PL167810B1 - Sposób enzymatycznej hydrolizy lancucha aminokwasu przedproinsuliny PL PL - Google Patents
Sposób enzymatycznej hydrolizy lancucha aminokwasu przedproinsuliny PL PLInfo
- Publication number
- PL167810B1 PL167810B1 PL91291617A PL29161791A PL167810B1 PL 167810 B1 PL167810 B1 PL 167810B1 PL 91291617 A PL91291617 A PL 91291617A PL 29161791 A PL29161791 A PL 29161791A PL 167810 B1 PL167810 B1 PL 167810B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- amino acid
- peptide
- arginine
- amino acids
- human
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
I. Sposób enzymatycznej hydrolizy lancucha aminokwasu przedproinsuliny o wzorze przedstawio- nym na rysunku, w którym R 1 oznacza n aminokwa- sów, przy czym n oznacza liczbe calkowita 0 albo 1, R oznacza wodór, dajacy sie odszczepic chemicznie albo enzymatycznie aminokwas albo peptyd o 2 do 30 resztach aminokwasowych, R 3 oznacza grupe hydro- ksylowa, aminokwas albo peptyd o 2 do 10 aminokwa- sach, X oznacza L-arginine albo peptyd o 2 do 45 aminokwasach, przy którym C-krancowo i N-kranco- wo stoi reszta L-argininy, Y oznacza dajacy sie kodo- wac genetycznie aminokwas, Z oznacza dajacy sie kodowac genetycznie aminokwas, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza naturalna albo zmieniona przez wy- miane jednej albo kilku reszt aminokwasowych se- kwencje aminokwasu ludzkich albo zwierzecych insulin, znam ienny tym , ze jako enzym stosuje sie Clostripain. WZÓR PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest enzymatyczny sposób przemiany przedproinsulin w insuliny przez hydrolizę łańcucha aminokwasu przedproinsuliny.
Insuliny składają się z dwóch łańcuchów polipeptydowych, łańcucha A, który zawiera 21 reszt aminokwasowych i łańcucha B o 30 resztach aminokwasowych. Łańcuchy A i B są połączone ze sobą przez dwa mostki dwusiarczkowe, przy czym reszty cysteiny są połączone ze sobą w pozycji a7 i B7 oraz A20 i B19. Trzeci mostek dwusiarczkowy istnieje między A6 i A11. Zwierzęce i ludzkie insuliny tworzą się w trzustkach w postaci przedproinsulin. Ludzka przedproinsulina składa się np. z przedpeptydu o 24 resztach aminokwasowych, przy czym
167 810 bezpośrednio stoi proinsulina o 86 resztach aminokwasowych o następującej konfiguracji: przedpeptyd-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, przy czym C oznacza Łańcuch aminokwasu o 31 resztach. Podczas wydalania z wysepek trzustkowych (Langerhansa) przedpeptyd zostaje oddzielony i powstaje proinsulina. Następnie zostaje rozszczepiony proteolitycznie łańcuch C i · powstaje czynna insulina ludzka.
Metody inżynierii genetycznej pozwalają w rosnącej mierze na ekspresję przedproinsulin w mikroorganizmach (opis patentowy EP-A nr 347 781, opis patentowy eP-A nr 367 163). Odszczepianie przedprosekwencji następuje z reguły chemicznie albo enzymatycznie (opis patentowy DE-P nr 3 440 988, opis patentowy EP-A nr 026 4250). Znane enzymatyczne metody przemiany polegają na rozszczepianiu za pomocą trypsyny i karboksypeptydazy B (Kemmber W. et al. J.Biol.Chem., 246 (1971) 6786-6791; opis patentowy EP-A nr 195 691; opis patentowy EP-B nr 89007. Wadą tej metody jest powstawanie dużych ilości produktów ubocznych, które tylko z trudem trzeba oddzielić z roztworu reakcyjnego. Szczególnie przy przemianie ludzkiej przedproinsuliny w insulinę ludzką (Humaninnsulin, HI) powstają większe ilości insuliny ludzkiej Des-Thr(B30) (Des-Thr(B30)-HI). Ten produkt uboczny odróżnia się od HI tylko przez brak stojącego na końcu aminokwasu i jest bardzo trudny do oddzielania z roztworów reakcyjnych.
W celu uniknięcia tego tworzenia produktu ubocznego można dodawać określone metale ciężkie, w szczególności nikiel, do zestawu rozszczepiania (opis patentowy EP-A nr 0264 250). Tego rodzaju prowadzenie reakcji nie jest pożądane z wieloprzemysłowego punktu widzenia ze względu na wysokie obciążenia ścieków metalami ciężkimi. Występuje dlatego zapotrzebowanie na możliwie specyficzną i znośną dla środowiska przemianę przedproinsulin.
Clostripain (clostripeptydaza B; EC 3.4.22.8) jest enzymem z przesączu hodowli Clostridium histolyticum o masie cząsteczkowej około 30 000 do 80 000, który wykazuje zarówno aktywność proteolitycznąjak również aktywność amidazy-esterazy (Mitchell, W.M. Harrington, W.F., J.of Biol.Chem., 243 (18), 4683-4692, 1968). Odznacza się on wysoką specyficznością dla wiązań Arg-C. Tak w wyodrębnionym łańcuchu B insuliny wiązanie Arg-Gly jest rozszczepiane przez Clostripain 500-krotnie szybciej niż wiązanie Lys-Ala i w glukagonie zostają rozszczepione tylko Arg-Arg, Arg-Ala i Lys-Tyr. Szybkości hydrolizy dla tych wiązań stoją w stosunku 1, 1Π i 1/300 do siebie (Labouesse, B., Bull.Soc. Chim.Biol., 42, 1293, 1960).
Nieoczekiwanie obecnie znaleziono, że Clostripain (klostripaina) rozszczepia przedproinsulinę specyficznie C-końcowo za argininą, bez wystąpienia za znajdującą się w łańcuchu B argininą (B22) znaczniejszego rozszczepiania łańcucha aminokwasu.
Wynalazek dotyczy zatem sposobu hydrolizy łańcucha aminokwasu przedproinsuliny o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, w którym R1 oznacza n aminokwasów, przy czym n oznacza liczbę całkowitą 0 albo 1, R2 oznacza wodór, dający się odszczepić chemicznie albo enzymatycznie aminokwas albo peptyd o 2 do 30 resztach aminokwasowych, R3 oznacza grupę hydroksylową, aminokwas albo peptyd 2 do 10 aminokwasach, X oznacza L-argininę albo peptyd o 2 do 45 aminokwasach, przy którym C-końcowo i N-końcowo stoi reszta L-argininy, Y oznacza dający się kodować genetycznie aminokwas, Z oznacza dający się kodować genetycznie aminokwas, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza natuaralną albo zmienioną przez wymianę jednej albo kilku reszt aminokwasowych sekwencję aminokwasu ludzkich albo zwierzęcych insulin, który charakteryzuje się tym, że jako enzym stosuje się Clostripain.
Sekwencję aminokwasu peptydów i protein określa się od N-krańcowego końca łańcucha aminokwasu. Proteazy hydrolizują wiązanie peptydowe między aminokwasami peptydów i protein. Clostripain hydrolizuje zawierające L-argininę peptydy albo proteiny specyficznie za argininą. Jako produkty reakcji hydrolizy przedproinsuliny powstają pochodne insuliny albo polipeptydy, które mają C-końcowo resztę argininy, albo aminokwasy.
Pod pojęciem naturalne aminokwasy rozumie się np. Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Trp, Arg, Lys Hyl, Orn, Cit albo His.
Dla pojęcia dający się kodować genetycznie aminokwas są np. Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro albo selenocysteina.
Korzystne są przedproinsuliny o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, w którym R1 oznacza Phe, r2 oznacza wodór, naturalny aminokwas albo peptyd o 2 do 30
167 810 naturalnych aminokwasach, który kończy się C-krańcowo L-argininą, R3 oznacza grupę hydroksylową, naturalny aminokwas albo peptyd o 2 do 10 naturalnych aminokwasach, X oznacza L-argininę albo C-Łańcuch ludzkiej albo zwierzęcej proinsuliny, Y oznacza aminokwas z grupy Thr, Ala albo Ser, Z oznacza aminokwas z grupy Asn, Gln, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala albo Met, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza sekwencję aminokwasu ludzkich albo zwierzęcych insulin.
Szczególnie korzystne są przedproinsuliny o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R1 oznacza Phe, R2 oznacza wodór albo peptyd, o 2 do 30 naturalnych aminokwasach, który kończy się C-krańcowo L-argininą, r3 oznacza grupę hydroksylową, naturalny aminokwas albo peptyd, o 2 do 10 naturalnych aminokwasach, X oznacza L-argininę albo C-Łańcuch ludzkiej, świńskiej albo bydlęcej proinsuliny, Y oznacza Thr, Z oznacza Asn, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza sekwencję aminokwasu ludzkiej, świńskiej albo bydlęcej insuliny.
W szczególności korzystne są insuliny, które zostały już zaproponowane w niemieckich zgłoszeniach patentowych nr P 39 19 852 i nr P 40 12 818.0. Na przykład InsuArg o następuj ącej sekwencji aminokwasu:
NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH
Clostripain (EC 3.4.22.8.) jest pozakomórkową tioloproteazą z Clostridien’u. Enzym jest heterodimerem i nie ma żadnej homologii z innymi znanymi tioloproteazami. Enzym ma nadzwyczajnie wysoką specyficzność dla wiązań Arg-XXX w szczególności Arg-Pro. Można ją scharakteryzować przez masę cząsteczkową między 30 000 i 80 000 i punkt izoelektryczny, od pH 4,8 do 4,9. Jako aktywatory działają np. cysteina, merkaptoetanol, ditiotreitol albo jony wapnia.
W obecności np. tosylo-L- lizyno-chlorometyloketonu, nadtlenku wodoru, EDTA, jonów Co2+-, Cu2+-, Cd2+- albo cytrynianu Clostripain jest hamowany.
Wytwarzanie Clostripain’u przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów przez fermentację. W tych procesach hoduje się laseczki beztlenowe zarodnikujące (Clostridien), dotąd aż Clostripain nagromadzi się w pożywce. Przydatny jest np. Clostridium histolylicum, w szczególności Clostridium histolyticum DSM627. Przydatne są również mutanty i warianty wymienionych mikroorganizmów, jeśli syntetyzują Clostripain.
Hodowlę przeprowadza się anaerobowo osobno albo w hodowli mieszanej, np. wgłębnie w stojącej hodowli w nieobecności tlenu albo w fermentorach, ewentualnie przy wprowadzaniu azotu, gazów szlachetnych albo innych gazów, oprócz tlenu. Fermentację przeprowadza się w zakresie temperatur od około 10 do 45°C, korzystnie około 25 do 40°C, w szczególności 30 do 38°C. Fermentację prowadzi się w zakresie pH między 5 i 8,5, korzystnie między 5,5 i 8. W tych warunkach wykazuje odwar hodowlany na ogół po 1 do 3 dni znaczniejsze nagromadzenie enzymu. Synteza Clostripain’u rozpoczyna się w późnej log-fazie i osiąga swe maksimum w stałej fazie wzrostu. Produkcję enzymu można śledzić za pomocą testu aktywności (Mitchel W., Meth. of Enzym., tom 47 (1977), str. 165-170).
Zastosowany do produkcji Clostripain’u roztwór odżywczy zawiera 0,2 do 6%, korzystnie 0,5 do 3%, organicznych związków azotu jak również sole nieorganiczne. Jako organiczne związki azotu wchodzą w rachubę: aminokwasy, peptony, dalej wyciągi mięsne, zmielone nasiona, np. kukurydzy, pszenicy, fasoli, soji albo rośliny bawełny, pozostałości destylacji z wytwarzania alkoholu, mączki mięsne albo wyciągi z drożdży. Z soli nieorganicznych roztwór odżywczy może zawierać np. chlorki, węglany, siarczany albo fosforany metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych, żelazo, cynk i mangan, lecz również sole amonowe i azotany.
Optymalne warunki fermentacji są dla każdego mikroorganizmu wprawdzie różne, ale albo są już znane specjalistom albo też łatwe do ustalenia w łatwych próbach wstępnych. Oczyszczanie Clostripain’u można przeprowadzać klasycznymi sposobami np. przez strącanie z siarczanem amonu, chromatografię z wymieniaczami jonów albo chromatografię żelową. Łączenie enzymu jest możliwe według powszechnie używanych metod (Colowick i Kaplan, Meth. Enzymol., tom XLIV).
167 810
Do reakcji enzymatycznej można stosować zarówno całe komórki w postaci wolnej albo unieruchomionej jak również wyodrębniony produkt enzymu, który może być również związany na nośniku.
Rozszczepianie przedproinsulin o wzorze, przedstawionym na rysunku, za pomocą Clostripain’u przeprowadza się w środowisku wodnym, do którego można również dodać mieszające się z wodą składniki organiczne, jak np. alkohole, ketony, mocznik,
N, N-dwumetyloformamid. W szczególności do zestawu reakcyjnego dla lepszej kontroli wartości pH można dodać odpowiednie bufory nieorganiczne albo organiczne jak fosforan, Tris, glicyna, HEPES i podobne. Stężenie przedproinsulin podczas rozszczepiania wynosi np. między
O, 01 mg/ml i 100 mg/ml, korzystnie między 0,1 mg/ml i 10 mg/ml. Stosunek przedproinusliny do Clostripain’u wynosi (mg do jednostek, Units (U)) 1:0,01 do 1:1000, korzystnie 1:0,1 do 1:50.
Temperatura przy reakcji jest również zmienna w szerokim zakresie. Korzystny jest zakres temeperatur między 0°C i +80°C, szczególnie korzystna temeperatura między +20°C i +40°C.
Wartość pH w reakcji może się zmieniać między pH 4 i pH 12, szczególnie korzystny jest zakres między pH 6 i pH 9.
Czas, który jest potrzebny do przemiany przedproinsulin w odpowiednie produkty pośrednie, można zmieniać zależnie od warunków reakcji w szerokim zakresie, np. może on wynosić między 15 min i 48 h, korzystny jest czas trwania reakcji między 1h i 6h.
Enzym przed zastosowaniem jest aktywowany w odpowiedni sposób w obecności merkaptanu. Jako merkaptany wchodzą przy tym w rachubę w zasadzie wszystkie związki, które zawierają grupy SH, korzystnie stosuje się DTT, DTE, merkaptoetanol, kwas tioglikolowy albo cysteinę. Stężenie merkaptanu można zmieniać w szerokim zakresie, korzystne są stężenia między 0,1 mM i 100 mM. Dalej bufor aktywacji zawiera jony Ca2+, korzystnie CaCk. Aktywacja zachodzi między pH 4 i pH 12, korzystnie między pH 6 i pH 8, szczególnie korzystny jest zakres pH 7 do pH 8. W celu utrzymania wartości pH można dodać odpowiednią substancję buforową, np. Tris, HEPES, glicynę i podobne. Temperatura aktywacji może wynosić między 0°C i 60°C, korzystny jest zakres 0°C do 10°C, szczególnie korzystny 0°C do 5°C. Tak aktywowany enzym może być stosowany bezpośrednio, albo ewentualnie przez chromatografię przez ®Ultrogel AcA 202 uwolniony od buforu aktywacji.
Rozszczepianie według wynalazku przedproinsuliny o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, prowadzi do pochodnych insuliny z resztami argininy przy C-krańcowym końcu insulin i odpowiednich odszczepionych aminokwasów i/albo peptydów. Pochodne insuliny można w razie potrzeby za pomocą karboksypeptydazy B przeprowadzić w odpowiednie insuliny. To może nastąpić w tym samym zestawie reakcji równocześnie razem z Clostripain’em, lecz również w wyżej wymienionych warunkach reakcji kolejno, przy czym pochodna insuliny może być ewentualnie wyodrębniona przed obróbką karboksypeptydazą B za pomocą znanych metod jak np. chromatografia albo krystalizacja. Karboksypeptydazę B można stosować w postaci rozpuszczonej albo unieruchomionej. Stosunek karboksypeptydazy B do pochodnej insuliny wynosi (ciężar do ciężaru) około 1:10 do 1:5000, korzystnie około 1:500 do 1:3500 i szczególnie korzystnie około 1:1000 do 1:3000.
Stosunek karboksypeptydazy B do Clostripain’u wynosi (ciężar do ciężaru) około 1:1 do 10:1 i korzystnie 2:1 do 5:1.
Produkty reakcji rozszczepiania Clostripain’em i/albo karboksypeptydazą B można np. wytrącić przez obniżenie wartości pH i/albo oczyścić za pomocą znanych metod chromatografii kolumnowej. Otrzymaną insulinę można preparować w przyjętych postaciach podawania i stosować jako środki lecznicze do leczenia Diabetes mellitus.
W następujących przykładach opisano szczegółowo sposób według wynalazku. Dane procentowe odnoszą się do ciężaru, jeśli nie podano inaczej.
Przykład I. Clostripain - zestaw rozszczepiania do uwolnienia (B31)Arg-insuliny.
100 | μΐ Insu-Arg | (1 mg/ml) |
20 | μ! KCl | (IM) |
5 | ml Tris/Hd | (1M, pH7,8) |
55 | μΐ H2O | |
20 | μ! Clostripain (rozcieńczenie 1:40). |
167 810
Zawartość w zestawie:
Insu-Arg | 0,5 | mg/ml |
Clostripain | 2,5 | U/ml |
DTT | 12,5 | μM |
Tris/HCl | 25 | mM |
KCl | 100 | mM |
CaCl2 | 6 | pM. |
- Wylęganie 1-2h w temperaturze 28°C, reakcję można łatwo kontrolować przez HPLC, potem zatrzymanie reakcji za pomocą ketonu tosylo-L-lizyno-chlorometylu (TLCK).
- Zatrzymanie reakcji przez dodanie 1μ1 TLCK (15 mM).
- Składowanie w temperaturze 4°C.
- Wynik: ludzka insulina-Arg (Human-Arg).
Za pomocą HPLC nie daje się zmierzyć tworzenie ludzkiej insuliny (DES B30) [HumanInsulin (Des B30)].
Analityka HPLC.
Rozszczepiania skontrolowano z zastosowaniem kolumny RP 18 (0,125 M NH4 (SO4)2, za pomocą H2SO4 nastawiono na pH 4,25-50% gradient acetonitrylu) lub kolumny C8 (0,1 % TFA, 20%-50% gradient acetonitrylu).
Przykład Π.
Clostripain: 200 U/ml.
mM Tris/HCl, pH 7,8 mMDTT mM Ca Cl2.
μ1 roztworu Clostripain’u μl buforu aktywacji.
Bufor aktywacji: 500 100 25
Aktywacja: 100
Zestaw fałdowania;
35,7 mg ludzkiego sulfonianu pre-B-łańcuch-A-lańcuchowej insuliny-S
315 μΐ 1M merkaptoetanolu
105 μ.1 1M kwasu askorbinowego
100 mil 20 mM buforu glicyny, pH 10,7.
Fałdowanie następowało w ciągu nocy w chłodni w temeperaturze 4°C, wydajność fałdowania wynosiła 0,152 mg.ml. Po oddzieleniu od zanieczyszczeń przez strącanie przy pH 5,0 dodaje się Tris w stężeniu końcowym wynoszącym 50 mM i nastawia wartość pH na 7,8 za pomocą HCl. Dodano 30 μ1 roztworu enzymu.
Rozszczepianie prowadzono w temperaturze 30°C i obserwowano za pomocą HPLC.
Wynik: wyżej wymieniona przedproinsulina daje się rozszczepiać do ludzkiej insuliny Arg (Insulin Arg). Tworzenie insuliny (Des B 30) [Insulin (Des B 30)] jest minimalne.
167 810
167 810 (A-D (A-6) (A-7)
Gly - NH-X
I
Cys-S-S (A-20) (A-21)
Cys—‘ Cys—Cys-Z - R^
I (A-ll) ]
S T
S S (1) (B-2)
R - R1-HN-Val- Cys(B-7)
-Cys-Y (B-19) (B-30)
WZÓR
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz
Cena 1,50 zł
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób enzymatycznej hydrolizy łańcucha aminokwasu przedproinsuliny o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R1 oznacza n aminokwasów, przy czym n oznacza liczbę całkowitą 0 albo 1, R2 oznacza wodór, dający się odszczepić chemicznie albo enzymatycznie aminokwas albo peptyd o 2 do 30 resztach aminokwasowych, R3 oznacza grupę hydroksylową, aminokwas albo peptyd o 2 do 10 aminokwasach, X oznacza L-argininę albo peptyd o 2 do 45 aminokwasach, przy którym C-krańcowo i N-krańcowo stoi reszta L-argininy, Y oznacza dający się kodować genetycznie aminokwas, Z oznacza dający się kodować genetycznie aminokwas, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza naturalną albo zmienioną przez wymianę jednej albo kilku reszt aminokwasowych sekwencję aminokwasu ludzkich albo zwierzęcych insulin, znamienny tym, że jako enzym stosuje się Clostripain.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się przedproinsulinę o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R1 oznacza Phe, R2 oznacza wodór, naturalny aminokwas albo peptyd o 2 do 30 naturalnych aminokwasach, który kończy się C-krańcowo L-argininą, r3 oznacza grupę hydroksylową, naturalny aminokwas albo peptyd, o 2 do 10 naturalnych aminokwasach, X oznacza L-argininę albo albo C-łańcuch ludzkiej albo zwierzęcej proinsuliny, Y oznacza aminokwas z grupy Thr, Ala albo Ser, Z oznacza aminokwas z grupy Asn, Gln, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala albo Met, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza sekwencję aminokwasu ludzkich albo zwierzęcych insulin.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym,że stosuje się przedproinsulinę o wzorze, przedstawionym na rysunku, w którym R1 oznacza Phe, R2 oznacza wodór albo peptyd, o 2 do 30 naturalnych aminokwasach, który kończy się C-krańcowo L-argininą, r3 oznacza grupę hydroksylową, naturalny aminokwas albo peptyd, o 2 do 10 naturalnych aminokwasach, X oznacza L-argininę albo C-łańcuch ludzkiej, świńskiej albo bydlęcej proinsuliny, Y oznacza Thr, Z oznacza Asn, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza sekwencję aminokwasu ludzkiej, świńskiej albo bydlęcej insuliny.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces przeprowadza się przy wartości pH między 4 i 12, korzystnie między 6 i 9.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się stężenie przedproinsulin o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, między 0,01 mg/ml i 100 mg/ml, korzystnie między 0,1 mg/ml i 10 mg/ml.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek przedproinsuliny do Clostripain'u wynosi (mg do U) 1:0,01 do 1:1000, korzystnie 1:0,1 do 1:50.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się temperaturę reakcji między 0°C i +80°C, korzystnie między +20°C i +40°C.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4028118 | 1990-09-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL291617A1 PL291617A1 (en) | 1992-03-09 |
PL167810B1 true PL167810B1 (pl) | 1995-11-30 |
Family
ID=6413629
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL91291617A PL167810B1 (pl) | 1990-09-05 | 1991-09-04 | Sposób enzymatycznej hydrolizy lancucha aminokwasu przedproinsuliny PL PL |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5728543A (pl) |
EP (1) | EP0474212B1 (pl) |
JP (1) | JP3005335B2 (pl) |
KR (1) | KR100188800B1 (pl) |
AT (1) | ATE145922T1 (pl) |
AU (1) | AU637254B2 (pl) |
CA (1) | CA2050606C (pl) |
CZ (1) | CZ283234B6 (pl) |
DE (1) | DE59108392D1 (pl) |
DK (1) | DK0474212T3 (pl) |
ES (1) | ES2095891T3 (pl) |
FI (1) | FI103805B1 (pl) |
GR (1) | GR3021909T3 (pl) |
HR (1) | HRP940766A2 (pl) |
HU (1) | HU214676B (pl) |
IE (1) | IE75723B1 (pl) |
IL (1) | IL99383A (pl) |
LT (1) | LT3328B (pl) |
LV (1) | LV10508B (pl) |
NO (1) | NO300980B1 (pl) |
NZ (1) | NZ239652A (pl) |
PL (1) | PL167810B1 (pl) |
RU (1) | RU2062301C1 (pl) |
SK (1) | SK279686B6 (pl) |
YU (1) | YU147491A (pl) |
ZA (1) | ZA917008B (pl) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6461834B1 (en) | 1998-11-06 | 2002-10-08 | Bionebraska, Inc. | Clostripain catalyzed amidation of peptides |
DE19915938A1 (de) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Aventis Pharma Gmbh | Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung |
AU2003239863A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Restoragen Inc. | Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides |
WO2003099854A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
AU2003239865A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Restoragen Inc. | Method for universal enzymatic production of bioactive peptides |
ME01366B (me) * | 2003-11-21 | 2013-12-20 | Nps Allelix Corp | POSTUPAK ZA PROIZVODNJU PEPTIDA 2 NALIK NA GLUKAGON l NJIHOVIH ANALOGA |
WO2013015697A1 (en) * | 2011-07-28 | 2013-01-31 | Mabion S.A. | A recombinant protein, a polynucleotide encoding it as well as a method of obtaining insulin or its an analogue |
KR102646845B1 (ko) | 2018-08-08 | 2024-03-14 | 주식회사 대웅제약 | 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
LU81606A1 (de) | 1979-08-14 | 1981-03-24 | Arbed | Verfahren und einrichtung zur wiederverwertung von kohlenstoffreichen abfallprodukten |
DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
EP0109420A1 (de) | 1982-05-27 | 1984-05-30 | Neiman S.A. | Zylinderschloss, insbesondere lenkschloss für ein kraftfahrzeug |
JPS60217894A (ja) * | 1984-04-14 | 1985-10-31 | Suntory Ltd | 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 |
DE3440988A1 (de) * | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
IL84110A (en) | 1986-10-14 | 1992-11-15 | Lilly Co Eli | Process for transforming a human insulin precursor to a human insulin |
DE4012818A1 (de) * | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
DE3919852A1 (de) * | 1988-06-23 | 1989-12-28 | Hoechst Ag | Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung |
EP0347781B1 (de) | 1988-06-23 | 1994-02-16 | Hoechst Aktiengesellschaft | Mini-Proinsulin, seine Herstellung und Verwendung |
EP0367163B1 (de) | 1988-11-03 | 1996-01-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
US5617606A (en) | 1996-02-29 | 1997-04-08 | Baracuda International Corp. | Fluted swimming pool cleaner discs |
-
1991
- 1991-09-03 KR KR1019910015314A patent/KR100188800B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 IL IL9938391A patent/IL99383A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 FI FI914151A patent/FI103805B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 SK SK2711-91A patent/SK279686B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 CZ CS912711A patent/CZ283234B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 NZ NZ239652A patent/NZ239652A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 JP JP3223243A patent/JP3005335B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 DE DE59108392T patent/DE59108392D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 EP EP91114934A patent/EP0474212B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 ES ES91114934T patent/ES2095891T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 RU SU915001486A patent/RU2062301C1/ru active
- 1991-09-04 IE IE311791A patent/IE75723B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 PL PL91291617A patent/PL167810B1/pl unknown
- 1991-09-04 NO NO913474A patent/NO300980B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 DK DK91114934.2T patent/DK0474212T3/da active
- 1991-09-04 ZA ZA917008A patent/ZA917008B/xx unknown
- 1991-09-04 YU YU147491A patent/YU147491A/sh unknown
- 1991-09-04 CA CA002050606A patent/CA2050606C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 AT AT91114934T patent/ATE145922T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 AU AU83567/91A patent/AU637254B2/en not_active Expired
- 1991-09-05 HU HU912875A patent/HU214676B/hu unknown
-
1993
- 1993-05-05 LV LVP-93-288A patent/LV10508B/xx unknown
- 1993-06-25 LT LTIP712A patent/LT3328B/lt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-08 US US08/291,060 patent/US5728543A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 HR HRP-1474/91A patent/HRP940766A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-12-05 GR GR960403067T patent/GR3021909T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5512459A (en) | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides | |
KR0150565B1 (ko) | 유전자 조환에 의한 사람 인슐린 전구체의 제조 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법 | |
JP4291900B2 (ja) | 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法 | |
EP0489711B1 (en) | Method for producing human growth hormone | |
US5763215A (en) | Method of removing N-terminal amino acid residues from eucaryotic polypeptide analogs and polypeptides produced thereby | |
CN100424179C (zh) | 制备胰岛素化合物的方法 | |
PL162822B1 (pl) | Sposób wytwarzania stabilnych, biologicznie czynnych somatotropin PL PL PL PL PL | |
US4639332A (en) | Process for the preparation of insulin derivatives | |
PL167810B1 (pl) | Sposób enzymatycznej hydrolizy lancucha aminokwasu przedproinsuliny PL PL | |
US6461834B1 (en) | Clostripain catalyzed amidation of peptides | |
NZ248810A (en) | A dipeptidylaminopeptidase from a slime-mold | |
IE883462L (en) | A method for the selective cleavage of fusion proteins | |
AU618420B2 (en) | A method for the selective cleavage of fusion proteins | |
EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin | |
PT98859B (pt) | Processo enzimatico para a transformacao de preproinsulinas em insulinas | |
Okamoto et al. | An improved method for large-scale purification of recombinant human glucagon | |
Naoko et al. | α-Amino-ε-caprolactam racemase for L-lysine production | |
EP2867250A2 (en) | Proinsulin with enhanced helper sequence |