HU197349B - Process for producing cloning vectors usable for the expression of growth hormones - Google Patents

Description

Á találmány protein termékek előállítására használható új dezoxi-ribonukleinsav-ezekvenciák és klónozó vektorok (hordozók) előállítására vonatkozik.

Inouye Masayori és munkatársai kiterjedt vizsgálatokat végeztek a Gram-negatív baktériumok külső membrán proteinjeit, elsősorban a lipoproteint meghatározó gének megismerésére. A vizsgálatok bizonyították, hogy a lipoproteinek viszonylag nagy menynyieégben vannak jelen a baktérium sejtekben. így például az Escherichia coli külső membránjában sejtenként 7,2 χ 10⁵ lipoprotein molekula van. Ezen felül, mivel úgy tűnik, hogy az E. coli kromoszómában csak egyetlen lipoprotein strukturgén létezik, transzkripciójának módja igen hatékony kell legyen.

Inouye és munkatársainak a közelmúltban végzett kísérletei arra irányultak, hogy a lipoproteint olyan megfelelően elkészített plazmiddal fejezzék ki, amelyet megfelelően transzformált mikroorganizmusokba juttattak, és amely kísérletek lehetővé teszik a különböző lipoprotein gének (lpp) meghatározását és dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáinak analízisét. Nakamura és Inouye közlik [Cell, 18, 1109-1117 (1979)] az E. coli külső membrán lipoproteinjének dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját. Ezen szekvencia promoter szakaszának analízise bizonyos érdekességeket mutatott. Először is úgy találták, hogy a transzkripciós iniciációs helyet (-l-től a -261. bázispárig) megelőző 261 bázispár adenin-timin-tartalma 70%, azaz igen magas a 322 bázispárból álló mRNS szakasz 53%-os a transzkripciós terminációs hely után kővetkező 127 bázispárból álló szegmens 44%-os, és az E. coli kromoszóma átlagos, 49%-os adenin-timin-tartalmához képest. Másodszor, úgy találták, hogy a transzkripciós iniciációs helytől balra eső első 45 bázispár (-l-től a -45. bézispárig) 36 olyan bázist tartalmaz, amely vagy adenin vagy timin (80%). Harmadszor, a transzkripciós iniciációs helytől 8 bázissal eltolódva egy a Pribnow-boxszal azonos heptanukleotid-szekvencia helyezkedik el; negyedszer, a -27. és a -39. bázispárok között mindkét szálon egy RNS polimeráz felismerő hellyel analóg szekvencia található, ötödször, a transzkripciós iniciációs helynél egy hosszú szimmetrikus szakasz található.

Inouye és munkatársai kijelentették, hogy ezek a tulajdonságok külön-külön vagy egymással kombinálódva felelősek az lpp promoter nagyfokú hatékonyságáért. Részletesebben szólva, úgy találták, hogy a promoter-szekvencia magas adenin-timin-tartalma destabilizálja a dezoxi-ribonukleinsav hélix-szerkezetót, és ezzel a transzkripció kezdetéhez létfontosságú szálkicsavarodást elősegíti.

Inouye csoportja továbbá kimutatta, hogy nagyfokú homológia áll fenn a lipoprotein génszekvenciák között, valószínűleg az összes Gram-negatív festödésű baktérium esetén. így a Serratia marcescens lipoprotein gér. dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciájának összehasonlítása az E. coli lpp génjével nagyfokú homológiát mutatott [Nakamura és Inouye, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 1369-1373 (1980)]. Kimutatták, hogy különösen nagyfokú az azonosság a promoter .régióban (84%-os homológia), ennek extrém magas adenin- és timin-tartalma (78%) összehasonlítható az E. coli-éval (80%). Ugyanakkor, a lipoprotein mRNS 5*-nem-transzlatált szakasza is nagy homológiát (95%) mutat.

Újabban Yamagata és munkatársai [J. Bioi. Chem., 256, 2194-2198 (1981)] analizálták az Erwinia amylovora lipoprotein génjeinek dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját, és őszszehasonlították az E. coli és E. marcescens génjével. Ezek a vizsgálatok szintén alátámasztják az lpp gének között fennálló nagyfokú homológiát. A promoter régió (-45-től a - 1-ig) igen hasonló, 87% a homológia az E. coli-hoz és 93% az S. marcescens-hez viszonyítva. Igen magas adenin- és timin-tartalmat mutattak ki (80%), ez gyakorlatilag azonos az E. coli-éhoz (80%) és az S. marcescens-éhez (78%). Az mRNS nem-transzlatált szakaszának szekvenciája 97%-os homológiát mutat az E. coli-éval és 92%-os homológiát az

S. marcescens-ével összehasonlítva.

Az Inouye által bizonyított tény, hogy a lipoprotein gén nagyfokú konstitutív transzkripciót szenved, azt jelzi, hogy ez alkalmas idegen dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek kifejezésére. Inouye és munkatársainak munkája továbbá azt látszik bizonyítani, hogy a Gram-negatív festödésű baktériumok, például az Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Klebsiella aerogenes, Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda, Erwinia amylovora, Serratia marcescens lipoprotein génjei is felhasználhatók.

Inouye és munkatársainak kísérletei nemrég bizonyították, hogy a lipoprotein gén alkalmas termék kifejezésére [Lee, Nakamura és Inouye, J. Bacter., 146, 861-866 (1981)]. E munka során az S. marcescens lipoprotein génjét, lambda fág-vektorba klónozták, és ezután reklónozták a pBR322 és pSCIOl plazmid vektorokba. Az S. marcescens lpp gént hordozó mindkét vektorral E. coli sejteket transzformáltak. A kísérleti tények szerint normális kifejeződés tórtént, bár az E. coli lpp gént hordozó vektorokhoz képest valamivel kisebb mértékben.

Akárhogy is, az irodalomban közlik, hogy az lpp gén promotert és 5’-nem-transzlatált régiókat tartalmazó vektorok felhasználhatók jelentős mértékű lipoprotein-kifeje zésére.

A leírás során vektor alatt plazmidot, fág dezoxi-ribonukleinsavat vagy más, olyan dezoxii ibonukleinsav-szek véneiét értünk, amely

1) egy gazdasejtben replikálódni képes;

2) egy gazdasejtet transzformálni képes; és

3) a transzformált sejtek azonosítására használható markert hordoz.

A találmány szerinti eljárás klónozó vektorok specifikus osztályának két változatára vonatkozik. Külső proteinek jelentősen megnővekedett kifejeződése érhető el a klónozó vektorok bármelyik kiviteli változatával. Az első kiviteli változat szerint a klónozó vektorokat ügy készítjük el, hogy tandem elhelyezkedésben tartalmazzanak egy, a lipoprotein promoter régiót meghatározó nukleotid-szekvenciát, a lipoprotein 5’-nem-transzlatált szakaszát meghatározó nukleotid szekvenciát, és egy olyan szekvenciát, amely egy külső eredetű protein terméket határoz meg. Az ilyen terméket meghatározó szekvenciát egy transzlációs startjelet reprezentáló kodonon át kötjük a lipoprotein gén 5’-nem-transzlatált szakaszának 3'-végéhez. A második kivitelezési változat szerint az idegen eredetű protein terméket meghatározó szekvenciát az előzőekben megadott start kodonon és egy enterokináz hasítási helyet meghatározó nukleotid-szekvencián át kapcsoljuk a lipoprotein gén 5‘-nem-transzlatált szakaszának 3’-végéhez.

A találmány tárgya eljárás humán vagy bovin növekedési hormon kifejezésére használható rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok előállítására. Az alábbiakat tartalmazó klónozó vektort állítjuk elő:

a) E. coliban funkcionális replikációs origót tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-szegmens;

b) egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav-szegmens, mindegyik egy olyan tulajdonságot juttat transzformálható E. coli sejtbe transzformációkor, amely szelekcióra használható; és

c) tandem elhelyezkedő, alábbiakat tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-szegmena;

1) egy lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia promotere,

2) egy lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia 5'-nem-transzlatált szakasza, és

3) egy transzlációs start kodon, és ezután egy külső proteint meghatározó szekvencia, a kettő között a sejt saját proteinjét meghatározó nukleotid-szekvencia sem egy része, sem egésze nem lehet, vagy a transzlációs start kodon után egy enterokináz hasítási helyet meghatározó nukleotid-szekvencia helyezkedik el, ehhez megszakítás nélkül egy külső eredetű proteint leíró nukleotid-szekvencia kapcsolódik.

A dezoxi-ribonukleinsav klónozó rekobináns vektor előállítására az a), b) és c) pont dezoxi-ribonukleinsav-szegmenseket összekapcsoljuk. Ahogy azt már közöltük, a találmány célja olyan dezoxi-ríbonukleínsav4

-szekvenciák és rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok előállítása, amelyek igen nagy hatékonysággal termelik a külső eredetű proteint. Mindegyikükben szerepel legalább egy lipoprotein gén (lpp) rendszer, és E. coliból származó lipoprotein gén. Külső eredetű protein alatt olyan protein terméket értünk, amely a lipoprotein gén-rendszer által kifejezett lipoprotein molekulától, vagy bármilyen ehhez hasonló molekularésztől különbözik.

Az lpp gént öt elemmel írhatjuk le. Abban a sorrendben, ahogy a génben szerepelnek, ezek a következők:

1) a promoter régió;

2) az 5'-nem-lranszJatalt szakasz;

3) a lipoproteint kódoló szekvencia;

4) a 3*-nem-lranszlatáll szakasz; és

5) transzkripciós terminációs hely.

Ezen elemek funkciója a gén-rendszerben jól ismert. A promoter régió szabályozza az mRNS-termelés kezdetét (transzkripció). A promoter mentes lehet külső szabályozástól (konstitutív), állhat egy represszor szabályozása alatt, amely utóbbi - ha jelen van - leállítja a gén funkcióját. Állhat továbbá egy inducer szabályozása alatt; ez az inducer olyan anyag, amely a génfunkciót megindítja. Az lpp gén nem áll külső szabályozás alatt, ezért konstitutív.

A promoter közelében, vagy a promoterben helyezkedik el a transzkripciós iniciációshely, ez az a pont, ahová a ribonukleinsav polimeráz kötődik, és ahol elkezdődik az mRNS-transzkripciója. Ha egyszer a transzkripció megindult, mRNS keletkezik. Az mRNS szerkezetét a génelemek közül a második-negyedik határozza meg.

A keletkező mRNS protein termékké fordítható szekvenciát hordoz. A transzlatálható szekvencia az 5’-nem-transzlatált szakasztól jobbra, a 3’-nem-transzlatált régiótól pedig balra helyezkedik el. A transzlációt a riboszómáknak az mRNS molekulán lévő 5'~nemtranszlatált szakaszon lévő szekvenciához való kötődése szabályozza, ez a riboszóma kötőhely és egy transzlációs start kodonnal (AUG) kezdődik, amely egyébként kódolja a metioriin (Met) aminosavat is. A transzláció a transzlatált szakasz végén elhelyezkedő egy vagy több terminációs kodonnál áll le.

A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákkal lehetséges olyan klónozó vektorok előállítása, amelyek felhasználhatók külső eredetű (idegen) proteinek előállítására oly módon, hogy a vektorokba kifejezést szabályozó szekvenciákat építünk be, azaz olyan nukleotid-szekvenciát, amely szabályozza az adott strukturgénhez kapcsolódva annak kifejeződését. A találmány szerinti eljárás során előállított klónozó vektorok az lpp kifejeződést szabályozó szekvenciát vagy annak egy részét tartalmazzák, azaz hordozzák az előzőekben ismertetett 1), 2), 4) és 5) elemeket. A négy elem közül a találmány szerinti klónozó vektorban csak az 1. és 2. elemek szerepelnek minden esetben, azaz a promoter régió és az 5*-nem-transzlatált szakasz.

A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikák használatakor általános, hogy egy külső eredetű protein előállítására a proteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-ezekvenciát egy klónozó vektor kifejezést szabályozó szekvenciájába építjük be egy olyan ponton, hogy a termék hibrid proteinből álljon. Hibrid protein alatt olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav által meghatározott terméket értünk, amely áll egy természetes (endogén), a kifejeződést szabályozó szekvencia által meghatározott protein egészéből vagy annak egy részéből (esetünkben a lipoprotein), amelyhez kapcsolódik az idegen (exogén) protein.

A megfelelően tervezett hibrid protein az endogén proteinrészt és az idegen proteint elválasztó szakaszon hasítási helyet tartalmaz. A hasítási hely révén érett exogén protein termékhez jutunk a hibrid protein kémiai vagy enzimatikus kezelésével.

Ahogy azt az előzőekben már megadtuk, külső eredetű proteinek kifejezésére felhasználható az lpp kifejeződését szabályozó szekvencia. A közelmúltban azonban felfedezték, hogy az lpp kifejeződését szabályozó szekvencia igen előnyösen használható fel exogén proteinek kifejezésére abban az esetben, ha a molekulát úgy állítjuk össze, hogy a dezoxi-ribonukleinsav-szegmens tandem elhelyezkedésében hordozza a lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia promoterét és 5’-nem-transzlatált szakaszát, és egy transzlációs start kodont, amiután, anélkül, hogy endogén proteint meghatározó nukleotid-szekvencia vagy szekvencia-rész következne, exogén proteint meghatározó szekvencia vagy egy enterokináz hasítási helyet kódoló nukleotid-szekvencía következik, amelyhez megszakítás nélkül kapcsolódik az exogén proteint leíró szekvencia. Ez nem azonos a lipoproteint vagy ennek egy részét és exogén proteint tartalmazó hibrid proteinnel.

A találmány szerinti klónozó hordozók előállításához több elemre van szükség. Kettő a szükséges elemek közül a klónozó vektorok előállításakor általánosan használt. Először is, a vektornak tartalmaznia kell egy funkcionális replikéciós origót tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, ez a replikon. A plazmidok és fág dezoxi-ribonukleinsavak természetükből következően tartalmaznak gazdasejtben replikációt biztosító replikonokat.

Másodszor, a vektornak rendelkeznie kell egy olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmenssel, amely transzformálható gazdasejtbe egy olyan tulajdonságot juttat, amely lehetővé teszi a nem-transzformált sejtek szelekcióját a transzformált sejtek közül. Több tulajdonságot használhatunk szelekciós célokra. Az egyik leggyakrabban használt tulajdonság az antibiotikum rezisztencia, például a tetraciklinnel vagy ampicilinnel szembeni rezisztencia. Az előzőekben ismertetett két elem általában jelen van, és felismerhető a klónozó vektorokban. Ilyen vektorok például a baktérium plazmidok, mint például az E. coli plazmidjai, köztük a pBR322, pMB89, ColEl, pCRl; szélesebb gazda-specificitású plazmidok, például az RP4; fág dezoxi-ribonukleinsavak, mint például a Íambda és mások. A legtöbb, de talán az összes fentiekben tett vektor eleve tartalmazza a megadott két elemet.

A találmány szerinti specifikus vektorok harmadik eleme a lipoprotein kifejezösdését szabályozó szekvencia. Az E. coli lipoproteint kifejező szabályozó szekvencia jelen van a pKENlll plazmidban, és E. coli CC620 sejtekben szaporítható. A tenyészetet az alábbi állandó törzsgyűjteményben helyeztük letétbe: Northern Régiónál Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61 634. Innen az NRRL 15 011 sorszámon rendelhető meg. A lipoprotein kifejeződését szabályozó szekvencia kihasítható a pKENlllböl az ismert restrikciós helyeket és az ezeknek megfelelő restrikciós endonukleázokat felhasználva. Több más lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia is rendelkezésünkre áll, ezeket ismert módszerekkel használjuk. Ezek a módszerek tartalmazzák például a szintézissel való előállítást vagy megfelelő lpp-szekvenciákat felhasználva egy próbával való izolálást (például pKENlll), és az lpp-szekvenciák között fennálló nagyfokú homológiát felhasználva, ezekkel a próbákkal hibridizációval szelektáljuk a más forrásokból származó lpp-szekvenciát.

Rutin módszereket használva állítjuk eló az előnyös klónozó vektrorokat a lipoproteint kifejeződést szabályozó szekvencia beépítésével. A klónozó vektorokban különböző helyek léteznek, amelyekbe erre a helyre specifikus restrikciós endonukleázt használva belehasitunk. Bármely ilyen helyet kiválaszthatunk a lipoproteint kifejező szabályozó szekvencia beépítésére. Például a jól ismert és jól dokumentált pBR322 plazmidon több megfelelő restrikciós hely létezik, ezek bármelyikét felhasználhatjuk beépítési helyként. A β-laktamáz génen belül egy Pstl hely létezik. A specifikus kódoló szakaszokon kívül eső más helyek az EcoRI és PvuII. Ezeket és más helyeket a témában jártas szakemberek felismerik.

Ezen helyeket vagy másokat felhasználva a lipoprotein kifejeződést meghatározó szekvenciát vagy ennek alapvető fontosságú részét könnyen beépíthetjük a jelen leírásban megadott vektorok előállítása érdekében.

A negyedik elem, amely a találmány szerinti vektorokra továbbá jellemző, egy külső eredetű proteint kódoló dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia. A találmány szerinti vektorokban lévő külső eredetű proteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia leglé5 nyegesebb tulajdonsága annak elhelyezkedése. Ennek a lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia 3’-végétől és az 5'-nemtranszlatált szakasztól jobbra kell esnie, és kapcsolatban kell lennie ezzel egy transzlációs start kodonon keresztül. A találmány szerinti vektorokban a lipoproteint meghatározó dezoxi-ribonukleínsav-szekvencia egy részének sem szabad az 5'-nem-transzlatált szakasz és a külső eredetű proteint meghatározó szekvencia közé esnie.

A találmány szerinti vektorok második kivitelezési változatára jellemzően, egy ötödik elem kapcsolódik, ily módon a transzlációs kodont egy enterokináz hasítási helyet meghatározó nukleotid-Bzekvencia követi, amelyhez, közbeeső rész nélkül, a külső eredetű proteint leíró szekvencia kapcsolódik. Az előzőekben megadott hasítási hely aminosav-szekvenciéját felismeri és karboxil-terminális végén hasítja az enterokináz enzim. Az enterokinázzal hasítható aminosav-szekvenciát meghatározó nukleotid-szekvencia 5’-végén hozzákapcsolódik a transzlációs start kodonhoz, és 3’-végén pedig egy olyan nukleotid-szekvencia 5’-véghez, amely a külső eredetű proteint határozza meg, ily módon a kapott transzlációs termék (metionin) - (enterokináz hasítási hely) - (külső eredetű protein); ez enterokinázzal kezelve érett külső eredetű proteinné hasad.

Az enterokináz (3. 4. 21. 9) .egyik, a duodenum membránhoz kapcsolt számtalan hidroláz egyikének’ [Liepnieks Light, J. Bioi. Chem. 254, 1677-1683 (1971)] izolálását és tisztítását több közleményben ismertetik, például Liepnieks (lásd előbb) Maroux és munkatársai [J. Bioi. Chem., 246, 5031-5039 (1971)] és Baratti és munkatársai [Biochimica et Biophysica Acta, 315, 147-161 (1973)] közleményei.

Az enterokináz a peptidet egy lizin (Lys) karboxilcsoportjánal hasítja, amelyet több aminosav előz meg, azaz glutaminsav (glu) és/vagy aszparaginsav (Asp). így Light és munkatársai [Anal. Biochem., 106, 199-206 (1980)] több olyan aminosav-szekvenciát közölnek, amelyeket az enterokináz felismer. Ilyenek például az alábbiak:

Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,

Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,

Phe- Pro-Ile-Glu-Glu-Asp- Lys,

Leu-Pro-Leu-Glu-Asp-Asp-Lys,

Ala-Asp-Asp-Lys,

Asp-Aep-Asp-Asp-Lys, és mások.

A találmány szerinti klónozó vektorokban bármely fenti és más szekvenciákat meghatározó nukleotid-szekvencia jelen lehet. Az egyetlen igény az, hogy olyan legyen ez a nukleotid-szekvencia, hogy az általa kódolt aminosav-szekvencia felismerhető legyen, vagy, ha egy hosszabb láncú peptidben van jelen, hasítható legyen karboxil-terminális végén enterokinázzal.

A fenti igényeket kielégítő vektorok előállítása során az E. coli lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia ö'-nem-transzlalált régiójában jelenlévő egyetlen Xbal helyet használjuk ki. Az Xbal hely hasításakor az 5’-nem-transzlatá]t szakasz egy része kihasad. Oligonukleotid-szintézissel előállíthatunk egy olyan linkért, amely tartalmazza az 5’-_nem-transzlatált régió eltávolított részét, amelyhez egy strart kodont meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát kötünk, vagy a start kodont követően az enterokinázzal hasítható helyet és a külső eredetű protein egy részét vagy egészét meghatározó szekvenciát.

A külső eredetű proteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát előállíthatjuk szintetikusan, azaz az ismert foszfo-triészter-módszert vagy más, jól ismert technikát használva, de előállíthatjuk ezt a dezoxiribonukleinsav-szekvenciát ismert módon izolált mRNS másolatként is. Az előállított cDNS másolat szükség esetén a start kodonhoz közeleső ponton lévő restrikciós helyen hasíthatjuk. A találmány szerinti klónozó vektorok előállításának egyik kiviteli változata szerint előállítunk egy olyan linkért, amely áll az Xbal hasítási reakció során eltávolított lipoprotein 5*-nem-transzlatált szakasz egy részéből, ezután következik a start kodont is magába foglaló, külső eredetű protein hasított része.

Az előállítást szintetikus módszerrel végezzük. A találmány szerinti klónozó vektorok előállításának egy második kivitelezési változata szerint szintetikusan előállítjuk azt a linkért, amely tartalmazza az Xbal enzimmel kihasított lipoprotein 5'-nem-transzlatált fragmenst, és ezután elhelyezkedve pedig a start kodont, az enterokináz hasítási helyet és a külső eredetű protein hasított részét. Ezeket a hiányzó részeket pótolni képes linkereket a lipoprotein kifejeződését szabályozó szekvencia többi rendelkezésre álló elemé. vei összekapcsoljuk, amiután vektort kapunk.

A találmány szerinti eljárással előállított klónozó vektorokat felhasználhatjuk több külső eredetű protein előállítására, többek között emlős és humán hormonok, enzimek és : immunogén proteinek (vagy ezek intermedierjeinek) előállítására. Ilyen termék például az inzulin A lánca, az inzulin B lánca, a proinzulin, az interferon, a növekedési hormon, e. száj és körömfájás antigén proteinjei, a í szomatosztatin, a 0-endorfin ée mások. Előnyösek azok a klónozó vektorok, amelyek a humán növekedési hormont vagy a marha növekedési hormonét termelik, A találmány szerinti eljárás első kivitelezési változata szei rint előállított klónozó vektorok természetesen amino-terminális végükön metionint tartalmaznak a start kodon jelenléte miatt. A második kivitelezési változat szerint előállított vektorok kifejeződő termékei metionint l (Etart kodon), enterokináz hasítási helyet és

-511 külső eredetű proteint határoznak meg. Érett külső eredetű protein előállítására az utóbbi kifejeződő terméket ismert módon (lásd például Light és munkatársai, mint előbb) enterokinázzal kezeljük.

A találmány szerinti klónozó vektorokat több gazdasejtben használhatjuk, például Gram-negatlv festődésű prokariota mikroorganizmusokban, például Escherichia coli, Serratia, Pseudomonas sejtekben és hasonlókban; Gram-pozitív festődésű prokariota organizmusokban, mint például Bacillus vagy Steptomyces sejtekben és másokban; használhatjuk ezeket eukariotji organizmusokban is például Saccharomyces sejtekben is. Előnyösen azonban gazdasejtként Gram-negatív prokariota organizmust használunk. Különösen előnyős az E. coli, például az E. coli K12 törzse, mint például az RV308.

Jól ismert módszereket használunk a megfelelő gazdasejt találmány szerinti vektorokkal való transzformálásra, a sejtekben sokszorosítjuk a vektorokat, és standard fermentációs körülmények között fejezzük ki a külső eredetű protein terméket. A protein terméket a kapott tenyészetből ismert módszerekkel izoláljuk.

A találmány szerinti klónozó vektorok szerkezetét és funkcióját az alábbi példákban szemléltetjük. A példákat a mellékelt ábrák alapján kell elolvasnunk és megértenünk. Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az 1-4. ábrákon a találmány szerinti klónozó vektorok mindkét előállítási változata során használt intermedierek és kiindulási anyagok preparálásét ismertetjük.

Az 1-4. ábrákkal összefüggő 5. ábrán sematikusan szemléltetjük az 1. példában ismertetett módszert, amellyel a metionil-humán növekedési hormon termelésére használható klónozó vektort állítjuk elő.

Az 1-5. ábrákkal összefüggő 6-8. ábrákon együttesen szemléltetjük a 2. példában ismertetett módszert a metionil-marha növekedési hormon előállítására használható klónozó vektor izolálására.

A 9. ábrán, amely összefügg az 1-5. ábrákkal, sematikusan ábrázoljuk a 3. példában megadott módszert, amellyel az 1. példa szerinti klónozó vektor egy variánsát állítjuk elő, és amelyet a metionil-humán növekedési hormon termelésére használhatunk. Az 1-4. ábrákkal összefüggő 10. ábrán sematikusan ábrázoljuk a 4. példában ismertetett módszert a találmány szerinti klónozó vektorok második típusainak előállítására, ezeket a vektorokat a humán növekedési hormon előállítására használjuk fel.

Az 1-4. és 10. ábrákkal összefüggő 1113. ábrákon sematikusan ábrázoljuk az 5. példában megadott módszert, amivel a második kivitelezési változat szerinti, és a marha növekedési hormon előállítására használható klónozó hordozót állítjuk elő.

A találmány szerinti plazmidok első és második típusainak előállításakor használt köztes termékek és kiindulási anyagok készítését az alábbiakban ismertetjük.

Kiindulási anyagként pKEN021 plazmid vektor (lásd a 3. ábrán a 106. sorszámot) Xbal (5’-TCTAGA-3’) és BamHI (5’-GGATCC3’) restrikciós endonukleázokkal való hasításakor kapott 5,1 kb nagyságú fragmenst használjuk. A pKEN021 az első ébra 101. helyen bemutatott pKENlll származéka [Lee és munkatársai, J. Bact., 146, 861-866 (1981); és Zviebel és munkatársai, J. Bacht., 145, 654-656 (1981)]. A plazmid az E. coli CC620 törzsben van (NRRL 15 011). A pKENlll plazmádnak egy 2,8 kb nagyságú fragmensen rajta van az E. coli lipoprotein génje. A fragmens leírását Nakamura és Inouye adja meg [Cell, 18, 1109-1117 (1979)]. A pKEN021 plazmidban az egyetlen EcoRI (5’-GAATTC-3’) és a Sáli (5’-GTCGAC-3’) pBR322 restrikciós hely közötti 650 bázispárból álló szekvenciát kicseréltük az E. coli lipoprotein génből izolált szekvenciával. Az összes, ebból a génből származó funkcionális rész nukleotid-szekvenciáját meghatározták. A lipoprotein génszekvencia [Nakamura és Inouye, Cell, 16, 1109-1117 (1979)] egy 462 bázispárból álló Alal (5’-TCTAGA-3’) fragmenst hordoz a lipcprotein gén első kodonjától (metionin) balra esve. Ez a fragmens tartalmazza a promotert, az 5’-nem-transzlatélt szakaszt és a ribcszóma kötőhelyet. A riboszóma kötőhelyen belül 16 bázispárral a transzlációs iniciációs metionin kodonja előtt egyetlen Xbal (5’-TCTAGA-3’) restrikciós hely létezik. A strukturgén transzlációs terminációs kodonjától balra eső (105 bázispárral) Pvull (5’-CCAGCTG-3’) restrikciós helyet kicseréltük egy BamHI (5’-GGATCC-3’) restrikciós helylyel, úgy, hogy egy szintetikus DNS adapter fragmenst kapcsoltunk. (5’-CCGATCCGG-3’; a Ccllaborative Research terméke). A BamHI helyett a lipoprotein utolsó 35 aminosavát meghatározó kódoló szekvencia, a transzlációs terminációs kodon és az mRNS 3'-nem-transzlatált szakaszának megfelelő szekvencia követi. A pKEN021 plazmid tartalmaz továbbá egy 85 bázispárból álló, különleges szekvenciát, amely nincs kapcsolatban a lipoprotein génnel, és amely az E. coli kromoszómában ettől jobbra helyezkedik el. Ez a szekvencia azért létezik, mert a gén eredeti izolálása során használt módszerek és restrikciós enzimek által felismerhető helyek természetéből következik.

Az 1., 2. és 3. ábra kapcsán megadjuk az alábbiakban azt a módszert, amellyel a pKENlll plazmidból előállítjuk a pKEN021 plazmidot. Úgy járunk el, hogy 50 pg pKENlll (1. ábra 101.) plazmidot 25 egység Hpall (5’-CCGG-3’) restrikciós enzimmel kezelünk, 300 pl alábbi összetételű pufferben:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4 mmól magnézium-klorid,

-613 mmól β-merkapto-etanol, literenként.

A reakciót 2 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. Kétszer 300 jul alábi eleggyel extraháljuk a reakcióelegyet: fenol és kloroform 50:50 arányú elegye. A vizes fázist 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsav csapadékot 100 pl elektroforézis-pufferban olajuk, és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk. A gélt 0,5 pg/ /ml etidium-bromid-oldattal festjük, és a csíkokat a távolabbi tartományba eső hullámhosszúságú ultraibolya fényben figyeljük meg. Elektroelúcióval egy dialízis zsákba izoláljuk a 950 bázispárból álló csíkot. A terméket fenol és kloroform elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk, majd a 2,5 pg-nyi mennyiségű dezoxi-ribonukleinsavat 25 pl TEN-elegyben oldjuk. Ennek összetétele a következő:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-kiorid, pH = 7,4, és mmól nátrium-etilén-dinitril-tetraecetsav, pH = 8,0, literenként.

pg, 950 bázispárból álló Hpall fragmenst Alul (5’-AGCT-3’) restrikciós enzimmel kezelünk 200 pl alábbi összetételű pufferban:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-kiorid, pH - 7,6, és mmól magnézium-klorid, és mmól β-merkapto-etanol, literenként.

A reakciót 37 C° hőmérsékleten végezzük, 2 órán át. A dezoxi-ribonukleinsavat 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk, és a keletkezett 462 bázispárból álló Alul fragmenst az előzőekben megadottak szerint eljárva izoláljuk és tisztítjuk. A 462 bázispárból álló Alul fragmens 1 pg-ját 10 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz pufferben oldjuk. Ennek összetétele a kővetkező:

mmól trisz-hidrogén-kiorid, pH = 7,6 10 mmól magnézium-klorid, mmól ditio-treitol,

0,4 mmól adenozin-trifoszfát, literenként.

Az elegyhez előzőleg 150 pikomól foszforilezett EcoRi linkért adunk (5'-GGAATTCC-3’, a Collaborative Research terméke), majd 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal egészítjük ki. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 10 percen ót 65 C° hőmérsékleten tartjuk, és ezután 100 pl-re hígítjuk EcoRi puffer adagolásával. Ennek összetétele a kővetkező:

100 mmól trisz-hidrogén-kiorid, pH = = 7,2, mmól nátrium-klorid, mmól magnézium-klorid, mmól 0-merkapto-etanol, literenként.

Az elegyhez 40 egység EcoRi enzimet adunk. 2 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubálunk, majd az elegyet fenol és kloroform elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A dezoxi-ribonukleinsavat 20 pl, 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz-pufferban oldjuk, ehhez előzőleg 0,1 pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat (lásd 1. ábra 102.) adunk, amelyet EcoRi enzimmel linearizáltunk, és a molekula végein lévő foszfátcsoportok eltávolítására alkalikus foszfatázzal kezeltünk. A ligációs reakciót 16 órán át 4 C° hőmérsékleten végezzük, majd az eleggyel megfelelő E. coli törzset (hsr^-, hsm*) transzformálunk, például HB101 sejteket. A baktérium sejteket kompetenssé tesszük a transzformálásra, az ismert kalcium-kloridos kezeléssel. A transzformánsokat 12 pg/ml tetraciklint tartalmazó agar-lemezeken szelektáljuk. Több tetraciklinre rezisztens telepből izoláljuk a plazmidokat, a plazmid-izolálást a Bimbóim és Doly gyors alkalikus extrakciós módszerével végezzük [Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)]. Az 1. ábra 103. számmal jelzett helyén bemutatjuk azt a plazmidot, amely tartalmaz egy 466 bázispárból álló Xbal, BamHl fragmenst, mégpedig a kívánt orientációban. Ezt kiválasztjuk, és a következő lépésben kiindulási lépésként használjuk.

pg, a 2. ábra 103. számmal jelölt helyén bemutatott, egy HindlII (5’-AAGCTT-3’) restrikciós hellyel rendelkező plazmid dezoxiribonukleinsavat 2 egység HindlII enzimmel emésztünk 50 pl alábbi összetételű HindlII-pufferban:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-kiorid, pH = = 7,4, _ mmól magnézium-klorid, és 6 mmól ő-merkapto-etanol, literenként.

A reakciót 1 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. Fenol és kloroform elegyével extraháljuk a reakcióelegyet, és az etanollal kicsapott dezoxi-ribonukleinsavat 200 pl alábbi összetételű pufferban oldjuk:

300 mmól nátrium-klorid, mmól nátrium-aeetát, pH = 4,25, mmól cink-klorid, literenként.

200 egység Sl-nukleáz. (Miles Laboratories.)

Ez egyszálú dezoxi-ribonukleinsavakat hasít. 1 órán át 15 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a reakciót fenol és kloroform elegyével végzett extrakcióval és etanolos kicsapással állítjuk le. A plazmidról így eltávolitottuk az egyszálú HindlII enzimmel előállított végeket. A terméket 10 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz pufferban oldjuk, amelyhez előzőleg 20 pikomól foszforilezett BamHl linkért (5'-CCGGATCCGG-3’, Collaboratíve Research) adtunk, majd a reakcióelegyet 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal egészítjük ki. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd ligáz inaktiválására 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. Az elegyet BamHl pufferral

-715 (150 mmól nátrium-klorid, 20 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 8,0, 10 mmól magnézium-klorid, 6 mmól β-merkapto-etanol, literenként. 100 pl térfogatra hígítjuk, az elegyhez 20 egység BamHI enzimet adunk. 2 órán át 37 C° hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd 1%-os agaróz gélen tisztítjuk, A gélt festjük, és a nagyobb fragmenst (4,5 kb) fagyasztás után eluáljuk, és fenol-kloroform-eleggyel tisztítjuk, és etanollal kicsapjuk, a BamHI kohéziv végekkel rendelkező píazmidot 20 pl, 0»l egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligézt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz pufferban oldjuk. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a dezoxi-ribtínukleinsav val E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin (Ap^r) rezisztenciára szelektáljuk 100 pg/ml antibiotikum jelenlétében, és megvizsgáljuk 10 pg/ml tetraciklin nel szembeni érzékenységüket (Tc^a). Az Ap’Tc® fenotipusú telepekből több píazmidot izolálunk az előzőekben megadott Birnboim-módszerrel. Ezeket megvizsgáljuk a HindlII hely hiánya és az egyetlen BamHI hely jelenléte szempontjából. EcoRI ás Sáli egymást követő emésztés után 466 és egy 305 bázispárból álló fragmenst kapunk. A második ábra 104. számmal jelölt helyén bemutatott, ezekkel a tulajdonságokkal rendelkező píazmidot szelektálunk, és módosítjuk oly módon, hogy az lpp promotertől balra eső EcoRI helyet eltávolítjuk, és HindlII restrikciós hellyé alakítjuk ét.

A 2 pg, a 2. ábra 104. helyén bemutatott plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl EcoRI pufferban 0,2 egység EcoRI enzimmel kezelünk 10 percen át, 37 C° hőmérsékleten. A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. Fenol és kloroform elegyével végzett extrakciót követően a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, és 200 pl, 1000 egység/ml Sl-nukleázt tartalmazó Sl-nukleáz-pufferban oldjuk. 1 órán ét 12 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a reakciót fenol és kloroform elegyével extrahálva leállítjuk, a terméket etanollal kicsapjuk. Ezután 10 pl, 20 pikomól foszforilezett HindlII linkért (5'-CCAAGCTTGG-3’, Collaboratíve Research) tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázpufferben szuszpendáluk a dezoxi-ribonukleinsavat, és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsavligázt adagolunk. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd a ligázt inaktiváljuk oly módon, hogy 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. Ezután 10 egység HindlII enzimet tartalmazó HindlII pufferral 150 pl térfogatúra hígítjuk az elegyet. 2 órán át 37 C° hőmérsékleten tartjuk, majd 1%-os agaróz gélen frakcionáljuk. Etidium-bromiddal festjük a gélt, és legnagyobb csíkot (ekvivalens az egy hasítást szenvedett plazmiddal) elkülönítjük és tisztítjuk. A plazmidot 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-lígázt tartalmazó 20 pl térfogatú T4 ligáz-puffertan oldjuk. A reakciót 16 órán át 4 C° hőmérsékleten végezzük, és E. coli HB101 sejteket transzformálunk az eleggyel. Az ampicillinre rezisztens transzformánsokat szelektáljuk, és Birnboim-módszerrel vizsgáljuk. A plazmid izolátumokat EcoRI (egy hely) és HindlII (egy hely) restrikciós enzimekkel analizáljuk. Szelektáljuk a 2. ábra 105. számmal jelölt helyén bemutatott, egy EcoRI, HindlII fragmenssel (500 bázispár) jellemezhető píazmidot, és ezt használjuk fel klónozó hordozóként az lpp gén 3’-régiójának kapcsolásához.

Két pg, a 3. ábra 105 számmal jelölt helyén bemutatott píazmidot 50 pl Sáli restrikciós pufferban (összetétele a következő: 150 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,9 6 mmól magnézium-klorid, 6 mmmól β-merkapto-etanol) 2 egység Sáli enzimmel kezeljük 1 órán ét, 37 C° hőmérsékleten. A reakcióelegyet 2 egység BamHI restrikciós enzimet tartalmazó BamHI-pufferral 150 pl-re hígítjuk. Egy órán át 37 C^D hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd 2,5 egység alkalikus foszfatázt adagolunk, és 1 órán át 65 C° hőmérsékleten folytatjuk az inkulációt. Az elegyet fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és a terméket TEN-oldatban oldjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat használjuk az lpp 3’-fragmensének klónozására.

Az lpp 3’-régiót tartalmazó fragmens előállítására 10 pg, a 3. ábra 101. számmal jelzet-, helyén bemutatott pKENlll plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 200 pl alábbi összetételű Hpal pufferban kezelünk, 10 egység Hpal ;5’-GTTAAC-3’): 20 mmól kálium-klorit, mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 10 mmól magnézium-klorid és 6 mmól β-raerkapto-etanol literenként. A reakciót 37 C° hőmérsékleten végezzük, 2 órán át. Az elegyet ^fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat 10 pl, 20 pikomól foszforilezett Sáli linkért (5’-GGTCGACC-3’, Collaboratíve Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-íigázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz-pufferban oldjuk. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubálunk, majd a ligáz inaktiválására 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet. 10 egység Sáli enzimet tartalmazó Sáli pufferral 100 pl térfogatra hígítjuk az elegyet, és 1 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 300 pl, 10 egység PvuII restrikciós enzimet tartalmazó, alábbi összetételű PvuII pufferban oldjuk:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 7,5 mmól magnézium-klorid, mmól Λ-merkapto-etanol, literenként.

órán át 37 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd dezoxi-ribonukleinsavat 5%-os poliakril-amid gélen frakcionáljuk.

-817

0,5 pg, 950 bázispárból álló fragmenst kapunk, ezt tisztítjuk, és TEN-oldatban oldjuk. 0,2 pg fragmenst 20 pl, 20 pikomól foszforilezett BamHI linkért (5’-CCGGATCCGG-3’, Collaborative Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó T4 dezoxiribonukleinsav-ligáz-pufferban oldjuk. 16 órán át 4 C° hómérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a ligáz inaktiválására 10 percen át 65 C° hómérsékleten. A dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl-re hígítjuk 20 egység BamHI enzimet tartalmazó BamHI pufferral. 2 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubálunk, majd dezoxi-ribonukleinsavat 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionéljuk a fölös linker molekulák eltávolításéra. A BamHI és Sáli kohéziv végekkel rendelkező 950 bázispárból álló fragmenst elkülönítjük és tisztítjuk. A fragmenst 20 pl, az előzőekben leírt 0,2 Mg mennyiségű klónozó vektort és 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz-pufferban oldjuk. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubálunk, majd az eleggyel E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A plazmidokat izoláljuk az ampicillinrezisztens transzformánsokból, és vizsgáljuk a 950 bázispárból álló Sáli, BamHI fragmens jelenlétét. Az előállítani kívánt, 5,2 kb nagyságú plazmidot pKEN021 jellel jelöljük, és a 3. ábra 106. számmal jelzett helyén mutatjuk be.

Mg PKEN021 dezoxi-ribonukleinsavat 10 egység BamHI enzimmel kezelünk 1 órán át 37 C° hőmérsékleten, 200 pl alábbi összetételű Xbal/BamHI pufferban:

150 mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 8, mmól magnézium-klorid, mmól 0-merkapto-etanol, literenként.

Az emésztést 10 egység Xbal enzimmel megismételjük, a reakciót 1 órán át 37 C° hőmérsékleten végezzük. A dezoxi-ribonukleinsavat 1,5 órán ét 65 C° hőmérsékleten, 2,5 egység alkalikus foszfatázzal kezeljük, majd fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanolos kicsapással összegyűjtjük, és 50 m1 alábbi összetételű TEN-oldatban oldjuk:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 7,4, , mmól nátrium-klorid, mmól etilén-dinitril-tetraecetsav, literenként.

A dezoxi-ribonukleinsavat úgy oldjuk, hogy a reakcíóelegy pl-enként 0,2 Mg-ot tartalmazzon. Ezt a 3. ábra 107. számmal jelölt helyén bemutatott készítményt használjuk plazmid klónozó hordozóként.

A ptrpED50chGH800 jelű plazmidot (lásd a 4. ábra 108. helyét), amit Martial és munkatársai írtak le [Science, 205, 602-607 (1979)], használjuk a humán növekedési hormon gén egy részét meghatározó szekvenciát tartalmazó dezoxi- ribonukleinsav-fragmens forrásaként. A fragmenst előállíthatjuk azzal 10 az ismert módszerrel is, amely szerint a humán agyalapi mirigyből mRNS-t izolálunk, amely a humán növekedési hormont határozza meg. Ezt a módszert Goodman és munkatársai írják le [Methods in Enzymology, 68, 75-90 (1979)]. A ptrpED50chGH800 jelű plazmid humán növekedési hormon gén-része egyetlen Smal (5’-CCCGGG-3’) enzim által felismerhető helyet tartalmaz 6 bázispárral jobbra a gén transzlációs terminációs kodonjától. Ezt a helyet BamHI hellyel cseréltük fel, az alábbiak szerint eljárva:

Mg plazmidot 6 egység Smal enzimmel kezelünk 200 pl alábbi összetételű Smal restrikciós pufferban:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 8,0, mmól magnézium-klorid, mmól kálium-klorid, és 6 mmól β-merkapto-etanol, literenként.

A reakciót 1,5 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. Az emésztés teljessé válását követően fenol és kloroform elegyével extrahálunk, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el. A kicsapott dezoxiribonukleinsavat 24 pl TEN-oldatban oldjuk. 40 pikomól foszforilezett BamHI adapter fragmenst (Collaborative Research) adunk 0,5 pl (0,2) pikomól) fentiekben megadott, emésztett plazmidhoz, 16 pl, 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó ligáz-pufferban. A ligációt 2 órán ét 22 C° hőmérsékleten, és ezután 16 órán át 4 C° hőmérsékleten végezzük. A T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz inaktiválására a reakcióelegyet 10 percen át 65 C°' hőmérsékleten tartjuk. Ezután BamHI kohéziv végeket állítunk elő oly módon, hogy 20 egység BamHI enzimet tartalmazó BamHI pufferral 40 pl végtérfogatra hígítjuk az elegyet, és 1 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk. Az enzim hasítja a linker szekvenciát és azt a BamHI helyet is, amely a humán növekedési hormon klónozott cDNS-szekvenciájának kezdetén van. Ily módon 691 bázispárból álló fragmenshez jutunk, amelynek kohéziv BamHI végei vannak. Ezt 6%-os poliakril-amid gélen elkülönítjük, és a távoli hullámhosszúságú ultraibolya fényben vizsgáljuk, miután 1 p/ml töménységű etidium-bromid-oldattal festettük. A fragmenst tartalmazó gélt kivágjuk, és a dezoxiribonukleinsavat egy dialízis zsákba gyűjtjük össze elektroelucióval. Ezután etanolos kicsapást végzünk. A kicsapott dezoxiribonukleinsavat centrifugálással elkülönítjük, TEN-oldatban oldjuk, az oldatot fenol és kloroform elegyével extraháljuk, az etidium-bromid eltávolítására; végül etanollal kicsapjuk. Az elkülönített dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal az előzőekben megadott 20 pl térfogatú ligációs pufferban 0,2 pg pBR322 plazmiddal (lásd a 4. ábra 102. helyét) kapcsoljuk össze. A pBR322 plazmidot előzőleg az egyetlen BamHI helyen hasítottuk, és alkalikus foszfatázzal kezeltük. 16 órán át 4 C°

-919 hőmérsékleten folytatjuk a reakciót, majd az eleggyel E. coli JA221 törzset (recA, hrs hsm⁴, atrpE5, thr, leu, thi, lacY) transzformálunk. A törzs letéti száma: NRRL 15 014. A transzformáció során Wensink és munkatársai 5 módszerét használtuk [Cell, 3, 315-325 (1974)]. A transzformált telepeket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó agarlemezeken szelektáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 16 ampicillin-rezisztens telepből izoláljuk, az előzőleg megadott Birnboim-módszert, azaz a gyors alkalikus-denaturációs módszert használva. Ezután restrikciós enzimmel és gél-elektroforézíssel végzünk analízist. A 16 vizsgált plazmid közül 11 tartalmazza a körülbelül 700 bázispárból álló BamHI fragmenst. A plazmidok egyikét pNM575 jellel jelöljük, és a 4. ábra 109. helyén mutatjuk be. Ezt a plazmidot használjuk amplifikálásra (sokszorosításra) a következőkben ismertetett plazmidok előállításakor használt dezoxi-ribonukleinsav-fragmens forrásaként. Az érett humán növekedési hormon dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciája egyetlen FnuDII (5’-CGCG-3’) restrikciós helyet tartalmaz, ez 47 bázispárral arrébb helyezkedik el az első nukleotidtól számítva. A pBR322-ben 23 ezen enzim által felismerhető hely van. 25 pg pNM575 dezoxiribonukleinsavat 25 egység BamHI enzimmel kezelünk, 250 pl BamHI pufferban. A reakciót 1 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. A 691 bázispárból álló és BamHI kohéziv végekkel rendelkező fragmenst 6% poliakril-amid gélről izoláljuk, és az előzőekben megadottak szerint eljárva tisztítjuk. A fragmens 1/3-át (ez 8 pg plazmidnak felel meg) tisztítás után 2,5 egység FnuDII enzimmel emésztjük 100 pl FnuDII pufferban. Ennek összetétele a következő:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, mmól magnézium-klorid, mmól β-merkapto-etanol, literenként.

Xbal

5’-CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCAACCATTCCCTTATCC3’- TCCCATAATTATTACAAGGGTTGGTAAGGGAATAGGThal

AGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG 3’

TCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC 5’

A fragmenst az ismert foszfotriészter-módszerrel állítottuk elő, az alábbi szegmensekből:

1) CTAGAGGGTAT

2) TAATAATGTTCC

3) CAACCATTCCC

4) TTATCCAGGC

5) TTTTTGACAACG

6) CTATGCTCCG

7) CATTATTAATACCCT

8) GGTTGGGAA

9) GGATAAGGGAAT

10) GTCAAAAAGCCT

11) CGGAGCATAGCGTT.

A reakciót 37 C° hőmérsékleten végezzük, 1,5 órán át. Az 538 bázispárból álló, az utolsó 175 aminosavat meghatározó szakaszt és az ezután következő transzlációs stop kodon! tartalmazó fragmens izolálását 6% poliakrd-amidot tartalmazó gélen végzett elektrofcrézissel ismert módon vitelezzük ki.

1. példa

Plazmid előállítása a metionil-humán növekedési hormon kifejezésére az E. coli lipopj'otein promoterét használva

A) A plazmid előállítása

Foszfotriészter-mód szerrel szintetizáljuk az 5. ábra 110. számmal jelzett helyén megadott kétszálú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. A fragmenst felhasználjuk az lpp promoter szakaszának kapcsolásához a humán növekedési hormont meghatározó régióhoz, a humán növekedési hormon közvetlen kifejezése céljából. A felső szál 66 nukleotidból áll, ez tartalmazza az 5’-végen az Xbal hasítás sorén létrejött 4 nukleotidból álló egyszálú szekvenciát. Az alsó szál 62 nukleotidot tartalmaz, ez a felső szál 62 nukleotidjával komplementer. A szintetikus dezoxi-ribonukleinsav-fragmens első része követi az lpp gén természetes szekvenciáját az Xbal restrikciós helytől kezdődően a riboszóma kötőhelyen ót a transzláció kezdetét meghatározó metionin kodonig (19 bázispár), és ezután következik a humán növekedési hormon első 47 nukleotidja, egészen az előzőekben megadott egyetlen FnuDII helyig.

Az 5. ábra 110. helyén megadott kétszólj dezoxi-ribonukleinsav-fragmens az alábbi szerkezetű:

A fentiekben megadott szegmensek felhasználásával az alábbi három duplexet állítjuk eló.

a) Az 5’-nem-foszforilezett 1. szegmenst T4 ligázzal 5’-foszforilezett 7. szegmens jelenlétében hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezet. 2. szegmenshez. Ily módon ismert módszerek szerint eljárva [Brown és munkatár55 sai, Methods in Enzymology, 68, 109-151 (1979)] megkapjuk az 1. duplexet, A duplexet preparatív gél-elektroforézissel izoláljuk 15%-os poliakril-amidon.

b) A 3. 5'-foszforilezett szegmenst T4 li60 gázzal 5*-foszforilezett 8. és 9. szegmens jelenlétében hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezeti. 4. szegmenshez, amiután megkapjuk a 2. duplexet. Ezt 15%-os poliakril-amidon preparatív gél-elektroforézissel izoláljuk. A reak65 ciót a fentiek szerint végezzük.

-1021

c) Az 5. 5’-foszforilezett szegmenst T4 Hgázzal 5*-foszforilezett 10. szegmens és 5’-nem-foszforilezett 11. szegmens jelenlétében ligáljuk a 6. szegmens 5’-foszforilezett alakjához, amiután megkapjuk a 3. duplexet. A duplexet 15%-os poliakril-amidon preparatív gól-elektroforézissel izoláljuk.

Az 1., 2. és 3. duplexeket ezután T4 ligázzal összekapcsoljuk, miután megkapjuk az

5. ábra 110. helyén megadott kétszálú dezoxi-ribonukelinsav-szegmenst, amit 15%-os poliakril-amidon preparatív gél-elektroforézissel izolálunk. Ezt a terméket 5’-végein T4 polinukleotid-kinázzal (gamma-P³²)ATP jelenlétében enzimatikusan foszforilezzük.

A reakciót ismert módszerekkel végezzük.

A kifejeződő plazmid előállítására 0,1 pikomól (0,4 pg) plazmid vektort (5. ábra 107. helyén adjuk meg), 3,2 pikomól szintetikus dezoxi-ribonukelinsav-fragmenst (5, ábra, 110.) és 0,24 pikomól (0,08 pg) 538 bázispárból álló fragmenst (lásd az előzőeket, 5. ábra, 109.) 2 egység T4 dezoxi-ribonukelinsav-ligázzal enzimatikusan kapcsolunk 14 pl ligációs pufferban. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd az előzőekben megadottak szerint eljárva, E. coli JA221 sejteket transzformálunk. A transzformált telepeket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó agarlemezeken szelektáljuk. Az előzőekben megadott Birnboim-módszerrel 10 telepből izoláljuk a plazmidokat. A plazmídokat Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd akril-amid gél-elektroforézist végzünk, amiután ügy találjuk, hogy egy plazmid tartalmazza a várt, 604 bázispárból álló fragmenst. Ezt a plazmidot sokszorosítjuk, és az Xbal helytől az FnuDII helyig terjedő dezoxi-ribonukelinsav-szekvencíát Maxam és Gilbert módszerével meghatározzuk [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564 (1977)]. A szekvencia korrekt. A plazmidot pNM645 jellel jelöljük, és az 5. ábra 111. helyén ismertetjük.

B) A humán növekedési hormon kifejezése

A pNM645 plazmid által E. coli JA221 sejtekben kifejezett humán növekedési hormont módosított, szilárd fázisú radioimmun-méréssel mutatjuk ki [a módszert lásd az alábbi közleményekben: Broome és Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 2746-2749 (1978); Hitzeman és munkatársai; ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, 14, 57-58 (1979); és Erlich és munkatársai, Cell., 13, 681-689 (1978)].

A baktériumsejt proteinjeinek nátrium-dodecil-szulfát-poliakril-amid gélanalizisét Leammli szerint végezzük [Natúré, 227, 680-685 (1970)], a vizsgálatok szerint egy körülbelül 20 000 dalton molekulasúlyú nagy protein esik jelenik meg. A csík az ősszprotein legalább 10%-át képviseli, ugyanakkor nincs jelen a pKEN021 plazmidot tartalmazó 12

E. coli JA221 készítményekben. A kvantitatív kifejeződést standard radioimmun-méréssel vizsgáltuk [Twomey és munkatársai, Clin. Chem., 20, 389-391 (1974)]. A vizsgálatok szerint sejtként legalább 2 millió molekula van jelen. A metionil-humán növekedési hormon 500 g E. coli sejtből részlegesen tisztítjuk 8 mól/1 karbamid és 1% Triton X100 extrakcióval. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk, és az oldódó növekedési hormont tartalmazó felülúszót Whatman DE52 oszlopon frakcionáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat radioimmun-méréssel (RIA) határozzuk meg, ezeket összegyűjtjük és izoelektromos kicsapást végzünk. A terméket Whatman SE53 oszlopon tovább tisztítjuk. Radioimmun-méréssel meghatározzuk a terméket tartalmazó frakciókat, és az anyagot izoelektromos kicsapással vagy ultraszűréssel töményítjük.

A kinyert metioníl-humán növekedési hormon biológiai aktivitását hipofizis-ektomizált nőstény patkányokban határozzuk meg Greenspan és munkatársai szerint [Endocrinology, 45, 455-463 (1948)]. Aktivitása azonos volt a humán növekedési hormon aktivitásával.

2, példa

A metionil-marha növekedési hormon kifejezésére alkalmas plazmid előállítása az E. coli lipoprotein promoter felhasználásával.

A 6. ábra 111. számmal jelzett helyén megadott pNM645, a metionil-humán növekedési hormon kifejezésére használt plazmidot használjuk fel a metionil marha növekedési hormon kifejezésére alkalmas plazmid előállítására.

A marha növekedési hormon génjeinek egy részét meghatározó szekvenciát tartalmazó két dezoxi-ribonukleinsav-fragmens forrásaként a Miller és munkatársai által leírt pBP48 plazmidot használjuk [J. Bioi. Chem., 225, 7521-7524 (1980)]. A plazmid a marha növekedési hormont meghatározó szekvenciát egy 831 bázispárbói álló szakaszon tartalmazza, ezt a pBP322 PstI (5’-CTGCAG-3’) restrikciós helye hordozza, A marha növekedési hormont meghatározó szekvenciát Miller és munkatársai módszere mellett megkaphatjuk Goodman és munkatársai szerint eljárva is, a marha agyalapi mirigyéből izolált mRNS segítségével [Methods in Enzymology, 68, 75-90 (1979)].

A humán és a marha növekedési hormont meghatározó szekvencia igen hasonló, és sok homológiát mutat. A marha növekedési hormont kifejező plazmid előállításakor különösen előnyösen használhatjuk azokat a fragmenseket, amelyeket a PvuII restrikciós enzimmel (5’-CAGCTG-3’) végzett emésztéssel kapunk. A keletkező fragmensek 497 bázispárból állnak a humán növekedési hormon, és •194 bázispárbói a marha növekedési hormon

-1123 esetén. A megfelelő restrikciós helyek mindkét szekvenciában azonos kódoló helyen helyezkednek el.

Molekulánként 3 PvuII helyet tartalmazó, 10 pg, a 6. ábra 111. helyén megadott pNM645 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat egy egység PvuII enzimmel kezelünk, 200 μΐ alábbi összetételű PvuII restrikciós pufferral készült reakcióelegyben:

mmól nátrium-klorid 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,5 6 mmól magnézium-klorid, mmól β-merkapto-etanol, literenként.

A reakciót 10 percen át 37 C° hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk, majd dezoxi-ribonukleinsavat alkalikus foszfatázzal kezeljük. Ez a limitált emésztés a jelenlévő PvuII helyek felének-kétharmadának a hasadásához vezet. A fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen szeparáljuk, és a 6. ábra 113. számmal jelzett helyén bemutatott, a 497 bázispárból álló PvuII fragmenst elveszett lineáris plazmidnak megfelelő dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst (valamivel gyorsabban mozdul el, mint az egyetlen hasadást szenvedett plazmid) kivágjuk a gélből, tisztítjuk és a köztes pNM685 plazmid előállítására vektorként használjuk fel (a plazmidot a 6. ábra 114. helyén mutatjuk be).

A pBP348 plazmidból előállítunk egy 494 bázispárból álló PvuII fragmenst. 10 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 200 μΐ PvuII pufferban 10 egység PvuII enzimmel kezelünk, 1 órán ét, 37 C° hőmérsékleten. A fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen különítjük el, és a 494 bázispárból álló fragmenst (6. ábra 112.) előzőekben megadott módszereket használva tisztítjuk.

Előállítjuk a 6. ábra 114. számmal jelzett helyén megadott köztes pNM685 plazmidot oly módon, hogy 0,2 pg 113 jelű vektort 0,05 pg, 494 bázispárból álló fragmenssel ligálunk 20 μΐ T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz pufferban, amelyhez 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk. A reakciót 16 órán át végezzük 4 C° hőmérsékleten. Transzformációt és az ampicillinre rezisztens transzformánsok szelekcióját követően plazmidokat izolálunk az előzőekben megadott Birnboim-módszert használva. A plazmidokat megvizsgáljuk a 494 bázispárból álló PvuII fragmens jelenlétére. Az Xbal és az Smal enzimekkel végzett egymást követő emésztéssel meghatározzuk a fragmens megfelelő orientációját. A marha növekedési hormon szekvencia 494 bázispárból álló PvuII fragmense egyetlen aszszimetrikus Smal restrikció helyet tartalmaz. A pNM645 szülóplazmid Smal helyet nem tartalmaz. Köztes plazmidkónt kiválasztunk egy 494 bázispárból álló PvuII fragmenst, és egy 416 bázispárból álló Xbal, SmaT fragmenst tartalmazó plazmidot.

A 7. ábra 114. helyén bemutatott pNM685 plazmidot az alábbiak szerint eljárva átalakítjuk marha növekedési hormont kifejezn' képes plazmiddá:

Úgy járunk el, hogy

1) a humán növekedési hormon első 22 aininosavját meghatározó szekvenciát eltávolítjuk, és kicseréljük a marha növekedési hormon első 23 aminosavát meghatározó szekvenciára, és

2) a második PvuII hely és a stop kodon közötti rövid szekvenciát (ez humán növekedési hormon szekvencia) kicseréljük egy olyan szintetikus fragmenssel, amely visszaállítja az alanin kodont, azaz megadja a marha növekedési hormon 190. aniinosavának kodon ját.

pg pNM685 plazmidot egy egység

PvuIT enzimmel kezelünk 200 μΐ PvuII pufferban. A reakciót 5 percen át végezzük 37 C° hőmérsékleten. A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. A fragmensek keverékét 1% agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk, és a molekulánként csak egyetlen PvuII hasítási helyet tartalmazó lineáris plazmidot izoláljuk és tisztítjuk. Az elkülönített 3 pg-nyi mennyiségű anyagot 5 egység Xbal enzimmel teljesen emésztjük, és alkalikus foszfatázzal kezeljük. A fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk, és a legnagyobb fragmenst elkülőn'tjük és klónozó vektorként használjuk fel. A 7. ábra 115. számmal jelzett helyén megadott termék az Xbal hely és a humán és marha növekedési hormon első PvuII helye között lévő, 85 bázispárból álló fragmenst elvesztette.

A marha növekedési hormon első 23 aminosavát (69 bázispár) reprezentáló dezoxiriboni kleinsav-szekvencia az első PvuII helyig két Hpall restrikciós enzim által felismerhető helyet tartalmaz (5’-CCGG-3’). Az első hely 23 bázispárnyi távolságban van a kódoló szekvencia első nukleotidjától. A foszfotriészter-módszert használva szintézissel előállítunk egy olyan, 42 bázispárból álló fragmenst, amelyet a 7. ábra 116. helyén mutatunk be, és amely megfelel annak a 19 bázispárból álló szekvenciának, amely az lpp riboszóma kötőhelyen lévő Xbal helytől az ATG iniciációs kodonig terjed, és amelyet a marha növekedési hormon első 23 bázispárból álló szekvenciája követ.

A fragmens az alábbi szerkezetű;

Xbal Hpall

5’-CTAGAGGGTATTAATAATGGCTTTTCCGGCTATGTCTCTGTC-3’

3’ TCCCATAATTATTACCGAAAAGGCCGATACAGAGACAGGC 5’

-1225

A 42 bázispártról álló fragmens előállítására az alábbi hat szegmenst állítjuk elő:

1) CTAGAGGGTAT

2) TAATAATGGCTTTTC

3) CGGCTATGTCTCTGTC

4) CATTATTAATACCCT

5) TAGCCGGAAAAGC

6) CGGACAGAGACA.

A fentiek szerint előállított szegmenseket használva, az 5’-foszforilezett 2. szegmenst, az 5’-foszforilezett 3. szegmenst, az 5’-foszforilezett 5. szegmenst és a hat 5’nem-foszforilezett szegmenst, T4 ligázzal öszszekapcsoljuk, amiután egy duplexet kapunk. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. A duplexhez hozzákapcsoljuk az 5’-nem foszforilezett 1. szegmenst, és az 5’-foszforilezett 4. szegmenst T4 ligázzal. A 7. ábra 116. helyén megadott és a fentiek szerint előállított 42 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav-duplexet 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve tisztítjuk. A duplexet ezután 5’-végein T4 polinukleotid-kinázt és (gamma-p³²) ATP-t használva enzimatikusan foszforilezzük, ismert módszerek szerint eljárva.

A pBP348 eredeti plazmidból előállítjuk a fentiekben megadott Hpaíl helytől a PvuII helyig terjedő 46 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. 100 pg plazmidot 400 pl PvuII pufferban 50 egység PvuII enzimmel kezelünk, 2 órán át, 37 C° hőmérsékleten. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a dezoxi-ribonukleinsavat 400 jul PstI (5’-CTGCAG-3') pufferban oldjuk. A puffer összetétele a következő:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, mmól magnézium-klorid, mmól β-merkapto-etanol, literenként.

Az oldott terméket 50 egység PstI enzimmel kezeljük, 2 órán át, 37 C° hőmérsékleten. 6% poliakril-amidot tartalmazó, 30 cm hosszú gélen szeparáljuk, a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket, és az adott 46 bázispárból álló szekvenciát tartalmazó, 135 bázispárból álló fragmenst izoláljuk, és ismert módszerrel tisztítjuk. A kapott, 33 pg plazmiddal ekvivalens dezoxi-ribonukleinsav 1/3 részét Hpaíl restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük. A dezoxiribonukleinsav emésztését 100 pl Hpaíl pufferban végezzük, amelynek összetétele a következő:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, mmól magnézium-klorid, és mmól β-merkapto-etanol, literenként.

Az emésztést 1 egység Hpaíl enzimmel végezzük, 37 C° hőmérsékleten, 40 percen át. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragnienseket 5% akril-amidot tartalmazó gélen futtatjuk. Egy kü14 lönélló csíkon 1 pg SauIIIA restrikciós enzimmel emésztett pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat elektroforetizálunk. A fragmensek elegye egy 46 bázispárból álló fragmenst tartalmaz, ezt markerként használjuk.

A 46 bázispárból álló fragmens a 135 bázispárból álló fragmens Hpaíl részleges emésztésekor keletkezik (ez utóbbit a 7. ábra 112. helyén adjuk meg). A fragmenst ismert módszerekkel tisztítjuk.

A 7. ábra 115. helyén megadott, XBal és PvuII végekkel rendelkező, 0,2 pg plazmid vektort 1,6 pikomól szintetikus, 42 bázispárból álló és a 7. ábra 116. számmal jelölt helyén megadott fragmenssel elegyítünk, majd az elegyhez hozzáadunk a 7. ábra 112. helyén megadott 0,5-1 pikomól, 46 bázispárból álló fragmenst. A 10 pl térfogatú ligációs pufferben 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal végezzük a ligációs reakciót, 16 órán át, 4 C° hőmérsékleten. Az eleggyel E. coli JA221 sejteket transzformálunk, és a plazmidokat az ampicillin-rezisztens telepekből izoláljuk. A plazmidokat megvizsgáljuk a 494 bázispárból álló PvuII és a 88 bázispárból álló Xbal, PvuII fragmens jelenlétére. A analizált telep közül 18 rendelkezik ezekkel a fragmensekkel. Két plazmidot szekvenálunk az Xbal helytől a PvuII helyig, és radioimmun-méréssel teszteljük marha növekedési hormonra. Az egyik a radioimmun-mérés során pozitív eredményt adott, és a megfelelő szekvenciával rendelkezik. Ezt a plazmidot a

7. ábra 117. helyén adjuk meg, és pNM797 jellel jelöljük. Standard radioimmun-méréssel mérjük a kvalitatív kifejeződést, és úgy találjuk, hogy sejtenként legalább 10⁵ molekula marba növekedési hormon van jelen.

A 8. ábra 117. helyén megadott pNM797 plazmid egy aminosav kodon cseréjét igényli a marha növekedési hormon teljes kódolása érdekében. A cserét úgy végezzük, hogy PNM797 fragmens PvuII-tól a BamHI helyig terjedő, 28 bázispárból álló fragmensét kihasítjuk, és az alábbi, és a 8. ábra 118. helyén megadott szintetikus kétszálú fragmenssel helyettesítjük (a felső szálon 13, az alsó szálon 17 bázispárt tartalmaz):

5’ CTGTGCCTTCTAG 3’

3’ GACACGGAAGATCCTAG 5’.

pg pNM797 dezoxi-ribonukleinsavat 1 egység PvuII enzimmel kezelünk, 200 jul PvuII pufferban, 5 percen ót, 37 C° hőmérsékleten. Az enzim inaktiválására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. A mintákat BamHI pufferral 300 pl-re hígítjuk, és 10 egység BamHI enzimmel 1 órán át

C° hőmérsékleten teljesen emésztjük. Ezután 5 egység alkalikus foszfatázt adagolunk, és 1 órán át 65 C° hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el, és tisztítjuk az egyetlen vágást

-1327 szenvedett, a 8. ábra 119. helyén megadott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. 0.2 pg fragmenst 5 pikomól szintetikus fragmenssel ligálunk 2 egység T4 ligáz jelenlétében, 20 pl ligáz-pufferban, 1 éjszakán ét, 4 C° hőmérsékleten. Transzformációt és az előzőekben ismertetett Bimbóim plazmid izolálását követően több olyan plazmidot szelektálunk, amely tartalmazza a megfelelő nagyságú PvuII fragmenst (494 bázispár), és Xbal, BamHI fragmenst (604 bázispár). Legalább két termék szekvenciáját a BamHI helytől az egyetlen Smal helyig meghatározzuk, és egyet kiválasztunk, amelynek megfelelő a szekvenciája. Ezt a 8. ábra 120. számmal jelzett helyén mutatjuk be.

3. példa kz 1. példában megadottak szerint előállított plazmid variációja.

A pNM645 (9. ábra 111.) plazmid tetraciklin-rezisztenciát biztosító variációját állítjuk elő oly módon, hogy a BamHI és Sáli restrikciós helyek között lévő lpp 3'-szekvenciát a pBR322 (9. ábra 102.) plazmidból származó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenssel cseréljük ki. A pBR322 plazmidban a tetraciklin-rezisztencia egy olyan gén által biztosított, amelynek promoterét HindlII enzimmel (5’-AAGCTT-3’) hasíthatjuk. A gén kódoló szakasza ennek közelében kezdődik, és a plazmid BamHI és Sáli restrikciós helyéig tart. A tetraciklin promotert HindlII emésztéssel és SÍ nukleázos kezeléssel roncsoljuk oly módon, hogy az egyszálú végeket eltávolítjuk. 5 pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat 10 egység HindlII enzimmel kezelünk 1 órán ét, 37 C° hőmérsékleten, az alábbi összetételű, 200 pl HindlII pufferban:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, mmól magnézium-klorid és 6 mmól β-merkapto-etanol, literenként.

A dezoxí-ribonukleinsavat ezután fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 300 pl SÍ pufferban szuszpendáljuk. A puffer összetétele a kővetkező:

300 mmól nátrium-klorid, mmól nátrium-acetát, pH - 4,25, mmól cink-klorid, literenként.

Az SÍ nukleázt 1000 egység/ml koncentrációban adagoljuk, és az elegyet 1 órán át 15 C° hőmérsékleten inkubáljuk. A terméket fenol és kloroform elegyével extraháljuk, és az etanollal kicsapott dezoxi-ribonukleinsavat 200 pl alábbi összetételű Sáli restrikciós pufferban oldjuk:

150 mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 7,9, mmól magnézium-klorid, mmól β-merkapto-etanol, literenként.

Az emésztést 5 egység Sáli enzimmel végezzük, 1 órán át, 37 C° hőmérsékleten. Az elegyet 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel frakciónál juk, és izoláljuk a keletkezett 617 bázispárból álló fragmenst. A fragmens tisztítását az előzőekben megadottak szerint végezzük. 5 pg pNM645 dezoxi-ribonukleinsavat 5 egység BaMHI enzimmel kezelünk, 1 órán át, 37 C° hőmérsékleten. A terméket fenol és kloroform elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk, majd dezoxiribcnukleinsavat TEN-oldatban oldjuk. 2 pg, BamHI kohézív végekkel rendelkező pNM645 dezoxi-ribonukleinsavat tompa végű dezoxi-rifconukleinsavvá alakítunk oly módon, hogy 1 egység E. coli dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz I enzim nagy fragmensével feltöltjük. A feltöltést 20 pl alábbi összetételű dezoxiribonukleinsav-polimeráz I pufferban végezzük' mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,6, 10 mmól magnézium-klorid, mmól β-merkapto-etanol és

0,5-0,5 mmól dATP, dCTP, dGTP és dTTP, literenként.

A reakciót 1 órán át végezzük 15 C° hőmérsékleten. Az enzimet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten denaturáljuk, és dezoxiribonukleinsavat Sáli puffer és 3 egység Sal^r restrikciós enzim adagolásával hasítjuk. Az emésztést 1 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. A dezoxi-ribonukleinsavat 1% agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk, és a nagy plazmid fragmenst fagyasztást követően eluáljuk a gélről. Az etidium-bromidot és az agaróz fragmenseket fenol és kloroform elegyével extrahálva eltávolítjuk és etanolos kicsapást végzünk. A plazmidot 20 pl TEN-oldatban oldjuk. 0,2 pg (0,05 pikomól) plazmid vei tort 0,2 pg (0,05 pikomól) 617 bázispárból állc fragmenshez ligálunk, az előzőekben megadott körülmények között. Az eleggyel E. coli JA221 telepeket transzformálunk, és 100 pg/ml ampicillint és 15 pg/ml tetraciklint tartalmazó agar-lemezeken szelektálunk. Izoláljuk a 9. ábra 121 helyén megadott pNM736 jellel jelzett plazmidokat, ezek a restrikciós enzim analízis szerint az adott szekvenciát tartalmazzák. A metionil-humán növekedési hormon kifejezése a pNM645 plazmidnál találttal azonos.

4, példa

A Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-humán növekedési hormont kifejező plazmid előállítása és felhasználása szubsztrátként szelektív enterokináz (3. 4. 21. 9) hasításra érett humán növekedési hormon előállítására.

Foszfo-triészter-módszerrel szintetizálunk egy kétszálú, a 10. ábra 122. számmal jelzett helyén megadott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst, és hozzákapcsoljuk egy olyan lpp promoter régióhoz, amely megelőzi a

-1429 start kodonnal kezdődő humán növekedési hormont kódoló szakaszt, és amiután egy, az enterokináz által felismert és hasított szekvenciát meghatározó rövid peptidet leíró kódoló szakasz következik. A felsó szál 90 5 nukleotidból áll, ez az 5*-végén Xbal hasítást követően kapott 4 nukleotidból álló egyszálú részt hordoz. Az alsó szál olyan 86 nukleotidból áll, amely komplementer a felső szál utolsó 86 nukleotid jóval. A szintetikus ,10 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens első részét az lpp gén természetes szekvenciája követi, a riboszóma kötőhely Xbal restrikciós helyétől a 19 bózispárból álló transzlációs inicióciós metionin kodonig, majd ezután következik az enterokináz hasitási helynek megfelelő szekvencia, és a humán növekedési hormon elsó 47 nukleotidja az előzőekben megadott egyetlen FnuDII helyig.

A 10. ábra 122 helyén megadott kétszálú dezoxiribonukleinsav-fragmens az alábbi szerkezetű:

Xbal

5’ CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAATCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTTFnuDII

CCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG 3' GGTAAGGGAATAGGTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC 5’

A fragmenst az ismert foszfo-triészter- 20 -módszerrel állítjuk eló, az alábbi szegmensekből:

1)	CTAGAGGGTAT	25
2)	TAATAATGTTCC
3)	CATTGGATGAT
4)	GATGATAAGTTCC
5)	CAACCATTCCC
6)	TTATCCAGGC
7)	TTTTTGACAACG	30
8)	CTATGCTCCG
9)	CATTATTAATACCCT
10)	ATGGGAA
11)	CTTATCATCATCCA
12)	GGTTGGGAA	35
13)	GGATAAGGGAAT
14)	GTCAAAAAGCCT
15)	CGGAGCATAGCGTT.
	A fenti szegmenseket	használva T4 li- 40

gázzal sorrendben elvégezzük az alábbi kötő-reakciókat:

a) Az 1. 5*-nem-foszforilezett szegmenst hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 2. szegmenshez S’-foszforilezett 9. szeg- 45 mens jelenlétében T4 ligázzal, amiután megkapjuk az 1. dezoxi-ribonukleinsavduplexet (Brown és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 109-151, 1979).

A duplexet preparatív gélelektroforézis- 50 sel izoláljuk 15%-os poliakril-amidon.

b) Az 5'-foszforilezett 3. szegmenst 5’-foszforilezett 11. szegmens jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 4. szegmenshez, amikor meg- 55 kapjuk a 2. dezoxi-ribonukleinsav-duplexet, amit 15%-os poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk.

c) Az 5’-foszforilezett 5. szegmenst 5’- 60 -foszforilezett 12. és 13. szegmensek jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 5. szegmenshez, amikor megkapjuk a 3. dezoxi-ribonukleinsav-duplexet, amit 15%-os poliakril- 65

-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk.

d) Az 5*-foszforilezett 7. szegmenst 5’-foszforilezett 14. és 5’-nem-foszforilezett 15. szegmens jelenlétében hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 8. szegmenshez T4 ligázzal, amikor megkapjuk a 4. dezoxi-ribonuklemsav-duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk.

e) Ezután a 2., 3. és 4. dezoxi-ribonukleinsav-duplexeket T4 ligázzal 5. dezoxi-ribonukleinsav-duplexszé kapcsoljuk öszsze, a terméket 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk.

f) Az 1. dezoxi-ribonukleinsav-duplexhez T4 ligóz jelenlétében hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 10. szegmenst, és az 5. dezoxi-ribonukleinsav-duplexet, a kapott és a 10. ábra 110. helyén bemutatott dezoxi-ribonukleinsav-duplexet ezután 10% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a dezoxi-ribonukleinsav-duplexet T4 polinukleotid-kináz és (gamma-p³²)ATP jelenlétében ismert módszerrel enzimatikusan foszforilezzük.

A kifejeződő plazmid előállítására enzimatikusan összekapcsoljuk 0,1 pikomól (0,4 Mg) plazmid vektort (5. ábra 107.), 0,025 pikomól szintetikus dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst (5. ábra 110.) és 0,3 pikomól (0,08 Mg) 538 bázispárból álló fragmenst (10. ábra 109., lásd az előzőekben). A reakciót 24 Mg ligációs pufferban végezzük 1.5 egység T4 dezoxí-ribonukleinsav-ligázzal. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd az előzőekben megadottak szerint eljárva E. coli JA221 sejteket transzformálunk. A transzformált telepeket 100 Mg/ml ampicillint tartalmazó agar-lemezeken szelektáljuk. 19 telepből izoláljuk Bimbóim módszerével (lásd előbb) a plazmidokat. Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel való emésztést és akrilamid gélelektroforézist kö-1531 vetően úgy találtuk, hogy 12 plazmid tartalmazza a vért 628 bázispárból álló fragmenst.

A pozitív plazmidok közül nyolcat Xbal és ezután PvuII enzimmel kezelünk, hét egy 109 bázispárból álló fragmenst adott. Az egyik plazmid szekvenciáját Maxam és Gilbert módszerével megállapítottuk [Proc. Natl. Sci., USA, 74, 506-564 (1977)], és azt pontosnak találtuk. A plazmidot pNM702 jellel jelöljük, és a 10. ábra 123 helyén ismertetjük. A humán növekedési hormon kifejezését standard radioimmun-méréssel határozzuk meg [Twomey és munkatársai, Clin. Chem., 20, 389-391 (1974)].

A kvantitatív kifejeződés-vizsgálat szerint sejtenként legalább 2 millió molekula keletkezik.

500 g E. coli sejtből részelegesen tisztítjuk a Met-phe-pro-]eu-(asp)-í-lys-humán növekedési hormont, oly módon, hogy 8 mólos karbamiddal és 1% Triton XlOO-zal extrahálunk. A sejttőrmeléket centrifugálással eltávolítjuk, és az oldódó humán növekedési hormont tartalmazó felülúszót Whatman DE52 oszlopon frakcionáljuk. A radioimmun-méréssel meghatározott aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és izoelektromos kicsapást végzünk. A terméket Whatman SE53 oszlopon tovább tisztítjuk. A frakciók közül a terméket tartalmazókat radioimmun-méréssel kiválasztjuk, és a terméket izoelektromos kicsapással vagy ultraszüréssel tőményitjük.

A részlegesen tisztított terméket enterokináz enzimmel hasítjuk. A Miles Laboratories nyers sertés enterokinázát Anderson és munkatársai módszerével [Biochemistry, 16, 3354-3360 (1977)] tovább tisztítjuk. Az enterokinázt a szubsztráttal együtt inkubáljuk, és időközönként mintákat veszünk, amelyeket izoelektromos fókuszáló gélen vizsgálunk. A kiindulási anyag izoelektromos pontja 4,3, ez az idővel változik, végül eléri a humán növekedési hormon 4,91 izoelektromos pontját.

5. példa

A Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-marha növekedési hormont kifejező plazmid előállítása E. coli lipoprotein promoter felhasználásával

A 11. ábra 123. helyén bemutatott pNM702 plazmid a humán növekedési hormont kifejező plazmid. Kiindulási anyagként ezt használjuk fel a Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-marha növekedési hormont kifejező plazmid előállítására. A Miller és munkatársai által leírt [J. Bioi. Chem., 255, 7521-7524 (1980)) és a 11. ábra 124. helyén bemutatott pBP348 plazmidot használjuk fel a marha növekedési hormon gén egy részét meghatározó szekvenciát hordozó két dezoxiribonukleinsav-fragmenst forrásként. A plazmid a pBR322 Pstl (5'-CTGCAG-3’) restrikciós helyébe épitve tartalmazza a 831 bázispárból álló és a marha, növekedési hormont meghatározó szekvenciát. Miller és munkatársai módszere helyett előállíthatjuk a marha növekedési hormon szekvenciáját a marha agyalapi mirigyből ismert módon izolált mRNS-ből is [Goodman és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 75-90 (1979)].

Ahogy az előzőekben már említettük, a humán növekedési hormon és marha növekedési hormon kódoló szekvenciája igen hasonló, és sok homológiát mutat.

A PvuII (5-CAGCTG-3’) restrikciós enzimmel kapót fragmensek felhasználhatók a marha növekedési hormont kifejező plazmid előállítására.

Molekulánként 3 PvuII helyet tartalmazó pNM702 (11. ábra 123.) dezoxi-ribonukleinsav IC pg-nyi mennyiségét egy egység PvuII enzimmel hasítunk, 200 pl alábbi összetételű PvuII restrikciós pufferban, 10 percen át, 37 C° hőmérsékleten:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-kiorid, pH = 7,5, mmól magnézium-klorid, és 6 mmól β-merkapto-etanol, literenként.

A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat alkalikus foszfatázzal kezeljük. A részleges emésztés során a PvuII jelenlévő helyeinek fele-kétharmada hasad. A fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen szeparáljuk, és a 11. ábra 125. számmal jelzett helyén megadott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst (valamivel gyorsabban mozdul el, mint az egy hasítást szenvedett plazmid) kihasítjuk a gélből. Ez a fragmens 497 bázispárból álló PvuII fragmenst nem tartalmazó lineáris plazmid nak felel meg. A tisztított terméket vektorként használjuk a 11, ábra 126. helyén megadott köztes plazmid előállítására.

A pBP348 plazmidból előállítunk egy 494 bázispárból álló PvuII fragmenst. 10 pg plazmidot 200 pl PvuII pufferban emésztünk 10 egység PvuII enzimmel, 1 órán át, 37 C° hőmérsékleten. A fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen szeparáljuk, és a 494 bázispárból álló fragmenst (11. ábra 124.) megfigyeljük, és az előzőekben megadottak szerint tisztítjuk.

Ezután előállítjuk a 11. ábra 126. helyén megadott köztes plazmidot oly módon, hogy 0,2 pg vektort és 0,05 pg, 494 bázispárból álió fragmenst összekapcsolunk 20 pg T4 dezcxi-ribonukleinsav-ligáz pufferban, amelyhez 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk. A reakciót 16 órán át végezzük 4 C° hőmérsékleten. Transzformációt és a transzformánsok ampicillin rezisztenciára való szelektálását követően plazmidokat izolálunk az előzőekben megadott Birnboim-módszerrel, és megvizsgáljuk a 494 bázispárból álló PvuII fragmens jelenlétét. A fragmens megfelelő orientációját Xbal és Smal enzimekkel való egymást követő emésztéssel bizonyítjuk. A 17

-1633 marha növekedési hormon szekvenciából eredő 494 bázispárból álló PvuII fragmens egyetlen asszimetrikus Smal restrikciós helyet tartalmaz. A kiindulási pNM702 szülőplazmid Smal helyet nem tartalmaz. A 494 bá- 5 zispárból álló PvuII fragmenst és 440 bázispárból álló Xbal, Smal fragmenst tartalmazó plazmidot köztes plazmádként izoláljuk, és felhasználjuk a további kísérletekben.

A 12. ábra 126. helyén megadott köztes 10 plazmidot átalakítjuk a fuzionált marha növekedési hormont kifejeződő plazmiddá. Két módon végezzük a kísérletet:

1) Az enterokináz szubsztrát-humán növekedési hormon első 30 aminosavát meghatáro- 16 zó kódoló szekvenciát eltávolítjuk, és helyettesítjük az enterokináz szubsztrát-marha növekedési hormon első 31 aminosavát meghatározó szekvenciával, és

2) A stop kodonig terjedő kódoló szekven- 20 ciában lévő második PvuII hely egy rövid szekvenciáját (ez humán növekedési hormon szekvencia) egy szintetikus fragmenssel helyettesítjük, annak érdekében, hogy helyreállítsuk a marha növekedési hormon 190. ami- 25 nosavának, az alaninnak a kodonját.

ug 12. ábra 126. helyén megadott köztes plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 1 egység PvuII enzimmel hasítunk 200 μΐ PvuII pufferban. A reakciót 5 percen át végezzük, 30 37 C° hőmérsékleten. A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. A fragmensek keverékét tartalmazó elegyet 1% agarózt tartalmazó gélen szeparáljuk, és a molekulánként csak egy PvuII hasítási helyet tartalmazó lineáris plazmidot izoláljuk és tisztítjuk. A 3 Mg terméket 5 egység Xbal enzimmel teljesen emésztjük és alkalikus foszfatázzal kezeljük. A fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk, és a legnagyobb fragmenst (ez nem tartalmazza az Xbal és az első PvuII hely között a humán és marha növekedési hormon szekvenciában lévő 109 bázispárból álló részt) izoláljuk, és felhasználjuk klónozó vektorként (12. ábra, 127.).

A marha növekedési hormon első 23 aminosavát meghatározó, 69 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia az első PvuII helyig két Hpall restrikciós enzimmel hasítható helyet (5’-CCGG-3’) tartalmaz. Az első hely 23 bázispárnyi távolságra van a kódoló szekvencia első nukleotidjától. Foszfo-triészter-inódszerrel 63 bázispárból álló fragmenst szintetizálunk (12. ábra, 128.). Ez a fragmens megfelel az lpp riboszóma kötőhelyében lévő Xbal hely ATG iniciációs kodonig terjedő, 19 bázispárból álló szekvenciának, amit a Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 24 bázispárból álló kódoló szekvencia és 20 olyan nukleotid követ, amely a marha növekedési hormon szekvenciájával azonos a Phe helytől az első Hpall helyig terjedően.

A fragmens az alábbi szerkezetű:

Xbal

5-CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAG3’- TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCHpall

TTCCCAGCCATGTCCTTGTC 3’ AAGGGTCGGTACAGGAACAGGC 5’

A 63 bázispárból álló fragmens előállítására az alábbi szegmenseket állítjuk elő:

1) CTAGAGGGTAT

2) TAATAATGTTCC

3) CATTGGATGAT

4) GATGATAAGTTCC

5) CAGCCATGTCCTTGTC 50

6) ATGGGAACATTATTAATACCCT

7) TTATCATCATCATCCA

8) ATGGCTGGGAAC

9) CGGACAAGGAC.

⁵⁵

A fenti szegmenseket felhasználva T4 ligázzal katalizált reakciókat végzünk, az alábbi sorrendben:

a) Az 1. 5’-nem-foszforilezett szegmenst 5’-foszforilezett 6. szegmens jelenlétében θο hozzákapcsoljuk az 5*-foszforilezett 2. szegmenssel T4 ligáz katalizálta reakcióban, amiután megkapjuk az 1. duplexet. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk. θθ

b) A 3., 4. és 5. 5’-foszforilezett szegmenseket 5’-foszforilezett 7. és 8., továbbá 5’nem-foszforilezett 9. szegmens jelenlétében T4 ligázzal kapcsoljuk, amiután megkapjuk a 2. dezoxi-ribonukleinsav-duplexeket. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk.

c) Az 1. és 2. uuplexeket T4 ligázzal őszszekapcsoljuk, amiután megkapjuk a 12. ábra 128. dezoxi-ribonukleinsav-duplexét, ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. A dezoxi-ribonukleinsavduplexet T4 polinukleotid-kinázzal és (gamma-p³²)ATP-vel ismert módon enzimatikusan foszforilezzük.

A fentiekben megadott Hpall helytől a PvuII helyig terjedő, 46 bázipárból álló dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst az eredeti pBP348 plazmidból állítjuk eló. 100 pg plazmidot 400 pl PvuII pufferban 50 egység PvuII enzimmel kezelünk, 2 órán át, 37 C° hőmérsékleten. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a dezoxi-ribonukleinsavat

-1735

400 pl Peti (5’-CTGCAG-3*) alábbi összetételű pufferban oldjuk:

mmól nátrium-klorid, mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, mmól magnézium-klorid, és mmól /3-merkapto-etanol, literenként.

Az emésztést 50 egység PstI enzimmel végezzük, 2 órán át, 37 C° hőmérsékleten. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó, 30 cm hoeszü gélen frakcionáljuk, és a szükséges, 46 bázispárból álló szekvenciát tartalmazó, 135 bázispárból álló fragmenst izoláljuk és ismert módon tisztítjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav harmadát (33 pg plazmiddal ekvivalens menynyiség) Hpall restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük. A dezoxi-ribonukleinsavat 100 μΐ alábbi összetételű Hpall pufferban oldjuk:

mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, mmól magnézium-klorid, és mmól β-merkapto-etanol, literenként.

A reakciót 1 egység Hpall enzimmel végezzük, 40 percen át, 37 C° hőmérsékleten. A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 5% akril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk, Egy külön csikón SauIIIA restrikciós enzimmel emésztett, 1 pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat futtatunk. A fragmensek keveréke tartalmaz egy 46 bázispárból álló fragmenst, ezt markerként használjuk. A 135 bázispárból álló fragmens Hpall enzimmel való részleges emésztését követően kapott, 46 bázispárból álló fragmenst (12. ábra 124.) ismert módon tisztítjuk.

0,2 pg, Xbal és PvuII végekkel rendelkező plazmid vektort (12. ábra 127.) 3,2 pikomól, 66 bázispárból álló szintetikus fragmenssel (12. ábra, 128.) és 0,5-1 pikomöl, 46 bázispárból álló fragmenssel (12. ábra, 124.) keverünk 10 pl ligációs pufferban. A fragmensek kötését 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal végezzük, 16 órán át, 4 C° hőmérsékleten. Az eleggyel E. coli JA221 sejteket transzformálunk, és az ampicillin rezisztens telepekből plazmidokat izolálunk. A plazmidokat megvizsgáljuk a 494 bázispárból álló PvuII és a 109 bázispárból álló Xbal, PvuII fragmens jelenlétére. A 12 vizsgált telep egyike tartalmazza ezen fragmenseket. A plazmidot az Xbal helytől a PvuII helyig szekvenciáljuk, és marha növekedési hormonnal szemben radioimmun-méréssel vizsgáljuk. Úgy találtuk, hogy pozitívan reagál a radioimmun-mérés során, és adott szekvenciával rendelkezik. A plazmidot pNM789 jellel jelöljük, és a 12. ábra 129. jellel jelölt részén adjuk meg. Standard radioimmun-méréssel megvizsgáljuk a marha növekedési hormon kvantitatív kifejeződését, és úgy találtuk, hogy sejtenként legalább 10⁵ molekula van jelen.

A 13. ábra 129. helyén megadott pNM789 plazmid a marha növekedési hormon teljes kódolására 1 aminosavat meghatározó kodon cseréjét igényli. Ezt úgy végezzük el, hogy a pNM789 28 bázispárból álló PvuII-BamHI fragmensét az alábbi szekvenciájú, és a 13. áb~'a 130. helyén bemutatott szerkezetű, szintetikus kétszálú fragmenssel helyettesítjük (a fragmens a felső szálban 13, az alsó szálban 17 bázispárt tartalmaz):

5’-CTGTGCCTTCTAG-3*

3’-GACACGGAAGATCCTAG-5’.

pg NM789 plazmidot 1 egység PvuII enzimmel kezelünk, 200 pl PvuII pufferban, 5 percen át, 37 C° hőmérsékleten. Az enzimet 10 percen ét 65 C° hőmérsékleten inaktiváljuk. A mintát 300 pl-re hígítjuk BamHI puffer adagolásával, és 10 egység BamHI enzimmel teljesen emésztjük. Az emésztést 1 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. Ezután 5 egység alkalikus foszfatázt adunk, és 1 órán át 65 C° hőmérsékleten folytatjuk a z inkubá'ást. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen szeparáljuk, és a

13. ábra 131. számmal jelzett helyén megadott dezoxi-ribonukleinsav-f ragmenet tisztítjuk. Ez a plazmid egy helyen való hasításkor keletkezik. 0,2 pg tisztított terméket 5 pikomól szintetikus fragmenssel ligálunk 2 egység T4 ligázzal, 20 pl ligáz-pufferral készült reakcióelegyben, 1 éjszakán át, 4 C° hőmérsékleten. Transzformációt és az előzőekben ismertetett Bimbóim plazmid izolálását követően több olyan plazmidot szelektálunk, amelyek tartalmazzák a megfelelő PvuII fragmenst (494 bázispár) és Xbal, BamHI fragmenst (628 bázispár). Ezek közül legalább kettőnek a szekvenciáját meghatározzuk a BamHI helytől az egyetlen Smal helyig, majd az adott szekvenciával rendelkező, és a 13. ábra 132. helyén bemutatott egyik plazmidot kiválasztjuk.

Claims (5)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1) egy E. coli lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia promotere,

-1837

1. Eljárás humán vagy bovin növekedési hormon kifejezésére használható rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy összekapcsolunk

a) funkcionális replikációs origót tartalmazó dezoxi- ribonukleinsav-szegmenst;

b) egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, amelyek mindegyike megfelelő gazdasejtbe transzformálva az adott vektort, a transzformálható gazdasejtnek szelekcióra alkalmas tulajdonságot biztosit; és

c) egy olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, amely tandem elhelyezkedésében az alábbi szekvenciákat hordozza:

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enterokinázzal hasítható helyként Asp-Asp-Asp-Asp-Lys aminosav-szekvencíát meghatározó kodonokat tartalmazó szekvenciát alkalmazunk.

2) egy E. coli lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia 5’-nem-transzlatált régiója, és

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enterokináz hasítási helyet kódoló dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciaként az alábbival azonos szekvenciát alkalmazunk:

GATGATGATGATAAG

CTACTACTACTATTC.

3) egy transzlációs start kodon, amelyet egy

A) humán vagy bovin növekedési hormont meghatározó szekvencia, vagy

B) egy enterokináz hasítási helyet meghatározó nukleotid-szekvencia, amelyhez közbenső kodonok nélkül egy humán vagy bovin növekedési hormont meghatározó nukleotid-szekvencia kapcsolódik, követ és kívánt esetben

d) egy E. coli lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia 3’-nem-transzlatált szakaszának egészét vágj' egy részét, ahol a nem-transzlatált szakasz jobbra haladva humán vagy bovin növekedési hormont leíró szekvenciához kapcsolódik, és kívánt esetben

e) egy E. coli lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia transzkripciós terminációs régiójának egészét vagy egy részét, ahol a transzkripciós terminációs régió jobbra haladva kapcsolódik az idegen proteint kódoló szekvenciához, és kívánt esetben

f) egy E. coli lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia transzkripciós terminációs régiójának egészét vagy egy részét, ahol a transzkripciós terminációs szakasz jobbra haladva kapcsolódik az adott 3’-nem-transzlatált régióhoz.

4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enterokináz hasítási helyként Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys aminosav szekvenciát kódoló szekvenciát alkalmazunk.

5. Az 4. igénypont szerinti eljárás, azzal * jellemezve, hogy enterokináz hasítási hely dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciá jaként az alábbi kodonokat tartalmazó szekvenciát alkalmazunk:

TTCCCATTGGATGATGATGATAAG

AAGGGTAACCTACTACTACTATTC.

6. Az 1. igénypont szerinti eljáráe hu5 mán növekedési hormont kifejező plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a pNM645 plazmid előállítására a pNM575 plazmid 691 bázispárból álló BamHI fragmensének 538 bázispárból ólló FnuDII fragmen0 sét, a pKEN021 plazmid alkalikus foszfatázzal kezelt BatuHI-Xbal fragmensét és a humán növekedési hormont meghatározó régióhoz kapcsolt, az lpp promoter régiót tartalmazó szintetikus kétszálú dezoxiribonukleinsav5 fragmenst összekapcsoljuk, vagy

b) a pNM736 plazmid előállítására a pBR322 617 bózispórból álló HindlII-Sall fragmensét hozzákapcsoljuk a pNM645 plazmid tompa végű BamHI fragmenséből Sáli emésztéssel ka0 pott legnagyobb fragmenséhez, vagy

c) a pNM702 plazmid előállítására összekapcsoljuk a pNM575 plazmid 691 bázispárból álló BamHI fragmenséből FnuDII emésztéssel kapott, 538 bázispárból álló fragmensét, a

5 pKEN21 plazmid alkalikus foszfatázzal kezelt BamHI-Xbal fragmensét, és tandem elhelyezkedésben az lpp promoter régiót, a start kodont, enterokináz által felismerhető és hasítható rövid peptidet meghatározó kodonokat

0 tartalmazó régiót, és humán növekedési hormont meghatározó szekvenciát tartalmazó szintetikus kétszálú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás bovin

5 növekedési hormont kifejező plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a pKEN797 plazmid előállítására a pNM685 plazmid részleges PvuII emésztésével kapott fragmenséből kapott legnagyobb frag0 menst, egy 42 bázispárból álló szintetikus dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst, és pBP348 plazmid 135 bazispárból álló PvuII fragmensből Hpall emésztéssel kapott 46 bázispárból álló fragmenst összekapcsoljuk, vagy

5 b) a pNM789 plazmid előállítására összekapcsoljuk a pBP348 PvuII emésztéséből kapott 494 kb-s fragmentumából és a pNM702 plazmid részleges emésztéséből kapott fragmentum ligálásával kialakitott intermedier plaz0 mid legnagyobb, alkalikus foszfatázzal kezelt részleges PvuII-Xbl emésztéssel kapott fragmensét, egy 63 bázispárból álló szintetikus dezoxiribonukleinsav-fragmenst, és pBP348 plazmid PvuII emésztéssel kapott, 135 bázis5 párból álló fragmenséből részleges Hpall emésztéssel nyert, 46 bázispárból álló fragmensét.