HU214676B - Eljárás preproinzulinok enzimes átalakítására inzulinná - Google Patents
Eljárás preproinzulinok enzimes átalakítására inzulinná Download PDFInfo
- Publication number
- HU214676B HU214676B HU912875A HU287591A HU214676B HU 214676 B HU214676 B HU 214676B HU 912875 A HU912875 A HU 912875A HU 287591 A HU287591 A HU 287591A HU 214676 B HU214676 B HU 214676B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- amino acid
- clostripain
- peptide
- preproinsulin
- amino acids
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás (I) általánős képletű preprőinzűlinőkátalakítására inzűlinná. R1 jelentése n számú aminősav, és n értéke 0 vagy 1, R2 jelentése hidrőgénatőm vagy enzimesen lehasítható természetes aminősavvagy 2–30 aminősavcsőpőrtból álló peptid, amely C-terminálisőn Arg-csőpőrtőt hőrdőz, R3 jelentése hidrőxilcsőpőrt vagy természetes aminősav vagy 2–10aminősavból álló peptid, X jelentése L-arginin vagy 2–45 aminősavból álló peptid, amely C-terminálisán és N-terminálisán L-arginincsőpőrtőt hőrdőz, Y jelentése genetikailag kódőlható aminősav, Z jelentése genetikailag kódőlható aminősav, és A1–A20, valamint B2–B29 emberi inzűlin természetes vagy egy vagy többaminősavcsőpőrt kicserélésével módősítőtt aminősav-szekvenciát jelent.Az eljárásra jellemző, hőgy a preprőinzűlint klősztripain jelenlétébenhidrőlizálják, amikőr is a preprőinzűlin és a klősztripain közöttimennyiségi arányt (mg:egység) 1:0,01 és 1:1000 közötti értékre álítják be, majd kívánt esetben a preprőinzűlint karbőxipetidáz-Benzimmel (karbőxipeptidáz:klősztripain tömegarány = 1:1–10:1) amegfelelő inzűlinná alakítják. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás preproinzulinok átalakítására inzulinná.
Az inzulinok két polipeptidláncból állnak: a 21 aminosavmaradékból álló A-láncból és a 30 aminosavmaradékból álló B-láncból. Az A- és a B-lánc két diszulfid-híddal kapcsolódik egymáshoz; ezek az A7 és B7 helyzetű két ciszteincsoport, valamint az A20 és B19 helyzetű két ciszteincsoport között helyezkednek el. A6 és A111 között harmadik diszulfid-híd van jelen. Az állati és a humán inzulin a hasnyálmirigyben képződik preproinzulinok alakjában. Az emberi preproinzulin például 24 aminocsoportot tartalmazó prepeptidből és ezzel kapcsolódó, 86 aminosavcsoportot tartalmazó proinzulinból áll:
prepeptid-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, ahol C 31 csoportból álló aminosavlánc. A Langerhans féle szigetekből történő kiválasztás közben a prepeptid lehasad, így proinzulin képződik. Ezt követően a C-lánc proteolitikusan lehasad, így a hatásos emberi inzulin jön létre.
Géntechnológiai módszerek növekvő mértékben lehetővé teszik, hogy a preproinzulinokat mikroorganizmusokban fejezzük ki (347781 és 367163 sz. publikált európai szabadalmi bejelentés). A prepro-szekvenciákat általában kémiai és/vagy enzimes módszerrel hasítják le (3440988 sz. NSZK-beli szabadalmi leírás, 264250 sz. európai szabadalmi bejelentés). Ismert enzimes átalakítási módszerek a tripszinnel vagy a karboxipeptidáz-B enzimmel végzett hasításon alapulnak [Kemmler W. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 246 (1971), 6786-6791; 195691 sz. európai szabadalmi bejelentés, 89007 sz. európai szabadalmi leírás]. Ezen módszerek hátránya, hogy nagy mennyiségű melléktermék keletkezik, amely a reakcióoldatból csak nehezen választható el. Főleg emberi preproinzulin átalakítása emberi inzulinná (humán inzulin, Hl) nagyobb mennyiségű dez-Thr(30)-humán-inzulint [dez-Thr(B30)-HI-t] eredményez. Ez a melléktermék a humán inzulintól csak a terminális Hírcsoport hiányában különbözik, és a reakcióoldatból nagyon nehezen választható el.
E melléktermék képződésének visszaszorítása érdekében bizonyos nehézfémsókat, főleg nikkelsókat adagolnak a bontási reakcióelegybe (264250 sz. európai szabadalmi bejelentés). Ez a módszer azonban ipari megvalósításra nem alkalmas, tekintettel a szennyvíz nemkívánatos nehézfém-terhelésére. Ezért igény van olyan eljárás iránt, amellyel preproinzulinok lehetőleg fajlagosan és környezetkímélőén alakíthatók át.
A klosztripain (klosztriopeptidáz B; EC 3.4.22.8): Clostridium histolyticum tenyészlé szűrletéből nyert, 30000-80000 móltömegű enzim, amelynek proteolitikus aktivitása is, amidáz-észtaráz aktivitása is van (Mitchell, W. M., Harrington, W. F., J. of Bioi. Chem., 243 [(18), 46834692 (1968)]. Az enzim nagyon fajlagos Arg-C-kötésekre. így az inzulin B-láncában az Arg-Glykötést 500-szor olyan gyorsan bontja, mint a Lys-Alakötést, és glükagonban csak az Arg-Arg-, Arg-Ala- és Lys-Tyr-kötéseket bontja. E kötések bontásának sebessége 1: 1/7. 1/300 értékben aránylik egymáshoz (Labouresse, B., Bull. Soc. Chim. Bioi., 42,1293,1960).
Meglepő módon azt találtuk, hogy klosztripain a preproinzulint fajlagosan a C-végén, az arginin mögött bontja anélkül, hogy a B-láncban lévő arginin (B22) mögött számottevő bontás következne be az aminosavláncban.
A találmány tárgya tehát eljárás (I) általános képletű preproinzulinok aminosavláncának hidrolízisére - az (I) általános képletben
R1 jelentése n számú aminosav, és n értéke 0 vagy 1,
R2 jelentése hidrogénatom vagy enzimesen lehasítható természetes aminosav vagy 2-30 aminosavcsoportból álló peptid, amely C-terminálisan Argcsoportot hordoz,
R3 jelentése hidroxilcsoport vagy természetes aminosav vagy 2-10 aminosavból álló peptid,
X jelentése L-arginin vagy 2—45 aminosavból álló peptid, amely C-terminálisán és N-terminálisán Larginincsoportot hordoz,
Y jelentése genetikailag kódolható aminosav,
Z jelentése genetikailag kódolható aminosav, és A1-A20, valamint B2-B29 emberi inzulin természetes vagy egy vagy több aminosavcsoport kicserélésével módosított aminosav-szekvenciát jelent.
Az eljárásra jellemző, hogy a preproinzulint klosztripain jelenlétében hidrolizáljuk, amikor is a preproinzulin és a klosztripain közötti mennyiségi arányt (mg. egység) 1:0,01 és 1:1000 közötti értékre állítjuk be, majd kívánt esetben a proinzulint karboxipeptidáz-B enzimmel (karboxipeptidáz: klosztripain tömegarány = 1:1-10:1) a megfelelő inzulinná alakítjuk.
A peptidek és proteinek aminosav-szekvenciáját az aminosavlánc N-terminális végétől kezdve jelöljük. A proteázok a peptidek és proteinek aminosavai közötti kötéseket hidrolizálják. Klosztripain az L-arginint tartalmazó peptideket és proteineket fajlagosan az arginin mögött hidrolizálja. A preproinzulin hidrolízisének reakciótermékeiként C-terminálisan arginincsoportot hordozó inzulinszármazékok vagy polipeptidek vagy pedig aminosavak keletkeznek.
Természetes aminosavakon például az alábbiakat értjük: Gly, Alá, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Trp, Arg, Lys, Hyl, Om, Cit vagy His.
Genetikailag kódolható aminosavakon például az alábbiakat értjük: Gly, Alá, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro vagy szelenocisztein.
Előnyben részesítjük az olyan (I) általános képletű preproinzulinokat, amelyekben R* jelentése Phe,
R2 jelentése hidrogénatom, természetes aminosav vagy olyan peptid, amely 2-30 természetes aminosavból áll és C-terminális vége L-arginincsoport,
R3 jelentése hidroxilcsoport, természetes aminosav vagy 2-10 természetes aminosavból álló peptid,
X jelentése L-arginin vagy emberi proinzulin C-lánca,
Y jelentése Thr, Alá vagy Ser,
Z jelentése Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Alá vagy Met, és
HU 214 676 Β
A1-A20, valamint B2-B29 emberi inzulin aminosav szekvenciáját jelenti.
Különösen előnyösek az olyan (I) általános képletű preproinzulinok, amelyekben R1 jelentése Phe,
R2 jelentése hidrogénatom vagy olyan peptid, amely
2-30 természetes aminosavból áll és C-terminális vége L-arginincsoport,
R3 jelentése hidroxilcsoport, természetes aminosav vagy 2-10 természetes aminosavból álló peptid,
X jelentése L-arginin vagy humán, sertés- vagy szarvasmarha-proinzulin C-lánca,
Y jelentése Thr,
Z jelentése Asn,
A1-A20 és B2-B29 humáninzulin aminosav-szekvenciáját jelenti.
A legelőnyösebbek azok az inzulinok, amelyeket a P 3919852 és a P 4012818.0 sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentés ismertet, például az alábbi aminosav-szekvenciájú Inzu-Arg:
NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Alá Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly He Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH.
Klosztripain (EC 3.4.22.8) Clostridiumokból származó extracelluláris tiolproteáz. Az enzim heterodimér szerkezetű, az ismert tiolproteázokkal semmilyen homológiát nem mutat. Fajlagossága az Arg-XXX-kötésekre, különösen Arg-Pro-kötésekre rendhagyóan nagy, móltömege 30000 és 80000 közötti, izoelektromos pontja pH 4,8 és 4,9 között van. Aktivátorként hatnak rá például cisztein, merkaptoetanol, ditiotreitol és kalciumionok.
T ozil-L-lizin-klór-metilketon, hidrogén-peroxid, EDTA, Co2+-, Cu2+-, Cd2+-ionok vagy citrát jelenlétében a klostripain gátolt.
A klosztripaint mikroorganizmusok segítségével, fermentáció útján állítják elő úgy, hogy Clostridiumot tenyésztenek, míg a klosztripain a tápközegben fel nem dúsul. Alkalmas például Clostridium histolyticum, különösen a Clostridium histolyticum DSM 627 sz. törzs. A megnevezett mikroorganizmusok mutánsai és variánsai is alkalmasak, amennyiben klosztripaint termelnek.
A tenyésztés anaerob körülmények között, tiszta vagy vegyes kultúrában, például süllyesztett, álló tenyészetben, oxigén távollétében, vagy farmentorokban, adott esetben nitrogéngáz, nemes gázok vagy egyéb gázok (oxigént kivéve) bevezetése mellett történik. A fermentálás hőmérséklete kb. 10-45 °C, előnyösen kb. 25-40 °C, különösen előnyösen 30-38 °C. A fermentálás 5-8,5 közötti, előnyösen 5,5 és 8 közötti pH-érték mellett történik. E között a körülmények között az enzim általában 1-3 nap elteltével kezd feldúsulni a tenyészlében. A klosztripain szintézise a késői logfázisban kezdődik, maximumát az stacionáris növekedés fázisában éri el. Az enzim termelése aktivitási tesztekkel nyomon követhető [Mitchell W., Meth. of Enzym., 47. köt. (1977), 165-170. oldal].
A klosztripain termeléséhez használt tápoldat 0,2-6%, előnyösen 0,5-3% szerves nitrogénvegyületeket, valamint ásványi sókat tartalmaz. Szerves nitrogénvegyületként az alábbiak jönnek számításba: aminosavak, peptonok, húskivonatok, darált magvak, például kukorica, búza, bab, szója vagy gyapotmagvak, az alkoholtermelés desztillációs maradékai, húsliszt vagy élesztőkivonat. Szervetlen sóként a tápoldat például az alkálifémek vagy alkáliföldfémek, vas, cink és mangán kloridjait, karbonátjait, szulfátjait vagy foszfátjait, de ammóniumsókat és nitrátokat is tartalmazhat.
A fermentálás optimális körülményei mikroorganizmusonként el-eltémek ugyan, de szakember vagy ismeri, vagy könnyű elókísérletekkel megállapíthatja. A klosztripain tisztítása klasszikus eljárással, például ammónium-szulfátos kicsapással, vagy ioncserélővagy gélpermeaciós kromatográfiával lehetséges. Az enzim ismert módon rögzíthető (Colowick és Káplán, Meth. Enzymol., Vol. XLIV).
Az enzimes reakcióhoz vagy teljes sejtek, szabad vagy immobilizált formában, vagy az elkülönített enzimtennék, adott esetben hordozóhoz rögzítve, alkalmazható.
Az (I) általános képletű preproinzulinokat vizes közegben bontjuk klosztripainnal. A vizes közeg vízzel elegyedő szerves alkotókat, például alkoholokat, ketonokat, karbamidot, Ν,Ν-dimetil-formamidot is tartalmazhat. A pH-érték jobb kézbentartása érdekében előnyösen megfelelő szerves vagy szervetlen puffért (foszfát, trisz, glicin, HEPES stb.) adagolhatunk. A bontási reakció alatt a preproinzulin koncentrációja például 0,01 mg/1-100 mg/1, előnyösen 0,1 mg/1-10 mg/1. A preproinzulin: klosztripain arány (mg: egységek) 1:0,01-1:1000, előnyösen 1:0,1-1:50.
A reagáltatás hőmérsékletét széles tartományon belül változtathatjuk. Előnyösen 0 °C és +80 °C közötti, különösen +20 °C és +40 °C közötti hőmérsékleten végezzük az enzimes hidrolízist.
A reakcióelegy pH-értéke 4 és 12 között lehet, a pH 6 és pH 9 közötti tartományt előnyben részesítjük.
Az idő, amely alatt a preproinzulin átalakul a megfelelő inzulinná, a reakciókörülményektől függően széles tartományban változhat, például 15 perc és 48 óra között lehet. A reakció előnyösen 1-6 órát vesz igénybe.
Alkalmazás előtt az enzimet merkaptán jelenlétében megfelelően aktiváljuk. Merkaptánként elvileg minden, SH-csoportot tartalmazó vegyületet alkalmazhatunk. Előnyös a DTT, DTE, merkaptoetanol, tioglikolsav vagy cisztein alkalmazása. A merkaptán koncentrációja széles tartományon belül változhat, előnyös a 0,1 mM és lOOmM közötti koncentráció. Az aktiváló puffer továbbá Ca++-ionokat tartalmaz. Az aktiválás 4 és 12 közötti, előnyösen 6 és e közötti, különösen előnyösen 7 és e közötti pH érték mellett történik. A pH-érték fenntartása érdekében alkalmas pufferanyag, például trisz, HEPES, glicin stb. lehet jelen. Az aktiválás hőmérséklete lehet 0 °C és 60 °C közötti, előnyös a 0 °C és 10 °C közötti, különösen előnyös a 0 °C és 5 °C közötti tartomány.Az így aktivált enzimet közvetlenül is felhasználhatjuk, de kívánt eset3
HU 214 676 Β ben Ultrogél AcA 202 gélen kromatografálva a pufféitól megszabadíthatjuk.
Az (I) általános képletű preproinzulinok találmány szerinti bontása az inzulin C-terminális végén Larginincsoportot tartalmazó inzulin-származékokhoz és a megfelelő lehasított aminosavakhoz és/vagy peptidekhez vezet. Az inzulinszármazékot kívánt esetben karboxipeptidáz B enzimmel a megfelelő inzulinná alakíthatjuk. Ez történhet ugyanabban a reakcióelegyben, a klosztripainos reakcióval egyidejűleg, de - a fenti reakciókörülmények között - utána is, ez esetben az inzulin-származékot ismert módon, például kromatográfiás módszerrel vagy kristályosítással elkülönítjük. A karboxipeptidáz B enzimet oldott vagy immobilizált formában alkalmazhatjuk. A karboxipeptidáz B és az inzulin-származék tömegaránya kb. 1:10-1:5000, előnyösen mintegy 1:500-1:3500 és különösen előnyösen 1:1000-1:3000. A karboxipeptidáz B és a klosztripain közötti tömegarány kb. 1:1-10:1, előnyösen kb. 2:1-5:1.
A klosztripainnal és/vagy karboxipeptidáz B enzimmel végzett bontás reakciótermékeit például a pH-érték csökkentésével kicsaphatjuk, és/vagy ismert oszlopkromatográfiás módszerrel tisztíthatjuk. A kapott inzulint a szokásos gyógyászati készítményekké alakíthatjuk és a Diabetes mellitus kezelésére alkalmazhatjuk.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. A százalékos adatok, ha mást nem kötünk ki, tömegszázalékokra vonatkoznak.
1. példa
A Clostridium histolyticum DSM 627 törzset az alábbi összetételű tápoldatban tenyésztjük:
| kazeinpepton | 3% |
| húskivonat | 3% |
| élszetőkivonat | 0,5% |
| cisztein | 0,05% |
| KH2PO4 | 0,15% |
| PH | 7,2 |
| Az előtenyészetet 1% oltókultúrával beoltjuk. A te- |
nyésztés zárt üvegedényekben anaerob körülmények között történik 37 °C-on, kb. 2 napon keresztül. A mikroorganizmus törzs fenntartásához a fenti tápoldat és glicerin 1:1 arányú elegyét használjuk, a törzset -20 °C-on tároljuk. 10 literes fermentort, amely 8 liter tápoldatot tartalmaz, 1% előtenyészettel beoltunk. A fermentálás nitrogéngáz bevezetése mellett, 33 °Con, állandó 7,0 pH érték mellett történik. 24 óra elteltével a tenyészet szűrletében 20 000 egység/l enzimaktivitás mutatható ki (Mitchell W., Meth. of Enzym., 47. köt., 165-170. old., 1977).
A feldolgozás során a sejteket kb. 6000 g gyorsulás mellett lecentrifugáljuk, a szűrletet 0,22 pm pórusméretű szűrőn át sterilre szüljük, és 60% jéghideg (-20 °Cos) metanolt adunk a szűrlethez. Az oldatot -20 °C-on 24 órán át állni hagyjuk, majd centrifugáljuk (8000 g). A szilárd anyagot kétszer desztillált steril vízben feloldjuk, majd újból centrifugáljuk (12000 g). A maradék aktivitása 300 E/ml, azaz 200 E/mg protein. A hozam a farmentorban mért aktivitás 75%-a volt.
| 2. példa | |
| A sejtek tenyésztése az 1. | példa szerint történik. |
| A farmentorba adagolt termelési közeg összetétele az | |
| alábbi: | |
| proteáz pepton (Difco) | 5% |
| cisztein | 0,05% |
| KH2504 | 0,15% |
| PH | 7,2 |
és 2% előtenyészettel oltjuk be. A klosztripain aktivitása 45 000 E/ml szűrt tenyészlé.
A sejtek eltávolítására tangential-flow szűrést végzünk 0,3 pm-es membránokon (Filtron, Omega Membrán). Az oldott klosztripaint 10 KD membránon (Filtron, Omega Membrán) végzett tangential-flow szűréssel feldúsítjuk. A dúsítási tényező 20. A kapott koncentrátumot sómentesítjük és DEAE-cellulózon kromatografáljuk. Klosztripain aktivitás 1000 E/ml; hozam: 85%. Felhasználásáig az enzimet -20 °C-on tároljuk.
3. példa
A) klosztripain aktiválása pl enzimkészítmény (200 E/ml, 286 E/mg, 1. példa) pl aktiváló puffer (250 mM DTT, 125 mM CaCl)
A reakcióelegyben a koncentrációk
DTT 5 mM
CaCl 2,5 mM.
Az enzimoldatot jégen 2 órán át inkubáljuk. A bontási reakcióhoz az enzimet 1:40 arányban 25 mM-os, 7,8 ph-jú trisz/HCl-pufferrel hígítjuk.
B) A (B31)Arg-inzulin felszabadításához alkalmazott reakcióelegy összetétele:
100 pl Inzu-Arg (1 mg/ml) pl Kel (1 M) pl trisz/HCl (1 M, pH 7,8) pl H2O pl klosztripain (1:40-szeres hígítás).
Az elegyet 28 °C-on 1-2 órán át inkubáljuk, a reakciót nagy nyomású folyadék kromatográfiával követjük. Utána a reakciót tozil-L-lizin-klórmetil-keton (TLCK) adagolásával megszakítjuk (1 ml 15 mM-os TLCK). Utána az elegyet 4 °C-on tároljuk.
Eredmény: humán inzulin-Arg. HPLC-val humán inzulin(dez B30)-képződés nem mutatható ki.
C) Humán inzulin felszabadítása karboxipeptidáz B enzimmel
200 pia klosztripainos elegyből 10 pl karboxipeptidáz B (l:100-szoros hígításban)
A karboxipeptidáz B koncentrációja így 2,5 pg/ml. Az alkalmazott karboxipeptidáz B enzim sertés hasnyálmirigyből származik, aktivitása 759 E/ml (150 E/mg), és alkalmazás előtt 25 mM-os, 7,8 pH-jú trisz/HCl-pufferrel 1:1000 arányban hígítjuk. Az elegyet 28 °C-on 2-4 órán át inkubáljuk, a reakciót HPLC-val követjük.
Eredmény: humán inzulin, inzulin(dez B30)-képződés HPLC-val nem mutatható ki.
D) Az alkalmazott HPLC-rendszer
HU 214 676 Β
RP 18 oszlop (0,125 M NH4(S04)2, kénsawal pH
4-re állítva, 25-50% acetonitril gradiens), illetve C 8 oszlop (0,1% TFA, 20-50% acetonitril gradiens).
4. példa
Klosztripain: 200 E/ml (az 1. példa szerinti)
Aktiváló puffer: 500 mM trisz/HCI, pH 7,8 lOOmMDTT 25 mM CaCl2
Aktiválás: 100 μΐ klostripain-oldat μΐ aktiválópuffer
Hajtogatási elegy összetétele:
35,7 mg emberi pre-B-lánc-A-láncinzulin-S-szulfonát 315 μΐ 1M merkapto-etanol 105 μΐ 1M aszkorbinsav 100 ml 20 mM glicinpuffer, pH 10,7
A hajtogatás éjjel 4° C-on a hűtőben történik, a hajtogatás hozama 0,152 mg/ml. A szennyeződéseket pH 5,0 mellett végzett pH-kicsapással eltávolítjuk, utána trisz-puffert adagolunk 50 mM végső koncentrációig. A pH-értéket 7,8-re állítjuk. 30 μΐ enzim-oldatot adagolunk. A bontást 30 °C-on végezzük, HPLC-val ellenőrizzük.
Eredmény: a fenti preproinzulin emberi inzulin-Arg termékké bontható. Az inzulin(dez B30)-képződés minimális.
Claims (7)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás (I) általános képletű preproinzulinok aminosavláncának hidrolízisére - az (I) általános képletbenR1 jelentése n számú aminosav, és n értéke 0 vagy 1,R2 jelentése hidrogénatom vagy enzimesen lehasítható természetes aminosav vagy 2-30 aminosavcsoportból álló peptid, amely C-terminálisan Alcsoportot hordoz,R3 jelentése hidroxilcsoport vagy természetes aminosav vagy 2-10 aminosavból álló peptid,X jelentése L-arginin vagy 2—45 aminosavból álló peptid, amely C-terminálisán és N-terminálisán Larginincsoportot hordoz,Y jelentése genetikailag kódolható aminosav,Z jelentése genetikailag kódolható aminosav, és A1-A20, valamint B2-B29 emberi inzulin természetes vagy egy vagy több aminosavcsoport kicserélésével módosított aminosav-szekvenciát jelent azzal jellemezve, hogy a preproinzulint klosztripain jelenlétében hidrolizáljuk, amikor is a preproinzulin és a klosztripain közötti mennyiségi tömegarányt (mg. egység) 1:0,01 és 1:1000 közötti értékre állítjuk be, majd kívánt esetben a preproinzulint karboxipeptidáz-B enzimmel (karboxipeptidáz. klosztripain tömegarány = 1:1-10:1) a megfelelő inzulinná alakítjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, amelynek során olyan (I) általános képletű preproinzulinból indulunk ki, amelybenR1 jelentése Phe,R2 jelentése hidrogénatom, természetes aminosav vagy olyan peptid, amely 2-30 természetes aminosavból áll és C-terminális vége L-arginincsoport,R3 jelentése hidroxilcsoport, természetes aminosav vagy 2-10 természetes aminosavból álló peptid,X jelentése L-arginin vagy emberi proinzulin C-lánca,Y jelentése Thr, Alá vagy Ser,Z jelentése Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Alá vagy Met, ésA1-A20 és B2-B29 emberi inzulin aminosavszekvenciáját jelenti, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypontban megadottak szerint járunk el.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, amelynek során olyan (I) általános képletű preproinzulinból indulunk ki, amelyben,R1 jelentése Phe,R2 jelentése hidrogénatom vagy olyan peptid, amely2-30 természetes aminosavból áll és C-terminális vége L-arginincsoport,R3 jelentése hidroxil-csoport, természetes aminosav vagy 2-10 természetes aminosavból álló peptid,X jelentése L-arginin vagy humán proinzulin C-lánca,Y jelentése Thr,Z jelentése Asn,A1-A20 és B2-B29 humán inzulin aminosav-szekvenciáját jelenti, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypontban megadottak szerint járunk el.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 4 és 12 közötti, előnyösen 6 és 9 közötti pH érték mellett végezzük az enzimes hidrolízist.
- 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű preproinzulin koncentrációját 0,01 mg/ml és 100 mg/ml, előnyösen 0,1 mg/ml és 10 mg/ml közötti értékre állítjuk be.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0 és 80 °C közötti, előnyösen 20 és 40° C közötti hőmérsékleten végezzük az enzimes hidrolízist.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a klosztripaint és/vagy a karboxipeptidáz B enzimet immobilizált formában alkalmazzuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4028118 | 1990-09-05 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU912875D0 HU912875D0 (en) | 1992-01-28 |
| HUT58823A HUT58823A (en) | 1992-03-30 |
| HU214676B true HU214676B (hu) | 1998-04-28 |
Family
ID=6413629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU912875A HU214676B (hu) | 1990-09-05 | 1991-09-05 | Eljárás preproinzulinok enzimes átalakítására inzulinná |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5728543A (hu) |
| EP (1) | EP0474212B1 (hu) |
| JP (1) | JP3005335B2 (hu) |
| KR (1) | KR100188800B1 (hu) |
| AT (1) | ATE145922T1 (hu) |
| AU (1) | AU637254B2 (hu) |
| CA (1) | CA2050606C (hu) |
| CZ (1) | CZ283234B6 (hu) |
| DE (1) | DE59108392D1 (hu) |
| DK (1) | DK0474212T3 (hu) |
| ES (1) | ES2095891T3 (hu) |
| FI (1) | FI103805B1 (hu) |
| GR (1) | GR3021909T3 (hu) |
| HR (1) | HRP940766A2 (hu) |
| HU (1) | HU214676B (hu) |
| IE (1) | IE75723B1 (hu) |
| IL (1) | IL99383A (hu) |
| LT (1) | LT3328B (hu) |
| LV (1) | LV10508B (hu) |
| NO (1) | NO300980B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ239652A (hu) |
| PL (1) | PL167810B1 (hu) |
| RU (1) | RU2062301C1 (hu) |
| SK (1) | SK279686B6 (hu) |
| YU (1) | YU147491A (hu) |
| ZA (1) | ZA917008B (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6461834B1 (en) | 1998-11-06 | 2002-10-08 | Bionebraska, Inc. | Clostripain catalyzed amidation of peptides |
| DE19915938A1 (de) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Aventis Pharma Gmbh | Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung |
| WO2003099847A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Restoragen, Inc. | Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides |
| EP1513945A4 (en) * | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Restoragen Inc | PROCESS FOR UNIVERSAL ENZYMATIC PRODUCTION OF BIOACTIVE PEPTIDES |
| WO2003099854A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
| SI1704234T1 (sl) * | 2003-11-21 | 2012-08-31 | Nps Pharma Inc | Proizvodnja glukagonu podobnih peptidov 2 in analogov |
| WO2013015697A1 (en) * | 2011-07-28 | 2013-01-31 | Mabion S.A. | A recombinant protein, a polynucleotide encoding it as well as a method of obtaining insulin or its an analogue |
| KR102646845B1 (ko) * | 2018-08-08 | 2024-03-14 | 주식회사 대웅제약 | 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LU81606A1 (de) | 1979-08-14 | 1981-03-24 | Arbed | Verfahren und einrichtung zur wiederverwertung von kohlenstoffreichen abfallprodukten |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| US4581909A (en) | 1982-05-27 | 1986-04-15 | Neiman S.A. | Cylinder lock, particularly a steering-wheel lock for a motor vehicle |
| JPS60217894A (ja) * | 1984-04-14 | 1985-10-31 | Suntory Ltd | 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 |
| DE3440988A1 (de) | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| IL84110A (en) | 1986-10-14 | 1992-11-15 | Lilly Co Eli | Process for transforming a human insulin precursor to a human insulin |
| DE4012818A1 (de) * | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| DE3919852A1 (de) * | 1988-06-23 | 1989-12-28 | Hoechst Ag | Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung |
| DE58906966D1 (de) | 1988-06-23 | 1994-03-24 | Hoechst Ag | Mini-Proinsulin, seine Herstellung und Verwendung. |
| ES2081826T3 (es) | 1988-11-03 | 1996-03-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos. |
| US5617606A (en) | 1996-02-29 | 1997-04-08 | Baracuda International Corp. | Fluted swimming pool cleaner discs |
-
1991
- 1991-09-03 NZ NZ239652A patent/NZ239652A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 FI FI914151A patent/FI103805B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 CZ CS912711A patent/CZ283234B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 IL IL9938391A patent/IL99383A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 SK SK2711-91A patent/SK279686B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 KR KR1019910015314A patent/KR100188800B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 YU YU147491A patent/YU147491A/sh unknown
- 1991-09-04 DK DK91114934.2T patent/DK0474212T3/da active
- 1991-09-04 AT AT91114934T patent/ATE145922T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 EP EP91114934A patent/EP0474212B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 ZA ZA917008A patent/ZA917008B/xx unknown
- 1991-09-04 ES ES91114934T patent/ES2095891T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 NO NO913474A patent/NO300980B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 RU SU915001486A patent/RU2062301C1/ru active
- 1991-09-04 JP JP3223243A patent/JP3005335B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 DE DE59108392T patent/DE59108392D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 IE IE311791A patent/IE75723B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 AU AU83567/91A patent/AU637254B2/en not_active Expired
- 1991-09-04 PL PL91291617A patent/PL167810B1/pl unknown
- 1991-09-04 CA CA002050606A patent/CA2050606C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-05 HU HU912875A patent/HU214676B/hu unknown
-
1993
- 1993-05-05 LV LVP-93-288A patent/LV10508B/xx unknown
- 1993-06-25 LT LTIP712A patent/LT3328B/lt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-08 US US08/291,060 patent/US5728543A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 HR HRP-1474/91A patent/HRP940766A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-12-05 GR GR960403067T patent/GR3021909T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0020290B1 (de) | Verfahren zur spezifischen Abspaltung von Proteinsequenzen aus Proteinen | |
| KR0150565B1 (ko) | 유전자 조환에 의한 사람 인슐린 전구체의 제조 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법 | |
| US5512459A (en) | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides | |
| NO180379B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et vesentlig renset insulinderivat | |
| CN100424179C (zh) | 制备胰岛素化合物的方法 | |
| KITAGAWA et al. | Amino Acid Sequence of Copper, Zinc-Superoxide Dimutase from Spinach Leaves | |
| HU214676B (hu) | Eljárás preproinzulinok enzimes átalakítására inzulinná | |
| KR100291528B1 (ko) | 딕티오스텔륨 디펩티딜아미노펩티다아제 | |
| KR20010099668A (ko) | 펩타이드의 효소적 아미드화 | |
| AU618035B2 (en) | A method for the selective cleavage of fusion proteins | |
| US5190875A (en) | Peptide amidase and the use thereof | |
| PT98859B (pt) | Processo enzimatico para a transformacao de preproinsulinas em insulinas | |
| Inoue et al. | Heterologous expression and site‐directed mutagenesis studies on the activation mechanism and the roles of the basic residues in the prosegment of aspergillopepsinogen I | |
| Okamoto et al. | An improved method for large-scale purification of recombinant human glucagon | |
| Davey et al. | Trypsin‐mediated semisynthesis of salmon calcitonin | |
| CN114181993A (zh) | 产生基于类泛素或泛素蛋白的生化工具的方法 | |
| JP2005065556A (ja) | 新規なセリンプロテアーゼ | |
| JPS6244920B2 (hu) | ||
| JPH0654684A (ja) | リパーゼ | |
| JPH10243797A (ja) | 新規プロテアーゼインヒビター及びその製造方法 | |
| NO163531B (no) | Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. | |
| DE3012170A1 (de) | Verfahren zur spezifischen abspaltung von prolin-haltigen dipeptidsequenzen aus proteinen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GMBH, DE |