CN103981242A

CN103981242A - 胰岛素的制备方法

Info

Publication number: CN103981242A
Application number: CN201310049452.4A
Authority: CN
Inventors: 雅各布·哈特曼; 塔玛·里希特; 什穆埃尔·赫斯; 江立新
Original assignee: Hua Ling Science And Technology Ltd
Current assignee: Hua Ling Science And Technology Ltd
Priority date: 2013-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2014-08-13
Also published as: HK1200874A1

Abstract

本发明提供胰岛素的制备方法。本发明涉及一种将胰岛素前体转化为活性胰岛素化合物、优选长效胰岛素的改进的方法。具体地讲，本发明提供一种方法，其中可逆地封闭Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，从而使胰蛋白酶能够切割经可逆封闭的Arg-Arg前体胰岛素。

Description

胰岛素的制备方法

技术领域

本发明涉及将胰岛素前体转化为长效活性胰岛素化合物的改进的方法。

背景技术

胰岛素是参与血糖浓度调节的一种胰腺激素。例如，将人、猪和牛的胰岛素、胰岛素类似物和混合胰岛素给予胰岛素依赖型糖尿病患者，以调节他们的血糖浓度。

成熟胰岛素是一种两条链的肽激素，含有51个氨基酸。其A-链由21个氨基酸组成，B-链由30个氨基酸组成。该分子在A-链内含有2个链间二硫键和1个链内二硫键。在体内，该激素首先被合成为一条长的前体分子，即前胰岛素原(preproinsulin)，随后被加工为胰岛素原(proinsulin)和胰岛素。最初的加工步骤是在初生链穿过内质网膜转移期间经蛋白水解而除去前肽。然后，胰岛素原折叠并伴随二硫键氧化并转运至高尔基体，在此包装成为分泌液泡。在此经特异性蛋白酶进一步加工形成成熟胰岛素。通过这样的蛋白水解切割，将胰岛素原中与B链和A链连接的C-链(C肽)切去。C肽长度为35个氨基酸并在其氨基端和羧基端分别包含2对碱性氨基酸，即ArgArg和LysArg(Steiner，1984)。假定将两条胰岛素链连接在一起的C肽有助于合适的折叠和二硫键的形成。事实上，其缺失或被仅有数个氨基酸长的较短的合成肽桥取代，仍然允许自胰岛素-样前体产生合适的胰岛素。

直到20世纪80年代，才从牛和猪的胰腺制品中分离出胰岛素。早期研究已经证明，可通过将呈S-磺酸形式的A链和B链结合或通过还原型胰岛素原的自发再氧化而在体外产生胰岛素。然后再经胰蛋白酶和羧肽酶B处理而回收胰岛素。然而，这些方法对于大规模生产来说并不实用。以后，通过转肽作用(例如美国专利号4,343,898)，使用胰蛋白酶和苏氨酸，替代猪胰岛素中的B30丙氨酸(猪胰岛素和人胰岛素之间的唯一差异)，可自猪胰岛素产生半合成人胰岛素。

例如EP87,238提供了在溶剂系统中进行的转肽反应，所述溶剂系统包含介于大约75%至97%(v/v)之间的至少一种非水反应易混溶剂，其包含至少大约50%(vol/vol)丁-1,4-二醇。通过使用L-丝氨酸特异性羧肽酶而进行的转肽方法公开于美国专利号4,579,820。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：(a)可逆地封闭Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH6-11的溶液；和(b)切割所述Arg-Arg前体胰岛素，包括使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应，从而制备胰岛素。

在一个实施方案中，本发明还提供一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：将Arg-Arg前体胰岛素暴露在11.0-11.5的pH值下；(b)可逆地封闭所述Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH6-11的溶液；和(c)切割所述Arg-Arg前体胰岛素，包括使步骤(b)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应，从而制备胰岛素。

在一个实施方案中，本发明还提供一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：(a)可逆地封闭Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH9的溶液；(b)切割所述Arg-Arg前体胰岛素，包括使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应；和(c)将步骤(b)的所述胰岛素的pH调节至pH6-10(步骤(c))，从而制备胰岛素。

在一个实施方案中，本发明的方法还包括胰岛素纯化操作，例如：微滤、离子交换色谱法、反相高压液相色谱法(RP-HPLC)或其任意组合。

在一个实施方案中，本发明的方法还包括胰岛素结晶，包括在柠檬酸-乙醇(pH6.4)中使所述胰岛素接触Zn++。

附图说明

图1是描述自Arg-Arg胰岛素前体制备本发明胰岛素的方法流程。

图2是胰岛素-ArgArg生产流程。

图3是纯化胰岛素-ArgArg与市售来得时比较的RP-HPLC分析图。胰岛素-ArgArg之前的峰是防腐剂间甲酚。

图4是本发明的重组人胰岛素-类似物前体表达盒的核苷酸序列和相应氨基酸序列。B链氨基酸在方框内。A链氨基酸在方框内。在胰岛素-类似物序列和Arg Arg桥之前的最初64个氨基酸(编码Cu/Zn-超氧化物歧化酶的部分序列)用粗体表示。RBS-核糖体结合位点。

图5是显示在接受STZ的糖尿病诱导并随后经每天注射(见箭头)指定试验材料治疗的Sprague-Dawley雄性大鼠中的平均组±SD血糖值的图。上图是对媒介物对照的血糖水平归一化的表达。

图6是通过本文所述方法产生的胰岛素的氨基酸序列。

图7显示在随机交叉研究中，在给予速效胰岛素(优泌林R)、长效胰岛素(来得时)和长效胰岛素即ArgArg(胰岛素RR)之后，在患糖尿病的比格犬(beagle dog)中的血糖水平(mM)随时间(小时)变化的图。

具体实施方式

在一个实施方案中，本发明提供自胰岛素前体制备胰岛素的改进的方法。在另一个实施方案中，本发明提供自Arg-Arg胰岛素前体制备胰岛素的改进的方法。在另一个实施方案中，在本发明的改进的方法中，将Arg-Arg胰岛素前体在碱性pH中直接溶解并折叠，然后进行胰蛋白酶处理，从而以简单的改进方式产生胰岛素。在另一个实施方案中，依照本发明的方法利用Arg-Arg胰岛素前体，产生真实的人胰岛素或其长效B31Arg-B32Arg变体。在另一个实施方案中，本发明的改进的方法包括：用柠康酸酐可逆地封闭Arg-Arg胰岛素前体中的Lys残基并用胰蛋白酶处理经可逆封闭的Arg-Arg胰岛素前体，从而切除前导肽和“C-链”连接。在另一个实施方案中，本发明的改进的方法包括：用柠康酸酐可逆地封闭Arg-Arg胰岛素前体中的Lys残基并用胰蛋白酶处理经可逆封闭的Arg-Arg胰岛素前体，从而切除前导肽和“C-链”连接，尤其是优选在第二Arg残基后(参见图1)。

在另一个实施方案中，本发明的方法通过提供前体胰岛素内的有限的胰蛋白酶切割位点而克服了现有技术水平的缺陷。在另一个实施方案中，本发明的方法是基于可逆地封闭前体胰岛素内的不想要的胰蛋白酶切割位点。在另一个实施方案中，可逆地封闭前体胰岛素内的不想要的胰蛋白酶切割位点，克服了现有技术水平的缺陷。

在另一个实施方案中，通过在pH9(通过自动滴定而保持该pH值)与过量柠康酸酐反应，所述前体蛋白中的所有赖氨酸残基都被可逆地封闭。在另一个实施方案中，剩余试剂被水解为柠康酸。在另一个实施方案中，剩余试剂通过加入5mM乙醇胺而猝灭。在另一个实施方案中，所述胰岛素前体的酰基衍生物获得-7的额外负电荷，这可在尿素-PAGE上容易地分析出。

在另一个实施方案中，本发明的胰岛素(本文所述方法的产物)是pI值大约6.9的胰岛素-ArgArg。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素-ArgArg具有长的体内活性特征。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素-ArgArg具有非常长的体内活性特征。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素-ArgArg具有储库-样(depot-like)特征，因为它在皮下注射之后沉淀。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素-ArgArg缓慢溶解到循环中。

在另一个实施方案中，本发明提供自Arg-Arg胰岛素前体制备胰岛素的改进的方法，所述方法包括以下步骤：(a)可逆地封闭所述Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的溶液；和(b)切割所述Arg-Arg前体胰岛素，包括使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应。

在另一个实施方案中，自Arg-Arg胰岛素前体制备胰岛素的所述改进的方法还包括在步骤(a)之前将Arg-Arg前体胰岛素暴露在11.0-11.5的pH值下。在另一个实施方案中，在步骤(a)之前将Arg-Arg前体胰岛素暴露在11.0-11.5的pH值下，导致最佳折叠。在另一个实施方案中，在折叠步骤结束之时，用HCl将pH降低至9。

在另一个实施方案中，自Arg-Arg胰岛素前体制备胰岛素的所述改进的方法还包括步骤(c)，其中步骤(c)包括将得自步骤(b)的所述胰岛素的pH调节至pH2.8。在另一个实施方案中，自Arg-Arg胰岛素前体制备胰岛素的所述改进的方法还包括步骤(c)，其中步骤(c)包括将得自步骤(b)的所述胰岛素的pH调节至pH2.8。

在另一个实施方案中，自Arg-Arg胰岛素前体制备胰岛素的所述改进的方法还包括步骤(d)。在另一个实施方案中，步骤(d)在步骤(c)之后。在另一个实施方案中，步骤(d)包括纯化所述胰岛素。在另一个实施方案中，通过微滤进行纯化。在另一个实施方案中，通过离子交换和混合模式色谱进行纯化。在另一个实施方案中，通过反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行纯化。

在另一个实施方案中，自Arg-Arg胰岛素前体制备胰岛素的所述改进的方法还包括使来自步骤(d)的所述胰岛素接触锌盐的步骤。

在另一个实施方案中，自Arg-Arg胰岛素前体制备胰岛素的所述改进的方法还包括使所述胰岛素结晶的步骤(e)。在另一个实施方案中，步骤(e)在步骤(d)之后。在另一个实施方案中，步骤(e)在步骤(c)之后。在另一个实施方案中，步骤(e)在步骤(b)之后。在另一个实施方案中，使胰岛素结晶是使所述胰岛素接触Zn++。在另一个实施方案中，使胰岛素结晶是在柠檬酸-乙醇中使所述胰岛素接触Zn++。在另一个实施方案中，使胰岛素结晶是在柠檬酸-乙醇(pH6.4)中使所述胰岛素接触Zn++。

在另一个实施方案中，本发明的前体胰岛素分离自经破碎细菌的包涵体。在另一个实施方案中，本发明的前体胰岛素在碱性pH时容易溶解和折叠。在另一个实施方案中，通过特异性胰蛋白酶切割连接的Arg残基，同时用柠康酸酐可逆地封闭所有Lys残基，而产生胰岛素。在另一个实施方案中，该试剂在大约pH9时易于与氨基反应，但所述酰基衍生物在酸性pH时被完全水解。在另一个实施方案中，在离子交换色谱法和混合模式色谱之后，纯化的胰岛素-ArgArg变体通过RP-HPLC而进一步纯化并配制为长效胰岛素。在另一个实施方案中，最终纯化步骤通过制备型反相(RP)HPLC除去胰岛素-样分子和其它次要污染物。在另一个实施方案中，通过在柠檬酸-乙醇(pH6.4)中用Zn++结晶而回收胰岛素，并真空干燥。

Arg-Arg胰岛素前体

在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体是包含Cu/ZnSOD部分的杂合蛋白。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体的N-端序列通过Arg残基与胰岛素原样部分融合，其中ArgArg将胰岛素的B链和A链连接在一起。

在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含以下氨基酸序列：RFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG(SEQ ID NO:1)。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是5-150个氨基酸的任何长度。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQID NO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是10-120个氨基酸的任何长度。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是20-100个氨基酸的任何长度。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是10-100个氨基酸的任何长度。在另一个实施方案中，所述前导序列不限于任何特定序列。

在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少5个氨基酸。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少10个氨基酸。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少20个氨基酸。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少50个氨基酸。在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少80个氨基酸。

在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体包含以下氨基酸序列：

MATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGPRFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG(SEQ ID NO:2)。

在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体由编码本发明的Arg-Arg胰岛素前体氨基酸序列的任何DNA分子来编码。在另一个实施方案中，编码Arg-Arg胰岛素前体的DNA分子编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个实施方案中，编码Arg-Arg胰岛素前体的DNA分子编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列之前的至少额外5个氨基酸。在另一个实施方案中，编码Arg-Arg胰岛素前体的DNA分子编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列之前的至少额外10个氨基酸。在另一个实施方案中，编码Arg-Arg胰岛素前体的DNA分子编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列之前的至少额外20个氨基酸。在另一个实施方案中，编码Arg-Arg胰岛素前体的DNA分子编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列之前的至少额外30个氨基酸。在另一个实施方案中，编码Arg-Arg胰岛素前体的DNA分子编码SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列之前的至少额外50个氨基酸。在另一个实施方案中，编码Arg-Arg胰岛素前体的DNA分子编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列之前的至少额外的80个氨基酸。

在另一个实施方案中，Arg-Arg胰岛素前体有包含以下核酸序列的DNA分子来编码：ATGGCAACCAAAGCAGTTAGCGTTCTGAAAGGTGATGGTCCGGTTCAGGGCATTATTAATTTTGAACAGAAAGAAAGCAATGGTCCGGTTAAAGTTTGGGGTAGCATTAAAGGTCTGACCGAAGGTCTGCATGGTTTTCATGTTCATGAATTTGGCGATAATACCGCAGGTAGCACCAGCGCAGGCCCGCGTTTTGTTAATCAGCATCTGTGTGGTAGCCATCTGGTTGAAGCACTGTATCTGGTTTGTGGTGAACGCGGTTTTTTTTATACCCCGAAAACCCGTCGTGGTATTGTTGAACAGTGTTGTACCAGCATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTATTGCGGCTAA(SEQ ID NO:3)。

在另一个实施方案中经本发明的方法或方法产生的胰岛素包含两条链：(1)包含以下氨基酸序列的链A：GIVEQCCTSICSLYQLENYCG(SEQID NO:4)；和(2)包含以下氨基酸序列的链B：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR(SEQ ID NO:5)。

在另一个实施方案中，本发明的胰岛素是经本文所述的方法产生的胰岛素。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素是人胰岛素。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素是哺乳动物胰岛素。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素是农场动物胰岛素。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素是胰岛素类似物或胰岛素衍生物。

在另一个实施方案中，胰岛素类似物是天然发生的胰岛素的类似物，其差异在于在相应的或相同的天然发生的胰岛素上至少一个天然发生的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代和/或添加/缺失至少一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，添加的和/或取代的氨基酸残基也可以是非天然发生的那些。在另一个实施方案中，胰岛素类似物描述于EP0214826、EP0375437和EP0678522，其通过引用全部结合到本文中。

在另一个实施方案中，胰岛素衍生物是天然发生的胰岛素的衍生物或得自经化学修饰的胰岛素类似物。在另一个实施方案中，所述化学修饰包括在一个或多个氨基酸上添加一个或多个特定化学基团。

在另一个实施方案中，本发明的胰岛素是选自以下的胰岛素类似物：LysB28ProB29人胰岛素，B28Asp人胰岛素，位置B28的脯氨酸被Leu、Asp、Ala、Val或Lys取代并且位置B29的Lys被或未被Pro取代的人胰岛素；AlaB26人胰岛素；des(B28-B30)人胰岛素；des(B27)人胰岛素和des(B30)人胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素类似物是谷赖胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素类似物是甘精胰岛素。

在另一个实施方案中，使Arg-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在pH7-11。在另一个实施方案中，使Arg-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在pH8-10。在另一个实施方案中，使Arg-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在pH8.5-9.5。在另一个实施方案中，使Arg-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在pH9。在另一个实施方案中，接触是指接触至少2分钟(min)。在另一个实施方案中，接触是指接触至少5分钟(min)。在另一个实施方案中，接触是指接触至少10分钟(min)。在另一个实施方案中，接触是指接触至少15分钟(min)。在另一个实施方案中，接触是指接触至少20分钟(min)。在另一个实施方案中，接触是指接触至少25分钟(min)。在另一个实施方案中，接触是指接触至少30分钟(min)。

在另一个实施方案中，柠康酸化(citraconylation)是在缺乏游离氨基的缓冲液(a buffer devoid offree amino group)中进行。在另一个实施方案中，柠康酸化是在碳酸盐缓冲液、磷酸缓冲液或硼酸缓冲液中进行。在另一个实施方案中，反应的pH维持在6-10。在另一个实施方案中，反应的pH维持在7-9.5。在另一个实施方案中，根据280nm处的吸光度，使用溶液中估计胰岛素量的3倍过量的柠康酸酐。在另一个实施方案中，反应时间为在室温下小于1小时。在另一个实施方案中，反应时间为在室温下20-60分钟。

在另一个实施方案中，胰蛋白酶是猪胰蛋白酶。在另一个实施方案中，胰蛋白酶是经TPCK处理。在另一个实施方案中，根据280nm处的吸光度，使用的胰蛋白酶与溶液中估计胰岛素量的比例为1:6000-10000。在另一个实施方案中，根据280nm处的吸光度，使用的胰蛋白酶与溶液中估计胰岛素量的比例为1:6000-9000。在另一个实施方案中，根据280nm处的吸光度，使用的胰蛋白酶与溶液中估计胰岛素量的比例为1:7500。在另一个实施方案中，反应在室温下进行0.5-2小时。在另一个实施方案中，反应最好在5-20mM Ca++、优选10mM Ca++存在下进行。在另一个实施方案中，反应在室温下(22±3°C)进行1小时。在另一个实施方案中，反应时间取决于酶浓度、温度和pH。

在另一个实施方案中，折叠发生在pH9-13的范围内。在另一个实施方案中，折叠发生在pH10-12的范围内。在另一个实施方案中，折叠发生在pH11-11.5的范围内。

在另一个实施方案中，可用HCl或NaOH进行pH调节。

在另一个实施方案中，胰岛素的结晶是在pH4-8的柠檬酸-乙醇中、在Zn++存在下进行。在另一个实施方案中，胰岛素的结晶是在pH6-7的柠檬酸-乙醇中、在Zn++存在下进行。在另一个实施方案中，胰岛素的结晶是在pH6.2-6.6的柠檬酸-乙醇中、在Zn++存在下进行。在另一个实施方案中，胰岛素的结晶是在pH6.4的柠檬酸-乙醇中、在Zn++存在下进行。

在另一个实施方案中，使Arg-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在16-40℃下进行。在另一个实施方案中，使Arg-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在20-35℃下进行。在另一个实施方案中，使Arg-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在19-25℃下进行。

在另一个实施方案中，使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在大约pH8时进行。在另一个实施方案中，使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在大约pH6-10时进行。在另一个实施方案中，使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在大约pH7.5-8.5时进行。在另一个实施方案中，使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在大约pH9时进行。

在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在16-40℃下进行。在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在20-40℃下进行。在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在22±3℃下进行。在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在室温下进行。

在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应至少30min。在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应至少1小时。在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应至少2小时。在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应至少3小时。在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应至少4小时。

在另一个实施方案中，使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应1-4小时。在另一个实施方案中，反应持续时间容易由本领域技术人员确定并且取决于温度、pH和胰蛋白酶浓度等。在另一个实施方案中，反应持续时间、温度和胰蛋白酶反应混合物的pH由本领域技术人员根据所用的具体胰蛋白酶(具体的动力学和规格型号)来确定。

在某些实施方案中，本文所用的“Arg-Arg前体胰岛素”或“胰岛素”包括天然蛋白(降解产物、合成蛋白或重组蛋白)和肽模拟物(通常是合成蛋白)、以及作为蛋白类似物的类肽(peptoid)和半类肽(semipeptoid)，在某些实施方案中，修饰使所述蛋白在体内更稳定或更能渗入细胞内。

在某些实施方案中，本发明的进一步修饰包括但不限于N-末端修饰、C-末端修饰、肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH)、主链修饰和残基修饰。制备肽模拟化合物的方法是本领域众所周知的并描述于例如Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.,第17.2章,F.Choplin Pergamon Press(1992)，其通过引用全部结合到本文中。这方面的更多细节在下文提供。

在某些实施方案中，所述肽内的肽键(-CO-NH-)被取代。在某些实施方案中，肽键被N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)取代。在某些实施方案中，肽键被酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在某些实施方案中，肽键被酮亚甲基键(-CO-CH2-)取代。在某些实施方案中，肽键被α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基，例如甲基、carba键(-CH2-NH-)。在某些实施方案中，肽键被羟基乙叉键(-CH(OH)-CH2-)取代。在某些实施方案中，肽键被硫代酰胺键(-CS-NH-)取代。在某些实施方案中，肽键被烯属双键(-CH=CH-)取代。在某些实施方案中，肽键被反向酰胺键(retroamide bond)(-NH-CO-)取代。在某些实施方案中，肽键被肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)取代，其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链。在某些实施方案中，这些修饰在肽链的任何键上发生并且甚至同时在几个(2-3个)键上发生。

在某些实施方案中，肽的天然芳族氨基酸(例如Trp、Tyr和Phe)被取代为合成的非天然酸，例如例如苯基甘氨酸、TIC、naphthylelanine(Nol)、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或o-甲基-Tyr。在某些实施方案中，本发明的肽包含一个或多个经修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复杂碳水化合物等)。

在一个实施方案中，“氨基酸”是指包括20种天然发生的氨基酸；这些氨基酸通常在体内在翻译后被修饰，包括例如，羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它不常见氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素(isodesmosine)、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施方案中，“氨基酸”同时包括D-氨基酸和L-氨基酸。

在某些实施方案中，重组蛋白技术用于产生本发明的“Arg-Arg前体胰岛素”。在某些实施方案中，重组蛋白技术用于产生相当长的肽(例如长度超过18-25个氨基酸)。在某些实施方案中，重组蛋白技术用于产生大量的本发明的“Arg-Arg前体胰岛素”。在某些实施方案中，重组技术描述于Bitter等(1987)Methods in Enzymol.153:516-544,Studier等(1990)Methodsin Enzymol.185:60-89,Brisson等(1984)Nature310:511-514,Takamatsu等(1987)EMBO J.6:307-311,Coruzzi等(1984)EMBO J.3:1671-1680和Brogli等,(1984)Science224:838-843,Gurley等(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565和Weissbach & Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY，第VIII部分,第421-463页。

在另一个实施方案中，用编码本发明蛋白的多核苷酸合成本发明的“Arg-Arg前体胰岛素”。在某些实施方案中，将编码本发明的Arg-Arg前体胰岛素的多核苷酸连接到表达载体上，所述载体包含顺式调节序列(例如启动子序列)的转录控制。在某些实施方案中，所述顺式-调节序列适合于指导本发明Arg-Arg前体胰岛素的组成型表达。在某些实施方案中，所述顺式-调节序列适合于指导本发明Arg-Arg前体胰岛素的特定表达。在某些实施方案中，所述顺式调节序列适合于指导本发明Arg-Arg前体胰岛素的诱导型表达。

在一个实施方案中，术语“多核苷酸”是指单链或双链的核酸序列，其可被分离出并以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(composite polynucleotide sequence)(例如上述的组合)形式提供。

在一个实施方案中，“基因组多核苷酸序列”是指源自(分离自)染色体并因此代表染色体的毗邻部分的序列。

在一个实施方案中，“复合多核苷酸序列”是指至少部分互补和至少部分是基因组的序列。在一个实施方案中，复合序列可包括编码本发明的Arg-Arg前体胰岛素所需的一些外显子序列，以及分布在其间的一些内含子序列。在一个实施方案中，所述内含子序列可来自任何来源，包括来自其它基因，并且通常会包括保守剪接信号序列。在一个实施方案中，内含子序列包括顺式作用表达调节元件。

在某些实施方案中，用PCR技术、或本领域技术人员已知的任何其它方法或程序来制备本发明的多核苷酸。在某些实施方案中，所述程序包括连接两个不同DNA序列(参见例如，“Current Protocols in MolecularBiology”,Ausubel等编著,John Wiley&Sons,1992)。

在一个实施方案中，将本发明的多核苷酸插入表达载体(即核酸构建体)，使重组蛋白能够表达。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括使该载体适合在原核生物中复制和整合的额外序列。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括使该载体适合在真核生物中复制和整合的额外序列。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括使该载体同样适合在原核生物和真核生物中复制和整合的穿梭载体。在某些实施方案中，克隆载体包括转录和翻译的起始序列(例如启动子、增强子)以及转录和翻译的终止序列。

在一个实施方案中，各种各样的原核细胞或真核细胞可用作宿主表达系统，以表达本发明的Arg-Arg前体胰岛素。在某些实施方案中，这些包括但不限于微生物和植物，例如已转化含有Arg-Arg前体胰岛素编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的表达载体的细菌；已转化含有Arg-Arg前体胰岛素编码序列的重组酵母表达载体的酵母菌；已感染含有Arg-Arg前体胰岛素编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或已转化含有Arg-Arg前体胰岛素编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)的植物细胞系统。

在某些实施方案中，使用非细菌表达系统(例如哺乳动物表达系统，例如CHO细胞)，以表达本发明的Arg-Arg前体胰岛素。在一个实施方案中，用于在哺乳动物细胞中表达本发明多核苷酸的表达载体是包含CMV启动子和新霉素抗性基因的pCI-DHFR载体。

在某些实施方案中，使用细菌系统，例如大肠杆菌BL-21(Escherichiacoli BL-21)。在一个实施方案中，希望是大量的蛋白。在一个实施方案中，希望指导高水平蛋白产物表达的载体，可与疏水性信号序列融合，所述信号序列指导所表达产物进入周质、或进入细菌包涵体或容易纯化该蛋白产物的培养基。在一个实施方案中，某种融合蛋白经工程改造而具有特异性切割位点，有助于该蛋白的回收。在一个实施方案中，适于这样操作的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体的pET系列[Studier等,Methods inEnzymol.185:60-89(1990)]。

在另一个实施方案中，本发明提供重组DNA方法的用途，所述用途允许在微生物中制备胰岛素前体或胰岛素类似物、尤其是氨基酸序列和/或氨基酸链长不同于人胰岛素的人胰岛素原或胰岛素原。在另一个实施方案中，自经遗传修饰的大肠杆菌细胞制备而来的胰岛素原(与本发明的前体胰岛素是同义词)没有任何正确连接的胱氨酸桥。在另一个实施方案中，用大肠杆菌获取胰岛素的方法描述于EP0055945，其通过引用全部结合到本文中。

在一个实施方案中，使用酵母表达系统。在一个实施方案中，含有组成型启动子或诱导型启动子的多种载体可用于酵母菌，正如美国专利申请号5,932,447所公开的那样。在另一个实施方案中，使用能促进外源DNA序列整合到酵母染色体的载体。

在一个实施方案中，可使用多种方法将本发明的表达载体引入细胞内。这类方法一般性地描述于Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992),in Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang等,Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995),Vega等,Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa等[Biotechniques4(6):504-512,1986]并且包括例如稳定或瞬时转染、脂质转染(lipofection)、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，有关正-负选择方法可参见美国专利号5,464,764和5,487,992。

在某些实施方案中，在允许Arg-Arg前体胰岛素大量表达的有效条件下培养经转化的细胞培养。在某些实施方案中，有效培养条件包括但不限于允许蛋白产生的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。在一个实施方案中，有效培养基是指细胞经培养能产生本发明的Arg-Arg前体胰岛素的任何培养基。在某些实施方案中，培养基通常包括具有可同化的碳源、氮源和磷源、以及合适的盐类、矿物质、金属和其它营养物例如维生素的水溶液。在某些实施方案中，可在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定板和培养皿上培养本发明的细胞。在某些实施方案中，培养是在合适于重组细胞/细菌的温度、pH和氧含量下进行。在某些实施方案中，培养条件是在本领域普通技术人员的专业范围之内。

在一个实施方案中，在预定培养时间之后，进行Arg-Arg前体胰岛素的回收。

在一个实施方案中，本文所用的术语“回收Arg-Arg前体胰岛素”是指收集含有Arg-Arg前体胰岛素的全部发酵培养基，而不一定是指额外的分离或纯化步骤。

在一个实施方案中，纯化方法用于纯化Arg-Arg前体胰岛素或本发明的胰岛素。纯化方法包括各种各样的标准蛋白纯化技术，例如但不限于亲和色谱法、离子交换色谱法、混合模式色谱法、过滤、电泳、疏水性相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、伴刀豆球蛋白A色谱法、色谱聚焦和分级溶解。

在一个实施方案中，Arg-Arg前体胰岛素或本发明的胰岛素以“基本纯化的”形式回收。

在一个实施方案中，术语“基本纯化的”是指允许所述蛋白有效用于本文所述的应用例如治疗糖尿病中的纯度。

在某些实施方案中，合成并纯化Arg-Arg前体胰岛素；可在体内或体外测定其治疗性功效。

在某些实施方案中，本发明的胰岛素可配制在经口或口服组合物中，并且在某些实施方案中，包括液体溶液剂、乳剂、混悬剂等。在某些实施方案中，适用于配制所述组合物的药学上可接受的载体是本领域众所周知的。在某些实施方案中，液体口服组合物包含大约0.001%至大约0.933%胰岛素，或在另一个实施方案中，大约0.01%至大约10%。

在某些实施方案中，用于本发明方法的组合物包括溶液剂或乳剂，在某些实施方案中，所述溶液剂或乳剂是水性溶液剂或乳剂，其包含安全而有效量的胰岛素和任选的其它化合物，供鼻内局部给药用。

在一个实施方案中，将本发明的注射剂配制在水性溶液剂中。在一个实施方案中，将本发明的注射剂配制在生理相容的缓冲液例如汉克斯溶液(Hank's solution)、林格液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液中。在某些实施方案中，对于经黏膜给药而言，适于穿过屏障的渗透剂用于配制。这类渗透剂是本领域公知的。

在一个实施方案中，配制本文所述的制剂，供胃肠外给药用，例如通过推注(bolus injection)或连续输注。在某些实施方案中，注射用制剂呈单位剂型的形式，例如在安瓿或多剂量容器中，并任选添加防腐剂。在某些实施方案中，组合物是在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并含有配制用试剂(formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

在某些实施方案中，所述组合物也包含：防腐剂，例如苯酚、间甲酚、间拉唑(metaprazol)、苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，例如乙二胺四乙酸钠等；缓冲剂，例如磷酸(盐)、柠檬酸(盐)和乙酸(盐)；张度剂(tonicity agent)，例如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂，例如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、偏亚硫酸氢钠(sodium metabisulfote)等；芳香剂；粘度调节剂，例如聚合物，包括纤维素及其衍生物；和聚乙烯醇以及调节这些水性组合物的pH的酸和碱(如果需要的话)。在某些实施方案中，所述组合物也包含局部麻醉剂或其它活性剂。所述组合物可以喷剂、雾化剂、滴剂等形式使用。

在查看以下实施例之后，本发明的额外目的、优势和新特征将是本领域普通技术人员显而易见的，所述实施例并非限制性的。另外，以上所述的和权利要求书部分要求保护的本发明的不同实施方案和方面各自可在以下实施例中找到实验支持。

实施例

通常，本文所用的命名法和本发明所用的实验室操作包括分子技术、生化技术、微生物技术和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook等,(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"第I-III卷，Ausubel,R.M.编著(1994)；Ausubel等,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wileyand Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to MolecularCloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等,"RecombinantDNA",Scientific American Books,New York；Birren等(编著)"GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series",第1-4卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中给出的方法；"Cell Biology:ALaboratory Handbook",第I-III卷，Cellis,J.E.编著(1994)；"Culture of AnimalCells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第3版；"Current Protocols in Immunology"第I-III卷，Coligan J.E.编著(1994)；Stites等(编著),"Basic and Clinical Immunology"(第8版),Appleton& Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编著),"Selected Methods inCellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫测定深入描述于以下专利和科技文献：参见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.编著(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,和HigginsS.J.编著.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,和Higgins S.J.,编著.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.编著(1986)；"ImmobilizedCells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to MolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"第1-317卷,AcademicPress；"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",AcademicPress,San Diego,CA(1990)；Marshak等,"Strategies for Protein Purificationand Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用结合到本文中。其它通用性文献在本文的全文中提供。

实施例1

有效产生胰岛素的方法

表达克隆

通过软件，优化编码胰岛素前体蛋白的核苷酸序列，以改善在大肠杆菌中的表达。再从合成的寡核苷酸中装配合成基因并克隆到pET24a(Novagen)，使用NdeI和BlpI限制酶位点。用上述克隆转染大肠杆菌BL21菌株(DE3)细胞。所述基因在T7启动子和lac操纵子的控制之下转录。转录终止是由T7终止子控制，翻译起始是由pET24核糖体结合位点起始。由IPTG诱导用作胰岛素前体的12.7kD融合蛋白的表达，导致产生非常高水平的胰岛素前体。该前体含有Cu/Zn SOD部分作为氨基端部分并通过Arg残基与胰岛素原样部分融合，其中Arg-Arg连接胰岛素的B链和A链。所述胰岛素前体的表达盒-核苷酸序列和相应氨基酸序列-见图4。

生长条件和胰岛素前体的积累

在补充有酵母浸膏、葡萄糖、氨和氧的基本盐培养基中，在37℃进行发酵，直到细胞浓度达到OD₆₆₀~50。为了诱导，添加IPTG并严格维持和控制低葡萄糖水平达6小时以上，直到达到培养物密度达到OD₆₆₀~120。非常高水平的胰岛素前体积累为胞内包涵体(IB)。用微孔中空纤维柱，经超滤收获细胞并用盐水洗涤。

回收

在850巴，经高剪切混合和高压匀浆破碎细菌细胞之后，回收IB。经连续离心收集IB并将沉淀物在碳酸盐缓冲液中洗涤2次。

溶解和折叠

将IB悬浮于NaHCO₃缓冲液中并通过短时暴露给pH12而溶解。再将所述溶液调节至pH11.5，离心澄清，然后再在23°C温育，总共6小时，从碱处理开始计。应当指出，pH是最佳折叠的重要参数，在pH值为11.0-11.5时折叠最好。在折叠周期结束时，用HCl将pH降低至9。

经柠康酸酐修饰和胰蛋白酶切割

通过在pH9(通过自动滴定而保持该pH值)与过量柠康酸酐反应，所述前体蛋白中的所有赖氨酸残基都被可逆地封闭。剩余试剂被水解为柠康酸或通过加入5mM乙醇胺而猝灭。通过在pH9(通过自动滴定而保持该pH值)与过量柠康酸酐反应，所述前体蛋白中的所有赖氨酸残基都被可逆地封闭。剩余试剂被水解为柠康酸或通过加入5mM乙醇胺而猝灭。所述胰岛素前体的酰基衍生物获得-7的额外负电荷，这可在尿素-PAGE上容易地分析出。所述蛋白再用稀释的胰蛋白酶和10mM Ca++在23℃处理1-2小时，得到柠康酸化(citraconylated)胰岛素-ArgArg。在反应周期结束时，通过将pH降至2.0使胰蛋白酶失活并在室温下温育大约16小时，以完全除去柠康酸残基。

纯化

所述溶液经离心和微滤而澄清并在SP琼脂糖柱上、在柠檬酸(pH3.0)中进行色谱。将在30%异丙醇中的洗脱合并液调节至pH9.0并用抑酞酶处理，以灭活任何残留胰蛋白酶，并在混合模式PPA HyperCell柱上进行色谱。所述胰岛素-ArgArg富集主要合并液在pH3.0洗脱并在pH7.0用Zn⁺⁺沉淀。

所得沉淀物经TFF收集。将浓缩浆液在含EDTA的酸性条件下溶解，胰岛素-ArgArg通过制备型反相HPLC进一步纯化和结晶。胰岛素晶体经过滤收集，洗涤和真空干燥，并将松散材料(bulk material)冻存于-20°C。图3显示高度纯化的胰岛素-ArgArg制剂的HPLC图。

实施例2

有效产生的胰岛素在体内具有活性

为了评价实施例1中产生的长效胰岛素类似物的潜在治疗效果，在链脲佐菌素(STZ)-诱导的糖尿病大鼠中通过在给药之后的不同时间点测定它们的血糖水平，测试胰岛素-ArgArg和来得时(Junod等,1969)。大约9周龄的年轻Sprague-Dawley雄性大鼠接受单次腹膜内注射60mg STZ/千克体重。诱导糖尿病后5天，大部分动物表现出血糖值高于300mg/dL。这些动物在连续3天经皮下注射而接受相当于6IU/kg的试验材料。该研究由3个实验组组成，每组6只动物，用以上指定的2种不同胰岛素治疗并用媒介物作为对照。在治疗之前和每次给药日之后的1、4、8和24小时测定血糖。如图5所示，两种试验材料在体内都具有相当的活性特征。

实施例3

有效产生的胰岛素在狗体内具有长效胰岛素的的活性

在四氧嘧啶-诱导的糖尿病比格犬中测试了不同胰岛素制剂降低血糖水平的效果。年龄2–5岁、体重10-17千克的8只健康的经阉割的雌性狗，经静脉内注射50mg/kg体重的四氧嘧啶。治疗之后3天，所有狗只都出现可重复的实验性糖尿病状态，表现出高血糖症和其它特征性症状(Watanabe等,The pathological features of alloxan diabetes in beagle dogs,JToxicol Pathol,2004,17,187-195)。

将如上所述制备的胰岛素-ArgArg(“胰岛素RR”)与两种市售胰岛素制剂即优泌林R(Elli Lily)和来得时(Sanofi-Aventis)进行比较。在8只糖尿病比格犬中，通过随机交叉研究，测试这三种制剂和媒介物对照。

给予不同胰岛素制剂、以及对照，每天1次，连续2天。在颈背面经皮下推注媒介物对照和0.4IU/kg体重/天的胰岛素制剂。全天采集全血样品，进行快速葡萄糖检测(Glucotrend2,Roche)并在每次采样之后2分钟内进行葡萄糖测定和记录。

结果见图7，表明与速效可溶性胰岛素(优泌林R)不同，来得时和和胰岛素-ArgArg在糖尿病比格犬体内都具有相似的长效活性特征。

Claims

1.一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：

（a）可逆地封闭包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH6-10的溶液；和

（b）部分切割所述Arg-Arg前体胰岛素，包括使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应，

从而制备胰岛素。

2.权利要求1所述的方法，其中所述使所述Arg-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在pH9时进行。

3.权利要求1所述的方法，其中所述使所述Arg-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在室温下进行2小时。

4.权利要求1所述的方法，其中所述使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在pH值为6.0-11.5时进行。

5.权利要求1所述的方法，其中所述使步骤(a)的Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在室温下进行。

6.权利要求5所述的方法，其中所述使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应进行至少0.5小时。

7.权利要求5所述的方法，其中所述使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应进行1-4小时。

8.权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前将所述Arg-Arg前体胰岛素暴露在10.0-11.5的pH值下。

9.权利要求1所述的方法，所述方法还包括将步骤(b)的所述胰岛素的pH调节至pH9(步骤(c))。

10.权利要求9所述的方法，所述方法还包括纯化所述胰岛素(步骤(d))。

11.权利要求10所述的方法，其中通过微滤进行所述纯化。

12.权利要求10所述的方法，其中通过离子交换色谱法、反相高压液相色谱法(RP-HPLC)或这两者进行所述纯化。

13.权利要求10所述的方法，所述方法还包括使所述胰岛素结晶，包括在柠檬酸-乙醇中使步骤(d)的所述胰岛素接触Zn++。

14.权利要求1所述的方法，其中所述胰岛素是长效胰岛素。

15.权利要求1所述的方法，其中将至少50%的所述Arg-Arg前体胰岛素转化为所述胰岛素。

16.权利要求1所述的方法，其中所述前体胰岛素得自细菌包涵体。

17.权利要求1所述的方法，其中所述所述溶液不含胺。

18.权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液是碳酸盐缓冲液。

19.权利要求1所述的方法，其中包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的所述Arg-Arg前体胰岛素是由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的Arg-Arg前体胰岛素。