CZ283234B6 - Enymatický způsob konverse preproinsulinů na insuliny - Google Patents
Enymatický způsob konverse preproinsulinů na insuliny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ283234B6 CZ283234B6 CS912711A CS271191A CZ283234B6 CZ 283234 B6 CZ283234 B6 CZ 283234B6 CS 912711 A CS912711 A CS 912711A CS 271191 A CS271191 A CS 271191A CZ 283234 B6 CZ283234 B6 CZ 283234B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- amino acid
- residue
- clostripain
- preproinsulin
- cys
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 title claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 title claims description 17
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 title abstract description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title abstract description 4
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 claims abstract description 37
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 24
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 claims abstract description 13
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims abstract description 6
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 12
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 6
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 claims description 5
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 2
- OJASMMNWWIJWFK-KUSCCAPHSA-N (3r)-1-[[4-[[(3r)-3-(diethylcarbamoyl)piperidin-1-yl]methyl]phenyl]methyl]-n,n-diethylpiperidine-3-carboxamide;dihydrobromide Chemical compound Br.Br.C1[C@H](C(=O)N(CC)CC)CCCN1CC(C=C1)=CC=C1CN1C[C@H](C(=O)N(CC)CC)CCC1 OJASMMNWWIJWFK-KUSCCAPHSA-N 0.000 claims 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 claims 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RDFCSSHDJSZMTQ-ZDUSSCGKSA-N Tos-Lys-CH2Cl Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)CCl)C=C1 RDFCSSHDJSZMTQ-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 3
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PBSQFBAJKPLRJY-BYULHYEWSA-N Asn-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PBSQFBAJKPLRJY-BYULHYEWSA-N 0.000 description 2
- KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N Cys-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 2
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N His-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- IWTBYNQNAPECCS-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IWTBYNQNAPECCS-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- WPTDJKDGICUFCP-XUXIUFHCSA-N Met-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WPTDJKDGICUFCP-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 2
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 2
- WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002897 organic nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KTDXIOQSLSGDPM-QHJSVBGUSA-N (2s,3r)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=C(O)C=C1 KTDXIOQSLSGDPM-QHJSVBGUSA-N 0.000 description 1
- BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N (4R)-2-oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CSC(=O)N1 BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RGQCNKIDEQJEBT-CQDKDKBSSA-N Ala-Leu-Tyr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RGQCNKIDEQJEBT-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N Arg-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- JBIRFLWXWDSDTR-CYDGBPFRSA-N Arg-Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N JBIRFLWXWDSDTR-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- SLQQPJBDBVPVQV-JYJNAYRXSA-N Arg-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SLQQPJBDBVPVQV-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Natural products OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YNQMEIJEWSHOEO-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O YNQMEIJEWSHOEO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BWJZSLQJNBSUPM-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BWJZSLQJNBSUPM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical class S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LTUVYLVIZHJCOQ-KKUMJFAQSA-N Glu-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LTUVYLVIZHJCOQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 1
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 1
- AIPUZFXMXAHZKY-QWRGUYRKSA-N His-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AIPUZFXMXAHZKY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- JDAWAWXGAUZPNJ-ZPFDUUQYSA-N Ile-Glu-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N JDAWAWXGAUZPNJ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N Ile-Val-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N Leu-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N Lys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- NCTDKZKNBDZDOL-GARJFASQSA-N Lys-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O NCTDKZKNBDZDOL-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N Lys-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N Phe-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 1
- GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N Pro-Lys-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WFIVLLFYUZZWOD-RHYQMDGZSA-N Pro-Lys-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WFIVLLFYUZZWOD-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N Ser-Asn-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XVNZSJIKGJLQLH-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N)O XVNZSJIKGJLQLH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- GITNQBVCEQBDQC-KKUMJFAQSA-N Tyr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GITNQBVCEQBDQC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 1
- FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N Val-Cys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- WDIGUPHXPBMODF-UMNHJUIQSA-N Val-Glu-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N WDIGUPHXPBMODF-UMNHJUIQSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002309 gasification Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- TYQCGQRIZGCHNB-JLAZNSOCSA-N l-ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(O)=C(O)C1=O TYQCGQRIZGCHNB-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052756 noble gas Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002835 noble gases Chemical class 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Popisuje se způsob specifické hydrolýzy řetězce aminokyseliny preproinsulinů obecného vzorce I, ve kterém R.sup.1 .n.znamená n aminokyselin, přičemž n je celé číslo 0 nebo 1, R.sup.2 .n.je vodík nebo chemicky nebo enzymaticky odštěpitelná nebo peptid se 2 až 30 zbytky aminokyselin, R.sup.3 .n.je hydroxyskupina, aminokyselina nebo peptid se 2 až 10 aminokyselinami, X je L-arginin nebo peptid se 2 až 45 aminokyselinami, na jehož terminálním C a N je zbytek L-argininu, Y je geneticky kodovatelná aminokyselina, Z je geneticky kodovatelná aminokyselina, A1 až A20 nebo B2 až B29 je přirozená nebo výměnou jednoho nebo více zbytků aminokyselin změněná sekvence aminokyseliny lidských nebo zvířecích insulinů, na odpovídající intermediáty za pomoci clostripainu a tyto intermediáty se mohou popřípadě převést karboxypeptidázou B v odpovídající insuliny.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu konverze preproinzulinů na inzulíny.
Dosavadní stav techniky
Inzulíny sestávají ze dvou polypeptidových řetězců, řetězce A, který obsahuje 21 zbytků aminokyselin, a řetězce B se 30 zbytky aminokyselin. A aB řetězce jsou spolu spojeny disulfidovými můstky, přičemž zbytky cysteinu jsou spolu spojeny v poloze A7 a B7, jakož i A20 aB19. Třetí disulfidový můstek je mezi A6 aAll. Zvířecí a lidské inzulíny se tvoří ve slinivce břišní ve formě preproinzulinů. Lidský preproinzulin sestává například z prepeptidu se 24 zbytky aminokyselin, na ně se připojuje proinzulin s 86 zbytky aminokyselin s následující konfigurací: prepeptid-B-arg-arg-C-lys-arg-A, přičemž C je řetězec aminokyselin s 31 zbytky. Během exkrece z Langerhansových ostrůvků se odštěpí prepeptid a vznikne proinzulin. Konečně se C-řetězec štěpí proteolyticky a vznikne účinný lidský inzulín.
Genově technické metody dovolí ve zvyšující se míře exprimovat preproinzuliny v mikroorganismech /EP-A-347 781, EP-A-367 163/. Odštěpení preprosekvencí se provádí zpravidla chemicky a/nebo enzymaticky /DE-P- 3 440 988, EP-A- 0264250/. Známé enzymatické metody konverze spočívají na štěpení trypsinem a karboxypeptidázou B /Kemmler W. et al. J. Biol. Chem., 246 /1971 / 6786-6791; EP-A-195 691; EP-B-89007/. Nedostatkem těchto metod je vznik velkých množství vedlejších produktů, které se dají jen obtížně oddělit zreakčního roztoku. Zejména při konverzi lidského preproinzulinu na lidský inzulín /humánní inzulín, HI/ vznikají větší množství des-thr/B30/-humánního inzulínu /des-thr/B30/-HI/. Tento vedlejší produkt se liší od HI jen tím, že chybí koncová aminokyselina a dá se velmi těžko oddělit z reakčního roztoku.
Pro snížení tvorby tohoto vedlejšího produktu se mohou ke štěpené várce přidávat určité těžké kovy, především nikl /EP-A-0264 250/. Takovéto vedení reakce není z hlediska velkovýroby na základě velkého zatížení odpadními vodami žádoucí. Je tedy zapotřebí najít co nej specifičtější a pro životní prostředí snesitelnou konverzi preproinzulinů.
Clostripain /clostriopeptidáza B; EC 3.4.22.8/ je enzym z filtrátu kultury Clostridium histolyticum s molekulovou hmotností asi 30 000 až 80 000, který vykazuje jak proteolytickou aktivitu, tak i aktivitu amidázy esterázy /Mitchell, W. M., Harington, W. F. J. of Biol. Chem., 243 /18/, 4683-4692, 1988/. Vyznačuje se velkou specifičností vůči vazbám arg-C. Tak se v izolovaném řetězci B inzulínu arg-gly vazba clostripainem 500krát rychleji odštěpí než vazba lys-ala avglukagonu se odštěpí jen arg-arg, arg-ala alys-tyr. Rychlost hydrolýzy pro tyto vazby je ve vzájemném poměru 1,1/7 a 1/300 /Labouesse, B. Bull. Soc. Chim. Biol., 42, 1293, 1960/. S překvapením bylo nyní nalezeno, že clostripain štěpí preproinzulin specificky na terminálním C za argininem, aniž by u argininu /B22/, přítomného za ním v řetězci B, došlo k štěpení řetězce aminokyselin, které by stálo za zmínku.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je způsob hydrolýzy řetězce aminokyselin preproinzulinu obecného vzorce I
| (A-l) | Gly NH I | ------------------X |
| (A-6) | 1 Cys - S - S | |
| (A-20) (A-21) | ||
| (A-7) | Cys----Cys------ | -----Cys - Z - R3 |
| (A-ll) | ||
| S | S | |
| s | S | |
| (B-2) | ||
| R’-HN-Val- | - Cys--------------- | -----Cys------------Y |
| (B-7) | (B-19) (B-30) |
ve kterém
R1 značí fenylalaninový zbytek,
R2 značí vodíkový atom, chemicky nebo enzymaticky odštěpitelný aminokyselinový zbytek nebo peptidový zbytek se 2 až 30 aminokyselinami,
R3 značí hydroxyskupinu,
X značí L-argininový zbytek nebo peptidový zbytek se 2 až 45 aminokyselinami, na jehož C-terminálním konci a N-terminálním konci je L-argininový zbytek,
Y značí threoninový zbytek,
Z značí geneticky kódovatelnou aminokyselinu a
A-l až A-20 a B-2 až B-29 značí aminokyselinovou sekvenci lidského inzulínu, jehož podstata spočívá v tom, že se preproinzulin hydrolyzuje za působení clostripainu a popřípadě se pomocí karboxypeptidázy B převede na odpovídající inzulín.
Sekvence aminokyselin peptidů a proteinů se na N-terminálním konci aminokyselinového řetězce označí. Proteázy hydrolyzují peptidovou vazbu mezi aminokyselinami peptidů a proteinů. Clostripain hydrolyzuje arginin, obsahující peptidy nebo proteiny, specificky za argininem. Jako reakční produkty hydrolýzy preproinzulinu vznikají deriváty inzulínu nebo polypeptidy, které mají na C-terminálním konci argininový zbytek, nebo aminokyseliny.
Pod pojmem přirozené aminokyseliny se rozumí například Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Trp, Arg, Lys, Hyl, Om, Cit nebo His.
Pod pojmem geneticky kódovatelné aminokyseliny se rozumí například Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro nebo selenocystein.
Výhodné jsou preproinzuliny obecného vzorce I, ve kterém
R1 značí fenylalaninový zbytek,
R2 značí vodíkový atom, přírodní aminokyselinový zbytek nebo peptidový zbytek se 2 až 30 přírodními aminokyselinami, který končí na C-terminálním konci L-argininem,
R3 značí hydroxyskupinu,
-2CZ 283234 B6
X značí L-argininový zbytek nebo C-řetězec lidského proinzulinu,
Y značí threoninový zbytek,
Z značí zbytek aminokyseliny arparaginu nebo glycinu, a
A-l až A-20 a B-2 až B-29 značí aminokyselinovou sekvenci lidského inzulínu.
Obzvláště výhodné jsou preproinzuliny obecného vzorce I, ve kterém
R1 značí fenylalaninový zbytek,
R2 značí vodíkový atom nebo peptidový zbytek se 2 až 24 přírodními aminokyselinami, který končí na C-terminálním konci L-argininem,
R3 značí hydroxyskupinu,
X značí L-argininový zbytek nebo C-řetězec lidského proinzulinu,
Y značí threoninový zbytek,
Z značí asparaginový zbytek, a
A-l až A-20 a B-2 až B-29 značí aminokyselinovou sekvenci lidského inzulínu.
Zcela obzvláště výhodné jsou například inzulíny s následující sekvencí aminokyselin:
NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gin
His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly
Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH.
Clostripain /EC 3.4.22.8/ je extracelulámí thiolproteáza z clostridienu. Enzym je heterodimér a není homologický s jinými známými thiolproteázami. Enzym má mimořádně vysokou specifitu vůči vazbám Arg-XXX, zejména Arg-Pro. Tato se dá charakterizovat molekulovou hmotností, pohybující se mezi 30 000 až 80 000 a izoelektrickým bodem, pH 4,8 až 4,9. Jako aktivátory působí například cystein, merkaptoethanol, dithiothreitol nebo ionty kalcia.
Y přítomnosti například tosyl-lysin-chlormethylketonu, peroxidu vodíku, EDTA, Co2+-, Cu2+Cd2+- iontů nebo citrátu dochází k inhibici clostripainu.
Clostripain se vyrábí fermentací za pomoci mikroorganismů. Při tomto způsobu se clostridien kultivuje až do pomnožení clostripainu v živném prostředí. Vhodné je například Clostridium hystolyticum, zejména Clostridium histolyticum DSM 627. Vhodní jsou ale i mutanti a varianty uvedených mikroorganismů, pokud syntetizují clostripain.
Kultivace se provádí anaerobně, buď samostatně, nebo ve směsné kultuře, například submerzně ve stojící kultuře v nepřítomnosti kyslíku, nebo ve fermentátorech, popřípadě za zavádění dusíku, vzácných plynů nebo jiných plynů, vyjma kyslíku. Fermentace se provádí v rozmezí teplot asi 10 až 45 °C, s výhodou asi 25 až 40 °C, zejména pak při 30 až 38 °C. Fermentace se provádí v oblasti hodnot pH mezi 5 až 8,5, s výhodou mezi 5,5 až 8. Za těchto podmínek vykazuje kultivační břečka obecně po 1 až 3 dnech akumulaci enzymu, která je hodná zmínky. Syntéza clostripainu spočívá v pozdní log-fázi a dosahuje svého maxima ve stacionární fázi růstu. Produkce enzymu se může sledovat pomocí testu aktivity /Mitchell W., Meth. of Enzym., sv. 47 /1977/strany 165-170/.
Živný roztok, použitý pro výrobu clostripainu, obsahuje 0,2 až 6 %, s výhodou 0,5 až 3 %, organických dusíkatých sloučenin, jakož i anorganických solí. Jako organické dusíkaté sloučeniny přichází v úvahu: aminokyseliny, peptony, dále masové extrakty, mletá semena, například kukuřice, pšenice, bobů, sóji nebo bavlníkových rostlin, destilační zbytky z výroby alkoholů, masové moučky nebo kvasnicové extrakty. Z anorganických solí může živný roztok obsahovat například chloridy, uhličitany, sírany nebo fosforečnany, nebo alkalické kovy nebo kovy alkalických zemin, železo, zinek, a mangan, ale i amonné soli a dusičnany.
-3 CZ 283234 B6
Optimální podmínky fermentace jsou sice pro každý mikroorganismus rozdílné, ale buď jsou již odborníkovi známé, nebo se dají zjistit pomocí snadných předběžných pokusů. Čištění clostripainu se může provádět klasickými způsoby, například srážením přes aluminiumsulfát, pomocí iontoměničů nebo pomocí gelové permeační chromatografie. Agregace enzymu je možná běžnými metodami /Colowick a Kaplan, Meth. Enzymol., Vol. XLIV/.
Pro enzymatickou konverzi se mohou používat jak celé buňky ve volné nebo imobilizované formě, tak i izolovaný enzymatický produkt, kteiý může být rovněž vázán na nosič.
Štěpení preproinzulinů obecného vzorce I clostripainem se provádí ve vodném prostředí, ke kterému se mohou přidávat rovněž s vodou mísitelné organické složky, jako například alkoholy, ketony, močovina, Ν,Ν-dimethylformamid. K reakční várce se mohou především pro snazší kontrolu hodnoty pH reakce přidávat odpovídající anorganické nebo organické pufry jako fosfát, Tris, Glycin, HEPES a j. Koncentrace preproinzulinu se během štěpení pohybuje například mezi 0,01 mg/ml až 100 mg/ml, s výhodou mezi 0,1 mg/ml až 10 mg/ml. Poměr preproinzulinu ke clostripainu činí /mg k unit/U// 1:0,01 až 1:1000, s výhodou 1:0,1 až 1:50.
Teplota při reakci se může rovněž měnit v širokém rozmezí. S výhodou jde o teplotní rozsah mezi 0 °C až +80 °C, zejména pak teplota, pohybující se mezi +20 °C až +40 °C.
Hodnota pH variace se může měnit mezi pH 4 až pH 12, zejména výhodná je oblast mezi pH 6 až pH9.
Doba, která je pro konverzi preproinzulinů na odpovídající intermediáty nezbytná, se může měnit podle reakčních podmínek v širokém rozmezí, například se může pohybovat mezi 15 minutami až 48 h, s výhodou se doba reakce pohybuje mezi 1 h až 6 h.
Enzym se před použitím aktivuje vhodným způsobem v přítomnosti merkaptanu. Jako merkaptany přichází přitom v zásadě v úvahu všechny sloučeniny, které obsahují SH-skupiny, s výhodou se používá DTT, DTE, merkaptoethanol, thioglykolová kyselina nebo cystein. Koncentrace merkaptanu se může měnit v širokém rozmezí, výhodné jsou koncentrace mezi 0,1 mM až 100 mM. Aktivační pufr obsahuje dále ionty Ca2+, s výhodou CaCb. Aktivace se provádí mezi pH 4 až pH 12, s výhodou při hodnotě pH 6 až pH 8, nejvýhodnější je oblast pH 7 až pH 8. Pro udržení hodnoty pH se může přidat vhodná pufrační látka, například Tris, HEPES, glycin aj. Teplota aktivace se může pohybovat mezi 0 °C až 60 °C, výhodná je oblast 0 °C až 10 °C, nejvýhodnější 0 °C až 5 °C. Takto aktivovaný enzym se může používat buď přímo, nebo se popřípadě může pomocí chromatografie přes RUltrogel AcA 202 zbavit aktivačního pufru.
Štěpení preproinzulinu obecného vzorce I podle vynálezu vede k derivátům inzulínu se zbytky argininu na C-terminálním konci inzulínu a k odpovídajícím odštěpeným aminokyselinám nebo peptidům. Deriváty inzulínu se mohou popřípadě převést pomocí karboxypeptidázy B na odpovídající inzulíny. To se může stát současně s clostripainem ve stejné reakční várce, ale i za reakčních podmínek, uvedených výše, po sobě, přičemž se derivát inzulínu může popřípadě před zpracováním s karboxypeptidázou B izolovat o sobě známým metodami, například chromatografícky nebo krystalizaci. Karboxypeptidáza B se může používat v rozpuštěné nebo imobilizované formě. Poměr karboxypeptidázy B k derivátu inzulínu činí /hmotnost ku hmotnosti/ asi 1:10 až 1:5000, s výhodou asi 1:500 až 1:5000 a nejvýhodněji asi 1:1000 až 1:3000.
Poměr karboxypeptidázy B ke clostripainu činí /hmotnost ku hmotnosti/ asi 1:1 až 10:1 as výhodou 2:1 až 5:1.
Reakční produkty štěpení clostripainu a/nebo karboxypeptidázy B se mohou například vysrážet snížením hodnoty pH a/nebo se mohou čistit pomocí známých metod sloupcové chromatografie. Získaný inzulín se může připravit v obvyklých formách pro podávání a jako léčivo pro léčení diabetů mellitus /úplavice cukrové/.
-4CZ 283234 B6
Příklady provedení vynálezu
V následujících příkladech je způsob podle vynálezu podrobně popsán. Údaje o procentech se týkají hmotnostních procent, jestliže to není uvedeno jinak.
Příklad 1
Kultivace Clostridium histolyticum DSM 627 se provádí v živném roztoku následujícího složení:
Kaseinpepton 3 % masový extrakt 3 % kvasnicový extrakt 0,5 % cystein 0,05 %
KH2PO4 0,15 % pH 7,2.
Naočkuje se 1 % předkultury. Kultivace se provádí v uzavřených lahvích za anaerobních podmínek při 37 °C asi 2 dny. Kmen mikroorganismů se uchovává ve výše uvedeném živném roztoku s 50 % glycerinu při -20 °C. Fermentor se naočkuje 1 % předkultury. Očkuje se fermentor s obsahem 10 1 a 8 1 živného roztoku. Kultivace se provádí při zaplynování dusíkem, při 33 °C, 24 h, a konstantním pH 7,0. Ve filtrátu kultury byla naměřena aktivita enzymu 20 000 U/l /Mitchell W., Meth. of Enzym., sv. 47, str. 165 - 170, 1977/.
Zpracování se provádělo odstředěním buněk asi při 6000 g, sterilní filtrací přes filtr s velikostí pórů 0,22 pm přídavkem 60 % ledově studeného /-20 °C/ methanolu k filtrátu. Potom byl roztok udržován 24 h při -20 °C a potom odstředěn /8000 g/. Peleta byla rozpuštěna ve sterilní bidestilované vodě a odstředěn vzniklý roztok /12 000 g/. V peletě byla naměřena aktivita enzymu 300 U/ml, 200 U/mg proteinu. Výtěžek činil 75 % naměřené aktivity ve fermentoru.
Příklad 2
Kultivace buněk se prováděla stejně jako v příkladu 1. Produkční médium ve fermentoru sestávalo z:
protease pepton /Difco/ 5 % cystein 0,05 %
KH2PO4 0,15% pH 7,2 a byla naočkována 2 % předkultury.
Aktivita clostripainu byla ve filtrátu kultury 45 000 U/ml.
Zpracování se provádělo tangenciální-flow-filtrací na 0,3' pm membránách /Filtron, Omega Membrán/ pro oddělení buněk a tangenciální-flow-filtrací na 10 KD membránách /Filtron, Omega Membrán/ pro nakoncentrování rozpuštěného clostripainu. Činitel nakoncentrování činí 20. Potom byl koncentrát deionizován a chromatografován přes DEAE-celulózy. Aktivita clostripainu 1000 U/ml; výtěžek 85 %. Uskladnění až do použití enzymatického preparátu se provádí při -20 °C.
Příklad 3
A. Aktivace clostripainu pl enzymatického preparátu /200 U/ml, 286 U/mg z příkladu 1/ pl aktivačního pufru /250 mM DTT, 125 mM CaCl2/
- obsah ve várce:
-5CZ 283234 B6
DTT 5 mM
CaCl2 2,5 mM
- inkubace 2 h na ledě pro štěpnou reakci se enzym zředí v poměru 1:40 25 mM Tris/HCl pufru, pH 7,8.
B. Štěpná várka clostripainu pro uvolnění /B31/Arg-inzulinu
100 μΐ Insu-Arg /1 mg/ml/ μΐ KC1 /1 M/ μΐ Tris/HCl/ΙΜ,ρΗ 7,8/ μΐ H2O μΐ clostripainu /zředění 1/40/
- obsah ve várce:
0,5 mg/ml
2.5 U/ml
12.5 μΜ mM
100 mM μΜ až 2 h při 28 °C, reakce se může snadno kontrolovat pomocí HPLC, potom
Insu-Arg clostripain DTT Tris/HCl KC1
CaCl2
- inkubace zastavení reakce s tosyl-L-lysinchlormethylketonem /TLCK/,
- zastavení reakce přídavkem 1 μΐ TLCK /15 mM/,
- skladování při 4 °C,
- výsledek: humánní inzulin-Arg. Pomocí HPLC není naměřitelný žádný humánní inzulin- /DesB30/.
C. Štěpná várka karboxypeptidázy B pro uvolnění lidského inzulínu
200 μΙ štěpné várky clostripainu μΐ karboxypeptidázy B /zředění 1:100/
- obsah karboxypeptidázy ve várce: 2,5 pg/ml
- inkubace 2 až 4 h při 28 °C, reakce se dá snadno přezkoušet pomocí HPLC
- pro reakci se karboxypeptidáza B /750 U/ml, 150 U/mg, z pankreatu prasat/ zředí v poměru 1:1000 25 mM Tris/HCl pufru, pH 7,8
- výsledek: lidský inzulín, žádná tvorba inzulinu/DesB30/, který je měřitelný pomocí HPLC.
D. Analytika HPLC
Štěpení byla kontrolována za použití RP 18 sloupce /0,125 M NHj/SO^, s H2SO4 nastaveno na hodnotu pH 4, 25 - 50 % gradient acetonitrilu/, popřípadě C 8 sloupce /0,1 % TFA, 20 % - 50 % gradient acetonitrilu/.
Příklad 4
Clostripain: 200 U/ml /z příkladu 1/ aktivační pufr: 500 mM Tris/HCl, pH 7,8 100 mM DTT mM CaCl2
Aktivace: 100 μΐ roztoku clostripainu
-6CZ 283234 B6 μΐ aktivačního pufru
Skládací várka: 35,7 mg lidského pre-B-řetězec-A-řetězec inzulinu-S-sulfonátu
315 μΐ 1 M merkaptoethanolu
105 μΐ 1 M kyseliny askorbové
100 ml 20 mM glycinového pufru, pH 10,7.
Skládání se provádělo přes noc v chladničce při 4°C, výtěžek skládání činil 0,152 mg/ml. Po oddělení nečistot snížením pH při pH 5,0 se přidá Tris v konečné koncentraci 50 mM a hodnota pH se nastaví pomocí HC1 na 7,8. Přidalo se 30 μΐ roztoku enzymu. Štěpení se provádělo při 30 °C a sledovalo se pomocí HPLC.
Výsledek: Výše uvedený preproinzulin se dá štěpit na lidský inzulin-Arg. Tvorba inzulin/DesB30/ je minimální.
Sekvence aminokyselin lidského pre-B-řetězec-A-řetězcového inzulínu:
NH2-Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys AsnCOOH
Příklad 5 mg lidského preproinzulinu se zpracuje clostripainem stejně, jako je popsáno v příkladě 4. Preproinzulin se dá štěpit na inzulín diArg. Tvorba inzulinu(Des-B30) je minimální.
Sekvence aminokyselin lidského preproinzulinu:
NHr-Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu
Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly
Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob hydrolýzy řetězce aminokyselin preproinzulinu obecného vzorce I
(A-l) Gly- NH 1 < (A-6) Cys- S- S (A-20) (A-21) (A-7) Cys- ---Cys------ Cys - Z - R3 (A-ll) S 1 S 1 (B-2) Rl-HN-Val — -Cys- Cys----------- Y (B-7) (B-19) (B-30) ve kterémR1 značí fenylalaninový zbytek,R2 značí vodíkový atom, chemicky nebo enzymaticky odštěpitelný aminokyselinový zbytek nebo peptidový zbytek se 2 až 30 aminokyselinami,R3 značí hydroxyskupinu,X značí L-argininový zbytek nebo peptidový zbytek se 2 až 45 aminokyselinami, na jehož C-terminálním konci a N-terminálním konci je L-argininový zbytek,Y značí threoninový zbytek,Z značí geneticky kódovatelnou aminokyselinu, aA-l až A-20 a B-2 až B-29 značí aminokyselinovou sekvenci lidského inzulínu, vyznačující se tím, že se preproinzulin hydrolyzuje za působení clostripainu a popřípadě se pomocí karboxypeptidázy B převede na odpovídající inzulín. - 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se hydrolyzuje preproinzulin obecného vzorce I, ve kterémR1 značí fenylalaninový zbytek,R2 značí vodíkový atom, zbytek přírodní aminokyseliny nebo peptidový zbytek se 2 až 24 přírodními aminokyselinami, který končí na C-terminálním konci L-argininem,R3 značí hydroxyskupinu,X značí L-argininový zbytek nebo C-řetězec lidského proinzulinu,-8CZ 283234 B6Y značí threoninový zbytek,Z značí zbytek aminokyseliny asparaginu nebo glycinu aA-l až A-20 a B-2 až B-29 značí aminokyselinovou sekvenci lidského inzulinu.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se hydrolyzuje preproinzulin obecného vzorce I, ve kterémR1 značí fenylalaninový zbytek,R2 značí vodíkový atom nebo peptidový zbytek se 2 až 24 přírodními aminokyselinami, který končí na C-terminálním konci L-argininem,R3 značí hydroxyskupinu,X značí L-argininový zbytek nebo C-řetězec lidského proinzulinu,Y značí threoninový zbytek,Z značí asparaginový zbytek, aA-l až A-20 a B-2 až B-29 značí aminokyselinovou sekvenci lidského inzulinu.
- 4. Způsob podle jednoho nebo několika nároků laž3, vyznačující se tím, že se pracuje při hodnotě pH v rozmezí 4 až 12, výhodně 6 až 9.
- 5. Způsob podle jednoho nebo několika nároků laž4, vyznačující se tím, že se koncentrace preproinzulinu obecného vzorce I pohybuje v rozmezí 0,01 až 100 mg/ml, výhodně 0,1 až 10 mg/ml.
- 6. Způsob podle jednoho nebo několika nároků laž5, vyznačující se tím, že poměr preproinzulinu ke clostripainu činí 1:0,01 až 1:1000, výhodně 1:0,1 až 1:50, vyjádřeno v mg preproinzulinu k jednotce U clostripainu, kde U je stanovena testem podle W. Mitchella.
- 7. Způsob podle jednoho nebo několika nároků laž6, vyznačující se tím, že reakční teplota je v rozmezí 0 až 80 °C, výhodně 20 až 40 °C.
- 8. Způsob podle jednoho nebo několika nároků laž7, vyznačující se tím, že současně je přítomná karboxypeptidáza B, nebo se použije po štěpení clostripainem.
- 9. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se clostripain a/nebo karboxypeptidáza B vyskytuje v imobilizované formě.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4028118 | 1990-09-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS271191A3 CS271191A3 (en) | 1992-03-18 |
| CZ283234B6 true CZ283234B6 (cs) | 1998-02-18 |
Family
ID=6413629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS912711A CZ283234B6 (cs) | 1990-09-05 | 1991-09-03 | Enymatický způsob konverse preproinsulinů na insuliny |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5728543A (cs) |
| EP (1) | EP0474212B1 (cs) |
| JP (1) | JP3005335B2 (cs) |
| KR (1) | KR100188800B1 (cs) |
| AT (1) | ATE145922T1 (cs) |
| AU (1) | AU637254B2 (cs) |
| CA (1) | CA2050606C (cs) |
| CZ (1) | CZ283234B6 (cs) |
| DE (1) | DE59108392D1 (cs) |
| DK (1) | DK0474212T3 (cs) |
| ES (1) | ES2095891T3 (cs) |
| FI (1) | FI103805B1 (cs) |
| GR (1) | GR3021909T3 (cs) |
| HR (1) | HRP940766A2 (cs) |
| HU (1) | HU214676B (cs) |
| IE (1) | IE75723B1 (cs) |
| IL (1) | IL99383A (cs) |
| LT (1) | LT3328B (cs) |
| LV (1) | LV10508B (cs) |
| NO (1) | NO300980B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ239652A (cs) |
| PL (1) | PL167810B1 (cs) |
| RU (1) | RU2062301C1 (cs) |
| SK (1) | SK279686B6 (cs) |
| YU (1) | YU147491A (cs) |
| ZA (1) | ZA917008B (cs) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2122549C1 (ru) * | 1997-12-29 | 1998-11-27 | Закрытое акционерное общество "Фосфосорб" | Способ хроматографического выделения и очистки белков, пептидов и их комплексов |
| RU2238951C2 (ru) * | 1998-03-31 | 2004-10-27 | Тонгхуа Гэнтеч Биотекнолоджи Лтд. | Химерный белок, обеспечивающий образование биоактивной конформации, способ получения белка с инсулиновой активностью, способ идентификации пептидильного фрагмента |
| US6461834B1 (en) * | 1998-11-06 | 2002-10-08 | Bionebraska, Inc. | Clostripain catalyzed amidation of peptides |
| DE19915938A1 (de) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Aventis Pharma Gmbh | Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung |
| EP1513945A4 (en) * | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Restoragen Inc | PROCESS FOR UNIVERSAL ENZYMATIC PRODUCTION OF BIOACTIVE PEPTIDES |
| EP1572720A4 (en) * | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Nps Allelix Corp | PROCESS FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF GLP-2 (1-34) AND GLP-2 (1-33) PEPTIDES |
| WO2003099847A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Restoragen, Inc. | Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides |
| HRP20120315T1 (hr) * | 2003-11-21 | 2012-05-31 | Nps Pharmaceuticals | Proizvodnja peptida 2 nalik glukagonu i analoga |
| WO2013015697A1 (en) * | 2011-07-28 | 2013-01-31 | Mabion S.A. | A recombinant protein, a polynucleotide encoding it as well as a method of obtaining insulin or its an analogue |
| KR102646845B1 (ko) * | 2018-08-08 | 2024-03-14 | 주식회사 대웅제약 | 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LU81606A1 (de) | 1979-08-14 | 1981-03-24 | Arbed | Verfahren und einrichtung zur wiederverwertung von kohlenstoffreichen abfallprodukten |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| US4581909A (en) | 1982-05-27 | 1986-04-15 | Neiman S.A. | Cylinder lock, particularly a steering-wheel lock for a motor vehicle |
| JPS60217894A (ja) * | 1984-04-14 | 1985-10-31 | Suntory Ltd | 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 |
| DE3440988A1 (de) * | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| ZA877505B (en) | 1986-10-14 | 1989-05-30 | Lilly Co Eli | Process for transforming a human insulin precursor to human insulin |
| DE4012818A1 (de) * | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| DE3919852A1 (de) * | 1988-06-23 | 1989-12-28 | Hoechst Ag | Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung |
| DE58906966D1 (de) | 1988-06-23 | 1994-03-24 | Hoechst Ag | Mini-Proinsulin, seine Herstellung und Verwendung. |
| ATE132531T1 (de) | 1988-11-03 | 1996-01-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung eines insulin- vorprodukts in streptomyceten |
| US5617606A (en) | 1996-02-29 | 1997-04-08 | Baracuda International Corp. | Fluted swimming pool cleaner discs |
-
1991
- 1991-09-03 CZ CS912711A patent/CZ283234B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 FI FI914151A patent/FI103805B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 KR KR1019910015314A patent/KR100188800B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-03 SK SK2711-91A patent/SK279686B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 IL IL9938391A patent/IL99383A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 NZ NZ239652A patent/NZ239652A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 JP JP3223243A patent/JP3005335B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 ZA ZA917008A patent/ZA917008B/xx unknown
- 1991-09-04 DE DE59108392T patent/DE59108392D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 YU YU147491A patent/YU147491A/sh unknown
- 1991-09-04 CA CA002050606A patent/CA2050606C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 AT AT91114934T patent/ATE145922T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 DK DK91114934.2T patent/DK0474212T3/da active
- 1991-09-04 IE IE311791A patent/IE75723B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 EP EP91114934A patent/EP0474212B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 RU SU915001486A patent/RU2062301C1/ru active
- 1991-09-04 AU AU83567/91A patent/AU637254B2/en not_active Expired
- 1991-09-04 ES ES91114934T patent/ES2095891T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 NO NO913474A patent/NO300980B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 PL PL91291617A patent/PL167810B1/pl unknown
- 1991-09-05 HU HU912875A patent/HU214676B/hu unknown
-
1993
- 1993-05-05 LV LVP-93-288A patent/LV10508B/xx unknown
- 1993-06-25 LT LTIP712A patent/LT3328B/lt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-08 US US08/291,060 patent/US5728543A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 HR HRP-1474/91A patent/HRP940766A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-12-05 GR GR960403067T patent/GR3021909T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5512459A (en) | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides | |
| EP0020290B1 (de) | Verfahren zur spezifischen Abspaltung von Proteinsequenzen aus Proteinen | |
| JP4291900B2 (ja) | 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法 | |
| RU2458989C1 (ru) | Способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты) | |
| NO180379B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et vesentlig renset insulinderivat | |
| NO318424B1 (no) | Fremgangsmate for isolering av insulin med korrekt koblede cysteinbroer | |
| HK143096A (en) | Method of removing n-terminal amino acid residues from eucaryotic polypetide analogs and polypeptides produced thereby | |
| US5763215A (en) | Method of removing N-terminal amino acid residues from eucaryotic polypeptide analogs and polypeptides produced thereby | |
| KITAGAWA et al. | Amino Acid Sequence of Copper, Zinc-Superoxide Dimutase from Spinach Leaves | |
| CZ283234B6 (cs) | Enymatický způsob konverse preproinsulinů na insuliny | |
| EP0017938A1 (en) | Process for preparing a B30-threonine insulin | |
| NZ248810A (en) | A dipeptidylaminopeptidase from a slime-mold | |
| CN103981242A (zh) | 胰岛素的制备方法 | |
| KR20010099668A (ko) | 펩타이드의 효소적 아미드화 | |
| EP3221448B1 (en) | Process for producing recombinant trypsin | |
| IE883462L (en) | A method for the selective cleavage of fusion proteins | |
| PT98859B (pt) | Processo enzimatico para a transformacao de preproinsulinas em insulinas | |
| NO326247B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av modent insulin eller et modent insulin derivat. | |
| KR19990016368A (ko) | 융합단백질을 이용한 인성장호르몬의 제조방법 | |
| EP2867250A2 (en) | Proinsulin with enhanced helper sequence | |
| JP2003319785A (ja) | アワビのアルギン酸リアーゼの遺伝子 | |
| MXPA01009979A (en) | Production of pancreatic procarboxy-peptidase b, isoforms and muteins thereof, and their use | |
| NO163531B (no) | Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. | |
| HK1187058B (en) | Improved process for production of recombinant human growth hormone |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20110903 |