CN1049248C - 用链霉菌制备外源蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

在链霉菌宿主细胞以高产率进行了基因结构，该基因含有信息顺序、串联的前10个氨基酸和所希望的蛋白质密码，在培养介质中分泌出融合蛋白。

Description

用链霉菌制备外源蛋白的方法
由欧洲专利的公开号为(EP-A)0289936可知，制备融合蛋白质的方法，是将欲得到的蛋白质的结构基因偶联到按需要交换了的tendamistat基因密码链的3′一末端上，这个结构基因在宿主细胞链霉菌上得到表达，分泌出的融合蛋白质自细胞中分离出，一种优选的实施形式是于3′-末端缩短tendamistat基因，为此，限制性内切酶BstEII的酶切位点在三联体31和32处，Stui在三联体的43和44处，Sau3A在三联体的52和53处。
本发明思想的进一步发展，是提出了制备融合蛋白质的方法，此时，被缩短的前胰岛素跟随串联部分，它的C-链只是由一个或两个赖氨酸残基组成(“小型前胰岛素”)。再进一步发展，提出了在该融合蛋白中，串联部分也被缩短了(见1990年5月9日公开的EP-A-0367163)。
现在却意外地发现，在链霉菌中具有非常短的tendamistat部分的融合蛋白质是很稳定的，并且可从培养基中分离出，由于非常短的tendamistat链，这样得到的融合蛋白有“成熟蛋白”的特点，并且在培养基中通常以富三级结构的形式存在。
EP-A0177827报道了表达系统中为使蛋白质运载的合成密码顺序，其特征是，该DNA基本上相当于天然的密码顺序，但核酸内切酶的或多或少的酶切位置表明，它并不含于天然DNA中，若将负责运载蛋白的基因偶联到某个DNSA序列中，这个融合基因在一载体上建成，因而宿主细胞发生转化，将外引物蛋白(ex-primierteProtein)自细胞浆中转运出。因此，可在原核生物细胞和真核生物细胞中制备真核生物、原核生物或病毒蛋白。作为实例的胞浆外蛋白碱性磷酸酶表明，在大肠杆菌的表达中，下面是有利的：在连结原顺序时，碱性磷酸酶的大约前40个氨基酸的密码要置于所需蛋白质的结构基因之前。在多数情况下，要补充少许氨基酸，例如大约10个，最合适是大约5个。具有猿原胰岛素的相应的融合蛋白大约有90％转运到胞浆外周空空。
在WO 91/03550(1991年3月21日公开)也提到了制备融合蛋白质的方法，即组建混合型的寡核苷酸，它构成融合蛋白的压载(Ballast)部分的密码，这些寡核苷酸插接在这样的区段，以便使它偶联在起调控功能的部位和所需蛋白结构基因上。由此得到的质粒宜于宿主细胞的转化，并选择出编码有高产率的融合蛋白的克隆，寡核苷酸以4-12个三联体组成为好，尤以4-8个三联体最好。
已试图制备具有短压载部分的融合蛋白，例如制备了这样的融合基因，这种为制备融合蛋白的基因有β-半乳糖苷酶的前10个氨基酸及生长因子释放抑制因子的密码。然而实验表明，为了保护融合蛋白免受宿主细胞中特异的蛋白酶的破坏，这样短的β-半乳糖苷酶的片段是不够的(US-A4366246，第15栏，第2段)，而相应于欧洲专利EP-A-0290005和0292763报导的融合蛋白的压载片段却有多于250个氨基酸组成。
但是融合蛋白是tendamistat基因的大约前10个氨基端的氨基酸和所需的蛋白质(例如前胰岛素)时，在链霉菌宿主细胞中却出人意料地稳定并分泌到介质中，由介质中可以得到高产率的融合蛋白，这也意外地适用于较小的蛋白质如“小型胰岛素原”。
此外“大约10个氨基酸”表明，也涉及较少的氨基酸，例如ten-damistat的只有7个N-端氨基酸，但最好不超过10个。优选的融合蛋白是它的tendamistat部分的7位和/或9位为脯氨酸(如天然顺序那样)。但是，按照已知的或预定的结构类型选择较大的ten-damistat-压载部分显然也是可能的，不过徽小的“压载部分”的优点自然会越来越丧失掉。
改变tendamistat部分的天然氨基酸次序。交换或删去某些氨基酸，或者插入在天然氨基酸顺序中不存在的氨基酸是可以的甚至是有利的。
本发明思想的特别有利的融合技术，可以通过简单的预试验得到了解。
另外，还可以用其它革兰氏阳性细菌来实现本发明思想，例如用杆菌或葡萄球菌细胞，使用这些缩主已知的信息顺序列。
按照本发明得到的融合蛋白以溶解的形式存在于培养基，这对进一步处理和精制有许多优点。例如用酶法进一步直接处理分泌产物以裂解掉压载部分，否则必须进行处理步骤，如同对不溶性的融合蛋白质所必须处理的那样。在进一步处理之前可以进行浓缩或纯制，例如用亲和色谱，超过滤，沉淀，离子交换色谱，吸附色谱，凝胶过滤或高压液相色谱。
如下的实施例是对本发明作进一步说明。
质粒结构的原料是在EP-A0367163提及的质粒PKK500。该质粒与EP-A0289936提及的质粒PKK400的区别是用类似的基因代替前胰岛素基因，该类似的基因在C-链处只有赖氨酸密码，并且在连结该“小型前胰岛素”基因处插入一个终止密码顺序。在EP-A0367163中的表1和表2重列出“小型胰岛素原”基因和终止密码顺序，作为附录列于其上。
质粒PKK400和PKK500在a-淀粉酶抑制剂基因中含有XmaIII内切点(在三联体-5--7处)。
实施例1
PKK500用限制酶EcoRI和XmaIII切开，大片段于0.8％琼脂糖凝胶中经凝胶电泳分离，并用电洗脱分出。该片段与用氨基磷酸酯方法合成的DNA片段(1)(SEQ ID)NO：1)连结，并将此连结混合物转化到大肠杆菌中。
     -5              -1
 Ala Gly Pro Ala Ser Ala5′G GCC GGG CCG GCC TCC GCC3′      CCC GGC CGG AGG CGG(XmaIII)Asp Thr Thr Val Ser Glu ProGAC ACG ACC GTC TCC GAG CCG       3′CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A 5′
                        (EcoRI)得到的质粒PKK510含有前胰岛素原密码，其中tendamistat的信号序列后面跟着的是tendamistat的前7个氨基酸，再与其后面接着的是小型胰岛素原。
实施例2
用类似于EP-A0289936所述将质粒PKK400转变成表达质性PGF1的方法，将质料PKK510的转变成表达质粒PKF1：
将分离出的PKK510质粒DNA用限制性内切酶的SphI和SstI切割，小片段同融合基因分离，市售的表达质粒PIJ702(在英国诺维治的John Innes基金会可以买到)用同样的酶进行酶切，分离出大片段。将分出的两个片段连接，连接的混合物转化到变铅青链霉菌TK24。从抗硫链丝菌素，白色的转化子中分离质粒。对携带有插入片段的克隆菌株进行振摇培养对生成的融合蛋白加以研究。
编码融合蛋白基因的表达以已知的方法进行：将转化的菌株于25℃摆瓶中培养4天，培养液中的菌丝体离心分离，用20μl培养滤液，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳杆测培养液中的融合蛋白电泳后，考马斯蓝染色可清楚地看到蛋白带，这条蛋白带在对照实验中不出现，对照实验的菌株采用含PIJ702转化子进行。
培养滤液若用赖氨酰蛋白酶处理，可用凝胶电泳鉴定出脱一(B30)-苏-胰岛素，后者用已知对照样品确证了。
此外，还可用免疫吸印法或胰岛素-RIA法检测带有胰岛素抗体的培养基滤液中的融合蛋白。
实施例3
按照实施例1和2的方法，若加入SEQ ID NO：2合成片段，则得到质粒PK320和PKF2。
     -5              -1
 Ala Gly Pro Ala Ser Ala5′G GCC GGG CCG GCC TCC GCC3′      CCC GGC CGG AGG CGG
(XmaIII)
            5Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp ProGAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG         3′CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CTG GGC TTA A   5′
                                (EcoRI)
该质粒编码融合蛋白的密码，该融合蛋白与实施例1和2得到的蛋白区别在于：在tendamistat的前7个氨基酸中有门冬酰氨(代替了天然氨基酸丙氨酸的位置)，以及随后的在串联中新生成的氨基酸脯氨酸。门冬酰胺代替了丙氨酸后，融合蛋白的多余部分引入了附加的正电荷。产率意外地比实施例2高大约20-30％。
实施例4
按照实施例1和2的方法，但加入具有SEQ IN NO：3的合成片段，则得到质粒PKK330或PKF。
       -5               -1
   Ala Gly Pro Ala Ser Ala5′  G GCC GGG CCG GCC TCC GCC3′        CCC GGC CGG AGG CGG
 (XmaIII)
                 5
 Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Ala Pro
 GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCG        3′
 CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGG CGT GGC TTA A  5′该质粒与实施例1和2的区别是，它含有tendamistat有4个天然氨基酸的密码，与实施例相比，产率大约高10％。
实施例5
由PKK500编码的融合蛋白在tendamistat部分和胰岛素原B链之间含有一个连段序列，它含有氨基酸Asn-Ser-Asn-Gly-Lys的密码，如下面所述的那样，该末端的赖氨酸和C链生成的赖氨酸被精氨酸置换了，在这里利用了胰岛素原顺序的密码范围为B30到A1的单一的StyI切点。
分离出的PKK500质粒DNA用StyI酶切用S1核酸酶消化的除掉伸出的末端，过剩的核酸酶用酚氯仿萃取。线型的质粒最后再用EcoRI切开，用电泳方法将大的片段分离，并用电洗脱分出。该片段与合成的片段(4)连接(SEQ IN NO：4)
                B1              10Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser HisAAT TCG AAC GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
 GC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG(EcoRI)
                    20                              30Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe PheCTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTCGAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
            B30C(B31)Tyr Thr Pro Lys Thr ArgTAC ACC CCC AAG ACC CGCATG TGG GGG TTC TGG GCG并将连接的混合物转化到大肠杆菌对质料进行限制性内切酶酶切分析以确定所需克隆，形成了SstII新酶切位点。此外，对SphI-SstI片段进行了序列分析。
为了表达融合蛋白的编码基团，已测序的将(用顺序分析检查的)片段与用同样的酶切的PIJ702片段连接，从而形成表达载体PGF4。
由PGF4编码和分泌的融合蛋白，一方面可以用α-淀粉的抑制剂平皿试验(EP-A0161629，实施例3)证明，另一方面可以用类似于实施例2的方法由振摇的培养基液来证明。
实施例6
若按实施例5将片段(4)连到载体PKK510，520和530上，则得到载体PKK610，620和630，将带有融合蛋白密码序列各个SphI-SstI片段装到载体PIJ702上，则得到表达载体PKF11，12和13。分泌出的融合蛋白的表达按实施例2进行检定。
实施例7
为了提高质粒PIJ702衍生物的表达，通过PstI和SphI酶切，由质粒上除掉黑色素启动子，并加入合成片段(5)(SEQ ID NO：5)
    10        20        30        40        50CTGCAGTGATCAGGGGGACCCTTGTGCGAATTTCCGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGGGACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCC
                    SphI60        70        80ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGCTGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG这样，得到合成的和tendamistat启动子的串联构建物。该质粒称作PGR110。
若用SphO和SstI酶切后，将合成的片段(1)，(2)和(3)连至PGR110中，则得到表达载体PGR200，210和220。同样，用片段(4)得到表达载体PGR250，260和270。
实施例8
合并应用胰蛋白酶成类似作用酶和羧肽酶作用于胰岛素前体形成人胰岛素则在降解反应中迅速地裂解掉氨基末端的压载部分，这是很有利的，目的是使裂解反应有利于向B31(精氨酸)-胰岛素的方向进行。氨基酸的改变在氨基酸B1(苯丙氨酸)之前，可按如下进行：
按照实施例1进行，用内切酶EcoRi DraIII切开质粒PKK500，然后，原来的片段被用氨基磷酸酯方法合成的DNA片段(6)代替(SEQ ID NO：6)
               B1Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu5′AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC   3′3′     GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG       5′
  (EcoRI)                                            (DraIII)
在大肠杆菌中克隆和变铅青链霉菌表达分别按实施例1和2进行。分别得到质粒PKK640和表达质粒PKF14。
按照实施例5(连接上片段(4)后)用此质粒也可进行类似的处理，这样得到质粒PKK650和PKF15。  表1
                B1             10ASN SER ASN GLY LYS PHE VAL ASN GLN HIS LEU CYS GLY SER HISAAT TCG AAC GGC AAG TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
 GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG(EcoRI)
            20                                  30LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE PHECTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTCGAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG
                 C  A1         40TYR THR PRO LYS THR LYS GLY ILE VAL GLU GLN CYS CYS THR SERTAC ACC CCC AAG ACC AAG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCCATG TGG GGG TTC TGG TTC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG
            50ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STPATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAATAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATTGTC GAC CTG CAG CCACAG CTG GAC GTC GGT TCG ASalI              (HindIII)
表25′-CGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGGATC
GCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTGCACCTAG-5′

Claims (1)

1.制备融合蛋白的方法，其特征是，将欲得到的蛋白的结构基因偶联到信号序列和tendamistat的大约前10个氨基端的氨基酸的密码上，该基因结构在链霉菌宿主细胞中得到表达，并由培养基中分离出分泌的融合蛋白，tendamistat基因的序列可被修饰。
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