CZ285440B6 - Způsob výroby cizích proteinů v streptomycetách - Google Patents

Způsob výroby cizích proteinů v streptomycetách Download PDF

Info

Publication number
CZ285440B6
CZ285440B6 CS911101A CS110191A CZ285440B6 CZ 285440 B6 CZ285440 B6 CZ 285440B6 CS 911101 A CS911101 A CS 911101A CS 110191 A CS110191 A CS 110191A CZ 285440 B6 CZ285440 B6 CZ 285440B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
fusion protein
gene
tendamistate
protein
amino acids
Prior art date
Application number
CS911101A
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus-Peter Dr. Koller
Günther Dr. Riess
Original Assignee
Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Aktiengesellschaft filed Critical Hoechst Aktiengesellschaft
Publication of CZ110191A3 publication Critical patent/CZ110191A3/cs
Publication of CZ285440B6 publication Critical patent/CZ285440B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Abstract

Řešení se týká genových struktur, kodujících signální sekvenci a asi prvních deset aminokyselin tendamistátu, jakož i požadovaný protein, exprimují se ve vysokých výtěžcích v hostitelských buňkách streptomycet a sekretují fúzní proteiny do prostředí.ŕ

Description

Fúzní protein, způsob jeho výroby, genová struktura pro jeho výrobu, vektor tuto genovou strukturu obsahující, streptomycetová buňka, obsahující tento vektor a použití tohoto fúzního proteinu
Oblast techniky
Vynález se týká fuzních proteinů, způsobu jejich výroby, genové struktury pro jejich výrobu, vektoru tuto genovou strukturu obsahující, streptomycetové buňky, obsahující tento vektor jeho použití tohoto fuzního proteinu.
Dosavadní stav techniky
Z evropské patentové přihlášky s číslem zveřejnění (EP-A) 0 289 936 je známo, že se fúzní proteiny vyrobí tak, že se strukturní gen pro požadovaný protein připojí na 3'-konec kódujícího řetězce popřípadě modifikovaného tendamistát-genu, tato genová struktura se přivede v hostitelské buňce bakterií Streptomyces k expresi a sekretovaný fuzní protein se izoluje z média. Při výhodné formě provedení se tendamistát-gen na 3'-konci zkrátí. Pro zkrácení se používají štěpná místa pro restrikční enzymy BstEII v oblasti tripletů 31 a 32, Stul v oblasti tripletů 43 a 44, jakož i Sau3A v oblasti tripletů 52 a 53.
Při dalším vývoji této vynálezecké myšlenky bylo již navrženo, vyrobit fúzní protein, ve kterém po podílu tendamistátu následuje zkrácený proinsulin, jehož C-řetězec sestává pouze z jednoho nebo dvou lysinových zbytků (miniproinsulin). Jako další pokračování vývoje bylo navrhováno, aby se v takovýchto fúzních proteinech zkrátil i podíl tendamistátu (evropská přihláška EP-A 0 367 163 zveřejněná 9. 5. 1990).
Nyní bylo s překvapením zjištěno, že fuzní proteiny s velmi krátkým podílem tendamistátu jsou v buňce streptomycet stálé a vyplavují se do média. Takto získané fúzní proteiny se chovají v důsledku velmi krátkého řetězce tendamistátu jako zralé proteiny a existují všeobecně v médiu ve správné terciární struktuře.
Z EP-A 0 177 827 je známá syntetická signální sekvence pro přenos proteinů do expresních systémů, která je charakteristická tím, že DNA odpovídá v podstatě přirozené signální sekvenci, avšak vykazuje jedno nebo více štěpných míst pro endonukleázy, která nejsou v přirozené DNA obsažena. Když se připojí gen pro protein, který se má přenést, na takovou sekvenci DNA, zabuduje se tento fuzní gen do vektoru a tím se transformuje hostitelská buňka, která transportuje exprimovaný protein z cytoplasmy, mohou se tak v prokaryotických a eukaryotických buňkách vyrobit prokaryotické nebo virální proteiny. Na příkladu periplasmatického proteinu alkalické fosfatázy se ukazuje, že pří expresi v E. coli je výhodné, když se v návaznosti na pre-sekvenci dosadí kodony pro asi prvních 40 aminokyselin alkalické fosfatázy před strukturní gen pro požadovaný protein. V mnoha případech však postačí také méně přídavných aminokyselin, například asi 10, s výhodou asi 5. Odpovídající fúzní protein s opičím proinsulinem byl transportován asi z 90 % do periplasmatického prostoru.
Bylo již také navrhováno (W0 91/03 550 z 21. 3. 1991) vyrábět fuzní proteiny tak, že se konstruuje směsný oligonukleotid, který kóduje balastní podíl fuzního protein, tento oligonukleotid se vnese do vektoru tak, že je funkčně připojen na regulační region a strukturní gen pro požadovaný protein, s takto získanou populací plasmidu se transformují vhodné hostitelské buňky a ty klony, které vykazují vysoký výtěžek fuzního proteinu, se selektují.
Oligonukleotid sestává při tom s výhodou ze 4 až 12, zejména pak 4 až 8 tripletů.
- 1 CZ 285440 B6
Zkoušelo se rovněž vyrobit fuzní proteiny s krátkým balastním podílem. Tak byla například vyrobena genová fuze, která kóduje fuzní protein z prvních 10 aminokyselin β-galaktosidázy a somatostatinu. Ukázalo se však, že tento krátký fragment β-galaktosidázy nepostačí k tomu, aby chránil fuzní protein před odbouráváním proteázami, vlastními hostiteli (US 4 366 246, 15, odstavec 2). V souladu s tím byly v EP-A 0 290 005 a 0 292 763 popsány fuzní proteiny, jejichž balastní podíl sestává z fragmentu β-galaktosidázy s více než 250 aminokyselinami.
Podstata vynálezu
Neočekávaně bylo nyní zjištěno, že fuzní proteiny, sestávající z prvních sedmi až deseti aminoterminálních aminokyselin tendamistátu a požadovaného proteinu, například proinsulinu, jsou v hostitelských buňkách streptomycet stabilní a jsou sekretovány do média, ze kterého se mohou získat ve vysokých výtěžcích. Je překvapující, že to platí i pro relativně malé proteiny jako jsou mini-proinsuliny.
Předmětem předloženého vynálezu tedy jsou fuzní proteiny, vyrobitelné tak, že se strukturní gen pro požadovaný protein připojí na kodony pro signální sekvence a na prvních sedm až deset aminoterminálních aminokyselin tendamistátu, tato genová struktura se přivede ve streptomycetové hostitelské buňce k expresi a sekretovaný fuzní protein se izoluje z média, přičemž tendamistátové genové sekvence mohou být v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny modifikované výměnou aminokyseliny.
Výhodný je fuzní protein, ve kterém je podíl N-terminálních prvních sedmi až deseti aminokyselin tendamistátu připojen, popřípadě přes můstkovou sekvenci, na požadovaný protein. Předmětem předloženého vynálezu je dále způsob výroby fůzních proteinů, jehož podstata spočívá vtom, že se strukturní gen pro požadovaný protein připojí na kodony pro signální sekvence a na prvních sedm až deset aminoterminálních aminokyselin tendamistátu, tato genová struktura se přivede ve streptomycetové hostitelské buňce k expresi a sekretovaný fuzní protein se izoluje z média, přičemž tendamistátové genové sekvence mohou být v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny modifikované výměnou aminokyseliny.
Dále je předmětem vynálezu genová struktura, u které jsou signální sekvence a prvních sedm až deset kodonů pro tendamistát připojeny na strukturní gen pro jiný protein.
Výhodně jsou v tendamistátovém podílu vyměněny kodony pro aminokyseliny v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny. Mezi genem tendamistátu a strukturním genem pro požadovaný protein je výhodně uspořádán fragment DNA, který je kódován pro peptidický linker se sekvencí AsnSer-Asn-Gly-Arg.
Dále je předmětem předloženého vynálezu vektor, do kterého je ligována výše uvedená genová struktura.
Předmětem předloženého vynálezu je rovněž streptomycetová buňka, obsahující výše uvedený vektor.
Konečně je předmětem vynálezu použití výše uvedeného fiizního proteinu, popřípadě fůzního proteinu, získatelného výše uvedeným způsobem, pro výrobu požadovaného proteinu.
Výhodné jsou fuzní proteiny, v jejichž podílu tendamistátu je v poloze 7 a/nebo 9 prolin (jako v přírodní sekvenci).
-2CZ 285440 B6
Samozřejmě je ale také možné, zvolit v souladu sjiž známými nebo navrženými formami provedení větší balastní podíl tendamistátu, přičemž se ale přirozeně stále více a více ztrácí výhoda malého balastu.
Je možné a dokonce výhodné, když se přirozený sled aminokyselin podílu tendamistatu mění, tedy, když se aminokyseliny vymění nebo se zavedou takové které se v přirozeném sledu aminokyselin nevyskytují. Dále je možné měnit sled aminokyselin v signálním peptidů.
Obzvláště výhodné fúzní konstrukce se mohou snadno zjistit na základě vynálezecké myšlenky jednoduchými předběžnými pokusy.
Dále je také možné uskutečnit vynálezeckou myšlenku i v jiných grampozitivních bakteriálních buňkách, například v buňkách bacilů nebo stafylokoků, za použití signálních sekvencí, které tito hostitelé rozeznají.
Fůzní proteiny, získané podle vynálezu, se vyskytují v médiu v rozpuštěné formě, což poskytuje řadu výhod při dalším zpracování a čištění. Tak se může provádět například další enzymatické zpracování za odštěpení balastního podílu bezprostředně s produktem sekrece, aniž by bylo nutné provádět postupy zpracování, které jsou nezbytné u nerozpustných fuzních proteinů. Je také možné provést před dalším zpracováním nejdříve zakoncentrování nebo čištění, například pomocí afinitní chromatografie, ale také ultrafiltrací, srážením, iontoměničovou chromatografií, adsorpční chromatografií, gelovou filtrací nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je blíže vysvětlen v následujících příkladech
Výchozím materiálem pro plasmidové konstrukce je plasmid pKK500, který byl navržen v EP-A 0 367 163. Tento plasmid se liší od plasmidu pKK400, známého z EP-A 0 289 936, náhradou genu proinsulinu analogickým genem, který kóduje namísto C-řetězce pouze aminokyselinu lysin, jakož i zavedením terminátorové sekvence, připojující se k tomuto genu mini-proinsulinu. V následující tabulce 1 a 2 je znázorněn gen mini-proinsulinu a sekvence terminátoru.
Tabulka 1
B1 10
ASN SER ASN GLY LYS PHE VAL ASN GLN HIS LEU CYS GLY SER HIS
AAT TCG AAC GGC AAG TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
(EcoRI)
20 30
LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE PHE
CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC
GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
c A1 40
TYR THR PRO LYS THR LYS GLY ILE VAL GLU GLN CYS CYS THR SER
TAC ACC CCC AAG ACC AAG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC
ATG TGG GGG TTC TGG TTC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG
-3CZ 285440 B6
Tabulka 1 - pokračování
ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STO
ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA
TAG ACG AGG GAG ATG GTC GGA CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT
GTC GAC CTG CAG CCA
CAG CTG GAC GTC GGT TCG A
Sáli (HindUI)
Tabulka 2 t
GCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGAAAACCTCGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTGCACCTAG-5'
Plasmidy pKK400 a pKK.500 obsahují v signální sekvenci genu inhibitoru α-amylázy štěpné místo XmalII (v oblasti tripletů -5 až -7).
Příklad 1
Plasmid pKK500 se otevře restrikčními enzymy EcoRI a XmalII a oddělí se velký fragment na 0,8 % agarosovém gelu gelovou elektroforézou a izoluje se elektroelucí. Tento fragment se liguje fragmentem DNA (1) (SEQ ID N0:l) syntetizovaným fosforamiditovou metodou
-5 -1
Ala Gly Pro Ala Ser Ala
5'G GCG GGG CCG GCC TCC GCC
3' CCC GGC CGG AGG CGG
(XmalII)
Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCG 3'
GTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A 5'
(EcoRI) a ligační směs se transformuje do E. coli. Získá se plasmid pKK510. Tento kóduje preproinsulin, ve kterém na signální sekvenci tendamistátu navazuje prvních 7 aminokyselin tendamistátu a potom řetězec mini-proinsulinu.
Příklad 2
Analogicky jako u způsobu převedení plasmidu pHH400 na expresní plasmid pGFI, který je popsán v EP-A 0 289 936, se plasmid pKK510 převede v expresní plasmid pKFI:
Izolovaná DNA plasmidu pKK510 se štěpí restrikčními enzymy SpHI a Sstl a izoluje se malý fragment s fuzním genem. Na trhu obvyklý expresní plasmid pIJ 702 /získatelný u firmy John Innes Foundation, Norwich, Anglie/ se štěpí stejnými enzymy a izoluje se velký fragment. Tyto oba izolované fragmenty se ligují, ligační směs se transformuje do S. lividans TK24 a z thiostrepton-resistentních bílých transformantů (to znamená neschopných tvořit melanin), se
-4CZ 285440 B6 izoluje plasmid. Klony, které nesou vloženou informaci, se zkouší v třepané kultuře, zda jsou schopny tvořit fuzní proteiny.
Exprese kódovaného fuzního proteinu se provádí o sobě známým způsobem, transformovaný kmen se inkubuje 4 dny při teplotě převyšující 25 °C v třepací baňce a mycelium se oddělí odstředěním od kultivačního roztoku. Vytvořený fuzní protein se může v kultivačním mediu zviditelnit po elektroforéze 20 pm filtrátu kultury v 15 % polyakrylamidovém gelu obarvením RCOOMASSIE-modří jako přídavný pás proteinu, který se při kontrolním pokusu neobjeví, na který byl kmen pouze transformován pomocí pIJ 702.
Jestliže se filtrát kultury zpracovává lysylendoproteinázou, tak se může prokázat gelovou elektroforézou Des-(B30)-Thr-insulin, který se verifikuje autentickou kontrolou.
Dále se může fuzní protein ve filtrátu kultury prokázat protilátkami insulinu buď v testu Immuno-Blot, nebo insulin-RIA.
Příklad 3
Postupuje se jako v příkladu 1 a 2, použije se ale syntetický fragment /2/ se SEQ ID NO: 2.
Ala -5 Gly Pro Ala Ser -1 Ala
5'G CCG GGG CCG GCC TCC GCC
3' CCC GGC CGG AGG CGG
/XmalII/
Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG 3'
CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CTG GGC TTA A 5'
/EcoRI/
a získají se tak plasmidy pKK320 popřípadě pKF2.
Tyto plasmidy kódují fuzní protein, který se liší od proteinu podle příkladu 1 a 2 tím, že po prvních 7 aminokyselinách tendamistátu následuje asparagin (místo přirozené aminokyseliny alaninu) a potom devátá aminokyselina v tendamistátu, prolin. Výměnou alaninu za asparagin se tedy zavede do balastního podílu fuzního proteinu dodatečný kladný náboj. Překvapivě se získají asi o 20 až 30 % vyšší výtěžky než podle příkladu 2.
Příklad 4
Postupuje se podle příkladu 1 a 2, ale použije se syntetický fragment /3/ se SEQ ID NO:3
-5 -1
Ala Gly Pro Ala Ser Ala
5'G GCC GGG CCG GCC TCC GCC
3' CCC GGG CGG AGG CGG
/XmalII/
-5CZ 285440 B6
Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Ala Pro
GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCG
CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CGT GGC
přičemž se získají plasmidy pKK330, popřípadě pKF3. Tyto plasmidy se liší od plasmidů podle příkladu 1 a 2 tím, že kódují prvních 9 přirozených aminokyselin tendamistátu. Ve srovnání s příkladem 2 se získají asi o 10 % vyšší výtěžky.
Příklad 5
Fúzní protein, kódovaný pKK500, obsahuje mezi podílem tendamistátu a B-řetězcem proinsulinu sekvenci linkeru, která kóduje aminokyseliny Asn-Ser-Asn-Gly-Lys. Náhrada tohoto koncového lysinu a lysinu, představujícího C-řetězec, argininem, se provádí dále popsaným způsobem. Při tom se postupuje od singulárního štěpného místa Styl v oblasti kodonu B30 až AI v sekvenci proinsulinu.
Izolovaný plasmid DNA, pocházející zpKK500 se štěpí pomocí Styl, natráví se pro odstranění přesahujících konců Sl nukleázou a přebytečná nukleáza se extrahuje fenolickým chloroformem. Linearizovaný plasmid se potom dále štěpí pomocí EcoRI, velký fragment se oddělí elektroforeticky a izoluje elektroelucí. Tento fragment se liguje se syntetickým fragmentem/4/SEQ ID NO:4/
B1 10
Asn AAT Ser TCG GC /EcoRI/ Asn AAC TTG Gly GGC CCG Arg CGC GCG Phe TTC AAG Val GTC CAG Asn AAC TTG Cln CAG GTC His GAC GTG Leu CTG GAC Cys TGC ACG Gly GGC GGG Ser TCG AGC His CAC GTG
20 30
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe
CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC CTC TTC
GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC CGC CCG AAG AAG
B/30C/B31/
Tyr Thr Pro Lys Thr Arg
TAC ACC CCC AAG ACC CGC
ATG TGG GGG TTC TGG GGG
a ligační směs se transfřomuje do E. coli. Požadované klony se zkouší restrikční analýzou získaného plasmidu, přičemž se upotřebí nově vzniklé štěpné místo SstlI. Dále se celý fragment SphI-Sstl sekvencuje.
Pro expresi kódovaného fuzního proteinu se fragment přezkoušený sekvenční analýzou liguje ve vektoru pIJ 702, štěpeného stejnými enzymy, přičemž vznikne expresní vektor pGF4.
Důkaz fuzního proteinu kódovaného pGF4 a sekretovaného se může provádět jednak deskovým testem pomocí inhibitoru α-amylázy /EP A O 161629/, příklad 3/ a jednak z média třepané kultury analogicky jako v příkladu 2.
-6CZ 285440 B6
Příklad 6
Jestliže se analogicky jako v příkladu 5 zavede fragment /4/ do vektorů pKK510, 520, 530, získají se vektory pKK610, 620 a 630. Vestavba takovýchto fragmentů SphI-Sstl se sekvencí kódovanou pro fuzní proteiny do vektoru pIJ 702 poskytne expresní vektory pKFl 1, 12 a 13.
Exprese sekretovaných fuzních proteinů se přezkouší podle příkladu 2.
Příklad 7
Pro zvýšení exprese derivátů plasmidu pIJ 702 se z tohoto natrávením pomocí Pstl a Sphl odstraní promotor melaminu a nahradí se syntetickým fragmentem /5/ (SEQ ID NO:5).
Pstl Bol 1
20 30 40 50
CTGCAGTGATCAGGGGGAGCCTTGTGCGAATTTCCGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGG GACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC
Sphl
70 80
ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGC TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG
Tím vznikne tandemová konstrukce ze syntetického promotoru a promotoru tendamistátu. Plasmid získá označení pGRl 10.
Jestliže se v pGRllO po štěpení pomocí Sphl a Sstl použijí syntetické fragmenty /1/, /2/ /a/3/, tak rezultují expresní vektory pGR20, 210 a 220. Analogicky se získají s fragmentem /4/ expresní vektoiy pGR250, 260 a 270.
Příklad 8
Jestliže se má zpreinsulinů vyrobit kombinací trypsinu nebo stejně působícího enzymu karboxypeptidázy B humánní insulin, je výhodné, v průběhu štěpné reakce rychle odštěpit aminoterminální balastní podíl, aby se podpořila ve směru kB31 (Arg)-insulinu. K tomu se nabízí modifikace aminokyselin před aminokyselinou Bl/Phe/:
Postupuje se podle příkladu 1 a otevře se plasmid pKK500 pomocí restrikčních enzymů EcoRi a DralII. Původní fragment se potom nahradí pomocí fragmentu DNA /6/, syntetizovaného fosforamiditovou metodou (SEQ ID NO:6)
Asn Ser Ala Arg Bl Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu
5’ AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC 3'
3’ GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG 5’
/EcoRi/ /DralII/
Klonování vE. coli a exprese ve Streptomyces lividans se provádí podle příkladu 1, popřípadě příkladu 2. Rezultuje plasmid pKK640, popřípadě expresní plasmid pKF14.
Analogicky se může postupovat i s plasmidem, který se získá podle příkladu 5 (po vestavbě fragmentu 141). Získá se tak plasmid pKK650, popřípadě pKF15.

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Fúzní protein, vyrobitelný připojením strukturního genu pro požadovaný protein na kodony pro signální sekvence a na prvních sedm až deset aminoterminálních aminokyselin tendamistátu, přivedením této genové struktuiy ve streptomycetové hostitelské buňce k expresi a izolováním sekretovaného fúzního proteinu z média, přičemž tendamistátové genové sekvence mohou být v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny modifikované výměnou aminokyseliny.
  2. 2. Fúzní protein podle nároku 1, ve kterém podíl N-terminálních prvních sedmi až deseti aminokyselin tendamistátu je připojen, popřípadě přes můstkovou sekvenci, na požadovaný protein.
  3. 3. Způsob výroby fuzních proteinů podle nároku 1, vyznačující se tím, že se strukturní gen pro požadovaný protein připojí na kodony pro signální sekvence a na prvních sedm až deset aminoterminálních aminokyselin tendamistátu, tato genová struktura se přivede ve streptomycetové hostitelské buňce k expresi a sekretovaný fuzní protein se izoluje z média, přičemž tendamistátové genové sekvence mohou být v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny modifikované výměnou aminokyseliny.
  4. 4. Genová struktura pro výrobu fuzního proteinu podle nároku 1, u které jsou signální sekvence a prvních sedm až deset kodonů pro tendamistát připojeny na strukturní gen pro požadovaný protein.
  5. 5. Genová struktura podle nároku 4, u které jsou v tendamistátovém podílu vyměněné kodony pro aminokyseliny v oblasti sedmé až desáté aminokyseliny.
  6. 6. Genová struktura podle nároků 4 nebo 5, u které je mezi genem tendamistátu a strukturním genem pro požadovaný protein uspořádán fragment DNA, který kóduje peptidický linker se sekvencí Asn-Ser-Asn-Gly-Arg.
  7. 7. Vektor, do kterého je ligována genová struktura podle nároků 4, 5 nebo 6.
  8. 8. Streptomycetová buňka, obsahující vektor podle nároku 7.
  9. 9. Použití fuzního proteinu podle nároku 1, pro výrobu požadovaného proteinu.
CS911101A 1990-04-21 1991-04-18 Způsob výroby cizích proteinů v streptomycetách CZ285440B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4012818A DE4012818A1 (de) 1990-04-21 1990-04-21 Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ110191A3 CZ110191A3 (en) 1993-08-11
CZ285440B6 true CZ285440B6 (cs) 1999-08-11

Family

ID=6404857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS911101A CZ285440B6 (cs) 1990-04-21 1991-04-18 Způsob výroby cizích proteinů v streptomycetách

Country Status (29)

Country Link
EP (1) EP0453969B1 (cs)
JP (1) JP3319605B2 (cs)
KR (1) KR0168669B1 (cs)
CN (1) CN1049248C (cs)
AT (1) ATE142263T1 (cs)
AU (1) AU630287B2 (cs)
BR (1) BR9101587A (cs)
CA (1) CA2040810C (cs)
CZ (1) CZ285440B6 (cs)
DE (2) DE4012818A1 (cs)
DK (1) DK0453969T3 (cs)
ES (1) ES2093043T3 (cs)
FI (1) FI911882A (cs)
GR (1) GR3021040T3 (cs)
HR (1) HRP940770A2 (cs)
HU (1) HU210358B (cs)
IE (1) IE911322A1 (cs)
IL (1) IL97903A0 (cs)
LT (1) LT3686B (cs)
LV (1) LV10494B (cs)
NO (1) NO911557L (cs)
NZ (1) NZ237882A (cs)
PL (2) PL169596B1 (cs)
PT (1) PT97427B (cs)
RU (1) RU2055892C1 (cs)
SK (1) SK110191A3 (cs)
TW (1) TW213487B (cs)
YU (1) YU48435B (cs)
ZA (1) ZA912937B (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100188800B1 (ko) * 1990-09-05 1999-06-01 이센브룩, 라피세 프리프로인슐린을 인슐린으로 전환시키기 위한 효소적 방법
DK0600372T3 (da) 1992-12-02 1997-08-11 Hoechst Ag Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer.
EP0622376B1 (de) * 1993-04-27 2001-08-08 Hoechst Aktiengesellschaft Amorphe monosphärische Formen von Insulinderivaten
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
CN1061375C (zh) * 1996-07-19 2001-01-31 中国科学院上海生物工程研究中心 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白
ES2218622T3 (es) 1996-07-26 2004-11-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada.
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
CN1298742C (zh) * 2003-06-03 2007-02-07 上海新药研究开发中心 一种适合于高效表达的融合蛋白及其生产方法
RU2395296C1 (ru) * 2009-02-19 2010-07-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" Способ получения препарата проинсулина для перорального применения
CN104818291A (zh) * 2015-05-08 2015-08-05 江南大学 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
DE3418274A1 (de) 1984-05-17 1985-11-21 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten
DE3707150A1 (de) * 1987-03-06 1988-09-15 Hoechst Ag Tendamistat-derivate
DE3714866A1 (de) * 1987-05-05 1988-11-24 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten
DE3715033A1 (de) 1987-05-06 1988-11-17 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung von fusionsproteinen
DE3716722A1 (de) 1987-05-19 1988-12-01 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen
DE3843713A1 (de) * 1988-04-25 1989-11-02 Henkel Kgaa Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung
ES2081826T3 (es) * 1988-11-03 1996-03-16 Hoechst Ag Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos.

Also Published As

Publication number Publication date
KR0168669B1 (ko) 1999-01-15
JP3319605B2 (ja) 2002-09-03
NZ237882A (en) 1993-12-23
LTIP1523A (en) 1995-06-26
TW213487B (cs) 1993-09-21
FI911882A0 (fi) 1991-04-18
LT3686B (en) 1996-01-25
AU630287B2 (en) 1992-10-22
NO911557L (no) 1991-10-22
HU911302D0 (en) 1991-10-28
HU210358B (en) 1995-04-28
NO911557D0 (no) 1991-04-19
CN1055952A (zh) 1991-11-06
CZ110191A3 (en) 1993-08-11
GR3021040T3 (en) 1996-12-31
LV10494A (lv) 1995-02-20
DE4012818A1 (de) 1991-10-24
YU69691A (sh) 1995-12-04
DK0453969T3 (cs) 1997-02-10
RU2055892C1 (ru) 1996-03-10
YU48435B (sh) 1998-07-10
CA2040810A1 (en) 1991-10-22
HRP940770A2 (en) 1997-06-30
EP0453969B1 (de) 1996-09-04
ZA912937B (en) 1991-12-24
SK110191A3 (en) 1995-07-11
IE911322A1 (en) 1991-10-23
FI911882A (fi) 1991-10-22
CA2040810C (en) 2001-07-24
PL169178B1 (pl) 1996-06-28
BR9101587A (pt) 1991-12-10
KR910018551A (ko) 1991-11-30
LV10494B (en) 1996-02-20
IL97903A0 (en) 1992-06-21
PL289953A1 (en) 1991-11-04
EP0453969A1 (de) 1991-10-30
JPH04228086A (ja) 1992-08-18
DE59108128D1 (de) 1996-10-10
ATE142263T1 (de) 1996-09-15
AU7515491A (en) 1991-10-24
ES2093043T3 (es) 1996-12-16
PL169596B1 (pl) 1996-08-30
PT97427A (pt) 1992-01-31
PT97427B (pt) 1998-08-31
HUT57268A (en) 1991-11-28
CN1049248C (zh) 2000-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3730255B2 (ja) イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質
US6500645B1 (en) N-terminally extended proteins expressed in yeast
US5322930A (en) Expression of recombinant polypeptides with improved purification
DE60208343T2 (de) FUSIONSPROTEINE aus hirudin und proinsulin oder insulin
IL95495A (en) Fusion proteins their preparation and use
JPS63251095A (ja) 新規融合蛋白質およびその精製方法
DE2848053A1 (de) Synthetische dna und verfahren zu ihrer herstellung
JPH06296491A (ja) シグナル配列をコードしているｄｎａと機能的に結合しているヒト成長ホルモンをコードしているｄｎａ
FI93734B (fi) Menetelmä eukaryoottisen painolastiosan sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoisia tuotteita
EP0211299A2 (de) Fusionsproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
EP0316933B1 (en) A process for producing apoaequorin
CZ285440B6 (cs) Způsob výroby cizích proteinů v streptomycetách
Molina et al. Expression of a synthetic gene encoding potato carboxypeptidase inhibitor using a bacterial secretion vector
EP0946735A1 (en) N-terminally extended proteins expressed in yeast
EP0868523B1 (en) Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell
US5426036A (en) Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
AU612144B2 (en) A process for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
EP0314184B1 (en) Expression plasmids
IL92178A (en) Process for preparing pre-insulin in streptomycetes
KR940004543B1 (ko) 이.콜라이의 trp 발현 시스템을 갖는 벡터를 제조하는 방법
AU4499399A (en) Method of making proteins in transformed yeast cells
KR19990009995A (ko) 신규한 인간성장호르몬방출인자-인간상피세포성장인자 융합유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬방출인자의 제조방법
JPS62228283A (ja) Ｄｎａ遺伝子、およびこれを含むプラスミドならびにこのプラスミドを用いる蛋白質の菌体外分泌法

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20110418