JPH01132383A - プラスミド組換え体 - Google Patents
プラスミド組換え体Info
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- JPH01132383A JPH01132383A JP28933287A JP28933287A JPH01132383A JP H01132383 A JPH01132383 A JP H01132383A JP 28933287 A JP28933287 A JP 28933287A JP 28933287 A JP28933287 A JP 28933287A JP H01132383 A JPH01132383 A JP H01132383A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、遺伝子工学的手法による表皮増殖作用を有す
る蛋白質の合成法に係り、特にその高効率生産、生産蛋
白質の安定性、生産蛋白質の分離精製に好適なプラスミ
ド組換え体に関する。
る蛋白質の合成法に係り、特にその高効率生産、生産蛋
白質の安定性、生産蛋白質の分離精製に好適なプラスミ
ド組換え体に関する。
一般に遺伝子工学的手法により、微生物体に、それが本
来生産していない蛋白質を生産させる場合、その合成効
率を向上させるためには、主に下記の要因を満たす必要
がある。これらは、（１）転写効率、翻訳効率の高いク
ローニングベクターの使用、（２）ベクターの特性を有
効に発揮させる宿主の選択、（３）生産蛋白質の安定性
、（４）組換え大腸菌培養液からの生産蛋白質の高効率
回収法の確立である。
来生産していない蛋白質を生産させる場合、その合成効
率を向上させるためには、主に下記の要因を満たす必要
がある。これらは、（１）転写効率、翻訳効率の高いク
ローニングベクターの使用、（２）ベクターの特性を有
効に発揮させる宿主の選択、（３）生産蛋白質の安定性
、（４）組換え大腸菌培養液からの生産蛋白質の高効率
回収法の確立である。
表皮増殖活性を有す蛋白質性因子（以下ＥＧＦと略記）
の遺伝子工学的手法による生産に関し、ウルデア等（Ｕ
ｒｄｅａ、 Ｍ、Ｓ、ｅｔａｌ）、プロシーデイング
イン ナショナル ア力デエミツク サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＡｃａｄＳｃｉ） Ｕ、Ｓ、Ａ、
８０． Ｎａ ２４ 。
の遺伝子工学的手法による生産に関し、ウルデア等（Ｕ
ｒｄｅａ、 Ｍ、Ｓ、ｅｔａｌ）、プロシーデイング
イン ナショナル ア力デエミツク サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＡｃａｄＳｃｉ） Ｕ、Ｓ、Ａ、
８０． Ｎａ ２４ 。
ｐ ｐ 、 ７４６１−７４６５ （１９８３） ；フ
ロック等（Ｆｌｏｃｋ。
ロック等（Ｆｌｏｃｋ。
Ｊ、１．ｅｔａｌ） 、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、、 １９５． Ｎａｌ／２ｐｐ、２４６−２５１、
（１９８４） ；特開昭５７−１２２０９６号公報、
北澤利記ほか：日本生化学会大会講演要旨、Ｐ 、 ８
５３ （１９８５）があり、いずれも５３個のアミノ酸
からなる天然型ＥＧＦの生産を目積したものである。融
合型ＥＧＦに関しては、ｔ ｒｐＥタンパクのＮ端部分
とＥＧＦとを連結したプラスミド組換え体が報告されて
いるスミス等（Ｓｍｉｔｈ、 Ｊ、 ｅｔａｌ）ニュー
クリーク エイシトリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅ５）、 Ｖｏｌ、 １０ 、 Ｎａ１５ 、
ｐ ｐ 、 ４４６７−４４８２ （１９８２））。
ｔ、、 １９５． Ｎａｌ／２ｐｐ、２４６−２５１、
（１９８４） ；特開昭５７−１２２０９６号公報、
北澤利記ほか：日本生化学会大会講演要旨、Ｐ 、 ８
５３ （１９８５）があり、いずれも５３個のアミノ酸
からなる天然型ＥＧＦの生産を目積したものである。融
合型ＥＧＦに関しては、ｔ ｒｐＥタンパクのＮ端部分
とＥＧＦとを連結したプラスミド組換え体が報告されて
いるスミス等（Ｓｍｉｔｈ、 Ｊ、 ｅｔａｌ）ニュー
クリーク エイシトリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅ５）、 Ｖｏｌ、 １０ 、 Ｎａ１５ 、
ｐ ｐ 、 ４４６７−４４８２ （１９８２））。
上記の天然型ＥＧＦを大腸菌で生産させる際にＥＧＦ遺
伝子の上流に１ ａ ｃＵＶ５．ｔ ｒＰｙｔａｃなど
の強力なプロモーターを連結し、生産量の増大をはかっ
たが、ＥＧＦの生産を確認出来なかったと報告している
（北澤利記ほか：日本化化学会大会講演要旨、 ｐ、
８５３ （１９８５） ）。また、これまで報告されて
いる天然型ＥＧＦの大腸菌体内での生産量は、比較的少
ない。これは、蛋白質の安定性を考慮しておらず、小さ
なペプチドのため効率よく合成されても大腸菌のプロテ
アーゼによりすみやかに分解されてしまうためと思われ
る（イタクラ等（Ｋ 、 Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ
） ：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、 １９８ 、
１０５６ （１９７７） ）。
伝子の上流に１ ａ ｃＵＶ５．ｔ ｒＰｙｔａｃなど
の強力なプロモーターを連結し、生産量の増大をはかっ
たが、ＥＧＦの生産を確認出来なかったと報告している
（北澤利記ほか：日本化化学会大会講演要旨、 ｐ、
８５３ （１９８５） ）。また、これまで報告されて
いる天然型ＥＧＦの大腸菌体内での生産量は、比較的少
ない。これは、蛋白質の安定性を考慮しておらず、小さ
なペプチドのため効率よく合成されても大腸菌のプロテ
アーゼによりすみやかに分解されてしまうためと思われ
る（イタクラ等（Ｋ 、 Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ
） ：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、 １９８ 、
１０５６ （１９７７） ）。
また、スミスらのｔｒｐＥタンパクのＮ末端全部とＥＧ
Ｆを連結した融合型ＥＧＦは、蛋白質の安定性という点
は考慮されているが、大腸菌菌体内で融合型として生産
されるため、生産量に限界があること、又、分離・精製
操作の困難さが考慮されていない。
Ｆを連結した融合型ＥＧＦは、蛋白質の安定性という点
は考慮されているが、大腸菌菌体内で融合型として生産
されるため、生産量に限界があること、又、分離・精製
操作の困難さが考慮されていない。
本発明の目的は、大腸菌菌体内で安定に存在する融合型
ＥＧＦを生産させる能力があり、かつ生産された融合型
タンパク質は分泌型のため分離・精製が簡便でＥＧＦの
高効率生産をも可能とするプラスシト組換え体ｐＡＭＰ
ＵＧを提供することにある。
ＥＧＦを生産させる能力があり、かつ生産された融合型
タンパク質は分泌型のため分離・精製が簡便でＥＧＦの
高効率生産をも可能とするプラスシト組換え体ｐＡＭＰ
ＵＧを提供することにある。
上記目的は、ラスミドｐＢＲ３２２に存在するアンピシ
リン耐性遺伝子上の制限酸素Ｈｉ ｎ ｃ ｎ部位にＥ
ＧＦ遺伝子のＮ末端を連結することにより達成される。
リン耐性遺伝子上の制限酸素Ｈｉ ｎ ｃ ｎ部位にＥ
ＧＦ遺伝子のＮ末端を連結することにより達成される。
この場合、アンピシリン耐性遺伝子のプロモーター、及
びＳＤ配列を利用すること、及び、Ｈｉ ｎ ｃ ｎ部
位にＥＧＦ遺伝子が連結した場合、アンピシリン耐性遺
伝子の産物であるぺ二シリナーゼが分泌酵素であるため
に、アンピシリン耐性遺伝子の持つ２３個のシグナルペ
プチドをコードする遺伝子により、融合型タンパク質が
大腸菌のペリプラズムと呼ばれる細胞壁と細胞膜との間
の空間に分泌されることは公知である［パセク等（Ｐａ
ｓｅｋ ｅｔ ａｌ） 、ネエーチャー（Ｎａｔｕｒｅ
） 。
びＳＤ配列を利用すること、及び、Ｈｉ ｎ ｃ ｎ部
位にＥＧＦ遺伝子が連結した場合、アンピシリン耐性遺
伝子の産物であるぺ二シリナーゼが分泌酵素であるため
に、アンピシリン耐性遺伝子の持つ２３個のシグナルペ
プチドをコードする遺伝子により、融合型タンパク質が
大腸菌のペリプラズムと呼ばれる細胞壁と細胞膜との間
の空間に分泌されることは公知である［パセク等（Ｐａ
ｓｅｋ ｅｔ ａｌ） 、ネエーチャー（Ｎａｔｕｒｅ
） 。
２８２、５７５ （１９７９） ］。
大腸菌が本来生産している蛋白質（ペニシリナーゼ）と
ＥＧＦと融合型タンパク質にすることにより、大腸菌体
内での安定性をはかった。さらに、アンピシリン耐性遺
伝子のプロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチドのた
めの配列を利用することにより、大腸菌内で生産された
融合型ＥＧＦは分解されることなくすみやかに、ペリプ
ラズムに移行し、ゆがて菌体外に出される。そのために
分離・精製が簡便で、しかも、大腸菌体内での生産物に
よるフィードバックによる生産制限を回避し、大量生産
を望めるようになった。
ＥＧＦと融合型タンパク質にすることにより、大腸菌体
内での安定性をはかった。さらに、アンピシリン耐性遺
伝子のプロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチドのた
めの配列を利用することにより、大腸菌内で生産された
融合型ＥＧＦは分解されることなくすみやかに、ペリプ
ラズムに移行し、ゆがて菌体外に出される。そのために
分離・精製が簡便で、しかも、大腸菌体内での生産物に
よるフィードバックによる生産制限を回避し、大量生産
を望めるようになった。
以下、プラスミド組換え体ｐＡＭＵＧ作製の１実施例を
第１図により説明する。
第１図により説明する。
プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素Ｈｉ ｎ ｃ Ｈに
より切断し、０．８ ％アガロースゲル電気泳動で１１
０６塩基対のＤＮＡ断片を分離し、１１０６塩基対に担
当するゲルを切り出し、透析キューブに入れ、電気的に
１１０６ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから泳出させ精製した
。一方、ｐＢＲ３２２ＵＧ’は、ＰＢＲ３２２のＥ ｃ
ｏ ＲＩ −Ｂ ａ ｍ Ｈｎ部位に第２図に示した
ＥＧＦ遺伝子を持つプラスミドである。これをＸｂａＩ
で切断し、常法に従って、Ｋｌｅｎｏ％ｌＦｒａｇｍｅ
ｎｔにより接着末端を平滑末端にした。さらにこのプラ
スミドの末端のリンをバクテリアのアルカリフォスファ
ターゼで除去し、このプラスミド同士の結合の回避をは
かり、先に得た１１０６塩基対のＤＮＡとＴ ４ Ｄ
Ｎ Ａ リガーゼを用いて連結した。この連結は、平
滑末端のＤＮＡ断片間で行なわれるため、この反応では
、図のＡ、Ｂの他、１１０６塩基対のＤＮＡ断片が何個
か入ったもの、又、連結がおこなわれていないもとの断
片が存在した。この反応で生ずるＤＮＡ形態を考慮し、
連結で生じた全ての試料をＥｃｏＲｌ、ＨｉｎｃｌＩで
二重切断し、６％ポリアクリルアシドゲル電気泳動、透
析チューブを用いた電気溶出法により、約９００ｂｐの
融合型ＥＧＦ遺伝子を持つＤＮＡ断片を得た。これを新
たなｐＢＲ３２２をＤｒａｌ、ＥｃｏＲＩで二重切断し
、アルカリフォスファターゼ処理をした３２３１塩基対
のベクターにＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ リガーゼにより連結
し、組換えプラスミドｐＡＭＰＵＧを得た。次いでルビ
ジウム・カルシウム法で大腸菌ＨＢ １０１をｐＡＭＰ
ＵＧで形質転換しくモレキュラー クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、マニアチス（ｅｄ
ｂｙＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔａｌ）コールド スプリ
ングハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ
）、 ｐｐ２５０−２５３ （１９８２）） 。
より切断し、０．８ ％アガロースゲル電気泳動で１１
０６塩基対のＤＮＡ断片を分離し、１１０６塩基対に担
当するゲルを切り出し、透析キューブに入れ、電気的に
１１０６ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから泳出させ精製した
。一方、ｐＢＲ３２２ＵＧ’は、ＰＢＲ３２２のＥ ｃ
ｏ ＲＩ −Ｂ ａ ｍ Ｈｎ部位に第２図に示した
ＥＧＦ遺伝子を持つプラスミドである。これをＸｂａＩ
で切断し、常法に従って、Ｋｌｅｎｏ％ｌＦｒａｇｍｅ
ｎｔにより接着末端を平滑末端にした。さらにこのプラ
スミドの末端のリンをバクテリアのアルカリフォスファ
ターゼで除去し、このプラスミド同士の結合の回避をは
かり、先に得た１１０６塩基対のＤＮＡとＴ ４ Ｄ
Ｎ Ａ リガーゼを用いて連結した。この連結は、平
滑末端のＤＮＡ断片間で行なわれるため、この反応では
、図のＡ、Ｂの他、１１０６塩基対のＤＮＡ断片が何個
か入ったもの、又、連結がおこなわれていないもとの断
片が存在した。この反応で生ずるＤＮＡ形態を考慮し、
連結で生じた全ての試料をＥｃｏＲｌ、ＨｉｎｃｌＩで
二重切断し、６％ポリアクリルアシドゲル電気泳動、透
析チューブを用いた電気溶出法により、約９００ｂｐの
融合型ＥＧＦ遺伝子を持つＤＮＡ断片を得た。これを新
たなｐＢＲ３２２をＤｒａｌ、ＥｃｏＲＩで二重切断し
、アルカリフォスファターゼ処理をした３２３１塩基対
のベクターにＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ リガーゼにより連結
し、組換えプラスミドｐＡＭＰＵＧを得た。次いでルビ
ジウム・カルシウム法で大腸菌ＨＢ １０１をｐＡＭＰ
ＵＧで形質転換しくモレキュラー クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、マニアチス（ｅｄ
ｂｙＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔａｌ）コールド スプリ
ングハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ
）、 ｐｐ２５０−２５３ （１９８２）） 。
テトラサイクリン含有寒天プレート培地でテ゛Ｉ〜ラサ
イクリン耐性になったコロニーを選択した。これを液体
培地中で培養し増殖させた後、菌体より組換えプラスミ
ドｐＡＭＰＵＧを回収した（モレキュラー クローニン
グ（Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 。
イクリン耐性になったコロニーを選択した。これを液体
培地中で培養し増殖させた後、菌体より組換えプラスミ
ドｐＡＭＰＵＧを回収した（モレキュラー クローニン
グ（Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 。
ｐｐ３６６−３６９ （１９８２） ）。
さらに、上記回収したプラスミドをＥｃｏＲＩ、Ｂａｍ
ＨＩで二重切断し、６６２塩基対のＤＮＡ断片を得、こ
れをＭ１３ファージｍｐ８のＥｃｏＲＩ−Ｂ ａ ｍ
ＨＩ部位に挿入し、アマジャム社のマニュアルに従い、
塩基配列決定を行ない、アンピシリン耐性遺伝子とＥＧ
Ｆ遺伝子が蛋白質の読み取りわ＜１のずれなく結合して
いることを確認した。
ＨＩで二重切断し、６６２塩基対のＤＮＡ断片を得、こ
れをＭ１３ファージｍｐ８のＥｃｏＲＩ−Ｂ ａ ｍ
ＨＩ部位に挿入し、アマジャム社のマニュアルに従い、
塩基配列決定を行ない、アンピシリン耐性遺伝子とＥＧ
Ｆ遺伝子が蛋白質の読み取りわ＜１のずれなく結合して
いることを確認した。
融合遺伝子の結合部位は以下のようになっていた。
ｐＡＭＰＵＧを含む組換え大腸菌を培養し、大腸菌の生
産する蛋白質を抽出し、ラジオレセプタアッセイ、ウェ
スタンブロッティング−ＥＬＩＳＡ法で検定したところ
、ＥＧＦの存在が確認出来た。
産する蛋白質を抽出し、ラジオレセプタアッセイ、ウェ
スタンブロッティング−ＥＬＩＳＡ法で検定したところ
、ＥＧＦの存在が確認出来た。
さらに２４時間の培養液中すなわち菌体外にＥＧＦが分
泌されていることが確認出来た。
泌されていることが確認出来た。
本発明により作製されたプラスミドベクターｐＡＭＰＵ
Ｇを含む組換え大腸菌を培養することにより、生理活性
を持つＥＧＦを簡便かつ大量に得ることが出来る。
Ｇを含む組換え大腸菌を培養することにより、生理活性
を持つＥＧＦを簡便かつ大量に得ることが出来る。
さらに、ｐＡＭＰＵＧのアンピシリン耐性遺伝子のプロ
モータの上流に、ｔａｃプロモータ。
モータの上流に、ｔａｃプロモータ。
１ａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータなど強力なプロモ
ータを１ケないし数個連結することにより、生産量の拡
大がはかれる。
ータを１ケないし数個連結することにより、生産量の拡
大がはかれる。
以上、ここで得られた知見は汎用性を持っており、ＥＧ
Ｆ以外の構造遺伝子を組込み、それの発現を図る場合に
も応用が可能である。
Ｆ以外の構造遺伝子を組込み、それの発現を図る場合に
も応用が可能である。
第１図は、プラスミドｐ Ａ Ｍ Ｐ Ｕ Ｇの作製法
を示す図、第２図は、今回使用した合成ＥＧＦの全塩基
配列を示す図である。 Ａ・・・アデニン、Ｃ・・・シトシン、Ｇ・・・グアニ
ン、Ｔ・・・チミン。
を示す図、第２図は、今回使用した合成ＥＧＦの全塩基
配列を示す図である。 Ａ・・・アデニン、Ｃ・・・シトシン、Ｇ・・・グアニ
ン、Ｔ・・・チミン。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アンピシリン耐性遺伝子上の制限酸素ＨｉｎｃII部
位に表皮増殖作用を有すポリペプチド（ＥＧＦ）をコー
ドする構造遺伝子を連結した融合型ＥＧＦ遺伝子を持つ
プラスミド組換え体。 ２、特許請求の範囲第１項記載のプラスミド組換え体に
おいて、プロモータ、ＳＤ配列はアンピシリン耐性遺伝
子のものを使用し、大腸菌本来の転写・翻訳機構を利用
したことを特徴とするプラスミド組換え体。 ３、特許請求の範囲第２項記載のプラスミド組換え体に
おいて、アンピシリン耐性遺伝子の上流に、ｔａｃプロ
モータ、１ａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータの少なく
とも一つを１ケあるいは数個連結したプラスミド組換え
体。 ４、第３項記載のプラスミド組換え体において、アンピ
シリン耐性遺伝子のプロモータ、ＳＤ配列を変化させた
プラスミド組換え体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28933287A JPH01132383A (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | プラスミド組換え体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28933287A JPH01132383A (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | プラスミド組換え体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01132383A true JPH01132383A (ja) | 1989-05-24 |
Family
ID=17741825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28933287A Pending JPH01132383A (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | プラスミド組換え体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01132383A (ja) |
-
1987
- 1987-11-18 JP JP28933287A patent/JPH01132383A/ja active Pending
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