説
明する。 Ａ．システインをセリンに換えたＭＡＰ遺伝子断片の作
成 寄託された大腸菌形質転換体に含まれる全合成ＭＡＰ遺
伝子は、図１に示すようにブロックＩ〜ＶＩＩＩからな
る８つのブロックを連結して構築したものであり、各々
のブロックはそれぞれ異なる制限酵素サイトで結合して
いる。したがって、制限酵素を特定することにより所望
のブロックのみを取り出すことが可能である。ＭＡＰの
アミノ酸配列中に存在する２つのシステイン残基をコ−
ドするコドンは、この全合成ＭＡＰ遺伝子のブロックＩ
ＩおよびブロックＶＩＩに存在する。そこで、システイ
ンをコ−ドするコドンをセリンをコ−ドするコドンに置
換えてこの部分のＤＮＡ断片を新たに合成し、ブロック
ごと置換えてしまえばよい。
【００１４】そのために、まず、目的のコドンを置換え
たＤＮＡ断片を合成し、これをプラスミドに組み込んだ
後クロ−ニングする。その際、他のアミノ酸配列は天然
のものと同じになるようにして、新たに制限酵素部位を
挿入あるいは削除してこれを指標にしてクローニングす
ることが望ましい。なお合成は、市販のＤＮＡ合成機で
行ないＨＰＬＣを用いて精製する。またＤＮＡの取扱上
必要なフェノール処理、エタノール沈澱、制限酵素によ
るＤＮＡの切断さらにそれに続くＤＮＡの回収、プラス
ミドＤＮＡを用いた大腸菌の形質転換法であるカルシウ
ム法、大腸菌形質転換体からのＤＮＡ精製法であるアル
カリＳＤＳ法、ＤＮＡの塩基配列決定法であるダイデオ
キシ法等の操作は公知の方法に従う。クローニングは、
予め合成したＤＮＡをアニールして２本鎖ＤＮＡとする
際にその末端が　ＥｃｏＲＩと　ＨｉｎｄＩＩＩの切断
部とになるようにし、そのままプラスミドの同じサイト
に挿入することで容易に行なうことができる。 Ｂ．クローニングしたＤＮＡ断片のＭＡＰ遺伝子への挿
入 前述のように、ＭＡＰ遺伝子の各ブロックの末端は制限
酵素サイトになっているので、クローニングしたＤＮＡ
断片をこの部分で切り出し、これを各々全合成ＭＡＰ遺
伝子に挿入する。その際、断片の挿入の確認は、新たに
挿入あるいは削除した制限酵素サイトの有無で確認でき
る。さらに挿入された各々のＭＡＰ遺伝子を適当な制限
酵素で再度切断し、今一度これらを接合し変異体ＭＡＰ
遺伝子（ＭＡＰ−Ｈ遺伝子）の構築を完了する。 Ｃ．大腸菌発現ベクタ−の構築 一般に、大腸菌内で発現させようとする外来性遺伝子を
大腸菌内に導入するために用いられるベクタ−には、導
入しようとする遺伝子以外に下記のＤＮＡ配列が必要で
ある。 （ａ）　転写を制御する領域（オペレ−タ−）（ｂ）　
遺伝子の転写開始を指示する領域（プロモ−タ−）大腸
菌内で発現するプロモ−タ−としては、大腸菌ファ−ジ
に由来する　Ｎ２５プロモ−タ−およびＰＬ　プロモ−
タ−等が知られている。例えば、上記ＰＬ　プロモ−タ
−は大腸菌λファ−ジ由来のプロモ−タ−であり、ｃＩ
と呼ばれる制御タンパク質によってその発現が抑制され
ていることが知られている。このｃＩにはｃＩ８５７　
と呼ばれる温度感受性変異体が存在する。このｃＩ８５
７　は、３０℃においてはｃＩと同様にＰＬ　プロモ−
タ−の発現を抑制するが、４２℃においてはその抑制能
力が失われてＰＬ　プロモ−タ−が発現する。したがっ
て、大腸菌に導入された発現ベクタ−がＰＬ　プロモ−
タ−とｃＩ８５７　リプレッサ−遺伝子とを備える場合
には、３０℃での培養ではＰＬ　プロモ−タ−の発現が
抑制され、遺伝子の転写は開始されない。これに対して
、４２℃で培養することにより、ＰＬ　プロモ−タ−が
発現して遺伝子の転写が開始される。
【００１５】ＰＬ　プロモ−タ−は、λファ−ジ遺伝子
または公知のｐＰＬ１ａｍｂｄａプラスミドＤＮＡから
、制限酵素　ＢａｍＨＩおよび　ＨｐａＩ　で切断する
ことにより得ることができる。また、ｃＩ８５７　リプ
レッサ−遺伝子は、λファ−ジ（ｃＩ８５７　、Ｓａｍ
７）遺伝子から、制限酵素　ＢｇｌＩＩおよび　Ｂａｎ
ＩＩＩ　で切断することにより得ることができる。 （ｃ）　転写終了を指令する領域（タ−ミネ−タ−）タ
−ミネ−タ−としては、大腸菌ファ−ジに由来する　ｔ
ＬＩタ−ミネ−タ−、大腸菌のリボソ−ム遺伝子に由来
する　ｒｒｎＢＴ１　Ｔ２　タ−ミネ−タ−等が知られ
ている。 （ｄ）　　ｍＲＮＡに転写された後、翻訳開始位置を指
示する領域（ＳＤ配列） ＳＤ配列としては、大腸菌の構成遺伝子に共通の配列を
使用することができる。 （ｅ）　ＳＤ配列と連動して翻訳の読み始めとなるメチ
オニンコドン（ＡＴＧ　） プラスミドＤＮＡを用いた発現ベクタ−は、プラスミド
ＤＮＡにおいて特定領域のＤＮＡの欠失または挿入を行
なうことにより構築することができる。この欠失または
挿入は、プラスミドを特定の部位で切断し、適当な処理
の後結合させることにより行なわれる。この際、合成Ｄ
ＮＡ断片を適宜用いることにより、プラスミドＤＮＡに
は存在しない制限酵素サイト、ＳＤ配列、タンパク質の
アミノ酸配列をコ−ドする遺伝子等を導入することが可
能である。
【００１６】例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３　に
は存在しない制限酵素サイト　ＸｂａＩ　およびＢａｎ
ＩＩＩ　を有するＤＮＡ断片およびその相補鎖を、ｐＫ
Ｋ２２３−３　の　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　によ
る切断断片（大断片）と結合させることにより制限酵素
サイト　ＸｂａＩ　および　ＢａｎＩＩＩ　をｐＫＫ２
２３−３　に導入することができる。さらに、この　Ｘ
ｂａＩ　および　ＢａｎＩＩＩ　を導入したｐＫＫ２２
３−３　と、　ＸｂａＩ　および　ＢａｎＩＩＩ　をそ
れぞれ５’−　および３’−　側に有する遺伝子とを用
いることにより、この遺伝子をプラスミドｐＫＫ２２３
−３　に導入することができる。また、この際、ＳＤ配
列および遺伝子の転写開始に必要な、メチオニン残基を
コ−ドするコドン（メチオニンコドン）を上記プラスミ
ドに導入することもできる。さらに、制限酵素サイト　
ＮｄｅＩ　（ＣＡＴＡＴＧ）にはメチオニンコドン（Ａ
ＴＧ　）が含まれているので、この制限酵素サイトを介
して他のタンパク質をコ−ドする遺伝子を挿入すること
もできる。
【００１７】必要なＤＮＡ断片は、ＤＮＡ合成機を用い
て合成することができる。ＤＮＡ合成機によって得られ
た合成ＤＮＡ断片、制限酵素で切断したＤＮＡ断片、お
よび、必要であれば、Ｔ４　ＤＮＡポリメラ−ゼ、ＤＮ
Ａポリメラ−ゼ・クレノウ・フラグメント等によって粘
着末端を平滑末端としたＤＮＡ断片を結合させることに
より発現ベクタ−を構築する。なお、各断片の結合は、
Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼ、またはこのＤＮＡリガ−ゼを含有
する市販のライゲ−ション・キットを用いて行なうこと
ができる。 Ｄ．ＭＡＰ分泌型ベクタ−の作成 上の記載に従い、例えばＰＬ　プロモ−タ−およびｃＩ
８５７　遺伝子を有し、前述の微工研に寄託された大腸
菌形質転換体（寄託番号：９９１３号）から抽出した全
合成ＭＡＰ遺伝子を組み込んだ発現ベクタ−を大腸菌に
導入し、遺伝子を発現させることにより、大腸菌にＭＡ
Ｐを産生させることができる。しかしながら、このまま
では産生されたＭＡＰは大腸菌内に貯蔵される一方であ
り、産生されるＭＡＰが大腸菌の生合成を阻害するため
ＭＡＰの産生量に限界がある。そこで、産生されたタン
パク質を菌外に分泌させる必要が生じる。
【００１８】大腸菌の外膜タンパク質であるＯｍｐＡは
、図２に示すシグナル配列を有している。図２には、こ
のシグナル配列をコ−ドする遺伝子の塩基配列を併せて
示した。このシグナル配列は、ＯｍｐＡを大腸菌内から
分泌させる働きを担っている。したがって、このシグナ
ル配列を他の異なるタンパク質の　Ｎ末端に結合するこ
とにより、そのタンパク質を大腸菌内から運び出すこと
ができる。例えば、このシグナルペプチドを用いて大腸
菌からＭＡＰを分泌させる場合、図２に示されるシグナ
ル配列をＭＡＰの　Ｎ末端であるアラニンのすぐ上流に
結合させればよい。また、このシグナル配列をコ−ドす
る遺伝子は、最初のメチオニンコドンが制限酵素　Ｎｄ
ｅＩ　の一部となっているので、　ＮｄｅＩ　サイトを
プロモ−タ−の下流に有している発現ベクタ−への挿入
が可能である。 なお、図２に示す配列には、ＭＡＰの　Ｎ末端の３つの
アミノ酸配列と、これに対応するＤＮＡ配列を併せて示
した。 Ｅ．ＭＡＰ−Ｈ遺伝子の分泌ベクターへの挿入上記Ｄで
得られるＭＡＰ分泌ベクタ−は、ＯｍｐＡのシグナル配
列の遺伝子を有し、その下流にＭＡＰ遺伝子が挿入され
ている。ＭＡＰ遺伝子のＮ末端配列中には制限酵素Ｘｂ
ａＩ、Ｃ末端のさらに下流には、　ＢａｎＩＩＩ　のサ
イトがあるので、この２つのサイトを用いてその部分に
上記Ｂで得られるＭＡＰ−Ｈ遺伝子を挿入する。 Ｆ．ＭＡＰ−Ｈの産生と精製 Ｅで用いるＭＡＰの分泌発現ベクターが、例えばＰＬ　
プロモーターとその制御タンパク質であるｃＩ８５７　
の遺伝子を有している場合には、３０℃では、そのプロ
モータの下流にあるＭＡＰ遺伝子の発現が完全に抑えら
れ、４２℃では、ｃＩ８５７　が不活性化して速やかに
ＭＡＰ遺伝子が発現してＭＡＰが生産される。また、Ｍ
ＡＰ遺伝子の上流には大腸菌外膜タンパク質ＯｍｐＡの
シグナル配列が挿入されており生産されたＭＡＰは速や
かに培地中に分泌される。そこで、ＭＡＰ−Ｈ遺伝子が
挿入されたプラスミドを導入した形質転換体を低温で培
養し適当な濃度になった時点で、公知の温度シフトによ
る方法を用いＭＡＰ−Ｈ遺伝子を発現させ、合成される
ＭＡＰ−Ｈを大腸菌より生産させ、培地中に分泌させる
。こうして得られたＭＡＰ−Ｈは、硫安塩析で沈澱とし
て濃縮しさらに透析した後、カルボキシメチル・セファ
ロース並びにブルー・セファロースカラムクロマトグラ
フィーを用いて精製する。
【００１９】なお、ＭＡＰあるいはその変異体であるＭ
ＡＰ−Ｈの定量は、ＭＡＰ抗血清を用いたＥＬＩＳＡ（
Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅ
ｎｔ　Ａｓｓａｙ　）により行なう。試験管内タンパク
質合成すなわち翻訳は、市販のウサギ網状赤血球粗抽出
物のタンパク質合成系にタバコモザイクウイルスのＲＮ
ＡをｍＲＮＡとして加え、翻訳によって生じた酸不溶性
ポリペプチド中の、系に加えた標識アミノ酸（３５Ｓ−
メチオニン）の取込量をもって評価する。この時、ＭＡ
ＰあるいはＭＡＰ−Ｈを系に適当量加えて、そのタンパ
ク質合成に対する影響を定量する。
【００２０】
【実施例】以下、本発明の実施例を示し本発明をさらに
具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定され
るものではない。なお、理解を助けるために、下記工程
Ａを図４に、工程Ｂを図５に、工程Ｃを図６に、工程Ｅ
を図７に、工程ＦおよびＧを図８に、工程ＨおよびＩを
図９に、並びに工程ＪおよびＫを図１０にそれぞれ模式
的に示した。 Ａ．合成ＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＫ２２３−３　に
挿入する工程 制限酵素サイト、ＳＤ配列、メチオニンコドン、および
図３に示す、ＭＡＰのＮ末端アミノ酸配列をコ−ドする
ＤＮＡリンカ−を、下記の方法でプラスミドｐＫＫ２２
３−３　に挿入した。プラスミドｐＫＫ２２３−３　は
、従来の方法で形質転換したＨＢ１０１　株の大腸菌か
ら精製したものである。
【００２１】制限酵素　ＥｃｏＲＩおよび　ＨｉｎｄＩ
ＩＩ（日本ジ−ン社）をそれぞれ１０ユニット含有する
ハイ・バッファ−（５０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ　７．
５）　−　１．００ｍＭ　塩化ナトリウム　−１ｍＭ塩
化マグネシウムの混合液）中において、　１ｕｇのｐＫ
Ｋ２２３−３　を３７℃で１時間反応させて切断した。 得られた溶液をフェノ−ル・クロロホルム処理し、次い
でエタノ−ル沈殿させてＤＮＡを回収した。ここで、フ
ェノ−ル・クロロホルム処理とは、次のような操作を行
なうものである。まず、予め　１０ｍＭ　トリス塩酸（
ｐＨ　８．０）　−　１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（
ＥＤＴＡ）混合液（以下、ＴＥ１　と記述する）で飽和
させたフェノ−ルを、得られたＤＮＡ溶液に等量加えて
混合し、その後遠心分離してＤＮＡを含有する水相を回
収する。次に、この水相に等量のクロロホルムをさらに
加えて混合し、その後遠心分離してＤＮＡを含有する水
相を回収する。また、エタノ−ル沈殿とは、次のような
操作を行なうものである。まず、得られた溶液に、この
溶液の　１／２０量の　５Ｍ　塩化ナトリウムおよび２
倍量のエタノ−ルを加え、　−７０℃で３０分間冷却す
る。次に、この溶液を高速で遠心分離して沈殿を回収す
る。
【００２２】ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステ
ムズ・ジャパン社製、３８１Ａ型）を使用し、ホスホロ
アミダイド法を用いて、図３に示す互いに相補的な塩基
配列を有する２種類の一本鎖合成ＤＮＡリンカ−を調製
した。この合成ＤＮＡリンカ−の各々　１ｕｇを、１０
ユニットのＴ４　キナ−ゼ（東洋紡績社製）を含有する
　１００ｕｌのキナ−ゼ溶液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ　７．６）　−１０ｍＭ塩化マグネシウム　−　５ｍ
Ｍジチオトレイト−ル　−　０．１ｍＭスペルミジン　
−０．１ｍＭＥＤＴＡ　−１ｍＭ　ＡＴＰの混合液）中
において３７℃で１時間反応させ、リンカ−の　５´末
端にリン酸を付加した。その後、得られた一本鎖ＤＮＡ
をアニ−リングにより二本鎖ＤＮＡにした。アニ−リン
グは、得られた反応液を混合し、６０℃で２０分間加温
した後室温で２０分間放置することにより行なった。次
いで、これをエタノ−ル沈殿させた後、１０ｕｌのＴＥ
１　に溶解した。
【００２３】このようにして得られた二本鎖合成ＤＮＡ
の溶液　５ｕｌに上述のｐＫＫ２２３−３　分解物　２
．５ｕｌ（約　０．５ｕｇ）を添加し、ライゲ−ション
・キット（宝酒造社製）を用いて１０℃で２時間反応さ
せた。これにより、プラスミドｐＫＫ２２３−３　に合
成ＤＮＡリンカ−を挿入したプラスミドｐＫＳ２　が得
られた。 Ｂ．ｐＫＳ２　の複製開始領域をｐＵＣ１９型に変換す
る工程 ハイ・バッファ−５０ｕｌ中において、　２ｕｇのプラ
スミドｐＫＳ２　と制限酵素　ＢａｍＨＩとを　３７　
℃で１時間反応させ、ｐＫＳ２　を切断した。次いで、
フェノ−ル・クロロホルム処理し、エタノ−ル沈殿させ
て切断したＤＮＡを回収した。得られた沈殿を、　２ユ
ニットのクレノウ・フラグメント（東洋紡績社製）を含
有するクレノウ溶液（５０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ　７
．２）　−１０ｍＭ硫酸マグネシウム　−　０．１ｍＭ
ジチオストイト−ル　−５０ｕｇ／ｍｌ仔牛胸腺アルブ
ミン混合液に各々　０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰ、およびＴＴＰを添加した溶液）　２５ｕｌ　
において２２℃で３０分間反応させて、ＤＮＡの粘着末
端を平滑末端とした。反応終了後、７０℃で　５分間加
熱し、フェノ−ル・クロロホルム処理および続くエタノ
−ル沈殿によってＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを
、１０ユニットの制限酵素　ＰｖｕＩ　（東洋紡績社製
）を含有するハイ・バッファ−　５０ｕｌ　に溶解して
３７℃で　１時間反応させることにより、さらに切断し
た。切断したＤＮＡは、フェノ−ル・クロロホルム処理
および続くエタノ−ル沈殿によって回収した。
【００２４】一方、　１ｕｇのプラスミドｐＵＣ１９（
宝酒造社製）を、制限酵素　ＰｖｕＩ　（東洋紡績社製
）および　ＰｖｕＩＩ（日本ジ−ン社製）をそれぞれ１
０ユニット含有するハイ・バッファ−　５０ｕｌ　中に
おいて、３７℃で　２時間反応させ、ｐＵＣ１９を切断
した。切断したＤＮＡ断片を、フェノ−ル・クロロホル
ム処理および続くエタノ−ル沈殿によって回収した。
【００２５】このようにして得られたｐＫＳ２　由来の
ＤＮＡ断片（大断片）およびｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断
片を、それぞれ　１０ｕｌ　のＴＥ１　に溶解した。そ
の後、各々の　３．５ｕｌづつを混合し、ライゲ−ショ
ン・キット（宝酒造社製）を用いて１０℃で　１時間反
応させることにより、プラスミドｐＫＳ３　を得た。こ
のｐＫＳ３　は、ｐＵＣ１９の複製開始領域と、ｐＫＳ
２　の大断片を含む領域とが結合したものである。 Ｃ．ｐＫＳ３　にＰＬ　プロモ−タ−を挿入する工程２
ｕｇのｐＫＳ３　を、１０ユニットの制限酵素　Ｐｓｔ
Ｉ　（日本ジ−ン社製）を含有するハイ・バッファ−５
０ｕｌ中において、３７℃で　１時間反応させて切断し
た。切断したＤＮＡ断片は、フェノ−ル・クロロホルム
処理および続くエタノ−ル沈殿によって回収した。回収
したＤＮＡ断片を、２０ｕｌのポリメラ−ゼ溶液（３３
ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ　７．９）　−　６６ｍＭ　リ
ン酸カリウム　−　１０ｍＭ　酢酸マグネシウム　−　
０．５ｍＭジチオトイレト−ル　−　０．１ｍｇ／ｍｌ
仔牛胸腺アルブミン混合液に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰおよびＴＴＰを各々　０．１ｍＭ添加し、さらに
　２．５ユニットのＴ４　ＤＮＡポリメラ−ゼ（東洋紡
績社製）を含有する溶液）中において３７℃で　５分間
加温し、その粘着末端を平滑末端にした。その後、　１
ｕｌの　０．５Ｍ　ＥＤＴＡを添加し、フェノ−ル・ク
ロロホルム処理および続くエタノ−ル沈殿を行なってＤ
ＮＡを回収した。回収したＤＮＡを、１０ユニットの制
限酵素　ＢａｍＨＩ（日本ジ−ン社製）を含有するハイ
・バッファ−　５０ｕｌ　中において３７℃で　１時間
反応させ、ＤＮＡをさらに切断した。
【００２６】これとは別に、ｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ（フ
ァルマシア社製）１ｕｇを、制限酵素ＢａｍＨＩおよび
　ＨｐａＩ　（ともに日本ジ−ン社製）を各々１０ユニ
ット含有するハイ・バッファ−５０ｕｌ　中において３
７℃で　１時間反応させることにより、切断した。次に
、フェノ−ル・クロロホルム処理および続くエタノ−ル
沈殿により、ＰＬ　プロモ−タ−を含むＤＮＡ断片を回
収した。
【００２７】ｐＫＳ３　由来のＤＮＡ断片およびＰＬ　
プロモ−タ−を含むＤＮＡ断片を、それぞれ　１０ｕｌ
　のＴＥ１　に溶解した。次に、各々の溶液の　３．５
ｕｌを混合した後、ライゲ−ション・キット（宝酒造社
製）を用いて結合させた。次いで、得られたＤＮＡを用
いて大腸菌（ＨＢ１０１　株）を形質転換させ、これに
より得られた形質転換体からプラスミドｐＳＨ４　を調
製した。プラスミドｐＳＨ４　は、ｐＫＳ３にＰＬ　プ
ロモ−タ−を挿入したプラスミドである。 Ｄ．λファ−ジＤＮＡからｃＩ８５７　遺伝子を切り出
す工程 λファ−ジ（λ、ｃＩ８５７　、Ｓａｍ７）ＤＮＡ（宝
酒造社製）　２ｕｇを、制限酵素　ＢｇｌＩＩ（日本ジ
−ン社製）および　ＢａｎＩＩＩ　（東洋紡績社製）を
各々１０ユニット含有するハイ・バッファ−　５０ｕｌ
　中において３７℃で　２時間反応させることにより切
断した。切断したＤＮＡ断片は、フェノ−ル・クロロホ
ルム処理および続くエタノ−ル沈殿により回収した。
【００２８】これとは別に、　１ｕｇのプラスミドｐＨ
ＳＧ３９７　（宝酒造社製）を、制限酵素　ＢａｍＨＩ
（日本ジ−ン社製）および　ＢａｎＩＩＩ　（東洋紡績
社製）を各々１０ユニット含有するハイ・バッファ−　
５０ｕｌ　中において３７℃で　１時間反応させること
により切断した。次いで、これに　２ｕｌ（　１ユニッ
ト）のアルカリ・ホスファタ−ゼ（東洋紡績社製）を添
加し、６０℃で３０分間反応させて、ＤＮＡの　５´末
端のリン酸を脱リン酸化した。その後、フェノ−ル・ク
ロロホルム処理および続くエタノ−ル沈殿により、ＤＮ
Ａを回収した。
【００２９】このようにして得られたλファ−ジＤＮＡ
分解物およびｐＨＳＧ３９７　分解物を、それぞれ　１
０ｕｌ　のＴＥ１　に溶解した。その後、各々の　３．
５ｕｌづつを混合し、ライゲ−ション・キット（宝酒造
社製）を用いて、１０℃で　２時間反応させて結合させ
た。得られたＤＮＡを用いて大腸菌（ＨＢ１０１　株）
を形質転換し、これにより得られた形質転換体からプラ
スミドＤＮＡを精製した。 得られたプラスミドは、ｐＨＳＧ３９７　に、ｃＩ８５
７　遺伝子領域を含む約１１００塩基対の　ＢｇｌＩＩ
−　ＢａｎＩＩＩ　断片が挿入されたプラスミドｐＨＳ
ＧｃＩ８５７　である。 Ｅ．ｐＳＨ４　にｃＩ８５３　遺伝子を挿入する工程２
ｕｇのｐＨＳＧｃＩ８５７　を、制限酵素　ＸｈｏＩ　
（日本ジ−ン社製）および　ＢａｎＩＩＩ　（東洋紡績
社製）を各々１０ユニット含有するハイ・バッファ−　
５０ｕｌ　中において３７℃で　１時間反応させること
により切断した。切断したＤＮＡは、フェノ−ル・クロ
ロホルム処理および続くエタノ−ル沈殿によって回収し
た。回収したＤＮＡを、　２ユニットのクレノウ・フラ
グメントを含有する　２５ｕｌ　のクレノウ溶液中にお
いて２２℃で３０分間反応させることにより、ＤＮＡの
粘着末端を平坦末端とした。次いで、反応液を７０℃で
　５分間加熱した後、フェノ−ル・クロロホルム処理お
よび続くエタノ−ル沈殿によりＤＮＡを回収した。
【００３０】これとは別に、　１ｕｇのｐＳＨ４　を、
１０ユニットの制限酵素　ＢａｍＨＩ（日本ジ−ン社製
）を含有するハイ・バッファ−　５０ｕｌ　中において
３７℃で　１時間反応させることにより切断した。切断
したＤＮＡは、フェノ−ル・クロロホルム処理および続
くエタノ−ル沈殿により回収した。回収したＤＮＡを、
　２ユニットのクレノウ・フラグメントを含有するクレ
ノウ溶液　２５ｕｌ　中において２２℃で３０分間反応
させることにより、ＤＮＡの粘着末端を平滑末端とした
。次いで、反応液を７０℃で　５分間加熱した後、フェ
ノ−ル・クロロホルム処理および続くエタノ−ル沈殿に
よりＤＮＡを回収した。
【００３１】このようにして得られたｃＩ８５７　遺伝
子を含む断片および切断されたｐＳＨ４の断片を、それ
ぞれ　１０ｕｌ　のＴＥ１に溶解した。次に、各々の　
３．５ｕｌづつを混合した後、ライゲ−ション・キット
（宝酒造社製）を用いて１０℃で　２時間反応させて結
合させた。得られたＤＮＡを用いて大腸菌（ＨＢ１０１
　株）を形質転換し、これにより得られた形質転換体か
らプラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドは
、ｐＳＨ４　にｃＩ８５７　遺伝子が挿入されたプラス
ミドｐＳＨ５　である。 Ｆ．ｐＳＨ５　に全合成ＭＡＰ遺伝子を挿入する工程２
ｕｇのｐＳＨ５　を、制限酵素　ＸｂａＩ　（日本ジ−
ン社製）および　ＢａｎＩＩＩ　（東洋紡績社製）を各
々１０ユニット含有するハイ・バッファ−　５０ｕｌ　
中において３７℃で１時間反応させることにより切断し
た。切断したＤＮＡは、フェノ−ル・クロロホルム処理
および続くエタノ−ル沈殿により回収した。
【００３２】これとは別に、上述のｐＳＨ５　の場合と
同様の方法で　２ｕｇのｐＭＨＩを切断し、かつ切断し
たＤＮＡを回収した。ここで、ｐＭＨＩとは、全合成Ｍ
ＡＰ遺伝子をプラスミドｐＵＣ１９に組み込んだ合成プ
ラスミドであり、前述の微工研に寄託された大腸菌形質
転換体（寄託番号：９９１３号）から抽出されたもので
ある。
【００３３】このようにして得られたｐＳＨ５　由来の
ＤＮＡ断片およびｐＭＨＩ由来のＤＮＡ断片を、それぞ
れ１０ｕｌのＴＥ１　に溶解した。次いで、それぞれの
溶液の　３．５ｕｌづつを混合し、ライゲ−ション・キ
ット（宝酒造社製）を用いて１０℃で　１時間反応させ
て結合させた。得られたＤＮＡを用いて大腸菌（Ｎ　９
９　ｃＩ＋株）を形質転換し、これにより得られた形質
転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラ
スミドは、プラスミドｐＳＨ５　に全合成ＭＡＰ遺伝子
の　ＸｂａＩ　および　ＢａｎＩＩＩ　で切り出された
断片が挿入されたプラスミドｐＳＨ６　である。 Ｇ．ｐＳＨ６　にＯｍｐＡのシグナル配列遺伝子を挿入
する工程 第１図に示す塩基配列を有する、相補的ＤＮＡ断片のそ
れぞれの一本鎖を、ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオ
システムズ・ジャパン社製、３８１Ａ型）を用いてホス
ホロアミダイト法により合成した。合成された各々の一
本鎖ＤＮＡ１ｕｇを、１０ユニットのＴ４　キナ−ゼ（
東洋紡績社製）を含有する前述のキナ−ゼ溶液５０ｕｌ
中において、それぞれ３７℃で　１時間反応させること
により、　５´末端にリン酸を付加した。これら２種類
の一本鎖ＤＮＡを含有する反応液を混合し、６０℃で２
０分間加温し、次いで室温で２０分間放置することによ
りアニ−リングして、二本鎖ＤＮＡとした。この二本鎖
ＤＮＡをエタノ−ル沈殿により回収した後、　１０ｕｌ
　のＴＥに溶解した。
【００３４】これとは別に、　１ｕｇのプラスミドｐＳ
Ｈ６　を、各々１０ユニットの制限酵素　ＮｄｅＩ　お
よび　ＸｂａＩ　（ともに日本ジ−ン社製）を含有する
ハイ・バッファ−　５０ｕｌ　中において３７℃で　１
時間反応させることにより切断した。切断したＤＮＡを
、フェノ−ル・クロロホルム処理および続くエタノ−ル
沈殿により回収し、さらに　１０ｕｌ　のＴＥに溶解し
た。
【００３５】アニ−ルした合成ＤＮＡを含有する溶液お
よび切断した　ｐＳＨ６　を含有する溶液のそれぞれ　
３．５ｕｌづつを混合し、ライゲ−ション・キット（宝
酒造社製）を用いて１０℃で　２時間反応させて結合さ
せた。得られたＤＮＡを用いて大腸菌（Ｎ　９９　ｃＩ
＋株）を形質転換し、その結果得られた形質転換体から
プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドは、
ｐＳＨ６　にＯｍｐＡのシグナル配列の遺伝子が挿入さ
れたプラスミドｐＳＨ７　である。 Ｈ．変異体ＭＡＰのブロックＩＩとＶＩＩ　のクローニ
ング図１１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を４つの
断片として、また図１２に示す塩基配列を有するＤＮＡ
断片を２つの断片としてそれぞれＤＮＡ合成機（アプラ
イド・バイオシステムズ社製、３８１Ａ型）を用いて合
成した。これらはそれぞれＭＡＰ−Ｈ遺伝子のブロック
ＩＩおよびブロックＶＩＩのＤＮＡ断片である。なお、
ここではシステインの代わりにセリンをコ−ドするコド
ンとしてそれぞれ“ＴＣＧ”および“ＴＣＴ”を用いて
いるが、これらに限られるものではなく、セリンをコ−
ドするコドンであればどのようなものでもよい。
【００３６】これらの各　１ｕｇを１０ユニットのＴ４
　キナーゼ（東洋紡績社製）を含む　５０ｕｌ　の５０
ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ　７．６）−１０ｍＭ　塩化マ
グネシウム−　５ｍＭ　ジチオトレイト−ル−　０．１
ｍＭ　スペルミジン−　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ　−１ｍ
ＭＡＴＰの溶液中において３７℃で１時間反応させ、そ
の　５´末端をリン酸化した。次いで、ブロックＩＩに
おいては４つの断片を含む反応液、およびブロックＶＩ
Ｉ　においては２つの断片を含む反応液をそれぞれ混合
し、６０℃で２０分、その後さらに室温で１時間放置し
て相補鎖をアニールさせた。各々の　５ｕｌを、予め制
限酵素　ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ　ＩＩＩ　で切断してフ
ェノール処理およびエタノール沈澱して得られたプラス
ミドｐＵＣ１９を約　０．１ｕｇ含む溶液　２．５ｕｌ
に添加し、市販のライゲーションキット（宝酒造社製）
を用いて結合させた。このようにして得られたプラスミ
ドを用いて、カルシウム法にて大腸菌ＨＢ１０１　を形
質転換し、得られた形質転換体からアルカリＳＤＳ法で
プラスミドを精製して合成したＤＮＡ断片が挿入されて
いることを確認した。なお確認は、ダイデオキシ法を用
いたＤＮＡの塩基配列決定を用いて行った。ブロックＩ
Ｉの断片の挿入によりプラスミドｐＵＣＭＢＣ３６Ｓを
、またブロックＶＩＩ　の断片の挿入によりプラスミド
ｐＵＣＭＢＣ　２２０Ｓを得た。 Ｉ．全合成ＭＡＰ遺伝子へのブロックＩＩおよびＶＩＩ
　の挿入 得られたプラスミドｐＵＣＭＢＣ３６Ｓから制限酵素　
ＳａｃＩ　および　ＳｐｌＩ　によりブロックＩＩを、
プラスミドｐＵＣＭＢＣ２２０　Ｓから制限酵素　Ｅｃ
ｏ５２Ｉ　および　ＢｓｔＥＩＩ　によりブロックＶＩ
Ｉ　をそれぞれ切り出し、全合成ＭＡＰ遺伝子の対応す
るサイトに挿入した。なお挿入は、制限酵素で切断され
た約　１ｕｇのＤＮＡをそれぞれフェノール処理および
エタノール沈澱した後、　１０ｕｌ　の　１０ｍＭ　ト
リス塩酸（ｐＨ　８．０）−　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ混合
溶液（以下、ＴＥ１０と記述する）に溶解し、各々の溶
液の　３．５ｕｌを混合した後ライゲーションキット（
宝酒造社製）を用いて結合することにより行なった。ま
た、全合成ＭＡＰ遺伝子は、前述の寄託番号９９１３号
として微工研に寄託された大腸菌形質転換体から抽出さ
れたものである。得られたプラスミド、すなわち全合成
ＭＡＰ遺伝子（ｐＭＨ１）にＵＣＭＢＣ３６Ｓもしくは
ｐＵＣＭＢＣ　２２０Ｓから切り出した小断片（ブロッ
クＩＩもしくはブロック　ＶＩＩ）を挿入したプラスミ
ドを用い、カルシウム法で大腸菌ＨＢ１０１　株を形質
転換した。得られた形質転換体から、アルカリＳＤＳ法
でプラスミドを精製し、ブロックＩＩについては新たに
導入したＳａｌＩ　サイトの存在により、またブロック
ＶＩＩ　については削除した　ＰｖｕＩ　サイトの消失
により各ブロックの挿入を確認した。ブロックＩＩを挿
入することによりプラスミドｐＵＣＭＡＰＣ３６Ｓが、
またブロックＶＩＩを挿入することによりプラスミドｐ
ＵＣＭＡＰＣ　２２０Ｓがそれぞれ得られた。 Ｊ．２つのシステインを共にセリンのコドンに換えたＭ
ＡＰ遺伝子の構築 ２つのプラスミドｐＵＣＭＡＰＣ３６ＳおよびｐＵＣＭ
ＡＰＣ　２２０Ｓを、まずそれぞれ制限酵素　ＳａｃＩ
　および　ＳｐｌＩ　で切断した。さらに、切断したブ
ロックＩＩを含む試料は制限酵素　ＳｃａＩ　でさらに
切断し元のプラスミドに戻らないようにし、またブロッ
クＶＩＩ　を含む試料については、アルカリホスファタ
ーゼ（東洋紡績社製）を反応液中に加えてその　５´末
端のリン酸を取り除き、他のＤＮＡが制限酵素で切断し
た部位に挿入されない限り元のプラスミドに戻らないよ
うに工夫した。
【００３７】こうして処理した各々のプラスミド分解物
をフェノール処理、次いでエタノール沈澱させた後、１
０ｕｌのＴＥに溶解し、その　３．５ｕｌずつを混合し
てライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて結合さ
せた。これにより得られたブロックＩＩとＶＩＩ　が共
に挿入されたプラスミドを用いて、カルシウム法で大腸
菌ＭＶ１１８４を形質転換した。得られた形質転換体か
らアルカリＳＤＳ法にてプラスミドを精製し、先の行程
と同様にして制限酵素サイトの有無で挿入されたことを
確認し、プラスミドｐＵＣＭＡＰ−Ｈを得た。このプラ
スミドは、後掲の配列表において配列番号２で示される
塩基配列を有するＭＡＰ−Ｈ遺伝子を含む。 Ｋ．ＭＡＰ分泌発現ベクターｐＳＨ７　への変異体ＭＡ
Ｐ遺伝子の挿入 工程Ｊより得られたプラスミドｐＵＣＭＡＰ−Ｈと工程
Ｇより得られたＭＡＰ発現分泌ベクターｐＳＨ７　をそ
れぞれ制限酵素　ＸｂａＩ　と　ＢａｎＩＩＩ　で切断
し、フェノール処理、次いでエタノール沈澱させた後、
　１０ｕｌ　のＴＥに溶解した。その　３．５ｕｌづつ
を混合してライゲーションキット（宝酒造社製）を用い
て結合し、得られたプラスミドを用いてカルシウム法に
て大腸菌　９９ｃＩ＋株を形質転換した。こうして得ら
れた形質転換体からアルカリＳＤＳ法にてプラスミドを
精製し、ｐＳＨ７　にＭＡＰ−Ｈ遺伝子が挿入されたプ
ラスミドｐＳＨ７　Ｈを得た。このプラスミドｐＳＨ　
７Ｈを有する大腸菌形質転換体は、すでに工業技術院微
生物工業技術研究所特許微生物寄託センタ−に寄託され
ている（寄託番号：微工研菌寄第　１２０９３号）。 Ｌ．システイン結合の無いＭＡＰ変異体の生産と精製Ｍ
ＡＰ−Ｈ遺伝子が挿入された分泌ベクターｐＳＨ７　Ｈ
を用い、カルシウム法にて大腸菌ＭＭ２９４　を形質転
換した。得られた形質転換体を　２リットルのＬ培地（
１％バクト・トリプトン　−　０．５％バクト・イース
ト・エクストラクト　−　１％塩化ナトリウム　−　０
．１％ブドウ糖）を用いて３０℃で振とう培養した。培
養液の　５５０ｎｍの吸収が　０．８になった時点で、
予め５５℃に加温しておいた等量の培地を加えて全体の
温度を４２℃にし、さらにその温度で　３時間振とう培
養を続けた。その後、遠心分離により菌体を除去した培
地に硫安を９０％飽和になるように添加してタンパク質
を塩析し、さらに遠心分離により沈澱として回収した。 得られたタンパク質を約　４０ｍｌ　のＡ緩衝液（１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　６．０））に溶解し、さらに
Ａ緩衝液に対して透析を行なった。こうして得られた粗
抽出物を、予めＡ緩衝液にて前処理しておいたカルボキ
シメチル・セファロースカラム（２６φ×４０ｍｍ）に
吸着させた。 カラムをＡ緩衝液にて十分に洗浄した後、　０Ｍから　
０．５Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配にてタンパク質を溶
出した。抗ＭＡＰ抗血清を用いたＥＬＩＳＡにより、溶
出したタンパク質のＭＡＰ画分を集め、これをＢ緩衝液
（　１０ｍＭ　トリス／塩酸緩衝液（ｐＨ　８．０））
に対して透析し、その後、予めＢ緩衝液にて前処理した
ブルー・セファロースカラム（　５φ×５０ｍｍ）に吸
着させた。カラムをＢ緩衝液にて十分に洗浄した後　０
Ｍから　０．２Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配にてタンパ
ク質を溶出させた。抗ＭＡＰ抗血清を用いたＥＬＩＳＡ
により溶出したタンパク質のＭＡＰ画分を集め、これを
蒸留水に対して透析し、精製ＭＡＰ−Ｈとした。この段
階のＭＡＰ−ＨをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動にて解析した結果を図１３に模式的に示す。図１３に
おいて、レ−ン１は分子量マ−カ−であり、上から９７
、６６、４２、３０および２０キロダルトンを示す。ま
た、レ−ン２〜４は天然のＭＡＰであり、レ−ン５がこ
こで得られたＭＡＰ−Ｈである。レ−ン２のＭＡＰは、
電気泳動の直前にメルカプトエタノ−ルで還元してＳ−
Ｓ結合を切断しており、還元していないレ−ン４のＭＡ
Ｐと比較すると、パタ−ンが変化していることが分かる
（図中のａおよびｂ）。レ−ン５のＭＡＰ−ＨはこのＳ
−Ｓ結合を切断したＭＡＰと同様のパタ−ンを示した。 また、図１３に示すＭＡＰ−Ｈの泳動パタ−ンには他の
不純物を示すバンドはほとんど見出せず、ほぼ均一のタ
ンパク質であることが分かる。 Ｍ．ＭＡＰ−Ｈの試験管内タンパク質合成に対する阻害
効果 ３５Ｓメチオニンおよび適当量のＭＡＰあるいはＭＡＰ
−Ｈを含有する市販のウサギ網状赤血球粗抽出物　１０
ｕｌ　にｍＲＮＡとしてタバコモザイクウイルスＲＮＡ
を添加し、３０℃で３０分反応させて翻訳をさせた。そ
の後、この反応液　２ｕｌをロ紙上に採って乾燥し、こ
れを１０％のトリクロロ酢酸溶液で１０分間煮沸した。 ロ紙上に残った放射性物質（３５Ｓを取り込んだポリペ
プチド）の放射能を、トルエン系のシンチレ−ターを用
いて測定した。このときｍＲＮＡを加えていないサンプ
ルの放射能を　０％、ＭＡＰもしくはＭＡＰ−Ｈを加え
ていないサンプルの放射能を１００％のコントロールと
してＭＡＰとＭＡＰ−Ｈの影響を検討した。その結果を
図１４に示す。図１４において、縦軸には３５Ｓの取込
量をコントロ−ルに対する割合で示し、横軸にはＭＡＰ
およびＭＡＰ−Ｈの濃度を示した。
【００３８】図１４より明らかなように、ＭＡＰはこの
系に対して約　３．５ｎＭで５０％の阻害効果を示した
のに対し、ＭＡＰ−Ｈは約　０．１６ｎＭ　で５０％の
阻害効果を示した。すなわちＭＡＰ−Ｈのタンパク質合
成阻害活性は天然のＭＡＰに比べ、約２２倍向上した。
【００３９】
【発明の効果】以上詳細に示した通り、本発明による抗
ウイルス性タンパク質であるＳ−Ｓ結合の無いＭＡＰ変
異体（ＭＡＰ−Ｈ）は、天然のＭＡＰが有する利点を保
持しつつ、より高いタンパク質合成阻害活性を有する。 したがって、本発明の高ウイルス性タンパク質は、例え
ばイムノトキシン等で使用される毒タンパク質としてき
わめて有望である。
【００４０】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２５０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ アンチセンス：Ｎｏ フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉ
ｌｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓ
ｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　　　１　　　　　　　　　　　　
　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｔｈｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈ
ｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ
　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　３０　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈ
ｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ
　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　３５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４５　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ
　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　
Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　５０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　
　　６０　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　
Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　６５　　　　　　　　　　　　　　　　
　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　
Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａ
ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈ
ｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　８５　
　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　Ａｓｐ　Ｖ
ａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓ
ｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ
　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　
　　　　　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　
　　　　　　　　　　　１０５　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓ
ｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ
　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　　　　　　
　　　　　　　　　　　１１５　　　　　　　　　　　
　　　　　　１２０　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　
Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　　　　　　
　　　　　　　　　　　１２５　　　　　　　　　　　
　　　　　　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　
　１３５　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　
Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　
　　　　　　１４０　　　　　　　　　　　　　　　　
　１４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　
Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌ
ｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌ
ｅ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　
　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０　
　　　　　　　　　　　　　　　　１６５　Ｖａｌ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙ
ｓ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ
　Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　１７０　
　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　　　　　　
　　　　　　　　　　　１８０　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙ
ｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ
　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　
　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　
　　　　　　　　　　　１９０　　　　　　　　　　　
　　　　　　１９５　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ
　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　
Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　　　　　　
　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　　　
　　　　　　２０５　　　　　　　　　　　　　　　　
　２１０　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　
Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌ
ｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　
　　　　　　２１５　　　　　　　　　　　　　　　　
　２２０　　　　　　　　　　　　　　　　　２２５　
Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｒｐ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　
　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　
　　　　　　　　　　　　　　　　２４０　Ｌｙｓ　Ｌ
ｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙ
ｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　
　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　 配列番号：２ 配列の長さ：７６２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ アンチセンス：Ｎｏ 配列 ＧＣＧ　ＣＣＴ　ＡＣＴ　ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＡＣＣ　Ａ
ＴＣ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＡＣ　ＣＴＧ　ＡＡ
Ｃ　ＡＡＣ　ＣＣＧ　　　　　　　　　　　４５Ａｌａ
　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　
Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａ
ｓｎ　Ｐｒｏ　　　１　　　　　　　　　　　　　　　
５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１５　ＡＣＣ　ＡＣＣ　
ＴＡＣ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＴＣ　ＡＴＡ　ＡＣＧ　Ａ
ＡＴ　ＡＴＣ　ＣＧＴ　ＡＣＧ　ＡＡＡ　ＧＴＣ　ＧＣ
Ａ　　　　　　　　　　　９０Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ
　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　
　　　　　　３０　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＡＣＣ　ＧＡＡ　
ＣＡＧ　ＴＣＧ　ＡＣＣ　ＡＴＣ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　Ａ
ＴＣ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＣ　ＴＴＣ　　　　　　　
　　　１３５Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ
　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　
Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５
　ＡＣＣ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＴＡＣ　ＴＣＴ　ＴＡＣ　
ＡＴＡ　ＧＡＣ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＧＴＧ　ＡＧＣ　Ｔ
ＣＧ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　　　　　　　　　　１８０Ｔｈ
ｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ
　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　
　　　　　　　　　　　　　　　６０　ＡＡＡ　ＡＴＣ
　ＡＣＣ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣ　ＧＡＣ　ＡＴＧ　
ＧＣＴ　ＧＡＣ　ＣＴＧ　ＴＡＣ　ＧＴＴ　ＣＴＧ　Ｇ
ＧＴ　　　　　　　　　　２２５Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｈ
ｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｌａ
　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　６５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　７５　ＴＡＣ　ＴＣＴ　ＧＡＣ　ＡＴＣ
　ＧＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　
ＧＣＴ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　　　　　　
　　　　２７０Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌ
ａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ
　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　８０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９
０　ＧＡＣ　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＴＴ
　ＧＣＧ　ＡＡＣ　ＡＡＴ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＣＣＧ　
ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＡＣＡ　　　　　　　　　　３１５Ａ
ｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌ
ａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ
　Ａｌａ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　９５　　　　　　　　　　　　　　　　　１００　　
　　　　　　　　　　　　　　　１０５　ＧＧＴ　ＡＣ
Ｔ　ＡＡＴ　ＣＧＴ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＡＣＣ
　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＧＧＣ　
ＧＡＴ　　　　　　　　　　３６０Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａ
ｓｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ
　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　　　　　
　　　　　　　　　　　　１１５　　　　　　　　　　
　　　　　　　１２０　ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡ
Ｃ　ＧＧＣ　ＧＧＡ　ＣＴＡ　ＣＧＴ　ＡＡＧ　ＧＡＣ
　ＡＡＴ　ＣＣＣ　ＣＴＡ　ＧＧＴ　ＡＴＣ　　　　　
　　　　　４０５Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓ
ｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　　　　　　　　
　　　　　　　　　１２５　　　　　　　　　　　　　
　　　　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３５　ＴＴＣ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＡＣ　ＴＣ
Ｇ　ＡＴＡ　ＧＴＴ　ＡＡＣ　ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＧＧＣ
　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　　　　　　　　　　４５０
Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｉ
ｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙ
ｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　
　１４０　　　　　　　　　　　　　　　　　１４５　
　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　ＧＡＣ　Ｇ
ＴＴ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＴＴ
Ｃ　ＴＴＣ　ＴＴＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＡＴＣ　ＣＡＧ
　ＡＴＧ　　　　　　　　　　４９５Ａｓｐ　Ｖａｌ　
Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐ
ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｍｅ
ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　
　　　　　　　　　　　　　１６０　　　　　　　　　
　　　　　　　　１６５　ＧＴＴ　ＴＣＧ　ＧＡＧ　Ｇ
ＣＴ　ＧＣＧ　ＣＧＣ　ＴＴＴ　ＡＡＧ　ＴＡＴ　ＡＴ
Ｃ　ＡＧＴ　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＡＴＣ　ＣＣＧ　　　　
　　　　　　５４０Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　
Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＩＬｅ　Ｐｒｏ　　　　　　　
　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　
　　　　　１７５　　　　　　　　　　　　　　　　　
１８０　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＴＡＣ　ＧＡＡ　Ｇ
ＡＡ　ＧＴＴ　ＡＣＣ　ＧＴＴ　ＧＡＣ　ＧＡＡ　ＴＡ
Ｃ　ＡＴＧ　ＡＣＣ　ＧＣＴ　　　　　　　　　　５８
５Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　
Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｍ
ｅｔ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　
　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０
　　　　　　　　　　　　　　　　　１９５　ＣＴＧ　
ＧＡＡ　ＡＡＣ　ＡＡＣ　ＴＧＧ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　Ｃ
ＴＧ　ＴＣＴ　ＡＣＧ　ＧＣＣ　ＧＴＡ　ＴＡＣ　ＡＡ
Ｃ　ＴＣＴ　　　　　　　　　　６３０Ｌｅｕ　Ｇｌｕ
　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓ
ｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　　
　　　　　　　　　　　　　　２０５　　　　　　　　
　　　　　　　　　２１０　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　
ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＧＣＴ　ＡＣＣ　ＡＡＡ　Ｔ
ＣＴ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＡＣＣ　ＴＣＴ　　　
　　　　　　　６７５Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ
　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　
Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　　　　　　
　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　　　　
　　　　　　２２０　　　　　　　　　　　　　　　　
　２２５　ＣＣＧ　ＧＴＴ　ＡＣＣ　ＡＴＣ　ＴＣＴ　
ＣＣＧ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　ＡＣＣ　Ｇ
ＴＣ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＡＴＣ　　　　　　　　　　７
２０Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ
　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　
Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　　　
　　　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３
５　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０　ＡＡＡ
　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＣＴＴ　
ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＴＡＡＴＡＡＡＴＣＧ　ＡＴ
　　　　　　　　　　　　　　　　７６２Ｌｙｓ　Ｌｅ
ｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ
　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　
２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　 配列番号：３ 配列の長さ：１０８ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ アンチセンス：Ｎｏ 他の情報：配列番号２　に示す配列の７６−１７３　塩
基対に相当する合成ＤＮＡ断片 配列 ＡＧＣＴＴＧＧ　ＣＧＴ　ＡＣＧ　ＡＡＡ　ＧＴＣ　Ｇ
ＣＡ　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＡＣＣ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＴＣ
Ｇ　ＡＣＣ　ＡＴＣ　　　　　　　　　　　４６　　　
　　　　　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　
Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　１　　　　　　　
　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１０　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＡＴＣ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　
ＡＣＣ　ＴＴＣ　ＡＣＣ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＴＡＣ　Ｔ
ＣＴ　ＴＡＣ　ＡＴＡ　ＧＡＣ　　　　　　　　　　　
９１Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ
　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　
Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　　　　　　１５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２５　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＧＴＧ　ＡＧＣ
　ＴＣＡＡＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１０８Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　 　　　　　３０　 配列番号：４ 配列の長さ：８１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ アンチセンス：Ｎｏ 他の情報：配列番号２　に示す配列の　６１４−６８４
　塩基対に相当する合成ＤＮＡ断片 配列 ＡＧＣＴＴＧＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＴＡ　ＴＡＣ　ＡＡＣ
　ＴＣＴ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　
ＡＣＣ　ＧＣＴ　　　　　　　　　　　　　４５　　　
　　　　　　　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓｅ
ｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ
　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　
　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１０　ＡＣＣ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　
ＧＣＴ　ＡＣＣ　ＴＣＴ　ＣＣＧ　ＧＴＴ　ＡＣＣ　Ａ
ＡＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８１Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　　　　　
　　　　　１５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２０　 配列番号：５ 配列の長さ：７５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧ　ＣＣＴ　ＡＣＴ　ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＡＣＣ　Ａ
ＴＣ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＡＣ　ＣＴＧ　ＡＡ
Ｃ　ＡＡＣ　ＣＣＧ　　　　　　　　　　　４５ＡＣＣ
　ＡＣＣ　ＴＡＣ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＴＣ　ＡＴＡ　
ＡＣＧ　ＡＡＴ　ＡＴＣ　ＣＧＴ　ＡＣＧ　ＡＡＡ　Ｇ
ＴＣ　ＧＣＡ　　　　　　　　　　　９０ＧＡＣ　ＡＡ
Ａ　ＡＣＣ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＡＣＣ　ＡＴＣ
　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＡＴＣ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＣ　
ＴＴＣ　　　　　　　　　　１３５ＡＣＣ　ＣＡＧ　Ｃ
ＧＴ　ＴＡＣ　ＴＣＴ　ＴＡＣ　ＡＴＡ　ＧＡＣ　ＴＴ
Ｇ　ＡＴＣ　ＧＴＧ　ＡＧＣ　ＴＣＧ　ＡＣＧ　ＣＡＧ
　　　　　　　　　　１８０ＡＡＡ　ＡＴＣ　ＡＣＣ　
ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣ　ＧＡＣ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　Ｇ
ＡＣ　ＣＴＧ　ＴＡＣ　ＧＴＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　　　
　　　　　　　２２５ＴＡＣ　ＴＣＴ　ＧＡＣ　ＡＴＣ
　ＧＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　
ＧＣＴ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　　　　　　
　　　　２７０ＧＡＣ　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣ
Ｔ　ＧＴＴ　ＧＣＧ　ＡＡＣ　ＡＡＴ　ＴＴＣ　ＴＴＣ
　ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＡＣＡ　　　　　　　　　
　３１５ＧＧＴ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　ＣＧＴ　ＡＴＣ　Ａ
ＡＡ　ＴＴＡ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＧＧＴ　ＴＣ
Ｔ　ＴＡＴ　ＧＧＣ　ＧＡＴ　　　　　　　　　　３６
０ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＣ　ＧＧＣ　ＧＧＡ　
ＣＴＡ　ＣＧＴ　ＡＡＧ　ＧＡＣ　ＡＡＴ　ＣＣＣ　Ｃ
ＴＡ　ＧＧＴ　ＡＴＣ　　　　　　　　　　４０５ＴＴ
Ｃ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＡＣ　ＴＣＧ　ＡＴＡ
　ＧＴＴ　ＡＡＣ　ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＧＧＣ　ＡＡＡ　
ＧＣＴ　ＧＧＴ　　　　　　　　　　４５０ＧＡＣ　Ｇ
ＴＴ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＴＴ
Ｃ　ＴＴＣ　ＴＴＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＡＴＣ　ＣＡＧ
　ＡＴＧ　　　　　　　　　　４９５ＧＴＴ　ＴＣＧ　
ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＣＧＣ　ＴＴＴ　ＡＡＧ　Ｔ
ＡＴ　ＡＴＣ　ＡＧＴ　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＡＴＣ　ＣＣ
Ｇ　　　　　　　　　　５４０ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ
　ＴＡＣ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＡＣＣ　ＧＴＴ　
ＧＡＣ　ＧＡＡ　ＴＡＣ　ＡＴＧ　ＡＣＣ　ＧＣＴ　　
　　　　　　　　５８５ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＡＣ　ＡＡ
Ｃ　ＴＧＧ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＡＣＧ
　ＧＣＣ　ＧＴＡ　ＴＡＣ　ＡＡＣ　ＴＣＴ　　　　　
　　　　　６３０ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＡＣＣ　Ａ
ＣＣ　ＡＣＣ　ＧＣＴ　ＡＣＣ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＣＡ
Ｇ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＡＣＣ　ＴＣＴ　　　　　　　　
　　６７５ＣＣＧ　ＧＴＴ　ＡＣＣ　ＡＴＣ　ＴＣＴ　
ＣＣＧ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　ＡＣＣ　Ｇ
ＴＣ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＡＴＣ　　　　　　　　　　７
２０ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　ＣＴＧ
　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＴＡＡＴＡＡ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５６ 配列番号：６ 配列の長さ：７４ 配列の型：核酸 配列 ＡＴ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＧＣＴ　ＡＴ
Ｃ　ＧＣＧ　ＡＴＴ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＣＴＧ
　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＴＴＣ　　　　　　　　４７　　　
Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａ
ｌａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌ
ａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　　　　　１　　　　　　　　　　
　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５ＧＣＴ　
ＡＣＣ　ＧＴＡ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣ　ＧＣＧＣＣ
ＴＡＣＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　７４Ａｌａ　Ｔｈｒ
　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２０　 配列番号：７ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 配列 ＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡ
ＣＡＴＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＴＡＧＡＡＡＡＴＣ
ＧＡＴＡＡＡ　　　　　　　　　　　　　　５６
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＡＰをコ−ドする合成遺伝子の塩基配列を示
す図
【図２】ＯｍｐＡのシグナル配列とこれをコ−ドする遺
伝子の塩基配列を、ＭＡＰのアミノ酸配列の一部とこれ
をコ−ドする遺伝子の塩基配列と共に示す図
【図３】合
成ＤＮＡリンカ−の塩基配列を示す図
【図４】本発明の
実施例における工程Ａを模式的に示す図
【図５】本発明の実施例における工程Ｂを模式的に示す
図
【図６】本発明の実施例における工程Ｃを模式的に示す
図
【図７】本発明の実施例における工程Ｅを模式的に示す
図
【図８】本発明の実施例における工程ＦおよびＧを模式
的に示す図
【図９】本発明の実施例における工程ＨおよびＩを模式
的に示す図
【図１０】本発明の実施例における工程ＪおよびＫを模
式的に示す図
【図１１】本発明の実施例において、ＭＡＰ変異体に挿
入されるブロックＩＩとして合成されたＤＮＡ断片のア
ミノ酸配列とそれをコ−ドする遺伝子の塩基配列を示す
図
【図１２】本発明の実施例において、変異体ＭＡＰに
挿入されるブロックＶＩＩ　として合成されたＤＮＡ断
片のアミノ酸配列とそれをコ−ドする遺伝子の塩基配列
を示す図
【図１３】精製した変異体ＭＡＰのＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により得られた泳動パタ−
ンを模式的に示す図
【図１４】ＭＡＰおよびＳ−Ｓ結合の無い変異体ＭＡＰ
のウサギ網状赤血球の系に対するタンパク質合成阻害活
性を示すグラフ
JP3083456A 1991-03-22 1991-03-22 抗ウイルス性タンパク質 Pending JPH04295499A (ja)

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