HRP940770A2 - Process for the production of stranger protein in streptomycetes - Google Patents
Process for the production of stranger protein in streptomycetes Download PDFInfo
- Publication number
- HRP940770A2 HRP940770A2 HRP-696/91A HRP940770A HRP940770A2 HR P940770 A2 HRP940770 A2 HR P940770A2 HR P940770 A HRP940770 A HR P940770A HR P940770 A2 HRP940770 A2 HR P940770A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- tendamistat
- gene
- protein
- amino acids
- plasmid
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 title claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 229950001790 tendamistat Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 108010037401 tendamistate Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 108010013359 miniproinsulin Proteins 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 101710171801 Alpha-amylase inhibitor Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 1
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 241000828254 Streptomyces lividans TK24 Species 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 1
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Description
Iz europske patentne prijave, objavljene pod brojem (EP-A) 0 289 936, poznato je, da se fuzijski proteini mogu pripremiti tako, da se strukturni geni pripoje sa željenim proteinom na završetku 3 kodnog lanca, u datom slučaju modificiranog tendamistatnog gena, tu gensku strukturu eksprimira se u stanici domaćinu streptomiceti i izlučeni fuzijski protein se izolira iz supernatanta. U izvedbi kojoj se daje prednost tendamistatni gen skraćuje se na završetku 3'. Za skraćivanje se koriste mjesta cijepanja za restrikcijske enzime BstEII u području tripleta 31 i 32, StuI u području tripleta 43 i 44, kao također i Sau3A u području tripleta 52 i 53.
U daljnjem razvoju te inventivne zamisli već je predložena priprava fuzijskog proteina u kojem iza tendamistatnog dijela slijedi skraćeni proinzulin, čiji se C lanac sastoji samo od jednog ili dva ostatka lizina ("mini-proinzulin") . U daljnjem razvoju predloženo je da se u fuzijskim proteinima te vrsti također skrati i tendamistatni dio (EP-A-0 367 163, objavljena 9.5.1990.)
Sada smo iznenađujuće utvrdili da su fuzijski proteini s vrlo kratkim tendamistatnim dijelom u stanici streptomicete postojani i izlučuju se u medij. Tako dobiveni fuzijski proteini se zbog vrlo kratkog tendamistatnog lanca ponašaju kao "zreli" proteini i nalaze se u mediju u pravilu općenito u tercijarnoj strukturi.
Iz EP-A- 0 177 827 poznata je sintetička signalna sekvenca za transport proteina u sisteme za ekspresiju, koja je naznačena time, da odgovara DNA u glavnom prirodnoj signalnoj sekvenci, iako međutim ima jedno ili više mjesta cijepanja za endonukleaze, koje prirodna DNA ne posjeduje. Ako se gen za protein, kojeg treba transportirati, priključi na takovu sekvencu DNA, taj fuzijski gen ugradi se u vektor i s njim se tranformira stanicu domaćina koja transportira eksprimirani protein iz citoplazme, mogu se pripraviti eukariotski, prokariotski ili virusni proteini u prokariotskim i eukariotskim stanicama. Na primjeru proteina periplazme alkalne fosfataze prikazano je, da je kod ekspresije u E. coli vrlo korisno da se također i za predsekvencu ispred strukturnog gena željenog proteina postave kodoni za približno prvih 40 amino kiselina alkalne fosfataze. Međutim, u mnogim primjerima dovoljno je također i manje dodatnih amino kiselina, npr. približno 10, ponajprije približno 5. Odgovarajući fuzijski protein s majmunskim proinzulinom transportiran je približno je 90%-tno u prostor periplazme.
Također je već predloženo (WO 91/03 550, objavljena 21.3.1991.), da se fuzijski protein pripremi tako da se konstruira miješani oligonukleotid, koji kodira za balastni dio fuzijskog proteina, taj oligonikleotid se unese u vektor tako da je funkcionalno priključen na regulacijsko područje i na strukturni gen željenog proteina, s tom tako dobivenom plazmidnom populacijom transformiraju se prikladne stanice domaćini i selektiraju oni kloni koji pokazuju visok dobitak kodiranog fuzijskog proteina.
Pri tome oligonukleotid se sastoji ponajprije od 4 do 12, naročito od 4 do 8 tripleta.
Pokušalo se je već pripremiti i fuzijske proteine s kratkim balastnim dijelom, Tako je npr. pripravljena genska fuzija koja kodira fuzijski protein iz prvih 10 amino kiselina β-galaktozidaze i somatostatina. Pokazalo se je ipak da taj kratki fragment β-galaktozidaze nije dovoljan da bi zaštitio fuzijski protein od razgradnje s vlasititim proteazama domaćina (US-A 4 366 246, stupac 15, stavak 2). S tim u skladu u EP-A 0 290 005 i 0 929 763 opisani su fuzijski proteini čiji se balastni dio sastoji od β-galaktozidaze s više od 250 amino kiselina.
Sada smo iznenađujuće utvrdili da su fuzijski proteini iz približno prvih 10 aminoterminalnih amino kiselina tendamistata i željenog proteina, npr. proinzulina, u stanicama domaćinima streptomičetama postojani i izlučuju se u medij, iz kojeg se mogu dobiti s visokim dobicima. Iznenađujuće također vrijedi i za relativno male proteine kao "mini-proinzuline".
Pri tome "približno 10 amino kiselina" znači da u obzir dolazi također i manji broj amino kiselina, npr. prvih 7 N-terminalnih amino kiselina tendamistata, iako ponajprije ne više od 10. Prednost imaju fuzijski proteini u kojima u tendamistatnom dijelu u položaju 7 i/ili 9 stoji prolin (kao u prirodnoj sekvenci).
U skladu sa već poznatim ili predloženim oblicima izvedbe, moguće je naravno odabrati veći tendamistatni balastni dio, pri čemu međutim dakako se sve više gubi prednost manjeg "balasta".
Moguće je i vrlo korisno mijenjati prirodni niz amino kiselina tendamistatnog dijela, dakle zamijeniti ili ispustiti amini kiseline ili ugraditi amino kiseline koje se pojavljuju u prirodnom nizu amino kiselina. Nadalje, može se varirati i niz amino kiselina u signalnom peptidu.
U smislu izuma, posebne korisne fuzijske konstrukcije mogu se lako odrediti s jednostavnim prethodnim pokusima.
Nadalje, zamisao izuma može se ostvariti također i u drugim stanicama gram pozitivnih bakterija, npr. u stanicama bacila i stafilokoka, uz upotrebu signalnih sekvenci, koje te stanice domaćini prepoznaju.
Fuzijski proteini dobiveni prema izumu nalaze se u mediju u otopljenom obliku, što nudi mnoge prednosti kod daljnje prerade i čišćenja. Tako se daljnja enzimska prerada uz odcjepljenje balastnog dijela vrši lako neposredno s proizvodom izlučivanja, pri čemu nije potrebno provoditi faze prerade, koje su potrebne kod netopivih fuzijskih proteina. Međutim, prije daljnje prerade može se također provesti zgušnjavanje ili čišćenje, npr. afinitetnom kromatografijom, zatim također i ultrafiltracijom, taloženjem, kromatografijom s ionskom izmjenom, apsorpcijskom kromatografijom, gel filtracijom ili visokotlačnom tekućinskom kromatografijom.
Primjeri
Izum se potanje objašanjava u slijedećim primjerima.
Polazni materijal za plazmidne konstrukcije je plazmid pKK500, koji je predložen u EP-A 0367 163. Taj plazmid razlikuje se od plazmida pKK400, poznatog iz EP-A 0 289 936, po zamjeni gena proinzulina s analognim genom, koji kodira na mjestu lanca C samo amino kiselinu lizin, kao također ugradnjom terminalne sekvence iza tog genoma "mini-proinzulina" . Tablice 1 i 2 iz EP-A 0 367 163, u kojima su prikazani gen "mini-proinzulina", odnosno terminalna sekvenca, priložene su ovom opisu.
Plazmidi pKK400 i pKK500 u signalnoj sekvenci gena inhibitora a-amilaze sadrže mjesto za cijepljenje XmaIII (u području tripleta -5 do -7).
Primjer 1
Plazmid pKK500 obradi se s restrikcijskim enzimom EcoRI i XmaIII i veliki fragment odvoji se na 0,8%-tnom gelu agara gel elektroforezom i izolira elektroeluiranjem. Taj fragment sljepi se s fragmentom (1) DNA (SEQ ID NO:1)
[image]
sintetiziranim fosforamidnom metodom, i nakon sljepljivanja smjesu se transformira u E. coli. Dobije se plazmid pKK510. On kodira preproinzulin u kojem iza signalne sekvence tendamistata slijedi prvih 7 amino kiselina tendamistata i zatim lanac mini-proinzulina.
Primjer 2
Analogno postupku preobrazbe plazmida pKK400 u ekspresijski plazmid pGF1, opisanom u EP-A 0 289 936, plazmid pKK510 prevede se u ekspresijski plazmid pKF1.
Izoliranu DNA plazmida pKK510 prereže se s restrikcijskim enzimom SphI i SstI i izolira mali fragment s fuzijskim genom. Obični komercijalni ekspresijski plazmid pIJ 702 (može se dobiti od tvrtke John Innes Foundation, Norwich, Engleska) razreže se s istim enzimom i izolira se veliki fragment. Taj izolirani fragment se sljepi, nakon sljepljivanja smjesu se transformira u S. lividans TK24 i iz bijelih (tj. nesposobnih za tvorbu melanina) transformanata, otpornih prema tiostreptonu, izolira se plazmid. Kloni koji nose ugrađeni insert ispitani su u trešenoj kulturi s obzirom na njihovu tvorbu fuzijskih proteina.
Ekspresija kodiranog fuzijskog proteina vrši se na sam po sebi poznat način. Transformirani soj se inkubira 4 dana pri 25°C u tikvici za mućkanje i centrifugiranjem se odvoji micelij od otopine kulture, nakon elektroforeze 20 µm filtrata kulture u 15%-tnom poliakrilamidnom gelu može se pripremiti nastali fuzijski protein taloženjem sa COOMASSIE®-plavim, vidljiv kao dodatna proteinska liza, koja se ne pojavljuje u usporedbenom pokusu u kojem je soj transformiran samo s pIJ 702.
Filtrat kulture obradi se s lizilendoproteinazom, može se gel elektroforezom dokazati Des-(B30)-Thr-inzulin, koji se verificira s kontrolom autentičnosti.
Nadalje, u filtratu kulture može se dokazati fuzijski protein s antitijelima prema inzulinu i to ili s "imunskim kopiranjem" ili s radioimunskim ispitivanjem inzulina.
Primjer 3
Postupa se kao u primjerima 1 i 2, osim što se koristi sintetički fragment (2)s SEQ ID NO:2
[image]
[image]
Taj plazmid kodira fuzijski protein koji se razlikuje od proteina u primjerima 1 i 2 time da iza prvih 7 amino kiselina tendamistata slijedi asparagin (umjesto prirodne amino kiseline alanina) i zatim deveta amino kiselina u tendamistatu, prolin. Zamjenom alanina s asparaginom također se uvodi dodatni pozitivan naboj u balastni dio fuzijskog proteina. Iznenađujuće se dobiju pribl. 20 do 30% veća iskorištenja nego u primjeru 2.
Primjer 4
Postupa se kao u primjerima 1 i 2, osim što se koristi sintetički fragment (3)s SEQ ID NO:3
[image]
[image]
i dobije se plazmid pKK330, odnosno pKF3. Taj plazmid razlikuje se od plazmida iz primjera 1 i 2 time, da ga kodira prvih 9 prirodnih amino kiselina tendamistata. U usporedbi s primjerom 2 dobiju se iskorištenja veća za pribl. 10%.
Primjer 5
Fuzijski protein, kojeg kodira pKK500, između tendamistatogh dijela i lanac B proinzulina sadrži sekvencu linkera, koja kodira za amino kiseline Asn-Ser-Asn-Gly-Lys. Zamjena tog terminalnog Lys i Lys, koji predstavlja lanac C, sa Arg, vrši se kako je dolje opisano. Pri tome se koristi jedino mjesto za rezanje StyI u području kodona B30 do A1 u sekvenci proinzulina.
Izoliranu DNA plazmida pKK500 razreze se sa StyI, razgradi sa S1 nukleazom, dade se odstraniti preko molekulskih krajeva, i suvišak nukleaze ekstrahira se s fenolom-kloroformom. Zatim se linearizirani plazmid razreže još sa EcoRI, veliki fragment se odvoji elektroforezom izolira se elektroeluacijom. Taj fragment se sljepi sa sintetičkim fragmentom (4) (SEQ ID NO:4)
[image]
i smjesu se nakon ljepljenja transformira u E. coli. Željeni kloni se provjere restrikcijskom analizom dobivenog plazmida, pri čemu se novo nastalo mjesto koristi za rezanje SstII. Zatim se odvoje sekvence u cjelokupnom fragmentu SphI-SstI.
Za ekspresiju kodiranog fuzijskog proteina sljepi se sekvencnom analizom provjereni fragment s vektorom pIJ 702, razrezanim s istim enzimima, pri čemu nastane ekspresijski vektor pGF4.
Dokaz izlučenog fuzijskog proteina, kojeg kodira pGF4, može se provesti ispitivanjem s inhibitorom a-amilaze na pločicama (EP A 0 161 629, primjer 3) ili iz supernatantne istresene kulture analogno primjeru 2.
Primjer 6
Ako analogno primjeru 5 u vektore pKK510, 520 i 530 ugradi se fragment (4) i dobiju se vektori pKK610, 620 i 630. Ugradnja dotičnih fragmenata SphI-SstI s kodnom sekvencom za fuzijske proteine u vektor pIJ 702 daje ekspresijske vektore Pkf11, 12 i 13. Ekspresija izlučenih fuzijskih proteina provjeri se kao u primjeru 2.
Primjer 7
Da se poveća ekspresiju derivata plazmida pIJ 702, iz njega se razgradnjom s PstI i SphI odstrani promotor melanina i nadomjesti ga se sa sintetičkim fragmentom (5) (SEQ ID NO:5)
[image]
Time se dobije tandemsku konstrukciju iz sintetičkog i tendamistatnog promotora. Plazmid je dobio oznaku pGR110.
Ako se nakon rezanja sa SphI i SStI u pGR110 ugrade sintetički fragmenti (1), (2) i (3), nastanu ekspresijski vektori pGR200, 210 i 220. Analogno se sa fragmentom (4) dobiju ekspresijski vektori pGR250, 260 i 270.
Primjer 8
Da se iz prethodnika inzulina s kombinacijom tripsina ili enzina jednakog djelovanja i karboksipeptidaze B pripremi humani inzulin, korisno je tijekom reakcije cijepljenja brzo odcijepiti aminoterminalni balastni dio, da se podupre reakciju cijepljenja u smjeru k B31 (Arg)-inzulina. Za to se nudi modifikaciju amino kiselina ispred amino kiseline B1 (Phe):
Radi se kao u primjeru 1 i plazmid pKK500 se otvori s restrikcijskim enzimima EcoRI i DraIII. Prvobitni fragment se zatim nadomjesti s fragmentom (6) (SEQ ID NO:6)
[image]
sintetiziranim fosforamidnom metodom. Kloniranje u E. coli i ekspresija u Streptomyces lividans vrši se kao u primjeru 1, odnosno 2. Nastaje plazmid pKK640, odnosno ekspresijski plazmid pKF14.
Analogno se može postupiti i s plazmidom koji se dobije u primjeru 5 (nakon ugradnje fragraneta (4)). Tako se dobiju plazmidi pKK650, odnosno pKF15.
Tablica 1
[image]
Tablica 2
[image]
Claims (8)
1. Postupak za pripravu fuzijskih proteina, naznačen time, da se strukturni gen priključi na željeni protein na kodone za signalnu sekvencu i približno prvih 10 aminoterminalnih amino kiselina tendamistata, tu gensku strukturu eksprimira se u stanici domaćinu streptommiceti i izlučeni fuzijski protein se izolira iz supernatanta, pri čemu sekvence tendamistatnog gena mogu biti modificirane.
2. Genska struktura, naznačena time, da sadrži signalnu sekvencu i približno prvih deset kodona za tendamistat i strukturni gen za drugi protein.
3. Genska struktura prema zahtjevu 2, naznačena time, da su u tendamistatnom dijelu ispušteni, zamijenjeni ili dodani kodoni za amino kiseline.
4. Genska struktura prema zahtjevu 2 ili 3, naznačena time, da se između tendamistatnog gena i strukturnog gena željenog proteina nalazi sekvenca linkera.
5. Vektor, naznačen time, da sadrži gensku strukturu prema zahtjevu 2, 3 ili 4.
6. Stanica streptomicete, naznačena time, da sadrži vektor prema zahtjevu 5.
7. Fuzijski protein, naznačena time, da sadrži dio od približno prvih deset amino kiselina tendamistata, koje se nalaze na N, priključen - u datom slučaju preko mostne sekvence - na željeni protein.
8. Upotreba fuzijskog proteina prema zahtjevu 7,odnosno fuzijskog proteina koji se može dobiti prema zahtjevu 1, naznačena time, da se korsiti za pripravu željenog proteina.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4012818A DE4012818A1 (de) | 1990-04-21 | 1990-04-21 | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
YU69691A YU48435B (sh) | 1990-04-21 | 1991-04-18 | Postupak za dobijanje stranih proteina u streptomicetama |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HRP940770A2 true HRP940770A2 (en) | 1997-06-30 |
Family
ID=6404857
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HRP-696/91A HRP940770A2 (en) | 1990-04-21 | 1994-10-25 | Process for the production of stranger protein in streptomycetes |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0453969B1 (hr) |
JP (1) | JP3319605B2 (hr) |
KR (1) | KR0168669B1 (hr) |
CN (1) | CN1049248C (hr) |
AT (1) | ATE142263T1 (hr) |
AU (1) | AU630287B2 (hr) |
BR (1) | BR9101587A (hr) |
CA (1) | CA2040810C (hr) |
CZ (1) | CZ285440B6 (hr) |
DE (2) | DE4012818A1 (hr) |
DK (1) | DK0453969T3 (hr) |
ES (1) | ES2093043T3 (hr) |
FI (1) | FI911882A (hr) |
GR (1) | GR3021040T3 (hr) |
HR (1) | HRP940770A2 (hr) |
HU (1) | HU210358B (hr) |
IE (1) | IE911322A1 (hr) |
IL (1) | IL97903A0 (hr) |
LT (1) | LT3686B (hr) |
LV (1) | LV10494B (hr) |
NO (1) | NO911557L (hr) |
NZ (1) | NZ237882A (hr) |
PL (2) | PL169596B1 (hr) |
PT (1) | PT97427B (hr) |
RU (1) | RU2055892C1 (hr) |
SK (1) | SK110191A3 (hr) |
TW (1) | TW213487B (hr) |
YU (1) | YU48435B (hr) |
ZA (1) | ZA912937B (hr) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100188800B1 (ko) * | 1990-09-05 | 1999-06-01 | 이센브룩, 라피세 | 프리프로인슐린을 인슐린으로 전환시키기 위한 효소적 방법 |
DK0600372T3 (da) | 1992-12-02 | 1997-08-11 | Hoechst Ag | Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer. |
EP0622376B1 (de) * | 1993-04-27 | 2001-08-08 | Hoechst Aktiengesellschaft | Amorphe monosphärische Formen von Insulinderivaten |
DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
CN1061375C (zh) * | 1996-07-19 | 2001-01-31 | 中国科学院上海生物工程研究中心 | 利用异源启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白 |
ES2218622T3 (es) | 1996-07-26 | 2004-11-16 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada. |
DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
CN1298742C (zh) * | 2003-06-03 | 2007-02-07 | 上海新药研究开发中心 | 一种适合于高效表达的融合蛋白及其生产方法 |
RU2395296C1 (ru) * | 2009-02-19 | 2010-07-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Концерн О3" | Способ получения препарата проинсулина для перорального применения |
CN104818291A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-05 | 江南大学 | 一种链霉菌重组表达载体的构建及应用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4366246A (en) | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
DE3418274A1 (de) | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
DE3714866A1 (de) * | 1987-05-05 | 1988-11-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
DE3715033A1 (de) | 1987-05-06 | 1988-11-17 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung von fusionsproteinen |
DE3716722A1 (de) | 1987-05-19 | 1988-12-01 | Hoechst Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von angiogeninen |
DE3843713A1 (de) * | 1988-04-25 | 1989-11-02 | Henkel Kgaa | Verwendung von calcinierten hydrotalciten als katalysatoren fuer die ethoxylierung bzw. propoxylierung |
ES2081826T3 (es) * | 1988-11-03 | 1996-03-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos. |
-
1990
- 1990-04-21 DE DE4012818A patent/DE4012818A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-04-18 DE DE59108128T patent/DE59108128D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 AT AT91106268T patent/ATE142263T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-18 ES ES91106268T patent/ES2093043T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-18 YU YU69691A patent/YU48435B/sh unknown
- 1991-04-18 FI FI911882A patent/FI911882A/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-04-18 CZ CS911101A patent/CZ285440B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-04-18 DK DK91106268.5T patent/DK0453969T3/da active
- 1991-04-18 SK SK1101-91A patent/SK110191A3/sk unknown
- 1991-04-18 EP EP91106268A patent/EP0453969B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 NZ NZ237882A patent/NZ237882A/en unknown
- 1991-04-19 IE IE132291A patent/IE911322A1/en unknown
- 1991-04-19 PL PL91309698A patent/PL169596B1/pl unknown
- 1991-04-19 PT PT97427A patent/PT97427B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-04-19 CA CA002040810A patent/CA2040810C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-19 AU AU75154/91A patent/AU630287B2/en not_active Expired
- 1991-04-19 IL IL97903A patent/IL97903A0/xx unknown
- 1991-04-19 ZA ZA912937A patent/ZA912937B/xx unknown
- 1991-04-19 RU SU914895292A patent/RU2055892C1/ru active
- 1991-04-19 BR BR919101587A patent/BR9101587A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-04-19 NO NO91911557A patent/NO911557L/no unknown
- 1991-04-19 KR KR1019910006250A patent/KR0168669B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-04-19 HU HU911302A patent/HU210358B/hu unknown
- 1991-04-19 PL PL91289953A patent/PL169178B1/pl unknown
- 1991-04-20 JP JP11700691A patent/JP3319605B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-20 CN CN91102541A patent/CN1049248C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-28 TW TW080104141A patent/TW213487B/zh active
-
1993
- 1993-05-04 LV LVP-93-283A patent/LV10494B/xx unknown
- 1993-12-03 LT LTIP1523A patent/LT3686B/lt unknown
-
1994
- 1994-10-25 HR HRP-696/91A patent/HRP940770A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-09-13 GR GR960402399T patent/GR3021040T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3043803B2 (ja) | 融合タンパク質、その調製及び用途 | |
EP0305481B1 (en) | Leader sequences for the production of recombinant proteins | |
US5215896A (en) | Leader sequences for the production of recombinant proteins | |
JP2001527387A (ja) | 合成リーダーペプチド配列 | |
WO1984004330A1 (en) | Secretion of exogenous polypeptides from yeast | |
JPH05268970A (ja) | 部分的合成遺伝子を用いる成長ホルモンの発現 | |
JPH10501413A (ja) | 合成リーダーペプチド配列類 | |
JPH0673096A (ja) | 成長ホルモン前駆体 | |
KR20030074842A (ko) | 세균 배양물의 상층액으로 관심있는 단백질의 분비를 위한융합 단백질 | |
JPH05345797A (ja) | 保護ペプチド融合インスリン様成長因子i | |
HRP940770A2 (en) | Process for the production of stranger protein in streptomycetes | |
WO1992003477A1 (en) | Biologically active compound, a process for the preparation thereof and use of the same | |
JPH06197787A (ja) | 新規なるdna分子及び宿主 | |
JPH10511845A (ja) | 細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法 | |
EP0130074B1 (en) | Portable inducible control system, expression vectors containing them, microorganisms transformed with them, and their use in expressing exogenous protein | |
EP0138644B1 (en) | Novel plasmid vectors | |
US4912046A (en) | Portable inducible control system | |
EP0352073A1 (en) | Vectors, cells transformed thereby, and their use in producing heterologous polypeptides | |
WO1989001968A1 (en) | Aprotinin homologues and process for the production of aprotinin and aprotinin homologues in yeast | |
US5426036A (en) | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes | |
EP0393039B1 (en) | Process for producing peptides by specific cleavage of fusion proteins with collagenases obtained by genetic engineering | |
JPH0213381A (ja) | 複数発現ベクターおよびこれを用いたタンパク質の製造法 | |
KR930001388B1 (ko) | 면역 글로불린의 Fc 부분의 변형된 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA를 이용한 새로운 융합 발현벡터의 제조방법 | |
JPH01132383A (ja) | プラスミド組換え体 | |
JPS62228283A (ja) | Dna遺伝子、およびこれを含むプラスミドならびにこのプラスミドを用いる蛋白質の菌体外分泌法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A1OB | Publication of a patent application | ||
OBST | Application withdrawn |