JPS6070085A - 誘導可能なポ−タブル・コントロ−ル系 - Google Patents
誘導可能なポ−タブル・コントロ−ル系Info
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- JPS6070085A JPS6070085A JP59134043A JP13404384A JPS6070085A JP S6070085 A JPS6070085 A JP S6070085A JP 59134043 A JP59134043 A JP 59134043A JP 13404384 A JP13404384 A JP 13404384A JP S6070085 A JPS6070085 A JP S6070085A
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- Japan
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- promoter
- operator
- control system
- gene
- repressor
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
外来性タンパク質を生合成する方法に関するものである
。さらに詳しくは、本発明は、所望の遺伝（ ２−２
） よび実験者によってコントロールされる諸要素（ファク
ター）に応じて、該遺伝子によって暗号化されているタ
ンパク質を生産する方法に関するものである。本発明は
、広範な原核性宿主に適用することができる。
。さらに詳しくは、本発明は、所望の遺伝（ ２−２
） よび実験者によってコントロールされる諸要素（ファク
ター）に応じて、該遺伝子によって暗号化されているタ
ンパク質を生産する方法に関するものである。本発明は
、広範な原核性宿主に適用することができる。
今日では、所望のタンパク質を得る手段としての組換え
技術の満足すべき利用法は、単に適当な遺伝子を発現ベ
クターに挿入し、適宜な宿主を形質転換することに止ま
るものでないということは明確に理解されている。発現
系が宿主細胞に識別されなければならないことのみなら
ず、該細胞が生産される外来性タンパク質の量に最も良
く耐えることができる時にだけ、上記タンパク質を高レ
ベルに生合成させる様、その発現の時期を調節すること
が必要である。外来性タンパク質の遺伝子は、しばしば
、どの様な内因性タンパク質の遺伝子よりもかなり多量
のタンパク質を生産するように発現される。しかしーも
しもその様な大量のタンパク質が究極目的であれば、そ
れは致死的であるので一往々にして発現を増殖相から分
離することが最善策である。別法として、細胞内の他の
諸々の事象との関係において、その機能を最適なものと
するために、タンパク質の生合成を特定のレベルに調節
することが望ましい。
技術の満足すべき利用法は、単に適当な遺伝子を発現ベ
クターに挿入し、適宜な宿主を形質転換することに止ま
るものでないということは明確に理解されている。発現
系が宿主細胞に識別されなければならないことのみなら
ず、該細胞が生産される外来性タンパク質の量に最も良
く耐えることができる時にだけ、上記タンパク質を高レ
ベルに生合成させる様、その発現の時期を調節すること
が必要である。外来性タンパク質の遺伝子は、しばしば
、どの様な内因性タンパク質の遺伝子よりもかなり多量
のタンパク質を生産するように発現される。しかしーも
しもその様な大量のタンパク質が究極目的であれば、そ
れは致死的であるので一往々にして発現を増殖相から分
離することが最善策である。別法として、細胞内の他の
諸々の事象との関係において、その機能を最適なものと
するために、タンパク質の生合成を特定のレベルに調節
することが望ましい。
従来技術
そこで、当該技術分野の研究者は、プロモーター配列内
に含まれているかーあるいは、そのやや下流にあるオペ
レーター配列と結合するリプレッサーにより、コントロ
ールされやすいプロモーター類を用いていた。
に含まれているかーあるいは、そのやや下流にあるオペ
レーター配列と結合するリプレッサーにより、コントロ
ールされやすいプロモーター類を用いていた。
微生物は、それ自身−タンパク質の生成レベルを調節す
るために、いくつかのコントロール機構を活用している
。ある種の微生物質およびあるタンパク質については、
そのコントロールは、リボゾームにおけるタンパク質の
生成速度に対する直接的な阻害または促進作用、もしく
は、ｍ Ｒ Ｎ Ａに対する安定化または非安定化作用
を介して、翻訳段階で実施されている。この翻訳段階に
おける調節は、現状においては、た易く実験者によって
調子良く自由自在にコントロールすることができるもの
でなく、未だかつて、例えばタンパクの生合成を高レベ
ルにする、などの組換え技術」二の目的を達成するため
に利用されたことはない。次に、転写の段階において微
生物によって使用されるコントロール手段について一少
なくとも２つの方法に がこれまで記述されている。その内の１つは、微△ 生物がその生活環（ライフサイクル）の様々な段階にお
いて生産するものであってーＲＮＡポリメラーゼと結合
し、該ポリメラーゼの、転写すべきＤＮＡ配列のある特
定のプロモータ一部位に対する適合性をより高く、ある
いはより低くするよう作用する物質である「シグマ因子
」である。しかしながらーこの方法は望ましいレベルの
コントロール効果を得ることができないので、この方法
もまた、今日では、翻訳段階でのコントロールと同様、
発現の外部からのコントロールを有効なものとするため
の手段として採り上げられていない。
るために、いくつかのコントロール機構を活用している
。ある種の微生物質およびあるタンパク質については、
そのコントロールは、リボゾームにおけるタンパク質の
生成速度に対する直接的な阻害または促進作用、もしく
は、ｍ Ｒ Ｎ Ａに対する安定化または非安定化作用
を介して、翻訳段階で実施されている。この翻訳段階に
おける調節は、現状においては、た易く実験者によって
調子良く自由自在にコントロールすることができるもの
でなく、未だかつて、例えばタンパクの生合成を高レベ
ルにする、などの組換え技術」二の目的を達成するため
に利用されたことはない。次に、転写の段階において微
生物によって使用されるコントロール手段について一少
なくとも２つの方法に がこれまで記述されている。その内の１つは、微△ 生物がその生活環（ライフサイクル）の様々な段階にお
いて生産するものであってーＲＮＡポリメラーゼと結合
し、該ポリメラーゼの、転写すべきＤＮＡ配列のある特
定のプロモータ一部位に対する適合性をより高く、ある
いはより低くするよう作用する物質である「シグマ因子
」である。しかしながらーこの方法は望ましいレベルの
コントロール効果を得ることができないので、この方法
もまた、今日では、翻訳段階でのコントロールと同様、
発現の外部からのコントロールを有効なものとするため
の手段として採り上げられていない。
第２の転写段階での方法には、「オペレーター」（すな
わち、オペロン内でプロモーターに接近して存在し、該
プロモーターに含まれるかーそのやや下流にあり、転写
を中止すべき時にリプレッサーが結合する部位である）
が用いられる。リプレッサーはその総有効量が欠如する
ことに呼応してオペレーターから離脱する。これは、細
胞に、リプレッサータンパク質を不活化する誘導物質（
インジューサー）を添加することにより誘導される。こ
れが、正にこれまで生物技術者達が自らの発現に対する
コントロールを有効なものにぜんが為に選んできたもの
である。その例は５ｈｉｎｓｋｙ 。
わち、オペロン内でプロモーターに接近して存在し、該
プロモーターに含まれるかーそのやや下流にあり、転写
を中止すべき時にリプレッサーが結合する部位である）
が用いられる。リプレッサーはその総有効量が欠如する
ことに呼応してオペレーターから離脱する。これは、細
胞に、リプレッサータンパク質を不活化する誘導物質（
インジューサー）を添加することにより誘導される。こ
れが、正にこれまで生物技術者達が自らの発現に対する
コントロールを有効なものにぜんが為に選んできたもの
である。その例は５ｈｉｎｓｋｙ 。
Ｊ 、 Ｊ 、ら、Ｃ，ｅｎｅ、１６ ：２７５（１９
８１）に見られる。しかしながら、従来、この種の試み
は、Ｅ。
８１）に見られる。しかしながら、従来、この種の試み
は、Ｅ。
ｃｏｌｉ（大腸菌）およびその近縁のグラム陰性宿主に
おいてのみ利用可能であった。何故ならば、オペレータ
ー／リプレッサー機構について明らかにされているのは
上記の系内のみであったからである。しかもその様なコ
ントロール系は−あらゆる種類の所望の発現のための遺
伝子と結合した状態において−そのコントロール系にと
って天然の宿主以外の宿主内で機能を発揮し得るように
は組立てられていなかった。この様に機能することがで
きれば、このコントロール系は「ポータブルー即ち移動
可能」なものになる。
おいてのみ利用可能であった。何故ならば、オペレータ
ー／リプレッサー機構について明らかにされているのは
上記の系内のみであったからである。しかもその様なコ
ントロール系は−あらゆる種類の所望の発現のための遺
伝子と結合した状態において−そのコントロール系にと
って天然の宿主以外の宿主内で機能を発揮し得るように
は組立てられていなかった。この様に機能することがで
きれば、このコントロール系は「ポータブルー即ち移動
可能」なものになる。
本発明はプロモーター／オペレーター配列を含ムホータ
ブルなコントロール系を提供するものであり、ここで、
このオペレーターは一潜在的に、リプレッサーおよびこ
れも適当なプロモーターに機能的に結合している、この
リプレッサーのための暗号配列の支配下にあるものであ
る。その様な配列の組合わせは、この様な内因性のコン
トロール系が使われていることが知られていないような
宿主をも含めて、極めて多種の宿主類に適用することが
できる。この様に、本発明は、プラスミド・ベクター類
または所望の宿主微生物のゲノムに挿入し得るコントロ
ール系であって、それと機能的に結合している遺伝子配
列に対して誘導可能な転写コントロールを付与すること
のできるコントロール系を提供するものである。本発明
のコントロ系 一ルは−いわゆる伝統的なＥ、ｃｏｌｉ宿主のみなら△ ず、より重要な点であるが、あまり伝統的でないグラム
陽性宿主類においても、操作し易くコントロールし易い
、所望のタンパク質を暗号化している遺伝子のための好
適な調節システムである。後者の宿主系には、自身の遺
伝的補体およびプラスミド物質内に、この様な遺伝子発
現コントロール系を全く有していないか、もしくは、こ
の様な調節システムを持ち合わせていることが未だ知ら
れていないような宿主も含まれる。
ブルなコントロール系を提供するものであり、ここで、
このオペレーターは一潜在的に、リプレッサーおよびこ
れも適当なプロモーターに機能的に結合している、この
リプレッサーのための暗号配列の支配下にあるものであ
る。その様な配列の組合わせは、この様な内因性のコン
トロール系が使われていることが知られていないような
宿主をも含めて、極めて多種の宿主類に適用することが
できる。この様に、本発明は、プラスミド・ベクター類
または所望の宿主微生物のゲノムに挿入し得るコントロ
ール系であって、それと機能的に結合している遺伝子配
列に対して誘導可能な転写コントロールを付与すること
のできるコントロール系を提供するものである。本発明
のコントロ系 一ルは−いわゆる伝統的なＥ、ｃｏｌｉ宿主のみなら△ ず、より重要な点であるが、あまり伝統的でないグラム
陽性宿主類においても、操作し易くコントロールし易い
、所望のタンパク質を暗号化している遺伝子のための好
適な調節システムである。後者の宿主系には、自身の遺
伝的補体およびプラスミド物質内に、この様な遺伝子発
現コントロール系を全く有していないか、もしくは、こ
の様な調節システムを持ち合わせていることが未だ知ら
れていないような宿主も含まれる。
発明の要約
本発明は、所望の暗号化された配列を発現するための、
ボータプルな細菌性転写コントロール系に関するもので
ある。それは、基本的には、該暗号配列の発現に用い得
る、プロモーター／オペレーター／リプレッサーからな
る一つの組合わせである。このものは−リプレッサーと
結合し得るオペレーターＤＮＡ配列−および該オペレー
ターに適合するリプレッサーを暗号化しているＤＮＡ配
列を含む。：このオペレーター、リプレッサー暗号化配
列並びに所望の遺伝子配列は一各々、１または１以上の
プロモーター類に機能的に結合している。即ち本発明は
、誘導によってその作用を調節し得ると共に一グラム陽
性菌をも含めて宿主細菌株一般に適用することのできる
転写コントロール系を提供するものである。また本発明
は−このコントロール系を用いて所望の遺伝子の発現を
調節する方法、並びにその様な系を含有する発現ベクタ
ー類に関するものである。さらにまた本発明は−これら
のベクターで形質転換された菌−およびその様な菌の培
養物に関するものである。
ボータプルな細菌性転写コントロール系に関するもので
ある。それは、基本的には、該暗号配列の発現に用い得
る、プロモーター／オペレーター／リプレッサーからな
る一つの組合わせである。このものは−リプレッサーと
結合し得るオペレーターＤＮＡ配列−および該オペレー
ターに適合するリプレッサーを暗号化しているＤＮＡ配
列を含む。：このオペレーター、リプレッサー暗号化配
列並びに所望の遺伝子配列は一各々、１または１以上の
プロモーター類に機能的に結合している。即ち本発明は
、誘導によってその作用を調節し得ると共に一グラム陽
性菌をも含めて宿主細菌株一般に適用することのできる
転写コントロール系を提供するものである。また本発明
は−このコントロール系を用いて所望の遺伝子の発現を
調節する方法、並びにその様な系を含有する発現ベクタ
ー類に関するものである。さらにまた本発明は−これら
のベクターで形質転換された菌−およびその様な菌の培
養物に関するものである。
他の観点から言えば、本発明は、ペリシリナーゼプロモ
ーターのためのＲＮＡポリメラーゼ認識部位（サイト）
の配列と、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ ） フロモ
ーター／オペレーターのオペレーター領域を含有するハ
イブリッド（雑種）プロモーター／オペレーター、およ
び、同様に−ｓｐ。
ーターのためのＲＮＡポリメラーゼ認識部位（サイト）
の配列と、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ ） フロモ
ーター／オペレーターのオペレーター領域を含有するハ
イブリッド（雑種）プロモーター／オペレーター、およ
び、同様に−ｓｐ。
−１フアージプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ認識部
位の配列と一１ａｃプロモーター／オペレーターのオペ
レーター領域を含有しているハイブリッドプロモーター
に関するものである。これらのハイフリットは、本発明
方法におけるリプレッサ−コントロールのためのターゲ
ット（標的）として特に有効である。
位の配列と一１ａｃプロモーター／オペレーターのオペ
レーター領域を含有しているハイブリッドプロモーター
に関するものである。これらのハイフリットは、本発明
方法におけるリプレッサ−コントロールのためのターゲ
ット（標的）として特に有効である。
今日の知識からしても、本発明のコントロール系が様々
な宿主において作動し得るということは、いくつかの理
由から驚異的な事である：即ち、１ａｃＩ ＩＪプレツ
サーは通常のＥ、ｃｏｌｉ内の環境ではマルチマーとし
て作用することが知られている。しかし、他の微生物に
おける細胞環境が、このリプレッサーに、凝集し得る様
な正しい立体配置をとらせるか否かは不確かである。さ
らには−非一大腸菌群の宿主のＲＮＡポリメラーゼ類は
、そのオペレーター／リプレッサー凝集が−そのポリメ
ラーゼを阻害するのに役立たない程、Ｅ、ｃｏｌｉのｋ
ＮＡポリメラーゼと異っているかもしれない。最後に、
ダラム陽性菌について言えば−リプレッサーとの接触が
可能となる様、適当な誘導物質が細胞内に浸透し得るか
否かさえも不明である。
な宿主において作動し得るということは、いくつかの理
由から驚異的な事である：即ち、１ａｃＩ ＩＪプレツ
サーは通常のＥ、ｃｏｌｉ内の環境ではマルチマーとし
て作用することが知られている。しかし、他の微生物に
おける細胞環境が、このリプレッサーに、凝集し得る様
な正しい立体配置をとらせるか否かは不確かである。さ
らには−非一大腸菌群の宿主のＲＮＡポリメラーゼ類は
、そのオペレーター／リプレッサー凝集が−そのポリメ
ラーゼを阻害するのに役立たない程、Ｅ、ｃｏｌｉのｋ
ＮＡポリメラーゼと異っているかもしれない。最後に、
ダラム陽性菌について言えば−リプレッサーとの接触が
可能となる様、適当な誘導物質が細胞内に浸透し得るか
否かさえも不明である。
図面の説明
第１図はシャ乎トルベクター、ＰＢＳ４２、ｐＢＳＡ４
２、およびＰＢＳＡ４２サブクローンの組立て図である
。
２、およびＰＢＳＡ４２サブクローンの組立て図である
。
第２図はｐａｃ−１プロモーター・オペレーターのコン
トロール下にあ゛るペニシリナーゼ遺伝子を含有してい
るプラスミドｐＢｓＡ１０５の組立て図である。
トロール下にあ゛るペニシリナーゼ遺伝子を含有してい
るプラスミドｐＢｓＡ１０５の組立て図である。
第３図は１ａｃｌ：ＩＪプレツサーの発現ベクターであ
るプラスミドｐｌ−Ｑ４５の組立て図である。
るプラスミドｐｌ−Ｑ４５の組立て図である。
第４図は本発明に係るポータプルシステム係）のコント
ロール下にあるペニシリナーゼ発現ベクター、ｐ Ａ
Ｉ Ｑ ２５の組立て図である。
ロール下にあるペニシリナーゼ発現ベクター、ｐ Ａ
Ｉ Ｑ ２５の組立て図である。
第５図はＰＶＡ平板」二で増殖させたＩＰＴＧ誘導細胞
におけるペニシリナーゼの発現の検出を示す図である。
におけるペニシリナーゼの発現の検出を示す図である。
第６図はｐ Ａ Ｉ Ｑ ２５で形質転換された桿菌（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）の培養物の上澄みの５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ測定の結果を示すものである。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）の培養物の上澄みの５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ測定の結果を示すものである。
第７図は本発明のコントロール系の下にある白血球イン
ターフェロンＡの発現ベクターＰＬＴＱ１の組立て図並
びにｐＡＩＱ１２０の組立て図である。
ターフェロンＡの発現ベクターＰＬＴＱ１の組立て図並
びにｐＡＩＱ１２０の組立て図である。
第８図はｐａｃ−１および５ｐａｃ−１ハイブリツドプ
ロモーター／オペレーター、それぞれの全ヌクレオチド
配列を示す図である。
ロモーター／オペレーター、それぞれの全ヌクレオチド
配列を示す図である。
第９図はヒト白血球インターフェロンＡ遺伝子に機能的
に結合した５ｐａｃ−１プロモーター／オペレーターを
含有しているｐＳＰＩＦ−１［の組立て図である。
に結合した５ｐａｃ−１プロモーター／オペレーターを
含有しているｐＳＰＩＦ−１［の組立て図である。
第１０図は染色体−補体挿入体を含むｐＥＲの組立て図
である。
である。
第１１図は組込み可能なプラスミドの中に、ｐａｃ−１
のコントロール下にあるペニシリナーゼ遺伝子を含むＰ
ＰＣＸ−２１の組立て図である。
のコントロール下にあるペニシリナーゼ遺伝子を含むＰ
ＰＣＸ−２１の組立て図である。
第１２図はＰＩＱ４５の組立てに用いたーＥｃｏＲＩお
よびＢｓｔＥＨ部位を含有するフラグメントの配列を示
す図である。
よびＢｓｔＥＨ部位を含有するフラグメントの配列を示
す図である。
詳細な説明
Ａ、定義
本明細書において−ＤＮＡ配列について「機能的に結合
した」という場合には、各々の機能が相互に依存する様
な仕方で並列に配置されているＤＮＡ配列を意味する。
した」という場合には、各々の機能が相互に依存する様
な仕方で並列に配置されているＤＮＡ配列を意味する。
例えば、暗号配列に対して機能的に結合しているプロモ
ーターは一該暗号配列を発現させることができる。また
、プロモーターに対して機能的に結合しているオペレー
ターは、リプレッサータンパク質と結合した場合にはこ
のプロモーターの機能を阻害することができ一他方、字
≠÷参抑制を解除された場合にはこのプロモーターを正
常に機能せしめることができる。この様なオペレーター
配列はプロモーター配列に重なって存在していてもよく
、あるいはその下流にあってもよい。「機能的に結合し
た」状態は、２個の配列の間の機能的な相互関係が維持
されている限り、その配置とは無関係である。
ーターは一該暗号配列を発現させることができる。また
、プロモーターに対して機能的に結合しているオペレー
ターは、リプレッサータンパク質と結合した場合にはこ
のプロモーターの機能を阻害することができ一他方、字
≠÷参抑制を解除された場合にはこのプロモーターを正
常に機能せしめることができる。この様なオペレーター
配列はプロモーター配列に重なって存在していてもよく
、あるいはその下流にあってもよい。「機能的に結合し
た」状態は、２個の配列の間の機能的な相互関係が維持
されている限り、その配置とは無関係である。
「適合し得るリプレッサー」という語句は、ある種のタ
ンパク質であって、オペレーター配列（その蛋白質が適
合性を有するもの）に結合し、それによって、該オペレ
ーターに、そのオペレーターが「機能的に結合」してい
るプロモーターに対する阻害効果を示させる様なタンパ
ク質を意味する。従って、「適合性を有する」リプレッ
サーという用語は、関連するオペレーター配列との関係
においてのみ意味を有するのである。
ンパク質であって、オペレーター配列（その蛋白質が適
合性を有するもの）に結合し、それによって、該オペレ
ーターに、そのオペレーターが「機能的に結合」してい
るプロモーターに対する阻害効果を示させる様なタンパ
ク質を意味する。従って、「適合性を有する」リプレッ
サーという用語は、関連するオペレーター配列との関係
においてのみ意味を有するのである。
「誘導可能な」プロモーターという語句は一層プロモー
ター系を含有する微生物が存在している培地の温度を変
化させたり、あるいは該培地に化合物を加える等の単純
な操作に応じてｑ制が解除されること（脱抑靜−＝シ）
により、「作動を開始」することのできるプロモーター
であり、随意な発現システムを与えるプロモーターを意
味する。その様な「誘導可能な」コントロールシステム
の代表例としては、「ＩａＣリプレッサー」を除去する
ことによって誘導され得るオペレーター配列を下流に含
有しているｐｌａｃＵＶ５がある。
ター系を含有する微生物が存在している培地の温度を変
化させたり、あるいは該培地に化合物を加える等の単純
な操作に応じてｑ制が解除されること（脱抑靜−＝シ）
により、「作動を開始」することのできるプロモーター
であり、随意な発現システムを与えるプロモーターを意
味する。その様な「誘導可能な」コントロールシステム
の代表例としては、「ＩａＣリプレッサー」を除去する
ことによって誘導され得るオペレーター配列を下流に含
有しているｐｌａｃＵＶ５がある。
この様ハ除去は一培地にインプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトジッド（ｉＰＴＧ）を加えることにより誘発する
ことができる。即ち−この誘導物質（インジューサー）
は細胞内に透過して入り、リプレッサータンパク質と結
合し、その結果−形質転換されていない細胞内で、もし
くは、何らかの遺伝子がｐｌａｃＵＶ５プロモーターの
コントロール下に置かれている様な組換え発現ベクター
によって形質転換された細胞内で、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を発現させることになる。この系はアメリカ特
許出願第２６４．３′０６号、１９８１年５月１８日出
願（ＥＰＯ公開番号第００６７５４０号の下、１９８２
年１２月２２日に公開）に詳しく述べられている。もう
一つの一般的なプロモーターは（ただし、このものの被
誘導能力は、培地への添加物に対する感受性が低い）、
アメリカ特許出願第１３３．２９６号、１９８０年３月
２４日出願（ＥＰＯ公開番号第００３６７７６号）に記
載のｔｒｐプロモーターである。このプロモーターは、
培地にインドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えることに
よって誘導される。この誘導物質は−トリプトファンと
競合してリプレッサータンパク質に結合する。しかし、
中≠≠昏抑制を解除するための最少要求量がタンパク合
成に必須なトリプトファンの存在によって支配されるの
で、前述のＩａｃプロモーターに比べて一参≠÷＃抑制
を随意な状態に適合させるという点では劣っている。
ラクトジッド（ｉＰＴＧ）を加えることにより誘発する
ことができる。即ち−この誘導物質（インジューサー）
は細胞内に透過して入り、リプレッサータンパク質と結
合し、その結果−形質転換されていない細胞内で、もし
くは、何らかの遺伝子がｐｌａｃＵＶ５プロモーターの
コントロール下に置かれている様な組換え発現ベクター
によって形質転換された細胞内で、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を発現させることになる。この系はアメリカ特
許出願第２６４．３′０６号、１９８１年５月１８日出
願（ＥＰＯ公開番号第００６７５４０号の下、１９８２
年１２月２２日に公開）に詳しく述べられている。もう
一つの一般的なプロモーターは（ただし、このものの被
誘導能力は、培地への添加物に対する感受性が低い）、
アメリカ特許出願第１３３．２９６号、１９８０年３月
２４日出願（ＥＰＯ公開番号第００３６７７６号）に記
載のｔｒｐプロモーターである。このプロモーターは、
培地にインドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えることに
よって誘導される。この誘導物質は−トリプトファンと
競合してリプレッサータンパク質に結合する。しかし、
中≠≠昏抑制を解除するための最少要求量がタンパク合
成に必須なトリプトファンの存在によって支配されるの
で、前述のＩａｃプロモーターに比べて一参≠÷＃抑制
を随意な状態に適合させるという点では劣っている。
「ポータプルな」コントロール系という語句は、所望の
遺伝子配列に機能的にライゲート（結合）させることが
できると共に一一般の原核性宿主内で発現をコントロー
ルすることができる系を意味し−この原核性宿主は、そ
の系の起源である宿主に限定されない。その様な能力を
有する宿主には、原始核を持つ細菌の系統図全域の菌類
が含まれる。
遺伝子配列に機能的にライゲート（結合）させることが
できると共に一一般の原核性宿主内で発現をコントロー
ルすることができる系を意味し−この原核性宿主は、そ
の系の起源である宿主に限定されない。その様な能力を
有する宿主には、原始核を持つ細菌の系統図全域の菌類
が含まれる。
「ダラム陽性」菌という語句は、細胞内に物質を入れ、
または出すような活性輸送を許容する単一膜で被われて
いる菌であって、標準的な定義に従う。強さは、受動的
な透過のみが可能な細胞壁によって付与される。本発明
においては、従来、この種の微生物では誘導可能な転写
時のコントロール系が得られなかったことから−この種
の微生物は重要である。即ち、本発明のポータプル・コ
ントロール系は−この種の微生物においても、そのよう
なコントロール作用を示すのである。
または出すような活性輸送を許容する単一膜で被われて
いる菌であって、標準的な定義に従う。強さは、受動的
な透過のみが可能な細胞壁によって付与される。本発明
においては、従来、この種の微生物では誘導可能な転写
時のコントロール系が得られなかったことから−この種
の微生物は重要である。即ち、本発明のポータプル・コ
ントロール系は−この種の微生物においても、そのよう
なコントロール作用を示すのである。
他方、グラム陰性菌の代表的な菌である大腸菌、Ｅ、
ｃｏｌｉ （活性輸送の可能な２個の被覆膜を持っテイ
ル）は、上で述べたものと類似のコントロール系ニつい
ての伝統的な宿主である。シュートモ（１ω ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）の如き一遠縁のグラ
ム陰性の菌株については、その様な系を有することが知
られていない。勿論１１本発明のポータプルコントロー
ル系の主な利点は、それが広範な宿主に利用できること
にある。しかしながら、このことは、より一層日常的に
使用されている＝Ｅ、ｃｏｌｉの如き宿主系に適用し得
ないことを意味するものではない。
ｃｏｌｉ （活性輸送の可能な２個の被覆膜を持っテイ
ル）は、上で述べたものと類似のコントロール系ニつい
ての伝統的な宿主である。シュートモ（１ω ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）の如き一遠縁のグラ
ム陰性の菌株については、その様な系を有することが知
られていない。勿論１１本発明のポータプルコントロー
ル系の主な利点は、それが広範な宿主に利用できること
にある。しかしながら、このことは、より一層日常的に
使用されている＝Ｅ、ｃｏｌｉの如き宿主系に適用し得
ないことを意味するものではない。
Ｂ、一般的な説明
本発明のコントロール系を得るには、プロモーター／オ
ペレーターと、該プロモーター／オペレーターのオペレ
ーターに結合するリプレッサーを暗号化している遺伝子
（適当なプロモーター調節の下にある）とを結合させる
のに組換え技術を利用する。次いで、このパッケージ（
組合せ）を所望の遺伝子と一緒に、機能し得る状態に配
する。
ペレーターと、該プロモーター／オペレーターのオペレ
ーターに結合するリプレッサーを暗号化している遺伝子
（適当なプロモーター調節の下にある）とを結合させる
のに組換え技術を利用する。次いで、このパッケージ（
組合せ）を所望の遺伝子と一緒に、機能し得る状態に配
する。
従って、本発明のコントロール・パッケーシハ、その下
で所望の遺伝子が機能する様なプロモーター／オペレー
ターを提供するのみならず、そのコントロール機構、即
ち、リプレッサーの発現系を１１’７１ も提供するものである。この様なものは一自身のゲノム
内にリプレッサータンパク質を発現させ得る遺伝子を有
しているＥ、 ｃｏｌｉの如き微生物にとっては必須で
はないが、リプレッサーを暗号化していない微生物が宿
主である場合には必要な配列部分である。
で所望の遺伝子が機能する様なプロモーター／オペレー
ターを提供するのみならず、そのコントロール機構、即
ち、リプレッサーの発現系を１１’７１ も提供するものである。この様なものは一自身のゲノム
内にリプレッサータンパク質を発現させ得る遺伝子を有
しているＥ、 ｃｏｌｉの如き微生物にとっては必須で
はないが、リプレッサーを暗号化していない微生物が宿
主である場合には必要な配列部分である。
所望のタンパク質を暗号化しているＤＮＡに機能−的に
結合したコントロール系を組立てる実際の方法は、直列
式（タンデム）の組立て法に帰する。
結合したコントロール系を組立てる実際の方法は、直列
式（タンデム）の組立て法に帰する。
所望の遺伝子はプロモーター／オペレーター、好ましく
はハイブリッドプロモーター／オペレーターのコントロ
ール下に置かれる。ハイブリッドプロモーター／オペレ
ーターを用いることができるので、使用を意図する宿主
微生物内で有効であることが知られているプロモーター
を選択すると共に、細胞外から導入される化合物の影響
を受け得るリプレッサーによってコントロールされるこ
とが知られてオペレータ一群から選択されたオペレータ
ー（誘導可能なオペレーター）とを用いることができる
。従って−１つの好ましい実施態様として、Ｂ、 ５ｕ
ｂｌｉｌｉｓ内で機能的であることが知られているペニ
シリナーゼプロモーターと一日常的に使用される誘導物
質・（ＩＰＴＧ）の影響を受けるタンパク質によってコ
ントロールされるｌａｃオペレーターとを結合させると
よい。この様にすることにより、このプロモーター／オ
ペレーターは、伝統的な大腸菌型のコントロール系を使
うこともできるが、それ自身は非大腸菌糸である宿主に
も用いることができるという特徴を有することになる。
はハイブリッドプロモーター／オペレーターのコントロ
ール下に置かれる。ハイブリッドプロモーター／オペレ
ーターを用いることができるので、使用を意図する宿主
微生物内で有効であることが知られているプロモーター
を選択すると共に、細胞外から導入される化合物の影響
を受け得るリプレッサーによってコントロールされるこ
とが知られてオペレータ一群から選択されたオペレータ
ー（誘導可能なオペレーター）とを用いることができる
。従って−１つの好ましい実施態様として、Ｂ、 ５ｕ
ｂｌｉｌｉｓ内で機能的であることが知られているペニ
シリナーゼプロモーターと一日常的に使用される誘導物
質・（ＩＰＴＧ）の影響を受けるタンパク質によってコ
ントロールされるｌａｃオペレーターとを結合させると
よい。この様にすることにより、このプロモーター／オ
ペレーターは、伝統的な大腸菌型のコントロール系を使
うこともできるが、それ自身は非大腸菌糸である宿主に
も用いることができるという特徴を有することになる。
組立てられたハイブリッドプロモーター／オペレーター
／所望の遺伝子オペロンを、−各端のオペロンのプロモ
ーター／オペレーターに適合し得るリプレッサーの暗号
遺伝子に機能的に結合したプロモーターであって、その
宿主細胞に適合し得るプロモーターを含有しているもう
１つのオペロンと結合させるか、またはコトランスフエ
クト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ ）させる。例えば、
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓにおいて用いるのに適当な組合
せは−ペニシリナーゼプロモーターが１ａｃＩ リプレ
ッサーの暗号遺伝子に機能的に結合したものである。し
かしながら、所望の宿主内で機能するあらゆるプロモー
ターもまた用いることができる。組換えＤＮＡ合成に最
も一般的に用いられるプロモーター類には、β−ラクタ
マーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース・プロモー
ター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ。
／所望の遺伝子オペロンを、−各端のオペロンのプロモ
ーター／オペレーターに適合し得るリプレッサーの暗号
遺伝子に機能的に結合したプロモーターであって、その
宿主細胞に適合し得るプロモーターを含有しているもう
１つのオペロンと結合させるか、またはコトランスフエ
クト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ ）させる。例えば、
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓにおいて用いるのに適当な組合
せは−ペニシリナーゼプロモーターが１ａｃＩ リプレ
ッサーの暗号遺伝子に機能的に結合したものである。し
かしながら、所望の宿主内で機能するあらゆるプロモー
ターもまた用いることができる。組換えＤＮＡ合成に最
も一般的に用いられるプロモーター類には、β−ラクタ
マーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース・プロモー
ター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ。
２７５：６１５（１９７８）ＨＩｔａｋｕｒａら一５ｃ
ｉｅｎｃｅ−１９８：１０５６ （１，９７７）ＨＧｏ
ｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ２８１ ：５４４（１９７
９））およびトリプトファン（ｔｒｐ ）プロモーター
系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ、、８ ：４０５７ （１９８０）； ＥＰＯＡＰ
Ｐｌ、 Ｐｕｂｌ １ｋｏ０３６７７６）が含まれる。
ｉｅｎｃｅ−１９８：１０５６ （１，９７７）ＨＧｏ
ｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ２８１ ：５４４（１９７
９））およびトリプトファン（ｔｒｐ ）プロモーター
系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ、、８ ：４０５７ （１９８０）； ＥＰＯＡＰ
Ｐｌ、 Ｐｕｂｌ １ｋｏ０３６７７６）が含まれる。
コレらの系が最もよく用いられるが、その他にも微生物
のプロモーター類が発見され、使用されており、それら
は、そのヌクレオチド配列も詳しく公表されている。熟
練した作業者はそれらをプラスミドベクターと機能的に
ライゲーション（結合）させることができ、またそれら
を適当なオペレーター配列とハイブリッド形成させるこ
とができるものである（ ５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃ
ｅ１ｌ ２０ ：２６９（１９８０））。
のプロモーター類が発見され、使用されており、それら
は、そのヌクレオチド配列も詳しく公表されている。熟
練した作業者はそれらをプラスミドベクターと機能的に
ライゲーション（結合）させることができ、またそれら
を適当なオペレーター配列とハイブリッド形成させるこ
とができるものである（ ５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃ
ｅ１ｌ ２０ ：２６９（１９８０））。
この様に、コントロール系ベクターは２つの完全なオペ
ロンを含むものであり、その１つは所望の遺伝子発現の
ためのコントロール可能なオペロンであって、もう１つ
はこの所望の遺伝子を発現させるプロモーター／オペレ
ーターを守→辷−牛抑制することのできるコントロール
タンパク質を産生じ得るオペロンである。
ロンを含むものであり、その１つは所望の遺伝子発現の
ためのコントロール可能なオペロンであって、もう１つ
はこの所望の遺伝子を発現させるプロモーター／オペレ
ーターを守→辷−牛抑制することのできるコントロール
タンパク質を産生じ得るオペロンである。
以下に述べる好ましい態様においては一所望の遺伝子配
列はＢａｃｉｌｌｕｓのペニシリナーゼ遺伝子、および
白血球インターフェロンの暗号遺伝子であるが、勿論、
適当な組換え技術を用いれば−どの様な所望の遺伝子を
も本発明のコントロールシステムの下に置くことができ
る。
列はＢａｃｉｌｌｕｓのペニシリナーゼ遺伝子、および
白血球インターフェロンの暗号遺伝子であるが、勿論、
適当な組換え技術を用いれば−どの様な所望の遺伝子を
も本発明のコントロールシステムの下に置くことができ
る。
コントロール系の全要素と所望の遺伝子とを同じ発現ベ
クターに含有させた組立て物が好都合である。しかし、
この様な組立て物は本発明を実施し得る上での、１つの
方法にすぎない。また、例えば−プロモーター／オペレ
ーター／所望の遺伝子からなる系を１つのプラスミドに
支持させ、リプレッサー発現系をもう１つのプラスミド
に支持させ−これらの両プラスミドで適当な宿主を同時
形質転換させることもできる。さらに、組み立てられた
プラスミド上に、宿主ゲノム内のものと相補性を有する
配列を使用すれば一該プラスミド配列の、宿主ゲノム内
への組込みを促進させるのに効果的である。従って、本
発明のコントロール系は、組立てられたポータプルベク
ターのみならず、形質転換された宿主の遺伝物質に組込
まれた形であってもよい。
クターに含有させた組立て物が好都合である。しかし、
この様な組立て物は本発明を実施し得る上での、１つの
方法にすぎない。また、例えば−プロモーター／オペレ
ーター／所望の遺伝子からなる系を１つのプラスミドに
支持させ、リプレッサー発現系をもう１つのプラスミド
に支持させ−これらの両プラスミドで適当な宿主を同時
形質転換させることもできる。さらに、組み立てられた
プラスミド上に、宿主ゲノム内のものと相補性を有する
配列を使用すれば一該プラスミド配列の、宿主ゲノム内
への組込みを促進させるのに効果的である。従って、本
発明のコントロール系は、組立てられたポータプルベク
ターのみならず、形質転換された宿主の遺伝物質に組込
まれた形であってもよい。
所望の暗号配列およびコントロール配列を含む適当なベ
クターの組立てには、標準的なライゲーション技術を用
いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを
開裂させ、修復（ｔａｉｌｏｒ ）し、所望のプラスミ
ドの形を整えるような形に再結合する。使用した方法は
ＤＮＡ源および意図されている宿主に無関係である。
クターの組立てには、標準的なライゲーション技術を用
いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを
開裂させ、修復（ｔａｉｌｏｒ ）し、所望のプラスミ
ドの形を整えるような形に再結合する。使用した方法は
ＤＮＡ源および意図されている宿主に無関係である。
開裂は、適当なバッファー内で制限酵素（群）によって
処理することにより行なう。通常、約１μ２のプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントに対して、約２０ｔｉｌの
緩衝液中で約１単位の酵素を用いる。（特定の制限酵素
に対して適当な緩衝液および基質の量は製造業者が明記
している。）インキュベーション時間は３７°Ｃにおい
て約１時間カ有効である。インキュベーションした後−
フェノールおよびクロロホルムで抽出してタンパク質を
除き、水層にエタノールを加えて析出させることにより
、核酸を回収する。
処理することにより行なう。通常、約１μ２のプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントに対して、約２０ｔｉｌの
緩衝液中で約１単位の酵素を用いる。（特定の制限酵素
に対して適当な緩衝液および基質の量は製造業者が明記
している。）インキュベーション時間は３７°Ｃにおい
て約１時間カ有効である。インキュベーションした後−
フェノールおよびクロロホルムで抽出してタンパク質を
除き、水層にエタノールを加えて析出させることにより
、核酸を回収する。
平滑末端が必要ならば−この標品を１５°で１５分間、
Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼエ（フレナラ）１０
単位で処理し、フェノール−クロロホルム抽出し一エタ
ノールで沈殿させる。
Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼエ（フレナラ）１０
単位で処理し、フェノール−クロロホルム抽出し一エタ
ノールで沈殿させる。
開裂したフラグメントのサイズを分けるには−Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ 、 Ｄ、ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅｓ、−８：４０５７（１９８０））の記載に従って６
％ポリアクリルアミドゲルを用いる。
ｄｅｌ 、 Ｄ、ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅｓ、−８：４０５７（１９８０））の記載に従って６
％ポリアクリルアミドゲルを用いる。
ライゲーションは、正しく合致するように末端を適当に
修復した、はぼ等モル量の所望の各成分を、ＤＮＡ０．
５μｙ当り約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで処理する
ことにより行う。（開裂して得たベクター類を構成成分
として用いるときは、細菌性アルカリホスファターゼで
処理し、開裂されたベクターの再結合を防止することが
有用である。） 以下に挙げる実施例において、プラスミドを組立てるた
めの適正なライゲーション（結合）が行なわれたことを
そのライゲーション混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換する
ことにより、あるいは、同じくその他の適当な微生物、
例えばＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ菌株を形質転換すること
により確認する。その他の本発明ノ組立てに用いたＥ、
ｃｏｌｉ菌株には次のものがある： Ｄ １２１０
（５ａｄｌｅｒ、 Ｊ、Ｒ，ら、１９８０Ｇｅｎｅ ８
； ２７９ ）−ハイブリッドプロモーターを含有する
プラスミドの組立てに使用；菌株３３００（Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ｙ
Ｂ □ Ｂ ）、ｐＩＱ４５の組立てに使用。成功し
た形質転換体は、プラスミド組立ての方法に応じて−ア
ンピシリンーテトラサイクリン、クロラムフェニコール
またはネオマイシンのいずれかに対する耐性に基いて選
び出された。次いで形質転換体から得られたプラスミド
を、Ｍｅｓｓｉｎｇら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、−９：３０９（１９８１）’の方法またはＭａ
ｘｍら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
−６５： ４９９ （１９８０））の方法に従って、制
限分析および／または配列決定することにより、分析し
た。
修復した、はぼ等モル量の所望の各成分を、ＤＮＡ０．
５μｙ当り約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで処理する
ことにより行う。（開裂して得たベクター類を構成成分
として用いるときは、細菌性アルカリホスファターゼで
処理し、開裂されたベクターの再結合を防止することが
有用である。） 以下に挙げる実施例において、プラスミドを組立てるた
めの適正なライゲーション（結合）が行なわれたことを
そのライゲーション混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換する
ことにより、あるいは、同じくその他の適当な微生物、
例えばＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ菌株を形質転換すること
により確認する。その他の本発明ノ組立てに用いたＥ、
ｃｏｌｉ菌株には次のものがある： Ｄ １２１０
（５ａｄｌｅｒ、 Ｊ、Ｒ，ら、１９８０Ｇｅｎｅ ８
； ２７９ ）−ハイブリッドプロモーターを含有する
プラスミドの組立てに使用；菌株３３００（Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ｙ
Ｂ □ Ｂ ）、ｐＩＱ４５の組立てに使用。成功し
た形質転換体は、プラスミド組立ての方法に応じて−ア
ンピシリンーテトラサイクリン、クロラムフェニコール
またはネオマイシンのいずれかに対する耐性に基いて選
び出された。次いで形質転換体から得られたプラスミド
を、Ｍｅｓｓｉｎｇら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、−９：３０９（１９８１）’の方法またはＭａ
ｘｍら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
−６５： ４９９ （１９８０））の方法に従って、制
限分析および／または配列決定することにより、分析し
た。
本発明でしばしば用いる技術である、特定の部位で開裂
されたＤＮＡ配列を得るために採用される一般的な方法
は、アメリカ特許第１３３，２９６号、１９８０年３月
８日出願（ＥＰＯ出願公開番号−第００３６７７６号、
１９８１年９月３０日）に記載の［プライマー修復（ｐ
ｒｉｍｅｒ ｒｅｐａｉｒ） 」反応である。この反応
においては、特異的に開裂させようとするＤＮＡフラグ
メントを変性さぜ−この変性された鎖の内の１つに相補
的である、塩基数約１２のプライマーと混合する。この
プライマーは、その一方の端が所望の開裂部位に正確に
接触するよう組立てる。このプライマーは、センス鎖ま
たはナンセンス鎖のいずれかに相補的である様に設計す
ることができ、そのことによって修復の方向をコントロ
ールする。修復は、この混合物をＤＮＡポリメラーゼエ
（フレナラフラグメント）で処理することによって行な
う（このフラグメントは、結合したプライマーの３′末
端を出発点として一部プライマーが結合している変性Ｄ
ＮＡに相補的な鎖を−その５′から３′の方向に向けて
合成すると共に−プライマーの５′末端から突出してい
る、残りの一本鎖の変性部分を切断するものである）。
されたＤＮＡ配列を得るために採用される一般的な方法
は、アメリカ特許第１３３，２９６号、１９８０年３月
８日出願（ＥＰＯ出願公開番号−第００３６７７６号、
１９８１年９月３０日）に記載の［プライマー修復（ｐ
ｒｉｍｅｒ ｒｅｐａｉｒ） 」反応である。この反応
においては、特異的に開裂させようとするＤＮＡフラグ
メントを変性さぜ−この変性された鎖の内の１つに相補
的である、塩基数約１２のプライマーと混合する。この
プライマーは、その一方の端が所望の開裂部位に正確に
接触するよう組立てる。このプライマーは、センス鎖ま
たはナンセンス鎖のいずれかに相補的である様に設計す
ることができ、そのことによって修復の方向をコントロ
ールする。修復は、この混合物をＤＮＡポリメラーゼエ
（フレナラフラグメント）で処理することによって行な
う（このフラグメントは、結合したプライマーの３′末
端を出発点として一部プライマーが結合している変性Ｄ
ＮＡに相補的な鎖を−その５′から３′の方向に向けて
合成すると共に−プライマーの５′末端から突出してい
る、残りの一本鎖の変性部分を切断するものである）。
ｃ、２ 形質転換
Ｅ、 ｃｏｌｉ （７）細胞形質転換はＣｏｈｅｎ、
Ｆ、Ｎ、ら（１’ｒｏｃ、Ｎａ１ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、 （ＵＳＡ）６９ ：２１１０（１９７２））の方法
に従って行なった。また、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓの形
質転換はＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、 Ｃ１ら（
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、、８１ニア４１（１９６
１））の方法に従って行なった。本発明のプラスミドを
用いて成功した形質転換体の選択は、適当な濃度の抗生
物質（即ち、クロラムフェニコール（ＣＭＰ）の場合は
１２．５μｂへｅ、ネオマイシン（ＮＥＯ）２０μｙ／
ｒｎｅ、アンピシリン（Ａ Ｍ Ｐ ） ２０ ｔｌｙ
／ｍｅ、エリスロマイシン（ＥＲＹ）５μｙ／＋ｌＩｅ
およびテトラサイクリン（ＴＥＴ）３μｙ／ｍｅ）を用
いて行なった。
Ｆ、Ｎ、ら（１’ｒｏｃ、Ｎａ１ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、 （ＵＳＡ）６９ ：２１１０（１９７２））の方法
に従って行なった。また、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓの形
質転換はＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、 Ｃ１ら（
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、、８１ニア４１（１９６
１））の方法に従って行なった。本発明のプラスミドを
用いて成功した形質転換体の選択は、適当な濃度の抗生
物質（即ち、クロラムフェニコール（ＣＭＰ）の場合は
１２．５μｂへｅ、ネオマイシン（ＮＥＯ）２０μｙ／
ｒｎｅ、アンピシリン（Ａ Ｍ Ｐ ） ２０ ｔｌｙ
／ｍｅ、エリスロマイシン（ＥＲＹ）５μｙ／＋ｌＩｅ
およびテトラサイクリン（ＴＥＴ）３μｙ／ｍｅ）を用
いて行なった。
ｃ、３ 分析
ペリシリナーゼの分析（ポリビニルアルコール（ＰＶＡ
）平板上での活性の検出を含む）は、５ｈｅｒｒａｔ、
Ｄ、Ｊ、ら（Ｊ 、 Ｇｅｎ １μｂ ｃｒｏｂｉｏ
ｌ 、、７６：２１７（１９７３））の方法に従って行
なった。白血球インターフェロンの分析は、前述のプラ
スミドで形質転換したＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ菌株■１
６８を−ＮＥＤ Ｉ ＱμＶ／−と０．５％グルコース
を添加したしブロス内で、３７°Ｃにおいて、細胞が０
Ｄ６００（１，０において）を示すまで増殖させて行な
った。
）平板上での活性の検出を含む）は、５ｈｅｒｒａｔ、
Ｄ、Ｊ、ら（Ｊ 、 Ｇｅｎ １μｂ ｃｒｏｂｉｏ
ｌ 、、７６：２１７（１９７３））の方法に従って行
なった。白血球インターフェロンの分析は、前述のプラ
スミドで形質転換したＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ菌株■１
６８を−ＮＥＤ Ｉ ＱμＶ／−と０．５％グルコース
を添加したしブロス内で、３７°Ｃにおいて、細胞が０
Ｄ６００（１，０において）を示すまで増殖させて行な
った。
その内、ｌ ｍｅづつを３回、エツペンドルフのミクロ
遠心分離機で４分間遠心分離して収穫した。得られた各
ペレットをＰＨ８の−１０ｍＭ）リス中リゾチーム１０
巧／−１および１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液０、１ ｍｅに
懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで
０．１％５ＤＳ０，９ｍｌを加え、この細胞をウシ血清
アルブミン１■／ ｍｅを含有するりん酸緩衝化生理食
塩水中で５０〜３００倍に希釈した。インターフェロン
値は− Ｓｔｅｗａｒｔ、 Ｗ、Ｅ。
遠心分離機で４分間遠心分離して収穫した。得られた各
ペレットをＰＨ８の−１０ｍＭ）リス中リゾチーム１０
巧／−１および１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液０、１ ｍｅに
懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで
０．１％５ＤＳ０，９ｍｌを加え、この細胞をウシ血清
アルブミン１■／ ｍｅを含有するりん酸緩衝化生理食
塩水中で５０〜３００倍に希釈した。インターフェロン
値は− Ｓｔｅｗａｒｔ、 Ｗ、Ｅ。
（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｂｅｒｌｉｎ（１９７９））の述べた方
法に従い、ＭＤＢＫ細胞と小水病性口内炎ウィルスを用
いて行なう細胞変性作用明害活性分析法により決定した
。
ｒｉｎｇｅｒ−Ｂｅｒｌｉｎ（１９７９））の述べた方
法に従い、ＭＤＢＫ細胞と小水病性口内炎ウィルスを用
いて行なう細胞変性作用明害活性分析法により決定した
。
プラスミドｐＡＩＱ２５は、本発明のコントロール系に
機能的に結合したベニシリナーゼ遺伝子を含有している
。この組立て物中では、ペニシリナーゼ遺伝子の前にペ
ニシリナーゼプロモーターの一部とｌａｃオペレーター
からなるハイブリッドプロモーター／オペレーターが存
在している。ペニシリナーゼ遺伝子の下流には、ペニシ
リナーゼプロモーターのコントロール下にある、ｌａｃ
：［リプレッサータンパク質の暗号配列が存在する。こ
のプラスミドバックボーン部分は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
内で機能し得る複製起源を含んでいる。
機能的に結合したベニシリナーゼ遺伝子を含有している
。この組立て物中では、ペニシリナーゼ遺伝子の前にペ
ニシリナーゼプロモーターの一部とｌａｃオペレーター
からなるハイブリッドプロモーター／オペレーターが存
在している。ペニシリナーゼ遺伝子の下流には、ペニシ
リナーゼプロモーターのコントロール下にある、ｌａｃ
：［リプレッサータンパク質の暗号配列が存在する。こ
のプラスミドバックボーン部分は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
内で機能し得る複製起源を含んでいる。
このプラスミドは、３つのフラグメントをライゲーショ
ンすることによって組立てられる（第４図参照）。フラ
グメント１は中間体プラスミドｐＢｓＡ１０５から導か
れた１５００塩基対のＥｃ。
ンすることによって組立てられる（第４図参照）。フラ
グメント１は中間体プラスミドｐＢｓＡ１０５から導か
れた１５００塩基対のＥｃ。
Ｒ１−平滑末端フラグメントであって、ペニシリナーゼ
遺伝子に機能的に結合したハイブリッド（ｐａｃ−１）
プロモーターを含む。フラグメント２は、中間体プラス
ミドＰＩＱ４５から導かれた塩基対１３００の平滑末端
−Ｂａｍ Ｈ１フラグメントであって、ペニシリナーゼ
プロモーターのコントロール下にあるＩａｃ ｌ：遺伝
子を含む。フラグメント３は、ＰＢＳ４２から導かれた
Ｅｃｏ Ｒｌ −Ｂａｍ Ｒ１のバックボーンフラグメ
ントである。このライゲーションに用いるこれら３つの
フラグメントの組立て法を次に述べる。
遺伝子に機能的に結合したハイブリッド（ｐａｃ−１）
プロモーターを含む。フラグメント２は、中間体プラス
ミドＰＩＱ４５から導かれた塩基対１３００の平滑末端
−Ｂａｍ Ｈ１フラグメントであって、ペニシリナーゼ
プロモーターのコントロール下にあるＩａｃ ｌ：遺伝
子を含む。フラグメント３は、ＰＢＳ４２から導かれた
Ｅｃｏ Ｒｌ −Ｂａｍ Ｒ１のバックボーンフラグメ
ントである。このライゲーションに用いるこれら３つの
フラグメントの組立て法を次に述べる。
一ゼオペロン
Ｐａｃ−１プロモーター／オペレーターおよびぺニシリ
ナーゼ遺伝子を含有するフラグメントは、中間体プラス
ミドｐＢｓＡＩＱ５から、該プラスミドをまずＢａｍＨ
ｌで処理し、次いでＤＮＡポリメラーゼのフレナラフラ
グメントを用いて充填し、さらにＥｃｏ Ｒｌで消化す
ることによって得られる。
ナーゼ遺伝子を含有するフラグメントは、中間体プラス
ミドｐＢｓＡＩＱ５から、該プラスミドをまずＢａｍＨ
ｌで処理し、次いでＤＮＡポリメラーゼのフレナラフラ
グメントを用いて充填し、さらにＥｃｏ Ｒｌで消化す
ることによって得られる。
に
ｐ Ｂ Ｓ Ａ １０５は下記の如く。して組立てられ
る。そのステップ１では、ペニシリナーゼ遺伝子を後の
り、 １．４ 章で述べるＰＢＳ４２ベクターに挿入し
てＰＢＳＡ４２ （第１図参照）を形成する。Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ菌株−７４９／Ｃ
（ＡＴＣＣ２５９７２）ノベニシリナーゼ遺伝子は、Ｉ
ｍａｎａｋａ 、 Ｔ、ら（Ｊ。
る。そのステップ１では、ペニシリナーゼ遺伝子を後の
り、 １．４ 章で述べるＰＢＳ４２ベクターに挿入し
てＰＢＳＡ４２ （第１図参照）を形成する。Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ菌株−７４９／Ｃ
（ＡＴＣＣ２５９７２）ノベニシリナーゼ遺伝子は、Ｉ
ｍａｎａｋａ 、 Ｔ、ら（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４７：７７６（１９８１））の
方法に従って単離された。このペニシリナーゼ遺伝子の
単離に用いたベクタープラスミドは、Ｄ、 ３．１章に
記載のｐＢ８７である。ペニシリナーゼ遺伝子を持った
ｐＢＳ７誘導体はｐ Ｂ Ｓ Ａ １と名付けられた。
方法に従って単離された。このペニシリナーゼ遺伝子の
単離に用いたベクタープラスミドは、Ｄ、 ３．１章に
記載のｐＢ８７である。ペニシリナーゼ遺伝子を持った
ｐＢＳ７誘導体はｐ Ｂ Ｓ Ａ １と名付けられた。
ステップ１は、ＰＢＳ４２をＥｃｏ’ＲＩとＢａｍ Ｈ
１で二重消化し、次いで一全ペリシリナーゼ遺伝子であ
って、そのプロモーターの４０塩基対上流のＨｐａｌ’
［部位をＥｃｏＲＩ部位に、そしてその遺伝子の３′末
端から６００塩基対下流のＰｖｕ ］’Ｉ部位をＢａｍ
Ｈ１部位に変換して修正した全ペニシリナーゼ遺伝子
の存在下に再結合することであった。これらの変換には
標準的手法を用いた。この様にして得たｐ Ｂ Ｓ Ａ
４２プラスミドは、ＰＢＳ４２バックボーンに全ペニ
シリナーゼ遺伝子を挿入したものである。ＰＢＳＡ４２
のサブクローン（ｐＢＳＡサブクローン）は、ペニシリ
ナーゼプロモーターヲ含有するｐＢＳＡ４２のＥｃｏＲ
Ｊ −Ｐｓｔ ■フラグメントをＥｃｏＲニーＰｓｔ
Ｉ消化ｐＢＲ３２２ベクターにライゲーションすること
によって組立てられた（第１図）。ｐＢＳＡ４２または
そのサブクローンは、ライゲーションによってｐＢｓＡ
１０５を与える３つのフラグメント、すなわち、Ａ、Ｂ
並びにＣを与えるものである。
１で二重消化し、次いで一全ペリシリナーゼ遺伝子であ
って、そのプロモーターの４０塩基対上流のＨｐａｌ’
［部位をＥｃｏＲＩ部位に、そしてその遺伝子の３′末
端から６００塩基対下流のＰｖｕ ］’Ｉ部位をＢａｍ
Ｈ１部位に変換して修正した全ペニシリナーゼ遺伝子
の存在下に再結合することであった。これらの変換には
標準的手法を用いた。この様にして得たｐ Ｂ Ｓ Ａ
４２プラスミドは、ＰＢＳ４２バックボーンに全ペニ
シリナーゼ遺伝子を挿入したものである。ＰＢＳＡ４２
のサブクローン（ｐＢＳＡサブクローン）は、ペニシリ
ナーゼプロモーターヲ含有するｐＢＳＡ４２のＥｃｏＲ
Ｊ −Ｐｓｔ ■フラグメントをＥｃｏＲニーＰｓｔ
Ｉ消化ｐＢＲ３２２ベクターにライゲーションすること
によって組立てられた（第１図）。ｐＢＳＡ４２または
そのサブクローンは、ライゲーションによってｐＢｓＡ
１０５を与える３つのフラグメント、すなわち、Ａ、Ｂ
並びにＣを与えるものである。
フラグメン）Ａは、第２図に示す如＜ ｐＢＳＡ４２を
ＥｃｏＲｌおよびＰｓｔｌで二重消化して調製される。
ＥｃｏＲｌおよびＰｓｔｌで二重消化して調製される。
このものは−ペニシリナーゼ遺伝子のＣ−末端を伴った
ｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２のバックボーン部分である。
ｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２のバックボーン部分である。
フラグメントＢは修飾されたベニシリナーゼプロモータ
ーを含有しており、ｐＢｓＡ４２のサブクローンを、）
（ｉｎｆ 王 で開裂させることにより導かれる。第２
図に示す如く、ｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２サブクローンのＨ
ｉｎｆ Ｉ 消化によって、ペニシリナーゼプロモータ
ー（およびその遺伝子の一部）を含有する７３０塩基対
のフラグメントが得られる。次いでこのＨｉｎｆＩ開裂
フラグメントを変性させ−ペニシリナーゼプロモーター
内の４位で切断するため、これをプライマー修復反応に
かける。用いるプライマーは５’−ＧＡＡＡＧＴＡＴＴ
ＡＣ−３’であり、このものはそのＤＮＡに、３′の方
向から読んで約−４位から結合する。得られた平滑末端
を有するフラグメントをプロモーターの上流のＥｃｏＲ
１部位で開裂させる。このようにして得られたフラグメ
ントＢはポジション−４（−４位）から前のベニシリナ
ーゼプロモータ一部分を含有している。
ーを含有しており、ｐＢｓＡ４２のサブクローンを、）
（ｉｎｆ 王 で開裂させることにより導かれる。第２
図に示す如く、ｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２サブクローンのＨ
ｉｎｆ Ｉ 消化によって、ペニシリナーゼプロモータ
ー（およびその遺伝子の一部）を含有する７３０塩基対
のフラグメントが得られる。次いでこのＨｉｎｆＩ開裂
フラグメントを変性させ−ペニシリナーゼプロモーター
内の４位で切断するため、これをプライマー修復反応に
かける。用いるプライマーは５’−ＧＡＡＡＧＴＡＴＴ
ＡＣ−３’であり、このものはそのＤＮＡに、３′の方
向から読んで約−４位から結合する。得られた平滑末端
を有するフラグメントをプロモーターの上流のＥｃｏＲ
１部位で開裂させる。このようにして得られたフラグメ
ントＢはポジション−４（−４位）から前のベニシリナ
ーゼプロモータ一部分を含有している。
フラグメントＣはｌａｃオペレーターおよびペニシリナ
ーゼ遺伝子のＮ−末端部分を含有している。
ーゼ遺伝子のＮ−末端部分を含有している。
このフラグメントＣを得るために、Ｉａｃオペレーター
を挿入することによってＰＢＳＡ４２から、ｐＢｓＡ１
３Ｑを組立てる。ＰＢＳＡ４２をＳａｕ ３ Ａで消化
し、プロモーターとリボンーム結合部位との間の８０塩
基対フラグメントを削除した。次いで残る５ａｕ３Ａ部
位に、式： で示される配列を有する、Ｂａｍ Ｈ１部位をその画境
界とするｌａｃオペレーター含有の合成りＮＡ配列を、
ライゲーションによって挿入し、ｐＢｓＡ８０を得た。
を挿入することによってＰＢＳＡ４２から、ｐＢｓＡ１
３Ｑを組立てる。ＰＢＳＡ４２をＳａｕ ３ Ａで消化
し、プロモーターとリボンーム結合部位との間の８０塩
基対フラグメントを削除した。次いで残る５ａｕ３Ａ部
位に、式： で示される配列を有する、Ｂａｍ Ｈ１部位をその画境
界とするｌａｃオペレーター含有の合成りＮＡ配列を、
ライゲーションによって挿入し、ｐＢｓＡ８０を得た。
次いで、上記のプラスミドｐ Ｂ Ｓ Ａ ８０を処理
してフラグメン）Ｃを得た。Ｈｉｎｆ■処理によってペ
ニシリナーゼリポソーム結合部位、ｌａｃオペレーター
の全部、およびペニシリナーゼ遺伝子のＮ末端部分とを
含む５３２塩基対フラグメントを得た。このフラグメン
トをプライマー修復反応にかけることにより、ＲＮＡポ
リメラーゼ結合部位を除くことができる。使用したプラ
イマーは式：％式％ で示されるものであり、これはこの組立て物の、Ｉａｃ
オペレーターの５゛末端に結合する。こうして得られた
短かくなったフラグメントをさらにＰｓｔｌで開裂させ
、短縮された遺伝子のＮ末端部分を得た。フラグメント
Ｃは、ハイブリッドｐａｃ−１プロモーター／オペレー
ターの部分を含有している。このプロモーター／オペレ
ーターの配列は第８図に示されている。
してフラグメン）Ｃを得た。Ｈｉｎｆ■処理によってペ
ニシリナーゼリポソーム結合部位、ｌａｃオペレーター
の全部、およびペニシリナーゼ遺伝子のＮ末端部分とを
含む５３２塩基対フラグメントを得た。このフラグメン
トをプライマー修復反応にかけることにより、ＲＮＡポ
リメラーゼ結合部位を除くことができる。使用したプラ
イマーは式：％式％ で示されるものであり、これはこの組立て物の、Ｉａｃ
オペレーターの５゛末端に結合する。こうして得られた
短かくなったフラグメントをさらにＰｓｔｌで開裂させ
、短縮された遺伝子のＮ末端部分を得た。フラグメント
Ｃは、ハイブリッドｐａｃ−１プロモーター／オペレー
ターの部分を含有している。このプロモーター／オペレ
ーターの配列は第８図に示されている。
フラグメントＡ、ＢおよびＣをライゲーションすること
により所望のプラスミドｐ Ｂ Ｓ Ａ Ｉ Ｑ ５を
得る。このプラスミドは、ペニシリナーゼプロモーター
の一部とｌａｃオペレーターを含むハイブリッドｐａｃ
−１（いずれもペニシリナーゼリポソーム結合部位から
上流）並びにペニシリナーゼ遺伝子とを含有している。
により所望のプラスミドｐ Ｂ Ｓ Ａ Ｉ Ｑ ５を
得る。このプラスミドは、ペニシリナーゼプロモーター
の一部とｌａｃオペレーターを含むハイブリッドｐａｃ
−１（いずれもペニシリナーゼリポソーム結合部位から
上流）並びにペニシリナーゼ遺伝子とを含有している。
フラグメント２はｐＩＱ４５をＥｃｏＲｌで消化し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼで末端を平滑にし、次いでＢａｍ Ｈ
１で処理することにより導かれる。ｐＩＱ４５は上記の
如くして得られたｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２サブクローンか
ら（７）７ラグメントと、Ｈａｒｅ、 Ｄ、 Ｔ−１ら
（Ｇｅｎｅ −３：２６９（１９７８））記載のｐＨ１
Ｑ６とを用いて組立てられる。ｐ Ｈｉ Ｑ ５はＩａ
ｃ Ｉ遺伝子全体を含有している。
ＮＡポリメラーゼで末端を平滑にし、次いでＢａｍ Ｈ
１で処理することにより導かれる。ｐＩＱ４５は上記の
如くして得られたｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２サブクローンか
ら（７）７ラグメントと、Ｈａｒｅ、 Ｄ、 Ｔ−１ら
（Ｇｅｎｅ −３：２６９（１９７８））記載のｐＨ１
Ｑ６とを用いて組立てられる。ｐ Ｈｉ Ｑ ５はＩａ
ｃ Ｉ遺伝子全体を含有している。
ＰＩＱ４５を形成するための３方向ライゲーシヨン（ｔ
ｈｒｅｅ −ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ）におけるフ
ラグメントＤは、ｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２から導かれ、ペ
ニシリナーゼプロモーターとベニシリナーゼ遺伝子の最
初の２個のアミノ酸とを含有している。ペニシリナーゼ
遺伝子の最初の２個のアミノ酸はｌａｃ ｌ：遺伝子の
最初の２個のアミノ酸と同じであるので、フラグメント
Ｄはｌａｃ遺伝子暗号配列の再構成に用いるのに有用で
ある。フラグメントＤを組立てるには、ｐ Ｂ Ｓ Ａ
４２サブクローンをＢａｍ ＨｌおよびＰｓｔｌで消
化し、ペニシリナーゼプロモーターと、ペニシリナーゼ
遺伝子のＮ−末端部分とを含む６５０塩基対からなるフ
ラグメントを得る。この遺伝子は、上記フラグメントの
変性されたネガティブセンス鎖に対するプライマーとし
て、５’ ＴＴＴＣＡ Ｔ ＣＡ Ａ Ａ Ａ −３’
を用いて行なうプライマー修復反応により、最初の２個
のアミノ酸のためのコドンのみを含むよう、短縮される
。こうして得られた短いフラグメントを、さらにＥｃｏ
Ｒｌで開裂させると第３図のフラグメントＤが得られる
。
ｈｒｅｅ −ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ）におけるフ
ラグメントＤは、ｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２から導かれ、ペ
ニシリナーゼプロモーターとベニシリナーゼ遺伝子の最
初の２個のアミノ酸とを含有している。ペニシリナーゼ
遺伝子の最初の２個のアミノ酸はｌａｃ ｌ：遺伝子の
最初の２個のアミノ酸と同じであるので、フラグメント
Ｄはｌａｃ遺伝子暗号配列の再構成に用いるのに有用で
ある。フラグメントＤを組立てるには、ｐ Ｂ Ｓ Ａ
４２サブクローンをＢａｍ ＨｌおよびＰｓｔｌで消
化し、ペニシリナーゼプロモーターと、ペニシリナーゼ
遺伝子のＮ−末端部分とを含む６５０塩基対からなるフ
ラグメントを得る。この遺伝子は、上記フラグメントの
変性されたネガティブセンス鎖に対するプライマーとし
て、５’ ＴＴＴＣＡ Ｔ ＣＡ Ａ Ａ Ａ −３’
を用いて行なうプライマー修復反応により、最初の２個
のアミノ酸のためのコドンのみを含むよう、短縮される
。こうして得られた短いフラグメントを、さらにＥｃｏ
Ｒｌで開裂させると第３図のフラグメントＤが得られる
。
フラグメン）ＥおよびＦは次の様にしてｐＨ１Ｑ６から
最終的に得ることができる。フラグメントＥは、ｐ Ｈ
ｉ Ｑ ５をＨｐｈｌで部分消化し、ポリメラーゼエで
末端を平滑化し−次いでＢｓｔＥ■で処理してアミノ酸
番号３から始まるｌａｃ ：［遺伝子のＮ末端部分を含
む、５２５塩基対のフラグメントとして単離される。こ
の様に−フラグメントＤおよびＥは共に、該遺伝子のプ
ロモーターおよびＢｓｔＥＴ部位に先行する遺伝子のＮ
末端部分を供給することになる。
最終的に得ることができる。フラグメントＥは、ｐ Ｈ
ｉ Ｑ ５をＨｐｈｌで部分消化し、ポリメラーゼエで
末端を平滑化し−次いでＢｓｔＥ■で処理してアミノ酸
番号３から始まるｌａｃ ：［遺伝子のＮ末端部分を含
む、５２５塩基対のフラグメントとして単離される。こ
の様に−フラグメントＤおよびＥは共に、該遺伝子のプ
ロモーターおよびＢｓｔＥＴ部位に先行する遺伝子のＮ
末端部分を供給することになる。
遺伝子の残る部分およびｐＩＱ４５のバックボーン部分
は、フラグメントＦが供給する。フラグメントＦはｐＨ
１Ｑ６から−ＰＢＳ４２のバックボーン部分を有してい
る中間体プラスミドｐＩＱ２を通して導かれる。このプ
ラスミドは、ｐＨ１Ｑ５のＢｓｔＥ■一部分的Ａｌｕｌ
による二重消化物（第３図参照）、ｐＢＳ４２から導か
れたＥｃｏＲ１充填−ＢａｍＨＩフラグメント（第１図
参照）−およびＥｃｏＲｌおよびＢｓｔＥ［部位を含有
するフラグメント（その塩基配列は第１２図に示されて
いる）を用いた３方向ライゲーシヨンで形成される。こ
れら３個のフラグメントをライゲーションすることによ
り、ＰＢＳ４２のバックボーンと、ＢｓｔＥ［部位から
Ｃ末端に向かって延びるｌａｃ Ｊ遺伝子の部分とを含
有するｐＩＱ２が形成される。このｐＴＱ２をＢｓｔＥ
ＩＩとＥｃｏＲ：［で開裂させればフラグメントＦが得
られる。
は、フラグメントＦが供給する。フラグメントＦはｐＨ
１Ｑ６から−ＰＢＳ４２のバックボーン部分を有してい
る中間体プラスミドｐＩＱ２を通して導かれる。このプ
ラスミドは、ｐＨ１Ｑ５のＢｓｔＥ■一部分的Ａｌｕｌ
による二重消化物（第３図参照）、ｐＢＳ４２から導か
れたＥｃｏＲ１充填−ＢａｍＨＩフラグメント（第１図
参照）−およびＥｃｏＲｌおよびＢｓｔＥ［部位を含有
するフラグメント（その塩基配列は第１２図に示されて
いる）を用いた３方向ライゲーシヨンで形成される。こ
れら３個のフラグメントをライゲーションすることによ
り、ＰＢＳ４２のバックボーンと、ＢｓｔＥ［部位から
Ｃ末端に向かって延びるｌａｃ Ｊ遺伝子の部分とを含
有するｐＩＱ２が形成される。このｐＴＱ２をＢｓｔＥ
ＩＩとＥｃｏＲ：［で開裂させればフラグメントＦが得
られる。
従って、フラグメン）Ｄ、ＥおよびＦのライゲーション
産物であるプラスミドＰＩＱ４５は、完全なＩａｃ Ｉ
遺伝子配列に結合したベニシリナーゼプロモーターを有
することになる。
産物であるプラスミドＰＩＱ４５は、完全なＩａｃ Ｉ
遺伝子配列に結合したベニシリナーゼプロモーターを有
することになる。
フラグメント３はＰＢＳ４２のＥｃｏＲｌおよびＢａｍ
Ｈｌの二重消化によって得られるベクタ一部分である
。ｐＢＳ４２はｐＵＢ１１０＝ ＰＣ１９４およびｐＢ
Ｒ３２２から得られる各フラグメントを使用して、３方
向ライゲーシヨンで形成される（第１図参照）。ｐＵＢ
ｌ、１．０はアミノ酸配列の第１９００番目のＨｐａｌ
’）部位から４５００５００番目ｍ Ｈ：［部位までの
約２６００塩基対からなるフラグメントであって、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ 内で作動可能な複製起源を有している：
Ｇｒｙｃｚｔａｎ、 Ｔ、 Ｊ 、ら（Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、、１３４：３１８（１９７８））；Ｊａｌ
ａｎｋｏ、Ａ、ら（Ｇｅｎｅ、１４ ：３２５（１９８
１））。Ｂａｍ ＨＪ部位はＤＮＡポリメラーゼ■を用
いて充填することにより平滑末端にした。また、ｐＢＲ
３２２部分は２０６７番目ノＰｖｕｌ’Ｉ部位から３２
１２２１２番目ｕ３Ａ部位までの〜１１００塩基対フラ
グメントであって、Ｅ、 ｃｏｌｉの複製起源を含有し
ている： Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｆ、ら（Ｇｅｎｅ２：９
５（１９７７））：５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、 Ｊ、Ｇ、
（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉ−Ｔａｒｂｏｒ Ｓｙｍ
ｐｏ−ｓｉｕｍ４３ ： Ｉ−７７（１９７８））。さ
らにＰＣ１９４フラグメントは９７３番目のＴ（ｐａｌ
’）部位から２００６００６番目ｕ３Ａ部位までの〜１
２００塩基対フラグメントであって、Ｅ、 ｃｏｌｉお
よびＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓの両方において−クロラム
フエニコール耐性を発現せしめる遺伝子を含有している
： Ｅｈｒｌｉｃｈ、 Ｓ。
Ｈｌの二重消化によって得られるベクタ一部分である
。ｐＢＳ４２はｐＵＢ１１０＝ ＰＣ１９４およびｐＢ
Ｒ３２２から得られる各フラグメントを使用して、３方
向ライゲーシヨンで形成される（第１図参照）。ｐＵＢ
ｌ、１．０はアミノ酸配列の第１９００番目のＨｐａｌ
’）部位から４５００５００番目ｍ Ｈ：［部位までの
約２６００塩基対からなるフラグメントであって、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ 内で作動可能な複製起源を有している：
Ｇｒｙｃｚｔａｎ、 Ｔ、 Ｊ 、ら（Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、、１３４：３１８（１９７８））；Ｊａｌ
ａｎｋｏ、Ａ、ら（Ｇｅｎｅ、１４ ：３２５（１９８
１））。Ｂａｍ ＨＪ部位はＤＮＡポリメラーゼ■を用
いて充填することにより平滑末端にした。また、ｐＢＲ
３２２部分は２０６７番目ノＰｖｕｌ’Ｉ部位から３２
１２２１２番目ｕ３Ａ部位までの〜１１００塩基対フラ
グメントであって、Ｅ、 ｃｏｌｉの複製起源を含有し
ている： Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｆ、ら（Ｇｅｎｅ２：９
５（１９７７））：５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、 Ｊ、Ｇ、
（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉ−Ｔａｒｂｏｒ Ｓｙｍ
ｐｏ−ｓｉｕｍ４３ ： Ｉ−７７（１９７８））。さ
らにＰＣ１９４フラグメントは９７３番目のＴ（ｐａｌ
’）部位から２００６００６番目ｕ３Ａ部位までの〜１
２００塩基対フラグメントであって、Ｅ、 ｃｏｌｉお
よびＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓの両方において−クロラム
フエニコール耐性を発現せしめる遺伝子を含有している
： Ｅｈｒｌｉｃｈ、 Ｓ。
Ｄ、 （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃ１ｄ、 Ｓｃｉ、
（ＵＳＡ） ７４ ：１６８０（１９７７） ；Ｈｏ
ｒｙｎｕｃｈｉ、 Ｓ、ら（Ｊ。
（ＵＳＡ） ７４ ：１６８０（１９７７） ；Ｈｏ
ｒｙｎｕｃｈｉ、 Ｓ、ら（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５０：８１５（１９８２））。
この様に−得られたプラスミドｐＢＳ４２は、Ｅ。
ｃｏｌ ｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ内で作動し得る複製
起源−並びにクロラムフェニコールに対する耐性を発現
させる遺伝子を含有している。ライゲーションによって
ｐＩＪＢｌｌＱからのＢａｍＨＩ部位が回復しているノ
テ、このｐＢＳ４２をＥｃｏＲｌとＢａｍ Ｈｌで二重
消化すると実質的に完全なプラスミドを得ることができ
る。
起源−並びにクロラムフェニコールに対する耐性を発現
させる遺伝子を含有している。ライゲーションによって
ｐＩＪＢｌｌＱからのＢａｍＨＩ部位が回復しているノ
テ、このｐＢＳ４２をＥｃｏＲｌとＢａｍ Ｈｌで二重
消化すると実質的に完全なプラスミドを得ることができ
る。
Ｄ、１．５ ペニシリナーゼ遺伝子の発現ｐ Ａ Ｉ
Ｑ ２５を含有するライゲーション混合物（Ｄ、１．１
参照）でＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ （Ｇｅ
ｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ＝ Ｃｏｌｕｍｂ
ｉａ−０ｈｉｏ ニ、受託番号ＩＡＩ （ＡＴＣＣＮｏ
、２７６８９）の下に寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ
菌株）を形質転換させ、成功した形質転換体をクロラム
フェニコール耐性に基いて選択した。これらの内のいく
つかを１ｍＭのＴＰＴＧの存在下または不存在下、ＰＶ
Ａ指示平板（ｃ、３章参照）上に置いて複製させた。結
果は一第４図に示す如くペニシリナーゼの生成はＴＰＴ
Ｇの存在によって促進されることを示唆している。
Ｑ ２５を含有するライゲーション混合物（Ｄ、１．１
参照）でＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ （Ｇｅ
ｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ＝ Ｃｏｌｕｍｂ
ｉａ−０ｈｉｏ ニ、受託番号ＩＡＩ （ＡＴＣＣＮｏ
、２７６８９）の下に寄託されているＢａｃｉｌｌｕｓ
菌株）を形質転換させ、成功した形質転換体をクロラム
フェニコール耐性に基いて選択した。これらの内のいく
つかを１ｍＭのＴＰＴＧの存在下または不存在下、ＰＶ
Ａ指示平板（ｃ、３章参照）上に置いて複製させた。結
果は一第４図に示す如くペニシリナーゼの生成はＴＰＴ
Ｇの存在によって促進されることを示唆している。
代表的なコロニーを−１ｍＭ Ｉ Ｐ ＴＧの存在下ま
たは不存在下でＬ Ｂ ＋ ０．５％グルコースおよび
１０μｆ ／ｍｅのクロラムフェニコール中で一夜増殖
させた。この細胞ブロスを０．１Ｍりん酸ナトリウム緩
衝液（ＰＨ７，０）で希釈し、そのペニシリナーゼを５
ｈｅｒｒａｔｔらの方法（Ｃ１３章の上方に記載）に従
って分析した。ＩＰＴＧの存在下に増殖させた細胞は平
均６０００単位／ ｍｅ （セルブロス）のベニシリナ
ーゼ値を示したのに対してＩＰＴＧ不存在下に増殖させ
た細胞は、Ｃ０単位／ｍｅ（培養物）の値を示したにす
ぎない。次いで、これらの培養物の上澄みをとり、５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥにかけると、ＴＰＴＧを用いて得られた培
養物のみ、分子量３３．０００（ペニシリナーゼの分子
量に略等しい）にバンドを示した（第５図）。
たは不存在下でＬ Ｂ ＋ ０．５％グルコースおよび
１０μｆ ／ｍｅのクロラムフェニコール中で一夜増殖
させた。この細胞ブロスを０．１Ｍりん酸ナトリウム緩
衝液（ＰＨ７，０）で希釈し、そのペニシリナーゼを５
ｈｅｒｒａｔｔらの方法（Ｃ１３章の上方に記載）に従
って分析した。ＩＰＴＧの存在下に増殖させた細胞は平
均６０００単位／ ｍｅ （セルブロス）のベニシリナ
ーゼ値を示したのに対してＩＰＴＧ不存在下に増殖させ
た細胞は、Ｃ０単位／ｍｅ（培養物）の値を示したにす
ぎない。次いで、これらの培養物の上澄みをとり、５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥにかけると、ＴＰＴＧを用いて得られた培
養物のみ、分子量３３．０００（ペニシリナーゼの分子
量に略等しい）にバンドを示した（第５図）。
第５図において一第１列は、ＰＡＩＱ２５で形質転換し
、ＩＰＴＧ不存在の下で増殖させた１１６Ｌ第２列はＰ
ＡＴＱ２５で形質転換し−ＩＰＴＧの存在下で増殖させ
た■１６８、そして第３列および第４列はＰＢＳ４２で
形質転換した■１６８をそれぞれＩＰＴＧの存在下およ
び不存在下に増殖させた場合の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる
分析結果を示すものである。
、ＩＰＴＧ不存在の下で増殖させた１１６Ｌ第２列はＰ
ＡＴＱ２５で形質転換し−ＩＰＴＧの存在下で増殖させ
た■１６８、そして第３列および第４列はＰＢＳ４２で
形質転換した■１６８をそれぞれＩＰＴＧの存在下およ
び不存在下に増殖させた場合の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる
分析結果を示すものである。
５ｐａｃ −■ハイブリッドプロモーターの全配列はｐ
ａｃ−■ハイブリッドの全配列と共に第３図に示されて
いる。下線の施されていない配列は５ＰＯ−１プロモー
ターの固有の（天然の）配列に対応し、下線の施されて
いる配列はｌａｃオペレーター（図中に表示）および、
Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列（図中、Ｘで表示）
に対応する。
ａｃ−■ハイブリッドの全配列と共に第３図に示されて
いる。下線の施されていない配列は５ＰＯ−１プロモー
ターの固有の（天然の）配列に対応し、下線の施されて
いる配列はｌａｃオペレーター（図中に表示）および、
Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列（図中、Ｘで表示）
に対応する。
５ｐａｃ −’ｆ−プロモーターは、ＲＮＡポリメラー
ゼ認識部位がＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓフアージプロモータ
ーに由来すること、その配列は５ＰＯ−ＩＤＮＡのＥｃ
。
ゼ認識部位がＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓフアージプロモータ
ーに由来すること、その配列は５ＰＯ−ＩＤＮＡのＥｃ
。
ＲＩ Ｈフラグメント２６に存在するものに相当するこ
とかわかっている（ Ｌｅｅ、 Ｇ、ら、Ｍｏｌ 、
Ｇｅｎ 。
とかわかっている（ Ｌｅｅ、 Ｇ、ら、Ｍｏｌ 、
Ｇｅｎ 。
Ｇｅｎｅｔ、１８０：５７（１，９８０））ことを除き
、前にり、１．．２で組立て法を述べたｐａｃ−Ｉプロ
モーターに類似している。５ＰＯ−ＩＤＮＡは上記Ｌｅ
ｅ。
、前にり、１．．２で組立て法を述べたｐａｃ−Ｉプロ
モーターに類似している。５ＰＯ−ＩＤＮＡは上記Ｌｅ
ｅ。
Ｇ、らの方法に従って調製した。そしてＥｃｏＲＩゞフ
ラグｌ ７） ２６はこの５ＰＯ−ＩＤＮＡを、１０％
グリセリン中にＩ Ｑ Ｕ／ｕｙとし−ＰＨ８，５のト
リス−塩酸０．０２５ＭおよびＣｌ２Ｏ，００２１１ｙ
で消化し、５％アクリルアミドゲル上で分画し、ｌ、
ｌ Ｋｂｐフラグメント２６を電気溶出することにより
調製した。前述の配列は、ＲＮＡポリメラーゼ認識部位
を一３５部分内においてＨｉｎｄ■で切断することによ
り、−３５配列の一部並びに５′「前方」領域を含む２
３２ ｂｐフラグメントを示した。
ラグｌ ７） ２６はこの５ＰＯ−ＩＤＮＡを、１０％
グリセリン中にＩ Ｑ Ｕ／ｕｙとし−ＰＨ８，５のト
リス−塩酸０．０２５ＭおよびＣｌ２Ｏ，００２１１ｙ
で消化し、５％アクリルアミドゲル上で分画し、ｌ、
ｌ Ｋｂｐフラグメント２６を電気溶出することにより
調製した。前述の配列は、ＲＮＡポリメラーゼ認識部位
を一３５部分内においてＨｉｎｄ■で切断することによ
り、−３５配列の一部並びに５′「前方」領域を含む２
３２ ｂｐフラグメントを示した。
ＲＮＡポリメラーゼ認識部位の残り部分を再生した合成
りＮＡを２３２ ｂｐフラグメントにライゲーションし
た。この配列は認識部位の末端−１０部位までのびてい
た。さらに、Ｉａｃオペレーターおよび５ｈｉｎｅ−Ｄ
ａｌ ｇａｒｎｏ配列（またはリポソーム結合部位）を
含有する合成りＮＡを、再生されたＲＮＡポリメラーゼ
認識部位にライゲーションした。
りＮＡを２３２ ｂｐフラグメントにライゲーションし
た。この配列は認識部位の末端−１０部位までのびてい
た。さらに、Ｉａｃオペレーターおよび５ｈｉｎｅ−Ｄ
ａｌ ｇａｒｎｏ配列（またはリポソーム結合部位）を
含有する合成りＮＡを、再生されたＲＮＡポリメラーゼ
認識部位にライゲーションした。
第７図はｐＬＩＱｌの組立て図である。ｐＬＩＱｌは−
プラスミドｐＡＩＱ１２０から得たフラグメントと５ｐ
ａｃ−１ハイブリツドプロモーターを含有するｐＳＰＩ
Ｆ−１１’［との２方向ライゲーシヨンによって形成さ
れる。
プラスミドｐＡＩＱ１２０から得たフラグメントと５ｐ
ａｃ−１ハイブリツドプロモーターを含有するｐＳＰＩ
Ｆ−１１’［との２方向ライゲーシヨンによって形成さ
れる。
プラスミドｐＡＩＱ１２０は前述のプラスミドｐ Ａ
Ｉ Ｑ ２５に類似しており、主な相違点はバックボー
ンがネオマイシン耐性プラスミドである点である。ｐ
Ａ Ｉ Ｑ １２０の組立ては第７図に示されている。
Ｉ Ｑ ２５に類似しており、主な相違点はバックボー
ンがネオマイシン耐性プラスミドである点である。ｐ
Ａ Ｉ Ｑ １２０の組立ては第７図に示されている。
親プラスミドｐＢＳ７はＧｒｙｃｚＬａｎ、 Ｔ、Ｊ、
ら（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３４ ：３１８
（１９７８） ）が述べているように、プラスミドｐＵ
Ｂ１１０から次の如くにして得られる。即ち、これをＢ
ａｍＴ（Ｉで消化し、ｐＢＲ３２２起源領域を含む部分
的Ｓａｕ ３ ＡフラグメントをＲａｍ ＨＩ部位にラ
イゲートする。このＳａｕ ３ Ａフラグメントは、標
準のｐＢＲ３２２地図上では１６６６位のＳａｕ ３
Ａ部位から２３３２位の５ａｕ３Ａ部位に及んでいる（
Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌ
ｏｇｕｅによる）。（）内に示したＢａｍ ｉ−Ｉ Ｊ
部位はライゲーションによって回復されζｐＢｓ７をＸ
ｂａｌで消化し、フレナラで末端を平滑にし−さらにＥ
ｃｏＲｌで処理した。得られたフラグメントをＢａｍ
Ｈ■消化で得たフラグメントとライゲートし一末端を平
滑にし、ｐ Ａ Ｉ Ｑ ２５をＥＣ０ＲＩ消化すると
ｐＡＩＱ１２０が得られる。
ら（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３４ ：３１８
（１９７８） ）が述べているように、プラスミドｐＵ
Ｂ１１０から次の如くにして得られる。即ち、これをＢ
ａｍＴ（Ｉで消化し、ｐＢＲ３２２起源領域を含む部分
的Ｓａｕ ３ ＡフラグメントをＲａｍ ＨＩ部位にラ
イゲートする。このＳａｕ ３ Ａフラグメントは、標
準のｐＢＲ３２２地図上では１６６６位のＳａｕ ３
Ａ部位から２３３２位の５ａｕ３Ａ部位に及んでいる（
Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌ
ｏｇｕｅによる）。（）内に示したＢａｍ ｉ−Ｉ Ｊ
部位はライゲーションによって回復されζｐＢｓ７をＸ
ｂａｌで消化し、フレナラで末端を平滑にし−さらにＥ
ｃｏＲｌで処理した。得られたフラグメントをＢａｍ
Ｈ■消化で得たフラグメントとライゲートし一末端を平
滑にし、ｐ Ａ Ｉ Ｑ ２５をＥＣ０ＲＩ消化すると
ｐＡＩＱ１２０が得られる。
ｐｓＩＩＦ−１１［の組立て法は第９図に示されている
。３個のＤＮＡフラグメントがライゲートされた。その
第１は第８図に示す如（ＥｃｏＲ■部位からＸｂａ 工
部位までの５ｐａｃ−１プロモーターである。第２は白
血球インターフェロンＡ遺伝子であって、開始コドンの
前のＸｂａ１部位からＢａｍＨＩ部位まで、ｐＢＲ３２
２ベクタープラスミド内を通過して存在するものである
。このフラグメントはＧｏｅｄｄｅｌら（（１９３Ｑ）
Ｎａｔｕｒｅ ２８７：４１１）の記載に従ってプラス
ミドｐＬｅＩＦＡ２５の誘導体から単離した。この誘導
体はＰＢＲ３２２ベクタープラスミドの、ＥｃｏＲ■部
位とＰｓｔＩ部位との間よりも、むしろＥｃｏ ＲＩ部
位とＢａｍＨＩ部位との間に位置して白血球インターフ
ェロン遺伝子を有しており、標準的な方法で組立てられ
た。Ｘｂａ工部位とインターフェロン遺伝子の開始コド
ンの間のヌクレオチド配列は、上記ｐＬｅＩＦＡ２５と
同一である。第３はＰＢ５４２のバックボーン部分であ
って、これはＥＣ０ＲＴとＢａｍＨＩで消化されている
。ｐ Ｌ Ｉ Ｑ ｌ を得るためには、ｐ Ｓ Ｐ
Ｉ Ｆ −■をＢａｍ Ｈｌ：で消化し、ポリメラーゼ
で平滑末端とし、ＥｃｏＲｌで処理し、白血球インター
フェロン遺伝子および５ｐａｃ−１プロモーターを含有
するフラグメントを単離する。ＰＡＩＱ１２０をＣｏａ
ｌで消化し、ポリメラーゼで末端を平滑にし、Ｅｃ。
。３個のＤＮＡフラグメントがライゲートされた。その
第１は第８図に示す如（ＥｃｏＲ■部位からＸｂａ 工
部位までの５ｐａｃ−１プロモーターである。第２は白
血球インターフェロンＡ遺伝子であって、開始コドンの
前のＸｂａ１部位からＢａｍＨＩ部位まで、ｐＢＲ３２
２ベクタープラスミド内を通過して存在するものである
。このフラグメントはＧｏｅｄｄｅｌら（（１９３Ｑ）
Ｎａｔｕｒｅ ２８７：４１１）の記載に従ってプラス
ミドｐＬｅＩＦＡ２５の誘導体から単離した。この誘導
体はＰＢＲ３２２ベクタープラスミドの、ＥｃｏＲ■部
位とＰｓｔＩ部位との間よりも、むしろＥｃｏ ＲＩ部
位とＢａｍＨＩ部位との間に位置して白血球インターフ
ェロン遺伝子を有しており、標準的な方法で組立てられ
た。Ｘｂａ工部位とインターフェロン遺伝子の開始コド
ンの間のヌクレオチド配列は、上記ｐＬｅＩＦＡ２５と
同一である。第３はＰＢ５４２のバックボーン部分であ
って、これはＥＣ０ＲＴとＢａｍＨＩで消化されている
。ｐ Ｌ Ｉ Ｑ ｌ を得るためには、ｐ Ｓ Ｐ
Ｉ Ｆ −■をＢａｍ Ｈｌ：で消化し、ポリメラーゼ
で平滑末端とし、ＥｃｏＲｌで処理し、白血球インター
フェロン遺伝子および５ｐａｃ−１プロモーターを含有
するフラグメントを単離する。ＰＡＩＱ１２０をＣｏａ
ｌで消化し、ポリメラーゼで末端を平滑にし、Ｅｃ。
ｋｌで処理することにより、ペニシリナーゼプロモータ
ーのコントロール下にあるｌａｃ ■遺伝子を含有し、
ｐｓＰＩＦ−Ｎフラグメントに合致するバックボーンフ
ラグメントを得ることができる。これらのフラグメント
をライゲーションして、第７図に示す所望のプラスミド
−ｐ Ｔ−Ｉ Ｑ ｌを得る。
ーのコントロール下にあるｌａｃ ■遺伝子を含有し、
ｐｓＰＩＦ−Ｎフラグメントに合致するバックボーンフ
ラグメントを得ることができる。これらのフラグメント
をライゲーションして、第７図に示す所望のプラスミド
−ｐ Ｔ−Ｉ Ｑ ｌを得る。
ｐ Ｌ Ｉ Ｑ １でＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ菌株１１
６８を形質転換させ、成功した形質転換体をネオマイシ
ン耐性に基いて選択した。成功した形質転換体をＬＢ＋
０．５％グルコース＋ネオマイシン１０μｙ／ｍｅを含
有する振とうフラスコ内で、１ｍＭＩＰＴＧの存在下、
あるいは非存在下において増殖させた。培養物中の白血
球をＣ１３章で述べた方法によって分析した。ＴＰＴＧ
の存在下に増殖させた培養物のインターフェロン値は１
００，０００単位／、ｆ（１０Ｄ６００）であるのに対
してＩＰＴＧ非存在下に増殖させて得た培養物の値は２
０００単位／ ｍｅ １０Ｄ６００であった。
６８を形質転換させ、成功した形質転換体をネオマイシ
ン耐性に基いて選択した。成功した形質転換体をＬＢ＋
０．５％グルコース＋ネオマイシン１０μｙ／ｍｅを含
有する振とうフラスコ内で、１ｍＭＩＰＴＧの存在下、
あるいは非存在下において増殖させた。培養物中の白血
球をＣ１３章で述べた方法によって分析した。ＴＰＴＧ
の存在下に増殖させた培養物のインターフェロン値は１
００，０００単位／、ｆ（１０Ｄ６００）であるのに対
してＩＰＴＧ非存在下に増殖させて得た培養物の値は２
０００単位／ ｍｅ １０Ｄ６００であった。
ペニシリナーゼまたは白血球インターフェロンの遺伝子
以外の他の遺伝子、例えばプロインスリン、あるいはβ
−またはγ−インターフェロンなどの遺伝子に本発明の
実施例り、ｌおよびり、３に類似する組立て法を用いる
ことは当業者にとっては容易なことである。本明細書中
で例示したプラスミド類はペニシリナーゼまたは白血球
インターフェロンＡの暗号ＤＮＡを取出すために、適当
な制限酵素で開裂することができ、これらの部分に所望
のタンパク質を暗号化しているＤＮＡフラグメントをラ
イゲーションによって置換えることができる。
以外の他の遺伝子、例えばプロインスリン、あるいはβ
−またはγ−インターフェロンなどの遺伝子に本発明の
実施例り、ｌおよびり、３に類似する組立て法を用いる
ことは当業者にとっては容易なことである。本明細書中
で例示したプラスミド類はペニシリナーゼまたは白血球
インターフェロンＡの暗号ＤＮＡを取出すために、適当
な制限酵素で開裂することができ、これらの部分に所望
のタンパク質を暗号化しているＤＮＡフラグメントをラ
イゲーションによって置換えることができる。
込み
り、１．３で述べた、リプレッサー遺伝子を含有するリ
プレッサープラスミドｐＩＱ４５をＢａｍ Ｈ■で消化
し、Ｓａｕ ３ Ａで部分消化されているＢ。
プレッサープラスミドｐＩＱ４５をＢａｍ Ｈ■で消化
し、Ｓａｕ ３ Ａで部分消化されているＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ ＤＮＡとライゲートした。Ｂ、５ｕ
ｂｔｉｌｉｓＤＮＡはＬｏｖｅｔｔ、 Ｐ、Ｓ、ら（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ−ｍＯＩＯｇｙ６８：３
４２（１９７９））の方法においてプロインスリンをプ
ロナーゼに置き換えて調製した。Ｃｍｐγ形質転換体を
選択し、それらのプラスミドを制限消化によって分析し
た。Ｓａｕ ３ Ａ挿入体を含有し、該挿入体の、Ｉａ
ｃｌＪプレツサー遺伝子から離れた側に１個のＢａｍＨ
Ｉ部位を有するｐＴＱ４５の誘導体はｐＩＱ４ｓ−３７
と名付けられた（第１０図）。
ｂｔｉｌｉｓＤＮＡはＬｏｖｅｔｔ、 Ｐ、Ｓ、ら（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ−ｍＯＩＯｇｙ６８：３
４２（１９７９））の方法においてプロインスリンをプ
ロナーゼに置き換えて調製した。Ｃｍｐγ形質転換体を
選択し、それらのプラスミドを制限消化によって分析し
た。Ｓａｕ ３ Ａ挿入体を含有し、該挿入体の、Ｉａ
ｃｌＪプレツサー遺伝子から離れた側に１個のＢａｍＨ
Ｉ部位を有するｐＴＱ４５の誘導体はｐＩＱ４ｓ−３７
と名付けられた（第１０図）。
Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ 、 Ｓ、およびＷｅｉｓｂｌｕ
ｍ、 Ｂ、（Ｊ。
ｍ、 Ｂ、（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５０ ：８０４（１９８２）
）が報告し、その配列を決定したプラスミドｐＥ１９４
から得られるエリスロマイシン耐性に関する遺伝子を一
１ａｃリプレッサーをＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ染色体に導
入する際のマーカーとして用いた。有用な制限サイト（
部位）を作り出すために、エリスロマイシン耐性遺伝子
を含有し、しかも最も大きい、ＰＥ１９４のＴａｑｌ：
フラグメントを単離し、ｐＢＲ３２２のＣＩａ■部位に
ライゲートした。この誘導体はｐ Ｔａ ｑＡ５と呼称
され、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ４部位およびＢａｍ Ｈ
■部位でその両側をかこまれたｅｒｙ耐性遺伝子を含有
している。
）が報告し、その配列を決定したプラスミドｐＥ１９４
から得られるエリスロマイシン耐性に関する遺伝子を一
１ａｃリプレッサーをＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ染色体に導
入する際のマーカーとして用いた。有用な制限サイト（
部位）を作り出すために、エリスロマイシン耐性遺伝子
を含有し、しかも最も大きい、ＰＥ１９４のＴａｑｌ：
フラグメントを単離し、ｐＢＲ３２２のＣＩａ■部位に
ライゲートした。この誘導体はｐ Ｔａ ｑＡ５と呼称
され、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ４部位およびＢａｍ Ｈ
■部位でその両側をかこまれたｅｒｙ耐性遺伝子を含有
している。
ｐＴａｑＡ５をＥｃｏＲ：［とＢａｍ ＨＩで消化し、
ｅｒｙ耐性遺伝子を含有するフラグメントを単離した。
ｅｒｙ耐性遺伝子を含有するフラグメントを単離した。
またＰＴＱ４５−３７をＥｃｏＲＩとＢａｍ ＨＩ テ
消化し、ｌａｃリプレッサー遺伝子を含有するフラグメ
ントおよびＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ染色体の、ラグメ７
）を単離した。これらの２種のフラグメントをライゲー
トシ、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ １６８ （Ｄ形質
転換ｉｃ 用イた。
消化し、ｌａｃリプレッサー遺伝子を含有するフラグメ
ントおよびＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ染色体の、ラグメ７
）を単離した。これらの２種のフラグメントをライゲー
トシ、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ １６８ （Ｄ形質
転換ｉｃ 用イた。
これら２つのフラグメントのどちらも複製起源を有して
いないので、ｅｒｙ耐性形質転換体が生成するためには
、Ｈａｌｄｅｎｗａｎｇ、 Ｗ、 Ｇ、ら（Ｊ、ＢａＣ
ｔｅ−ｒｉｏｌ、１４２：９０（１９８０））の記載の
如く、プラスミドが染色体内に組換えられる以外に方法
はない。
いないので、ｅｒｙ耐性形質転換体が生成するためには
、Ｈａｌｄｅｎｗａｎｇ、 Ｗ、 Ｇ、ら（Ｊ、ＢａＣ
ｔｅ−ｒｉｏｌ、１４２：９０（１９８０））の記載の
如く、プラスミドが染色体内に組換えられる以外に方法
はない。
Ｉａｃ＋Ｊプレッサーは、ｅｒｙ耐性遺伝子の組込みに
必要な１片の染色体ＤＮＡに共有結合的に結合している
ので、全てのｅｒｙ耐性形質転換体は、染色体内に組み
込まれたｌａｃリプレッサーを持っているはずである。
必要な１片の染色体ＤＮＡに共有結合的に結合している
ので、全てのｅｒｙ耐性形質転換体は、染色体内に組み
込まれたｌａｃリプレッサーを持っているはずである。
特ｌこ１個のｅｒｙ耐性形質転換体を選んで１１６８：
ＥＲと名付けた。
ＥＲと名付けた。
ｐａｃ−Ｉでコントロールされるペニシリナーゼ遺伝子
を有し、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ染色体に組み込まれ得
るｐＡＣＸ−２１の組立ては、第１１図に示されている
。親プラスミドｐＡｃ１３は第１１図に示すように４個
のフラグメントのライゲーションによって組立てられた
。
を有し、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ染色体に組み込まれ得
るｐＡＣＸ−２１の組立ては、第１１図に示されている
。親プラスミドｐＡｃ１３は第１１図に示すように４個
のフラグメントのライゲーションによって組立てられた
。
第１番目のｐｖｕ ＩＩＩ −Ｐｓｔ Ｉフラグメント
は天然のベニシリナーゼプロモーターとベニシリナーゼ
遺伝子の前端部分を有しており、ｐＢｓＡ−１から導か
れた。第２番目のＰｓｔ １− ＢａｍＨ■フラグメン
トはペニシリナーゼ遺伝子の後方部分を有しておりｐＢ
ＳＡ−１０５から導かれた。第３番目のＰｖｕ ■−Ｂ
ａｍ Ｈ：［７ラグメントはＰＢＲ３２２複製起源を有
しておリープラスミドｐＢ８４２から導かれた。第４番
目のＨｉ ｎｄ ］［−Ｈｈａ １ フラグメントはプ
ラスミドル０１９４由来のフロラムフェニコール耐性（
ＣＡＴ）遺伝子を含有しており、Ｅｎｒｌｉｃｈ、 Ｓ
、Ｄ、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ７５：１４３３（１９７８））記載の方法に従って
プラスミドｐＨｖ１４から単離した。
は天然のベニシリナーゼプロモーターとベニシリナーゼ
遺伝子の前端部分を有しており、ｐＢｓＡ−１から導か
れた。第２番目のＰｓｔ １− ＢａｍＨ■フラグメン
トはペニシリナーゼ遺伝子の後方部分を有しておりｐＢ
ＳＡ−１０５から導かれた。第３番目のＰｖｕ ■−Ｂ
ａｍ Ｈ：［７ラグメントはＰＢＲ３２２複製起源を有
しておリープラスミドｐＢ８４２から導かれた。第４番
目のＨｉ ｎｄ ］［−Ｈｈａ １ フラグメントはプ
ラスミドル０１９４由来のフロラムフェニコール耐性（
ＣＡＴ）遺伝子を含有しており、Ｅｎｒｌｉｃｈ、 Ｓ
、Ｄ、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ７５：１４３３（１９７８））記載の方法に従って
プラスミドｐＨｖ１４から単離した。
上記の章で述べた方法と同様の方法で、Ｂ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ 染色体ＤＮＡ（７）無作為なＳａｕ
３ Ａフラグメントを、ｐＡｃ１３の特異なりａｍＨ
Ｉ部位に挿入した。無作為な挿入体にＥｃｏＲＩ、Ｐｓ
ｔ■またはＢｇＩＩ部位のどれかが欠けている特定の誘
導体を選択してＰＡＣＸ、−２１と名付けた（第１１図
）。
３ Ａフラグメントを、ｐＡｃ１３の特異なりａｍＨ
Ｉ部位に挿入した。無作為な挿入体にＥｃｏＲＩ、Ｐｓ
ｔ■またはＢｇＩＩ部位のどれかが欠けている特定の誘
導体を選択してＰＡＣＸ、−２１と名付けた（第１１図
）。
ＰＡＣＸ−２１のベニシリナーゼ遺伝子を、単に天然の
プロモーターをｐ Ｂ Ｓ Ａ １０５由来のｐａｃ
−■プロモーターで置き換えることによりｐａｃ−■プ
ロモーターのコントロール下に置き、ｐＰＣＸ−２１を
得た。（第１１図） プラスミドｐＰＣＸ−２１およびＰＡＣＸ−２１でＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ菌株１１６８：ＥＲを形質転換し、Ｃ
ＭＰ耐性に基いてプラスミドの組み込み体を選択した。
プロモーターをｐ Ｂ Ｓ Ａ １０５由来のｐａｃ
−■プロモーターで置き換えることによりｐａｃ−■プ
ロモーターのコントロール下に置き、ｐＰＣＸ−２１を
得た。（第１１図） プラスミドｐＰＣＸ−２１およびＰＡＣＸ−２１でＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ菌株１１６８：ＥＲを形質転換し、Ｃ
ＭＰ耐性に基いてプラスミドの組み込み体を選択した。
各プラスミド組み込み体のベニシリナーゼ分析は前述の
如くして行なった。結果を以下に示す。
如くして行なった。結果を以下に示す。
第１図はシャトルベクターのＰＢＳ４２、ｐＢＳＡ４２
およびｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２サブクローンの組立て図で
ある。第２図はｐａｃ−１プロモーター オペレーター
のコントロール下にあるペニシリナーゼ遺伝子を含有し
ているプラスミドｐ Ｂ Ｓ Ａ １０５の組立て図で
ある。第３図はＩａｃ ］： ＩＪプレツサーの発現ベ
クターであるプラスミドｐＩＱ４５ の組立て図である
。第４図は本発明のポータプルなコントロール系の支配
下にあるペニシリナーゼ発現ベクターｐ Ａ Ｉ Ｑ
２５の組立て図である。第５図はＰＶＡ平板上で増殖さ
せたＩＰＴＧ誘導細胞のベニシリナーゼ発現状態を示す
グラフであって、上段は１ＰＴＧ不存在の場合を、下段
は存在する場合をそれぞれ示す。第６図はＰＡＩＱ２５
で形質転換したＢａｃｉｌｌｕｓ （Ｉ １６８ ）の
培養物の上澄みに対する５ＤＳ−ＰＡＧＥ測定の結果を
示すものであって、第１列はｐ Ａ Ｉ Ｑ ２５で形
質転換した■１６８をＩＰＴＧ不存在下で、第２列はＩ
ＰＴＧ存在下で増殖させた場合、また第３列および第４
列はｐＢＳ４２で形質転換した■１６８をＩＰＴＧの存
在下および不存在下において増殖させた場合の結果を示
すものである。第７図は本発明のコントロール系の下に
ある白血球インターフェロンＡの発現ベクターＰＬＩＱ
１の組立て図並びにｐＡＩＱ１２０の組立て図である。 第８図はハイブリッドプロモーター／オペレーターのヌ
クレオチド配列を示す模式図であって、上側はｐａｃ
−Ｉを、下側は、５ｐａｃ−１をそれぞれ示す。第９図
はヒト白血球インターフェロンＡ遺伝子に対して機能的
に結合した５ｐａｃ−１プロモーター／オペレーターを
含有しているｐＳＰＩＦ−１［の組立て図である。第１
０図は染色体−補体、挿入体を含有するｐＥＲの組立て
図である。第１１図は組み込み可能なプラスミドの中に
、ｐａｃ −１のコントロール下にあるペニシリナーゼ
遺伝子を含むｐＰＣＸ−２１の組立て図である。第１２
図はＰＩＱ４５の組立てに用いた、ＥｃｏＲＩおよびＢ
ｓｔＥ］Ｉ部位を含有するフラグメントの配列を示す模
式図である。 特許出願人 ジエネソテク、インコーポレイテッド代
理 人 弁理士 青白 葆 はか１名ｐＢ！３４２ベア
９− ρＣ１９４ＣＡＴメ１イ２【＋ ｐＢｓ４２ベクター 面コの浄り（内容に変更なし） 第５図 Ｂ５４２ ↓ 図面の浄コ（内容：こ変更なし） 第６図 ２３４ 手続補正書働式） １．事件の表示 昭和５９年特許願第 １３４０４３ 号２、発明の名称 誘導可能なポータプル・フントロール系３補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国カリ７オルニア９４．０８０、サ
ウス・サン・７ランシスコ、ポイント・サン・ブルーノ
・ブールバード４６０番 名称 ジェネンテク、インコーポレイテッド４、代理人 住所 大阪府大阪市東区本町２−１０ 木釘ビル内７、
補正の内容 （イ）明細書中、以下の箇所を補正する。 （１）５２頁１１行、「グラフであって、」を１状態図
である。」と訂正。 （２）５２頁１５行、「示すものであって、」を１示す
グラフである。」と訂正。 （ロ）濃墨を用いて適正な用紙に鮮明に描いノこ第５図
および第６図を提出する。 ＞′Ａ 皿
およびｐ Ｂ Ｓ Ａ ４２サブクローンの組立て図で
ある。第２図はｐａｃ−１プロモーター オペレーター
のコントロール下にあるペニシリナーゼ遺伝子を含有し
ているプラスミドｐ Ｂ Ｓ Ａ １０５の組立て図で
ある。第３図はＩａｃ ］： ＩＪプレツサーの発現ベ
クターであるプラスミドｐＩＱ４５ の組立て図である
。第４図は本発明のポータプルなコントロール系の支配
下にあるペニシリナーゼ発現ベクターｐ Ａ Ｉ Ｑ
２５の組立て図である。第５図はＰＶＡ平板上で増殖さ
せたＩＰＴＧ誘導細胞のベニシリナーゼ発現状態を示す
グラフであって、上段は１ＰＴＧ不存在の場合を、下段
は存在する場合をそれぞれ示す。第６図はＰＡＩＱ２５
で形質転換したＢａｃｉｌｌｕｓ （Ｉ １６８ ）の
培養物の上澄みに対する５ＤＳ−ＰＡＧＥ測定の結果を
示すものであって、第１列はｐ Ａ Ｉ Ｑ ２５で形
質転換した■１６８をＩＰＴＧ不存在下で、第２列はＩ
ＰＴＧ存在下で増殖させた場合、また第３列および第４
列はｐＢＳ４２で形質転換した■１６８をＩＰＴＧの存
在下および不存在下において増殖させた場合の結果を示
すものである。第７図は本発明のコントロール系の下に
ある白血球インターフェロンＡの発現ベクターＰＬＩＱ
１の組立て図並びにｐＡＩＱ１２０の組立て図である。 第８図はハイブリッドプロモーター／オペレーターのヌ
クレオチド配列を示す模式図であって、上側はｐａｃ
−Ｉを、下側は、５ｐａｃ−１をそれぞれ示す。第９図
はヒト白血球インターフェロンＡ遺伝子に対して機能的
に結合した５ｐａｃ−１プロモーター／オペレーターを
含有しているｐＳＰＩＦ−１［の組立て図である。第１
０図は染色体−補体、挿入体を含有するｐＥＲの組立て
図である。第１１図は組み込み可能なプラスミドの中に
、ｐａｃ −１のコントロール下にあるペニシリナーゼ
遺伝子を含むｐＰＣＸ−２１の組立て図である。第１２
図はＰＩＱ４５の組立てに用いた、ＥｃｏＲＩおよびＢ
ｓｔＥ］Ｉ部位を含有するフラグメントの配列を示す模
式図である。 特許出願人 ジエネソテク、インコーポレイテッド代
理 人 弁理士 青白 葆 はか１名ｐＢ！３４２ベア
９− ρＣ１９４ＣＡＴメ１イ２【＋ ｐＢｓ４２ベクター 面コの浄り（内容に変更なし） 第５図 Ｂ５４２ ↓ 図面の浄コ（内容：こ変更なし） 第６図 ２３４ 手続補正書働式） １．事件の表示 昭和５９年特許願第 １３４０４３ 号２、発明の名称 誘導可能なポータプル・フントロール系３補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国カリ７オルニア９４．０８０、サ
ウス・サン・７ランシスコ、ポイント・サン・ブルーノ
・ブールバード４６０番 名称 ジェネンテク、インコーポレイテッド４、代理人 住所 大阪府大阪市東区本町２−１０ 木釘ビル内７、
補正の内容 （イ）明細書中、以下の箇所を補正する。 （１）５２頁１１行、「グラフであって、」を１状態図
である。」と訂正。 （２）５２頁１５行、「示すものであって、」を１示す
グラフである。」と訂正。 （ロ）濃墨を用いて適正な用紙に鮮明に描いノこ第５図
および第６図を提出する。 ＞′Ａ 皿
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、主暗号配列発現のための細菌性ポータプル・コント
ロール系であって、（ａ）該主暗号配列に機能的に結合
したプロモーター／オペレーター−および（ｂ）上記オ
ペレーターに適合可能なリプレッサーを暗号化している
ＤＮＡ配列であって、上記プロモーターに機能的に結合
しているＤＮＡ配列、を含有しているコントロール系。 ２、主暗号配列発現のための細菌性ポータプル・転写コ
ントロール系であって、（ａ）リプレッサーと結合可能
なオペレーターＤＮＡ配列、および（ｂ）該オペレータ
ーに適合可能なリプレッサーを暗号化しているＤＮＡ配
列、を含有しており−オペレーターおよびリプレッサー
暗号配列がプロモーターに機能的に結合しているコント
ロール系。 ３、誘導によって調節でき、グラム陽性菌内で作動し得
る転写コントロール系。 （１） ４、 オペレーターがｌａｃオペレーターであり、リプ
レッサーがｌａｃ ：［である第１項〜第３項のいずれ
かに記載のコントロール系。 ５ 主暗号配列がペニシリナーゼまたは白血球インター
フェロンＡを暗号化している第１項〜第３項のいずれか
に記載のコントロール系。 ６、 プロモーターが宿主菌に適合し得るものである第
１項〜第３項のいずれかに記載のコントロール系。 ７、プロモーターがＢａｃｉｌｌｕｓプロモーターであ
る第６項に記載のコントロール系。 ８、第１項〜第３項のいずれかに記載の転写コントロー
ル系を含有する、主遺伝子のための発現ベクター。 ９ 第８項に記載のベクターにより形質転換された微生
物。 １０、第８項に記載のベクターにより形質転換された微
生物の培養物。 １１、ｐａｃ −１ハイブリツドプロモーター／オペレ
ーター。 （２−１） １２、 ５ｐａｃ−１ハイブリツドプロモーター／オペ
レーター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US50838883A | 1983-06-27 | 1983-06-27 | |
| US508388 | 1983-06-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6070085A true JPS6070085A (ja) | 1985-04-20 |
Family
ID=24022564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59134043A Pending JPS6070085A (ja) | 1983-06-27 | 1984-06-27 | 誘導可能なポ−タブル・コントロ−ル系 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0130074B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6070085A (ja) |
| AT (1) | ATE60803T1 (ja) |
| CA (1) | CA1264686A (ja) |
| DE (1) | DE3484078D1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0136907A3 (en) * | 1983-10-03 | 1986-12-30 | Genentech, Inc. | A xenogeneic expression control system, a method of using it, expression vectors containing it, cells transformed thereby and heterologous proteins produced therefrom |
| GB2166743B (en) * | 1984-11-13 | 1989-01-05 | Solvay | Process for a thermo-inducible gene expression in gram positive bacteria and bacillus subtilis strains containing plasmids which induce such an expression |
| DK160947C (da) * | 1986-04-17 | 1991-10-21 | Novo Industri As | Gen-udtrykkelsessystem |
| EP0303925B1 (de) * | 1987-08-17 | 1995-06-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Hochreprimierbare Expressionskontrollsequenzen |
| EP0544707A1 (en) * | 1990-08-13 | 1993-06-09 | Alko Limited | HYBRID $g(a)-AMYLASE PROMOTERS |
| WO1997004110A1 (en) * | 1995-07-14 | 1997-02-06 | Somatogen, Inc. | Methods for increasing protein expression |
| IL142895A0 (en) | 1998-11-03 | 2002-04-21 | Mitokor | Adenine nucleotide translocator polyptides |
| US6906173B2 (en) | 1998-11-03 | 2005-06-14 | Migenix Corp. | Production of adenine nucleotide translocator (ANT), novel ANT ligands and screening assays therefor |
| WO2001085944A2 (en) * | 2000-05-11 | 2001-11-15 | Mitokor | Production of adenine nucleotide translocator (ant), novel ant ligands and screening assays therefor |
| ES2299284B1 (es) * | 2004-11-04 | 2009-04-16 | Universidad Pablo De Olavide | Control de la expresion genica mediante el uso de un atenuador de la transcripcion. |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54141790A (en) * | 1978-04-14 | 1979-11-05 | Pasteur Institut | Modified dna and method of manufacturing hybrid protein using it |
| JPS5550892A (en) * | 1978-06-08 | 1980-04-14 | Pasteur Institut | Protein production * modified dna and vector applicable to said method |
| JPS56167698A (en) * | 1980-03-17 | 1981-12-23 | Purejidento Ando Fuerouzu Obu | Most desirable polypeptide prduction |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4374927A (en) * | 1981-02-24 | 1983-02-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Extrachromosomal regulation of expression |
| IL65775A (en) * | 1981-05-18 | 1985-05-31 | Genentech Inc | Microbial hybrid promotors and plasmids and e.coli comprising them |
| DE3319242A1 (de) * | 1983-05-27 | 1984-11-29 | Battelle-Institut E.V., 6000 Frankfurt | Verfahren und plasmid zur steuerung der expression von klonierten genen |
-
1984
- 1984-06-25 EP EP84304278A patent/EP0130074B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-25 DE DE8484304278T patent/DE3484078D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-25 AT AT84304278T patent/ATE60803T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-06-27 JP JP59134043A patent/JPS6070085A/ja active Pending
- 1984-06-27 CA CA000457631A patent/CA1264686A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54141790A (en) * | 1978-04-14 | 1979-11-05 | Pasteur Institut | Modified dna and method of manufacturing hybrid protein using it |
| JPS5550892A (en) * | 1978-06-08 | 1980-04-14 | Pasteur Institut | Protein production * modified dna and vector applicable to said method |
| JPS56167698A (en) * | 1980-03-17 | 1981-12-23 | Purejidento Ando Fuerouzu Obu | Most desirable polypeptide prduction |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0130074B1 (en) | 1991-02-06 |
| DE3484078D1 (de) | 1991-03-14 |
| EP0130074A1 (en) | 1985-01-02 |
| CA1264686A (en) | 1990-01-23 |
| ATE60803T1 (de) | 1991-02-15 |
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