NO300980B1 - Fremgangsmåte for hydrolyse av aminosyrekjeden til preproinsulin - Google Patents
Fremgangsmåte for hydrolyse av aminosyrekjeden til preproinsulinInfo
- Publication number
- NO300980B1 NO300980B1 NO913474A NO913474A NO300980B1 NO 300980 B1 NO300980 B1 NO 300980B1 NO 913474 A NO913474 A NO 913474A NO 913474 A NO913474 A NO 913474A NO 300980 B1 NO300980 B1 NO 300980B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- amino acid
- clostripain
- preproinsulin
- carboxypeptidase
- insulin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 title claims description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 title abstract description 11
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 19
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 3
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- RDFCSSHDJSZMTQ-ZDUSSCGKSA-N Tos-Lys-CH2Cl Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)CCl)C=C1 RDFCSSHDJSZMTQ-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 2
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002897 organic nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N (4R)-2-oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CSC(=O)N1 BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- MEUAVGJWGDPTLF-UHFFFAOYSA-N 4-(5-benzenesulfonylamino-1-methyl-1h-benzoimidazol-2-ylmethyl)-benzamidine Chemical compound N=1C2=CC(NS(=O)(=O)C=3C=CC=CC=3)=CC=C2N(C)C=1CC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 MEUAVGJWGDPTLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N Arg-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical class S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 1
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 1
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052756 noble gas Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002835 noble gases Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for hydrolyse av aminosyrekjeden til preproinsulin.
Insulin består av to polypeptidkjeder, A-kjeden som inneholder 21 aminosyrerester og B-kjeden med 30 aminosyrerester. A- og B-kjeden er forbundet med hverandre over to disulfid-broer, idet cysteinrestene er koblet med hverandre i posisjon A7 og B7 samt A20 og B19. En tredje disulfidbro står mellom A6 og All. Dyrisk og humant insulin blir blandet i bukspytt-kjertelen i form av preproinsulin. Humant preproinsulin består f.eks. av et prepeptid med 24 aminosyrerester, derpå koblet et proinsulin med 86 aminosyrerester med følgende kon-figurasjon: Prepeptid-B-Arg-C-Lys-Arg-A, der C står for en aminosyrekjede med 31 rester. I løpet av ekskresjonen fra de Langerhanske øyene blir prepeptidet avspaltet, og proinsulin oppstår. Deretter blir C-kjeden proteolytisk avspaltet, og virksomt humant insulin oppstår.
Det er i økende utstrekning mulig å uttrykke ved hjelp av gentekniske metoder preproinsulin i mikroorganismer (EP-A-347.781, EP-A-367.163). Avspaltning av preprosekvensen foregår som regel kjemisk og/eller enzymatisk (DE-P-3.440.988, EP-A-0.264.250). Kjente enzymatiske omdannings-metoder beror på spaltning med trypsin og karboksypeptidase B (Kemmler W. et al., J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791; EP-A-195.691; EP-B-89.007). Ulempen med disse metodene er at det oppstår store mengder biprodukter som bare vanskelig lar seg separere fra reaksjonsoppløsningen. Spesielt ved omdanning av humant preproinsulin til humant insulin (human-insulin, HI) oppstår større mengder av Des-Thr (B39)-human-insulin (Des-Thr(B30)-HI). Dette biproduktet skiller seg fra HI ved at det mangler en endestående aminosyre og kan bare vanskelig bli separert fra reaksjonsoppløsningen.
For å minske denne dannelsen av biprodukt kan det bli tilsatt bestemte tungmetaller, spesielt nikkel til spaltnings-blandingen (EP-A 0.264.250). En slik reaksjonsføring er p.g.a. den høye avløpsvannbelastningen med tungmetaller ikke ønskelig. Det er derfor behov for en spesifikk og om-givelsestålbar omdanning av preproinsuliner.
Clostripain (Clostriopeptidase B; EC 3.4.22.8) er et enzym fra kulturfiltratet til Clostridium histolyticum med en molekylvekt på omtrent 30.000 til 80.000 som både oppviser proteolytisk og også amidase-esteraseaktivitet (Mitchell, W. M., Harrington, W. F., J. of Biol. Chem., 243 (18), 468-4692, 1968). De fremhever seg gjennom en høy spesifisitet for Arg-C-bindinger. Således blir i den isolerte B-kjeden til insu-linet Arg-Gly-bindingen med clostripain 500-ganger hurtigere avspaltet enn Lys-Ala-bindingen og i glucagon blir bare Arg-Arg, Arg-Ala og Lys-Tyr avspaltet. Hydrolysehastigheten for disse bindingene står til hverandre i forhold 1, 1/7 og 1/300. (Labouesse, B., Bull. Soc. Chim. Biol., 42, 1293, 1960). Det ble overraskende funnet at clostripain spalter preproinsulin spesifikt C-terminalt bak arginin, uten at det oppstår nevneverdig spaltning av aminosyrekjeden bak den i B-kjeden tilstedeværende arginin (B22).
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for hydrolsye av aminosyrekjeden til preproinsulin med formel
I,
der
R<1> betyr n-aminosyrer, der n betyr hele tall 0 eller 1, R^ betyr hydrogen,
en kjemisk eller enzymatisk avspaltbar aminosyre
eller et peptid med 2 til 30 aminosyrerester,
r<3> betyr en hydroksygruppe,
en aminosyre eller et peptid med 2 til 10 aminosyrer, X betyr L-arginin eller
et peptid med 2 til 45 aminosyrer, ved C-terminalen
og N-terminalen en L-argininrest,
Y betyr en genetisk kodbar aminosyre,
Z betyr en genetisk kodbar aminosyre,
Al til A20 eller B2 til B29 betyr en naturlig eller gjennom utveksling av en eller flere aminosyrerester forandret aminosyresekvens av humant eller dyrisk insulin, kjennetegnet ved at preproinsulinet hydrolyseres i nærvær av clostripain og hydrolysen foregår ved et pH-intervall fra 6-9 og et rx.temp. intervall fra 20-40°C, kons. til preproinsulin med formel I ligger i et område på 0,1 mg/ml - 10 mg/ml og preproinsulin-clostripainforholdet (mg til enheter) utgjør 1:0,1 til 1:50, og overføres eventuelt med karboksypeptidase B til tilsvarende insulin.
Aminosyresekvensen til peptider og proteiner blir betegnet fra den N-terminale enden til aminosyrekjeden. Proteaser hydrolyserer peptidbindingen mellom aminosyrene til peptider og proteiner. Clostripain hydrolyserer L-arginin inne-holdende peptider eller proteiner spesifikt bak arginin. Som reaksjonsprodukter fra preproinsulinhydrolyse oppstår insulinderivater eller polypeptidet som C-terminalt har en argininrest, eller aminosyrer.
Under begrepet naturlige aminosyrer forstås eksempelvis Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Trp, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit eller His. Med begrepet genetisk kodbar aminosyre forstås f.eks. Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Len, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro eller selenocystein.
Spesielt foretrukket er insuliner som er foreslått i de tyske patentsøknadene P 39.19.852 og P 40.12.818.0. Eksempelvis InsuArg med følgende aminosyresekvens:
Clostripain (EC 3.4.22.8) er en ekstracellulær tiolprotease fra Clostridien. Enzymet er en heterodimer og innehar ingen homologi med andre kjente tiolproteaser. Enzymet har en uvanlig høy spesifisitet for Arg-XXX-bindinger, spesielt Arg-Pro. Det kan bli karakterisert ved en molekyl vekt mellom 30.000 og 80.000 og et isoelektrisk punkt, med pH på 4.8 til 4.9. Som aktivatorer virker f.eks. cystein, merkaptoetanol, ditiotreitol eller kalsiumioner.
I nærvær av f.eks. tosyl-L-lysin-klormetylketon, hydrogen-peroksyd, EDTA, C02+_, CU2+_, Cdg+.-ioner eller citrat blir clostripain hemmet.
Fremstilling av clostripain foregår ved hjelp av mikroorganismer gjennom fermentasjon. Ved disse fremgangsmåtene blir Clostridien dyrket, helt til clostripain opphoper seg i næringsmediet. Egnet er eksempelvis Clostridium histolyticum, spesielt Clostridium histolyticum DSM 627. Også mutan-ter og varianter av nevnte mikroorganismer er angitt dersom de syntetiserer clostripain.
Dyrkningen foregår anaerobt enkeltvis eller i blandings-kultur, eksempelvis nedsenket i stående kultur i nærvær av oksygen eller i fermentorer, eventuelt under innføring av nitrogen, edelgasser eller andre gasser, bortsett fra oksygen. Fermenteringen foregår i et temperaturområde på omtrent 10 til 45°C, fortrinnsvis omtrent 25 til 40°C, spesielt 30 til 38°C. Det blir fermentert i et pH-område mellom 5 og 8, fortrinnsvis mellom 5,5 og 8. Under disse betingelser viser kulturbrygget generelt etter 1 til 3 dager en nevneverdig akkumulasjon av enzymet. Syntesen av clostripain begynner i den sene log-fasen, og oppnår maksimum i den stasjonære vekstfasen. Produksjon av enzymet kan foregå ved hjelp av aktivitetstester (Mitchell W. , Meth. of Enzym., Bd. 47 (1977), sidene 165-170).
Næringsoppløsningen for produksjon av clostripain inneholder 0,2 til bio, fortrinnsvis 0,5 til 3$ organiske nitrogen-forbindelser samt uorganiske salter. Som organiske nitrogen-forbindelser kommer følgende i betraktning: aminosyrer, pepton, videre kjøttekstrakt, malte frø, eksempelvis fra mais, hvete, bønner, soya eller bomullsplanter, destillasjonsrester fra alkoholfremstilling, svinemel eller gjærekstrakt. Av uorganiske salter kan næringsoppløsningen eksempelvis inneholde klorider, karbonater, sulfater eller fosfater av alkali- eller jordalkalimetaller, jern, sink og mangan, men også ammoniumsalter og nitrat. De optimale fermenteringsbetingelsene er forskjellige for hver mikro-organisme, men kjent for fagfolk, eller kan bli fastslått i enkle forforsøk. Rensing av clostripain kan foregå ifølge klassiske fremgangsmåter f.eks. over ammoniumsulfat-felling, ionebytte- eller gelpermeasjonskromatografi. Kobling av enzymet er mulig ifølge kjent teknikk (Colowick og Kaplan, Meth, Enzymol., Vol. XLIV).
For den enzymatiske omsetningen kan både hele celler i fri eller immobilisert form og også det isolerte enzymproduktet, som eventuelt kan være bærebundet, bli anvendt.
Spaltning av preproinsulin med formel I med clostripain foregår i et vandig medium som også kan bli tilsatt vann-blandbare organiske bestanddeler, som f.eks. alkohol, keton, urinstoff, N ,N-dimetylformamid. Spesielt kan reaksjons-blandingen bli tilsatt for bedre pH-verdi-kontroll av reaksjonen tilsvarende uorganiske eller organiske buffere som fosfat, tris, glycin, HEPES, o.a. Konsentrasjonen av preproinsulin i løpet av spaltningen ligger eksempelvis mellom 0,1 mg/ml og 100 mg/ml, fortrinnsvis mellom 0,1 mg/ml og 10 mg/ml. Forholdet mellom mellom preproinsulin og clostripain utgjør (mg til enheter (U)) 1 : 0,01 til 1:1000, fortrinnsvis 1 : 0,1 til 1:50.
Reaksjonstemperaturen kan likeledes varieres innenfor vide rammer. Foretrukket er temperaturer mellom +20°C og +40°C.
pH-verdien kan variere mellom pH 6 og pH 9.
Tiden som er nødvendig for omdanning av preproinsulin til tilsvarende mellomprodukt, kan alt etter reaksjonsbetingel-sene varieres innenfor vide rammer, f.eks. kan den ligge mellom 15 min. og 48 t., foretrukket er en reaksjonsvarighet mellom 1 t og 6 t.
Enzymet blir aktivert på egnet måte i nærvær av et merkaptan før tilsetningen. Som merkaptaner kommer dermed i prinsippet alle forbindelser på tale som SE-grupper inneholder, fortrinnsvis blir DTT, DTE, merkaptetanol, tioglykolsyre eller cystein anvendt. Konsentrasjonen til merkaptanet kan bli variert i stor utstrekning, foretrukket er konsentrasjoner mellom 0,1 mm og 100 mm. Videre inneholder aktiverings-bufferen Ca<2+->ioner, fortrinnsvis CaC^. Aktiveringen foregår mellom pH 4 og pH 12, fortrinnsvis mellom pH 6 og pH 8, spesielt foretrukket er området pH 7 til pE 8. For opprett-holdelse av pH-verdien kan en egnet bufferforbindelse, f.eks. tris, HEPES, glycin, o.a. bli tilsatt. Aktiveringstempera-turen kan ligge mellom 0°C og 60°C, foretrukket er området 0°C til 10°C, spesielt foretrukket er 0°C til 5°C. Det på denne måten aktiverte enzymet kan enten bli anvendt direkte eller eventuelt ved hjelp av kromatografi over en gel bli befridd fra aktiveringsbuffer.
Spaltningen av preproinsulin med formel I iflg. oppfinnelsen fører til insulinderivater med argininrester ved den C-terminale enden av insulin og de tilsvarende avspaltede aminosyrene og/eller peptider. Insulinderivatene kan om ønsket bli overført til de tilsvarende insulinene med karboksypeptidase B. Dette kan skje ^i samme reaksjons-blanding samtidig med clostripain, men også under ovennevnte reaksjonsbetingelser etter hverandre, idet insulinderivatet eventuelt før karboksypeptidase B-behandlingen kan bli iso-lert ved i seg selv kjente metoder som f.eks. kromatografi eller krystallisasjon. Karboksypeptidase B kan bli tilsatt i oppløst eller i immobilisert form. Forholdet mellom karboksypeptidase B, og insulinderivat utgjør (vekt til vekt) omtrent 1:10 til 1:5.000, fortrinnsvis omtrent 1:500 til 1:3.500 og spesielt foretrukket er omtrent 1:1.000 til 1.3.000.
Forholdet mellom karboksypeptidase B og clostripain utgjør (vekt til vekt) omtrent 1:1 til 10:1, og foretrukket er 2:1 til 5:1.
Reaksjonsproduktene til clostripain og/eller karboksypeptidase B-spaltningen kan eksempelvis bli utfelt gjennom reduksjon av pH-verdien og/eller bli renset ved hjelp av kjente søylekromatografiske metoder. Oppnådd insulin kan bli tilberedet i vanlige administreringsformer og anvendt som legemiddel for behandling av diabetes mellitus.
I følgende eksempel blir fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen beskrevet. Prosentangivelsene angir vekten når ikke annet er angitt.
Eksempel 1
Dyrking av Clostridim histolyticum DSM 627 foregår i et nær ing smed i Tim med følgende sammensetning:
Forkulturen blir innpodet 1%. Dyrkningen foregår i lukkede flasker under anaerobe betingelser ved 37°C i omtrent 2 dager. Stammene til mikroorganismene blir holdt i ovennevnte næringsoppløsning med 5# glycerin ved —20°C. Fermentoren blir podet 1% med forkulturen. En fermentor med 10 1 innhold blir podet med 8 1 næringsoppløsning. Dyrkningen foregår under nitrogengassing ved 33°C, 24 t og konstant pH på 7,0. Det ble målt en enzymaktivitet på 20.000 U/l i kulturfiltratet (Mitchell W., Meth. of Enzym., Bd. 47, S. 165-170, 1977).
Opparbeidningen foregår gjennom avsentrifugering av cellene ved omtrent 6.000 g, sterilfiltrering gjennom et filter med 0,22 pm porestørrelse, tilsetning av 65é iskald (-20°C) metanol til filtrat. Deretter ble oppløsningen holdt i 24 t ved -20°C og til slutt avsentrifugert (8.000 g). Pelleten ble oppløst i sterilt bidest. Aqua, og avsentrifugert (12.000
g). I pelleten ble en enzymaktivitet på 300 U/ml, 200 U/mg protein målt. Utbytte utgjorde 75$ av målt aktivitet i
fermentoren.
Eksempel 2
Dyrkning av cellene foregår som i eksempel 1. Produksjons-mediet i fermentoren besto av:
og ble inokulert med 2% av en forkultur. Clostripain-aktiviteten var 45.000 U/ml i kulturfiltratet. Opparbeidningen foregår gjennom tangentiell-strømnings-filtrering på 0,3 pm membraner (Filtron, omegamembran) for separering av celler og tangentiell-strømnings-filtrering på 10 KD membraner (Filtron, omegamembran) for oppkonsentrering av oppløst clostripainer. Oppkonsentreringsfaktoren utgjør 20. Til slutt ble konsentratet avspaltet og kromatografert over DEAE-cellulose. Clostripainaktivitet 1000 U/ml; utbytte 85$. Lagring frem til tilsetning av enzympreparatet foregår ved -20°C.
Eksempel 3
A. Aktivering av clostripain
50 pl enzympreparat (200 U/ml, 286 U/ml fra eksempel 1) 1 pl aktiveringsbuffer (250 mM DTT, 125 mM CaCl2)
Innhold i blandingen:
Inkubasjon 2 t på is:
for spaltningsreaksjonen blir enzymet fortynnet 1:40 med
25 mM tris/HCl buffer pH 7,8.
B. Clostripain-spaltningsblanding for frigjøring av (B31)
Arg-insulin
Innhold i blandingen:
Inkubasjon i 1-2 t ved 28°C, og reaksjonen kan lett bli kontrollert ved hjelp av EPLC, og deretter stoppes reaksjonen med tosyl-L-lysin-klormetylketon (TLCK).
Stopping av reaksjonen gjennom tilsetning av 1 pl TLCK (15
mM)
Lagring ved 4°C
Resultat: Human-insulin-Arg. Ved hjelp av HPLC er ingen
human-insulin (DesB30 )-dannelse målbar.
Karboksypeptidase B - spaltningsblanding for frigjøring av humaninsulin
200 pl clostripain-spaltningsblanding
10 pl karboksypeptisase B (1:100 fortynning)
- Karboksypeptidase-innhold i blanding: 2,5 pg/ml
Inkubasjon 2-4 t ved 28°C, reaksjonen kan lett undersøkes
ved hjelp av HPLC.
For reaksjonen blir karboksypeptidase B (759 U/ml, 150
U/mg, fra svinebukspyttkjertel) fortynnet 1:1.000 med 25 mM tris/HCl buffer pH 7,8. - Resultat: Human-insulin. Ingen insulin (DesB30)-dannelse som er målbar med HPLC.
D. HPLC-analyse
Spaltningen ble kontrollert ved anvendelse av en RP 18 kolonne (0,125 M NH4 (S04 (S04)2, med H2S04 til pH 4, 25-50$ acetonitril-gradient) hhv. en C8-kolonne (0,1% TFA, 2056-50% acetonitril-gradient).
Eksempel 4
Clostripain: 200 U/ml (fra eksempel 1)
Aktiveringsbuffer: 500 mM Tris/HCl, pH 7,8
Foldingen foregår over natt i kjølerom med 4°C, og foldings-utbyttet utgjør 0,152 mg/ml. Etter separering av urenheter ved hjelp av pH-felling ved pH 5,0 blir Tris tilsatt i en sluttkonsentrasjon på 50 mM, og pH-verdien innstilt med HC1 til 7,8. 30 pl enzymoppløsning ble tilsatt. Spaltingen foregår ved 30°C og ble fulgt ved hjelp av HPLC.
Resultat: Ovennevnte preproinsulin kan spaltes til humant insulin Arg. Insulin (DesB30)-dannelsen er minimal.
Claims (3)
1.
Fremgangsmåte for hydrolyse av aminosyrekjeden til preproinsulin med formel I,
der
R<1> betyr n-aminosyrer, der n betyr hele tall 0 eller 1, R<2> betyr hydrogen,
en kjemisk eller enzymatisk avspaltbar aminosyre eller et peptid med 2 til 30 aminosyrerester,
R<3> betyr en hydroksygruppe,
en aminosyre eller et peptid med 2 til 10 aminosyrer, X betyr L-arginin eller
et peptid med 2 til 45 aminosyrer, ved C-terminalen og N-terminalen en L-argininrest,
Y betyr en genetisk kodbar aminosyre,
Z betyr en genetisk kodbar aminosyre,
Al til A20 eller B2 til B29 betyr en naturlig eller gjennom utveksling av en eller flere aminosyrerester forandret aminosyresekvens av humant eller dyrisk insulin, karakterisert ved at preproinsulinet hydrolyseres i nærvær av clostripain og hydrolysen foregår ved et pH-intervall fra 6-9 og et rx.temp. intervall fra 20-40°C, kons. til preproinsulin med formel I ligger i et område på 0,1 mg/ml - 10 mg/ml og preproinsulin-clostripainforholdet (mg til enheter) utgjør 1:0,1 til 1:50, og overføres eventuelt med karboksypeptidase B til tilsvarende insulin.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at karboksypeptidase B samtidig er nærværende eller tilsettes etter spaltning med clostripain.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1-2, karakterisert ved at clostripain og/eller karboksypeptidase B fore-ligger i mobilisert form.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4028118 | 1990-09-05 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO913474D0 NO913474D0 (no) | 1991-09-04 |
| NO913474L NO913474L (no) | 1992-03-06 |
| NO300980B1 true NO300980B1 (no) | 1997-08-25 |
Family
ID=6413629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO913474A NO300980B1 (no) | 1990-09-05 | 1991-09-04 | Fremgangsmåte for hydrolyse av aminosyrekjeden til preproinsulin |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5728543A (no) |
| EP (1) | EP0474212B1 (no) |
| JP (1) | JP3005335B2 (no) |
| KR (1) | KR100188800B1 (no) |
| AT (1) | ATE145922T1 (no) |
| AU (1) | AU637254B2 (no) |
| CA (1) | CA2050606C (no) |
| CZ (1) | CZ283234B6 (no) |
| DE (1) | DE59108392D1 (no) |
| DK (1) | DK0474212T3 (no) |
| ES (1) | ES2095891T3 (no) |
| FI (1) | FI103805B (no) |
| GR (1) | GR3021909T3 (no) |
| HR (1) | HRP940766A2 (no) |
| HU (1) | HU214676B (no) |
| IE (1) | IE75723B1 (no) |
| IL (1) | IL99383A (no) |
| LT (1) | LT3328B (no) |
| LV (1) | LV10508B (no) |
| NO (1) | NO300980B1 (no) |
| NZ (1) | NZ239652A (no) |
| PL (1) | PL167810B1 (no) |
| RU (1) | RU2062301C1 (no) |
| SK (1) | SK279686B6 (no) |
| YU (1) | YU147491A (no) |
| ZA (1) | ZA917008B (no) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6461834B1 (en) * | 1998-11-06 | 2002-10-08 | Bionebraska, Inc. | Clostripain catalyzed amidation of peptides |
| DE19915938A1 (de) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Aventis Pharma Gmbh | Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung |
| WO2003099847A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Restoragen, Inc. | Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides |
| CA2485695A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Fred W. Wagner | Method for universal enzymatic production of bioactive peptides |
| EP1572720A4 (en) * | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Nps Allelix Corp | PROCESS FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF GLP-2 (1-34) AND GLP-2 (1-33) PEPTIDES |
| PL1704234T3 (pl) * | 2003-11-21 | 2012-06-29 | Nps Pharma Inc | Wytwarzanie glukagonopodobnego peptydu 2 i analogów |
| WO2013015697A1 (en) * | 2011-07-28 | 2013-01-31 | Mabion S.A. | A recombinant protein, a polynucleotide encoding it as well as a method of obtaining insulin or its an analogue |
| KR102646845B1 (ko) * | 2018-08-08 | 2024-03-14 | 주식회사 대웅제약 | 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LU81606A1 (de) | 1979-08-14 | 1981-03-24 | Arbed | Verfahren und einrichtung zur wiederverwertung von kohlenstoffreichen abfallprodukten |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| EP0095691B1 (de) | 1982-05-27 | 1986-01-22 | Neiman S.A. | Zylinderschloss, insbesondere Lenkschloss für ein Kraftfahrzeug |
| JPS60217894A (ja) * | 1984-04-14 | 1985-10-31 | Suntory Ltd | 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 |
| DE3440988A1 (de) | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| CA1339955C (en) | 1986-10-14 | 1998-07-14 | Richard Eugene Heiney | Process for transforming a human insulin precursor to human insulin |
| DE4012818A1 (de) * | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| ATE101620T1 (de) | 1988-06-23 | 1994-03-15 | Hoechst Ag | Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung. |
| DE3919852A1 (de) * | 1988-06-23 | 1989-12-28 | Hoechst Ag | Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung |
| DE58909556D1 (de) | 1988-11-03 | 1996-02-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
| US5617606A (en) | 1996-02-29 | 1997-04-08 | Baracuda International Corp. | Fluted swimming pool cleaner discs |
-
1991
- 1991-09-03 NZ NZ239652A patent/NZ239652A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 FI FI914151A patent/FI103805B/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 KR KR1019910015314A patent/KR100188800B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 CZ CS912711A patent/CZ283234B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 IL IL9938391A patent/IL99383A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 SK SK2711-91A patent/SK279686B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 ZA ZA917008A patent/ZA917008B/xx unknown
- 1991-09-04 PL PL91291617A patent/PL167810B1/pl unknown
- 1991-09-04 IE IE311791A patent/IE75723B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 JP JP3223243A patent/JP3005335B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 DK DK91114934.2T patent/DK0474212T3/da active
- 1991-09-04 EP EP91114934A patent/EP0474212B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 ES ES91114934T patent/ES2095891T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 RU SU915001486A patent/RU2062301C1/ru active
- 1991-09-04 CA CA002050606A patent/CA2050606C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 NO NO913474A patent/NO300980B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 AU AU83567/91A patent/AU637254B2/en not_active Expired
- 1991-09-04 YU YU147491A patent/YU147491A/sh unknown
- 1991-09-04 DE DE59108392T patent/DE59108392D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 AT AT91114934T patent/ATE145922T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-05 HU HU912875A patent/HU214676B/hu unknown
-
1993
- 1993-05-05 LV LVP-93-288A patent/LV10508B/xx unknown
- 1993-06-25 LT LTIP712A patent/LT3328B/lt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-08 US US08/291,060 patent/US5728543A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 HR HRP-1474/91A patent/HRP940766A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-12-05 GR GR960403067T patent/GR3021909T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0150565B1 (ko) | 유전자 조환에 의한 사람 인슐린 전구체의 제조 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법 | |
| NO180379B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et vesentlig renset insulinderivat | |
| US5691169A (en) | Process for preparing a desired protein | |
| AU698872B2 (en) | Generation of human insulin | |
| RU2376379C2 (ru) | Способ получения инсулиновых соединений | |
| CN110498849A (zh) | 一种索玛鲁肽主肽链及其制备方法 | |
| CN109486800B (zh) | 一种新型赖氨酰肽链内切酶及其制备方法 | |
| NO300980B1 (no) | Fremgangsmåte for hydrolyse av aminosyrekjeden til preproinsulin | |
| US5565330A (en) | Method for removing N-terminal dipeptides from precursor polypeptides with dipeptidylaminopeptidase from Dictyostelium discoideum | |
| PT98859B (pt) | Processo enzimatico para a transformacao de preproinsulinas em insulinas | |
| NO326247B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av modent insulin eller et modent insulin derivat. | |
| US20120214963A1 (en) | Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs therefrom | |
| Okamoto et al. | An improved method for large-scale purification of recombinant human glucagon | |
| US20130210716A1 (en) | Lis-pro proinsulin compositions and methods of producing lis-pro insulin analogs therefrom | |
| EP2867250A2 (en) | Proinsulin with enhanced helper sequence | |
| KR19990016368A (ko) | 융합단백질을 이용한 인성장호르몬의 제조방법 | |
| DK166687B1 (da) | Enzymatisk fremgangsmaade til fremstilling af et oensket protein bortset fra humant vaeksthormon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |