KR900005776B1 - 인터페론의 제조방법 - Google Patents

인터페론의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR900005776B1
KR900005776B1 KR1019830003155A KR830003155A KR900005776B1 KR 900005776 B1 KR900005776 B1 KR 900005776B1 KR 1019830003155 A KR1019830003155 A KR 1019830003155A KR 830003155 A KR830003155 A KR 830003155A KR 900005776 B1 KR900005776 B1 KR 900005776B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
interferon
sequence
gene
coding
prc
Prior art date
Application number
KR1019830003155A
Other languages
English (en)
Other versions
KR840005490A (ko
Inventor
엠.크라울 로버트
Original Assignee
에프. 호프만-라 롯슈 에이지
페터 유레흐, 프리돌린 클라우스너
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 롯슈 에이지, 페터 유레흐, 프리돌린 클라우스너 filed Critical 에프. 호프만-라 롯슈 에이지
Publication of KR840005490A publication Critical patent/KR840005490A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR900005776B1 publication Critical patent/KR900005776B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/811—Interferon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

인터페론의 제조방법
제1도는 PL프로모터를 포함한 1200bp Bg1Ⅱ-BamHl 단편의 부분제한지도이다.
제2도는 350bp 삽입체상에 람다 PL프로모터를 포함하는 발현 벡터 pRC14의 작제도이다.
제3도는 발현벡터 pRC14내로의 백혈구 인터페론 유전자 삽입과정을 도시한 것이다.
제4도는 발현벡터 pRC15를 작제하기 위하여, 박테리오파아지 람다의 int 유전자를 위한 SD 서열을 함유한 82bp 단편을 분리하는데 사용되는 모식도이다.
제5도는 발현벡터 pRC15의 작제도이다.
제6도는 플라스미드 pRC14 및 pRC15를 사용한 각각의 발현벡터 pRC21 및 pRC22의 작제도이다.
제7도는 플라스미드 pRC2를 사용한 PL프로모터 및 합성 RBS-포함 발현벡터 pRC23의 작제도이다.
제8도는 섬유아세포 인터페론의 암호화 유전자를 플라스미드 pRC21 및 pRC22내로 삽입하는데 사용되는 모식도 및 생성된 프로모터-유전자 연결부위의 서열을 도시한 도이다.
제9도는 실시예 5(vii)에서 수득되는 플라스미드 pHIT3709의 제한효소 절단지도이다. 여기에서,
Figure kpo00001
부분은 시그널 펩타이드로 예상되는 펩타이드의 암호화 서열을 나타내며,
Figure kpo00002
부분은 IFI 폴리펩타이드의 암호화 서열을 나타낸다.
제10도는 실시예 5(vii)에서 수득되는 플라스미드 pHIT3709의 염기서열을 도시한 것이다.
제11도는 면역 인터페론의 암호화 유전자를 발현벡터 pRC22내로 삽입하는 데 사용되는 모식도 및 프로모터-유전자 연결부위의 서열을 도시한 도이다.
제12도는 면역 인터페론 유전자를 발현벡터 pRC23내로의 삽입과정 및 프로모터-유전자 연결부위의 서열뿐만 아니라 이의 변형체를 도시한 것이다.
본 발명은 인터페론의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 다양한 요인들이 이 형질전환된 미생물에 의해 진핵 단백질의 발현 효율에 영향을 미치는 것으로 알려지고 있다. 이 단백질의 발현을 한정하고 통제하는 가장 중요한 요인 중 두가지는 세균세포가 삽입된 유전자를 mRNA가 단백질로 해독되는 효율이다. 일반적으로 발현 과정으로서 알려져 있는 전사(transcription) 및 해독(translation)의 효율은 벡터 DNA상에서 클로닝된 유전자의 앞에 통상 위치하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 결정된다고 믿어진다. 대부분의 경우 이들 형질 발현조절 서열은 RNA 폴리머라제가 상호작용하여 전사가 개시되는 프로머터부위, 및 리보좀이 mRNA와 결합하고 상호작용하여 단백질로 해독개시되는 리보좀 결합 부위(RBS)를 포함한다.
플라스미드상에 천연적으로 존재하는 것과는 다른 여러 발현 조절 서열은 세균 숙주내에서 진핵 단백질 및 폴리펩타이드의 발현조절을 개선하기 위하여 종래에 사용되어 왔다. 예를들면 이.콜라이의 라토즈 오페론(Operon)의 오퍼레이터, 프로모터, 리보좀 결합 및 상호작용 서열, 이.콜라이의 트립토판 신테타제시스템의 상응하는 서열, 및 박테리오파아지 λ의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역을 들 수 있다[참고, H.Bernard 등, Gene 5, 59-76(1979)].
λ파아지의 PL 프로모터는 원핵 유기체내로 클로닝된 진핵 및 원핵 단백질을 발현시키는데 사용되어 왔다. PL의 촉진 활성은 온도-민감성 억제물질에 특이한 온도-민감성 유전자의 존재하에 낮은 온도에서 작동 정지됨이 밝혀졌지만, 원핵 단백질을 발현시킬 경우에는 열 유도로서 활성화될 수 있다. 이러한 프로모터시스템을 사용하는 종래 기술의 실례는 1981년 4월 1일 출원된 유럽특허원 제81301413.1호 및 문헌[Derynck 등, in Nature 287 193-197(1980)]에서 찾아볼 수 있다. 이들 참고문헌에서는 섬유아세포 인터페론과 같은 진핵 단백질의 발현시 PL프로모터 시스템을 완전한 세균 리보좀 결합부위와 접합시켜 사용하였다.
이.콜라이내에서 진핵 유전자를 형질 발현시킬 목적으로 진핵 유전자상에 적절한 조절 시그널의 결핍을 극복하기 위하여 다음의 제조함 DNA 기술을 둘다 사용하는 상이한 두가지 방법이 사용되어 왔다 : (1) 세균 유전자, (예를들면, β-락타마제 유전자)의 암호영역내에 진핵 유전자 암호 서열을 삽입시키고, 이에따라 이.콜라이 유전자의 완전한 RBS를 이용하거나, (2) 샤인-달가르노(SD) 서열, SD 서열(이.콜라이 DNA로부터 유래)에 인접한 서열(5'-방향의 상향서열) 및 AUG 출발코돈 +진핵 DNA로부터 유도된 나머지 암호서열로 구성되는 소위 "하이브리드"RBS를 작제한다. SD 서열은 진핵 유전자를 위한 프로모터와 개시 코돈 사이에 위치하는, 16s 리보좀 RNA의 3'-말단에 위치한 염기와 상보적인 3 내지 9개 염기의 서열이다.
첫번째 방법의 주요단점은 융합 폴리펩타이드가 생성된다는 데 있는 것으로 다시말하면 유전자 생성물의 일부가 이.콜라이 DNA에 의해 암호화되고 또 그의 일부가 진핵 DNA에 의해 암호화된다는 데 있다. 두번째 방법은 예를들면 진핵 세포내에서 천연적으로 생성된 유전자 생성물과 동일한 표준성체(부착된 전서열이 없는 완전하고 생물학적으로 활성인) 유전자 생성물을 생성하는데 성공적으로 사용되어 왔다[Derom 등,Gene 17, 55-54(1982), 및 Gheysen등, Gene 17, 55-63(1982)].
현재까지, 백혈구, 섬유아세포 및 면역과 같은 여러 인체 인터페론 종류는 두가지 방법으로 발현시켜 왔다. 섬유아세포 인터페론(IFN-β)을 발현시키려는 시도에서, 상술한 게이센 등의 문헌은 PL프로모터 시스템과 혼용하여 첫번째 방법(완전히 세균 RBS)을 사용하였다. 비록 이 문헌은 생물학적 활성 비융합 단백질이 수득되었음을 나타내고 있으나, IFN-β 유전자가 적절한 해독개시 서열을 가지고 있지 않기 때문에 상기의 결과는 세포내의 알려지지 않고 비효능적인 기작에 의한 융합 IFN-β 단백질의 세포 프로쎄싱에 의한 것임이 분명하다. 또한 상기 문헌으로 부터 진핵 유전자 생성물은 진핵 유전자의 시그널 부분에 의해 암호화된 아미노산 서열을 함유한다고 밝혀져 있다. 따라서 인터페론의 완성된 형태는 발현되지 않는다.
문헌[Gray 등, Nature 295, 503-508(1982), 및 Shepard 등 DNA 1, 125-131(1982)]에서는 "하이브리드 RBS" 두번째 방법을 사용하고 있다. 그러나 이들 문헌에 기술된 바와같이, 발현은 이.콜라이 trp 프로모터의 조절하에 일어나며, 하이브리드 RBS는 진핵 유전자 ATG 및 trp 리더의 SD 및 링커서열로 부터 유도된다. 또한 이들 문헌 둘다에서, SD 서열 및 SD서열에 인접한 서열(5'-방향의 상향서열)은 불변상태를 유지하였다. 유일한 변화는 링커영역에서 SD 서열과 ATG 코돈사이의 뉴클레오타이드 수 및 조성이 변하했다는 점이다.
선행기술은 클로닝 된 진핵 유전자의 발현을 선택적으로 증가시키는 데 요하는 유연성을 갖고 하이브리드 리보좀 결합부위를 고안하고 작제하는 방법이 결여되어 있다. 또한, 선행기술은 융합 단백질의 독립 세포 프로쎄싱 없이 온도 민감성 프로모터 시스템을 사용하여 완성형태로 클로닝된 진핵 유전자 단백질의 발현을 조절하는 방법이 결여되어 있다.
본 발명은 숙주 세균 세포내에서 인간 성체 백혈구, 섬유아세포 및 면역 인터페론과 같은 인터페론을 암호화한 클로닝된 유전자의 형질 발현을 조절하기 위한 개선된 백터 및 방법을 제공하여 선행기술의 상기 문제점을 극복해 준다.
광의 측면에서, 본 발명은 원핵 유기체에 람다 박테리오파아지로부터 분리된 프로모터 및 오퍼레이터 유전자, 온도 민감성(ts) 리프레서 단백질을 암호화하는 람다 파아지로부터 분리된 또다른 유전자 cI, 람다파아지 프로모터/오퍼레이터 서열 둘다와 연결된 하이브리드 리보좀 결합부위, 및 인간 인터페론의 암호화진핵 유전자를 제공함을 특징으로 하여, 인간 백혈구, 섬유아세포 및 면역 인터페론 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 완성 단백질의 활성에 영향을 미치지 않으면서 유기체에 의해 발현된 완성 진핵 단백질이 방출되도록 하기 위하여 미생물의 세포벽을 파괴하는 용해 조작을 포함한다.
본 발명은 박테리오파아지 λ로 부터 유도된 프로모터 및 오퍼레이터 DNA 서열, 하이브리드 리보좀 결합부위의 암호화 DNA 서열 및 인터페론, 바람직하게는 인간면역 인터페론의 암호화 DNA 서열을 포함하는 인터페론, 바람직하게는 인간 면역 인터페론을 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 벡터를 갖는 유기체, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이와 같은 세균도 포함한다. 본 발명은 마자막으로 a) 숙주 유기체를 λ 박테리오파아지로부터 유도된 온도 민감성 리프레서 단백질을 암호화하는 돌연변이 cI 리프세서 유전자를 갖는 발현 벡터로 형질전환시키고, b) 형질 전환된 유기체를 배양시켜 단계 a의 발현 벡터에 의해 암호화된 인터페론을 생성하며, c) 유기체를 용해시키고, d) 생성된 용해 물로부터 인터페론을 회수함을 특징으로 하여, 인터페론을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 발현벡터 또는 염색체상에서의 숙주 유기체는 형질발현 벡터 또는 λ박테리오파아지로부터 유도된 온도 민감성 리프세서 단백질을 암호화하는 돌연변이 cI 리프세서 유전자를 포함한다. 이 돌연변이 유전자는 다른 방도로, 상술한 바와같은 인터페론의 제조방법에서 돌연변이 리프세서 유전자를 발현시킬 수 있으며 단계 a)의 발현 벡터와 완전한 양존할 수 있는 독립된 복제 벡터로 숙주유기체를 형질 전환시켜, 숙주 유기체에 돌연변이 리프세서 유전자를 제공할 수 있다.
상기 방법의 단계는 b)후에, 세포는 공지된 방법으로 수거하고, 완충용액중에 현탁시킨 후 용해시킨다.
본 명세서에 사용된 용어 용해는 초음파적으로, 기계적으로 또는 본 분야의 숙련 가에게 알려져 사용되고 있는 그밖의 다른 방법으로 수행할 수도 있으나 바람직하게는 효소적으로, 숙주의 세포벽을 분쇄하는 과정을 의미한다. 인터페론은 전기영동 또는 크로마토그래피(예를들면, 항체 친화성 크로마토그래피)와 같은 본 분야의 숙련가에게 알려져 있는 단백질 정제방법을 사용하여 용해물로부터 회수할 수 있다. 본 발명에서 바람직한 유전자는 어떠한 프리서열(presequence)도 없이 완성된 형태의 인간 면역 인터페론을 암호화한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 약어 및 용어는 특별히 언급하지 않는 한 본 분야의 숙련가에게 흔히 알려져 사용되고 있는 것이다.
본 발명의 인간 면역 인터페론은 다음의 DNA 서열에 의해 암호화되어 있다.
Figure kpo00003
여기에서, X는 TAA, TGA 또는 TAG이다. 상기 DNA 서열의 5'-말단에는 서열 5' ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTC GCT TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT GGC 3'(Ⅲ) 또는 메티오닌의 암호화 ATG 삼련자가 존재할 수 있기 때문에, 그에 따라 각각 프리서열 Met-Lys-Tyr-Thr-Ser-Tyr-Ile-Leu-Ala-Phe-Gln-Leu-Cys-Ile-Val-Leu-Gly-Ser-Leu-Gly 또는 N-말단에 첨가된 Met를 갖는 면역 인터페론을 발현시킬 수 있다. 발현 벡터상에서 면역 인터페론 암호화 DNA 서열은 SD 서열을 경유하여 적절한 프로모터-오퍼레이터 서열의 하향서열에 연결된다.
ATG 출발 시그널을 포함하는 상기 언급된 DNA 서열 I에 의해 암호화된 인간 면역 인터페론 단백질은 다음의 아미노산 서열로 특징지어 진다.
Figure kpo00004
본 발명의 실행에서, ATG 출발 시그널에 의해 암호화된 첫번째 아미노산 Met는 발현후에 미생물에 의해 분열된다는 것은 연결할 수 있다.
인간 IFN-β 및 IFN-α(상이한 종)의 아미노산 서열 뿐만아니라 이들을 암호화하는 상응하는 DNA 서열은 공지되어 본 분야의 숙련가에게는 널리 알려져 있다.
본 발명에 따라, 인터페론 암호화 DNA 서열은 플라스미드 또는 클론된 백터의 DNA내로 삽입시킴으로써 제조합 DNA 서열을 생성한 다음 이를 사용하여 통상의 방법으로 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 본 발명에 따라, 형질전환된 숙주 세포는 바람직하게 시험관내에서 클로닝시킴이 바람직하다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 하이브리드 RBS 암호화 DNA 서열을 포함한다. 숙주세포내에서 해독의 개시예 필요한 RBS는 (1) 아미노산 메티오닌의 ATG 해독개시코돈(공지된 모든 이.콜라이 유전자 생성물은 아미노산 메티오닌으로 시작하며 이는 계속적으로 분열하거나 하지 않을 수 있다) (2) 16s 리보좀 RNA의 3'-말단에서 위치하는 염기와 상보적이고 SD 서열로 알여진 3 내지 9개 염기 서열(3) 이들 둘 사이에 위치하는 링커영역으로 알려진 염기 서열로 구성된다.
예를들면, 이.콜라이 lac Z 유전자의 출발 서열은
Figure kpo00005
ACAGCT [ATG]-이다. 밑줄친 서열은 7개 염기에 의해 ATG 삼련자로부터 분리되는 SD 서열이다. SD 서열과 ATG 삼련자 사이의 링커영역 길이는 유전마다 약 5 내지 16개의 염기로 변화시킬 수 있은며, 링커영역 길이와 단백질 발현양 사이에는 상호관계가 존재하는 것으로 나타난다. 또한, 링커영역의 서열은 발현양에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 또한, SD 서열 그 자체의 성질 뿐만 아니라 SD 서열 및 ATG 출발코돈을 플랭킹한 DNA 서열은 mRNA의 효과적인 해독에 중요한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 하이브리드 RBS는 DNA 서열의 길이 및/또는 서열내의 염기 순서에 의해 천연 RBS와는 구별된다. 이러한 차이는 링커영역, SD 서열 또는 DS 서열을 플랭킹한 서열(5'-방향의 상향서열)에 있다.
다음의 하이브리드 RBS들은 특히 운용한 것이다.
Figure kpo00006
본 발명의 바람직한 태양에서, 형질전환 과정에서 수용체로서 사용되는 미생물은 영국특허공보 제2055382A호에 기술된 에스케리키아 콜라이 K-12 균주 294이다. 이 미생물은 1978년 10월 28일 ATCC 기탁번호 제31446호로 American Type Culture Collection에 기탁되었으며, 용이하게 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에서 모든 재조합 DNA 조작은 National Institutes of Health(NIH)의 지침에 따라 수행하였다.
본 발명은 가장 바람직한 태양으로서 이.콜라이 K-12 균주 294를 기본으로 하여 기술하였으나, 이.콜라이 MA 210 또는 RR과 같은 그밖의 공지된 이.콜라이 균주 또는 American Type Culture Collection과 같은 공인된 미생물 기탁기관에 기탁되어 용이하게 구입할 수 있는 그밖의 미생물 균주도 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 박테리오 파아지 λ DNA에서 분리되어 양쪽 방향에 배향된 tetR및 ampR유전자 사이에 삽입된(즉, 전사는 ampR유전자 또는 tetR유전자 방향으로 진행한다) PL프로모터를 포함한 플라스미드 pBR 322의 유도체(제2,5,6 및 7도 참조)이다. 사용된 프로모터는 PL로서 그 이유는 PL이 λ cI 리프레서에 의해 효율적이고 편리하게 조절될 수 있는 상당히 강력한 프로모터이기 때문이다. 리프레서의 암호화 유전자는 리프레서를 온도에 민감하게 하는 돌연변이화 된 cIts 2 또는 cIts 857을 갖는다. 리프레서는 30℃에서 정상적으로 작용하며,약 37℃ 내지 42℃에서는 불활성화된다. 따라서, PL프로모터는 30℃에서 억제되며(작동 정지됨) 42℃에서 탈억제된다(작동 개시됨) 이러한 현상은 목적하는 유전자 생성물이 세포에 독성을 나타낼 수 있거나, 만일 다량이 존재할 경우 세포생장에 해를 미칠 수 있다는 점에서, 본 발명에서 필요하다. PL프로모터를 조절할 수 있다는 능력에 의해 실험자는 유전자 생성물을 발현시키지 않고 약 30℃ 내지 36℃에서 증식시킨 후, 최적 시간이 경과하여 온도를 약 37℃ 내지 약 42℃로 높여 목적하는 유전자 생성물을 생성할 수 있다.
본 발명의 모든 벡터는 또한 SD 서열의 3' 방향의 하향서열(말단 근처)에서 0,1 또는 4개의 염기 만큼 떨어져 있는 EcoR 1 제한 부위를 함유함으로써 상이한 하이브리드 RBS의 작제수단을 제공한다. PR-SD서열을 인터페론 암호화 유전자의 ATG 암호서열에 연결시키기 위하여 EcoR 1 부위를 사용하여 하이브리드 RBS를 작제한 후에도 또한 EcoR 1로 제한시키고, 말단을 클레노우(Klenow) 폴리머라제 I으로 채운 다음 두개의 생성된 말단을 T4DNA 리가제로 평활말단 연결시켜 변형시킬 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예로 좀더 상세히 설명될 것이다.
[실시예 1]
λPL프로모터 OL오퍼레이터를 포함하는 350염기쌍(bP) 단편을 분리하기 위하여, λcl 857 Sam 7DNA(Miles Laboratories)250㎍을 제한 엔도뉴클레아제 Bam H 1 및 Bgl Ⅱ로 분해시키고, 생성물을 전기영동시켜 아가로스겔상에서 분리시킨다. PL프로모터 OL오퍼레이터를 포함한 1200bp 단편을 겔로부터 분리한다(제1도 참조).
그런 다음, 이 1200bp 단편을 HpaI 으로 완전히 분해시켜 450bp 단편을 수득한 다음 다시 이를 Hinf I으로 부분 분해시킨다. 350bp 단편을 5% 폴리아크릴아미드겔 전기영동(PAGE)하여 분리하며, 이 단편은 리프레서가 결합하는 PL프로모터 및 OL오페리이터 부위(OL1,OL2,OL3)를 포함한다. λN 유전자의 SD 서열과 N유전자에 대한 개시코돈 사이에 존재하는 Hinf I 부위(제1도 및 제2도 참조)는 이.콜라이내에서 외래(foreign) 유전자를 발현시키기 위한 하이브리드 리보좀-결합 부위의 작제를 가능케 해준다. 이 Hinf I부위는 또한 EcoR 1 부위로 전환시킬 수 있다.
350bp Bal Ⅱ-Hinf I 단편을 EcoR 1 및 Bgl Ⅱ에 의해 분해된 플라스미드 pRC 1내로 클로닝시킨다.
pRC 1은 EcoR 1 부위에 인접한 Bal Ⅱ 부위를 포함하는 pBR 322의 유도체이다(제2도 참조).
제2도는 또한 연결된 말단부위의 서열을 보여주며, 벡터의 EcoR 1 말단이 어떻게 단편의 Hinf I 말단에 연결되어 EcoR 1 부위가 재구성될 수 있는가를 나타내준다(제2도에서 ⓐ는 생체내의 세포내 기작에 의해 복구된다). 생성된 재조합 플라스미드를 pRC14라고 명명한다.
PL프로모터를 사용한 그밖의 많은 발현 벡터를 작제하였다(제4,5,6 및 7도). pRC 15는 상술한 350bp Bgl Ⅱ-Hinf I 단편 외에도 λint 유전자의 SD 서열이 포함된 55bp 단편(Hinf I -Mbo I)을 포함한다(제4도 및 제5도 참조). pRC 21 및 pRC 22는 각가 pRC 14 및 pRC 15와 유사하다. 이들 플라스미드 사이의 근본적인 차이는 삽입된 PL-포함 단편의 배향 및 전사 방향이다(제5도 참조). pRC 23은 "컨센서스"RBS[Scherer 등, Nucleic Acids Research 8, 3895(1980)]를 포함한 합성 올리고뉴클레오타이드를 PL프로모터를 포함한 250bp Bgl Ⅱ-Hae Ⅲ 단편에 연결시키고, 연결된 생성물을 제7도에 도시한 바와같이 pRC 2내에 삽입시켜 작제한다.
[실시예 2]
백혈구 인터페론-A(이하에서는 LeIF-A 또는 LIFA로도 언급된다) 유전자를 다른 플라스미드 내에 삽입시키고 다음의 과정에 따라 숙주 유기체내에서 발현시킨다. LeIF 유전자 공급원인, pLeIF A25[Goeddel등 Nature 287, 411(1980)]로부터 PstI-EcoR 1단편을 분리하고, pRC 14로부터 분리된 EcoR1-PstI 거대 단편에 연결시킨다. 연결부위의 서열은 제3도에 도시되어 있다. SD서열은 ATG 개시 코돈으로부터 5개의 염기만큼 떨어져 있다. 이 거리를 9개로 늘리기 위해서, pRC 14/LIFA를 EcoR 1으로 분해시키고, 점착 말단을 폴리머라제 I(+dTTP, dATP)의 클레노우(Klenow) 단편으로 채운 다음 평활말단을 재연결시킨다. 생성된 연결부위의 서열은 제3도에 도시되어 있다(pRC 1410/LIFA). 본 실시예에서 사용된 신규한 하이브리드 리보좀 결합 부위의 서열은 pRC 14/LIFA의 경우 AGGAGAATTCATG이며 pRC1410/LIFA의 경우 AGGAGAATTAATTCATG이다(둘다 제3도에 도시되어 있다).
상술한 PL발현 플라스미드로 염색채상에 불완전 프로파아지를 소유한 이.콜라이 균주(균주 MA 210)를 형질전환시킨다. 프로파아지의 cI 리프레서 유전자는 온도에 민감하도록 유도하는 돌연변이 CIts 857을 포함한다. 즉, 리프레서는 약 30℃ 내지 약 36℃에서 작용하며 약 37℃ 내지 42℃에서 불활성화 된다. 이러한 현상은 PL프로모터를 편리하게 조절할 수 있는 기착을 제공한다. 이 경우, 세포를 M9-글루코즈 배지중의 30℃에서 배양하여 2-3×108/ml로 증식시킨 다음, 42℃로 2시간 동안 승온시킨다. 이어서, 배양물 중의 세포를 7M 구아니딘-HCI중에서 용해시키고 용해물을 검정한다. 이러한 과정을 pRC 1410/LIFA로 수행할 경우, 107 내지 108단위/ℓ의 인터페론 활성 수율이 세균 추출물 또는 용해물에서 검출된다(표 1).pRC 14/LIFA에서의 발현 양은 pRC 1410/LIFA에서 수득된 것의 약 10퍼센트이다. pRC 15/LIFA는 pRC1410/LIFA와 비슷한 LIFA 형질 발현 양을 나타낸다(표 1).
[표 1]
Figure kpo00007
a)균주 MA 210내의 cI 리프레서 유전자는 숙주 염색체상의 불완전 프로파아지로 존재하며, 온도-민감성 돌연변이 cI 857을 포함한다.
b)cI 리프레서 유전자는 pBR 322의 유도체와 양존가능한 저-복제를 플라스미드인 pRK 248 cIts 2내에 2400bp Bal Ⅱ 삽입제로서 존재한다.
c)cI 리프레서 유전자는 두가지 가능한 배향중 어느 한쪽으로 pRC 14/LIFA의 Bgl Ⅱ부위에서 2400bp 삽입체로서 존재한다.
d)주어전 값은 세균 추출물을 1 : 50으로 희석시켜 검정하여 얻은 데이타이다. 따라서 10,000단위/ml는 5×108세포/ml에서 추출물의 5×105단위/ml 또는 배양물의 약 5×104단위/ml(5×107단위/ml)로 전환한다.
[실시예 3]
인간 섬유 다세포 인터페론 유전자(FIF)를 하기와 같이 벡터 pRC 21 및 pRC 22내로 삽입시칸다(제8도). 별개의 반응으로, pRC 21 및 pRC 22를 EcoR 1으로 분해시키고, 말단을 클레노우 폴리머라제 I으로 채운 다음, BamHI으로 분해시키고 거대 단편(4.3kb)을 분리한다. FIF 유전자의 공급원인 pFIF trp69[Goeddel등, Nucleic Acids Res. 8, 4057(1980)]를 xbaI으로 분해시키고, 말단에 클레노우 폴리머라제 I으로 채워 평활말단으로 전환시킨 다음, BamHI으로 분해시켜 FIF 유전자가 포함된 좀더 작은 단편(850bp)을 분리한다. FIF 850bp 단편을 4.3KbPL-함유 단편에 연결시키고 생성된 착제물을 제한 분석하여 확인한다. FIF를 발현할 수 있는 PL-FIF 플라스미드의 능력을 측정하기 위해서. pRC 21/FIF 및 pRC 22/FIF로 형질전환된 이.콜라이 세포를 M9-글루코즈 배지중의 30℃에서 배양하여 세포 밀도 2-3×10세포/ml로 증식시키고 온도를 42℃에서 유도시킨다. 샘플 1ml를 취하여 원심분리하여 세포를 수거하고(5×10세포/ml) 7M 구아니딘-HCI중에 재현탁시켜 세포를 용해시킨다. 세포 조각을 원심분리하여 제거하고 상등액을 처음의 50배로 희석하여 항바이러스 활성을 분석한다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure kpo00008
[실시예 4]
FIF 발현에 미치는 신규한 하이브리드 리보좀 결합부위의 효과를 측정하기 위하여, pRC 21/FIF 및 pRC22/FIF의 유도체를 작제한다. pRC 22/FIF 및 pRC 22/FIF의 링커영역(제8도 참조)내의 두개 제한 부위의 조합은 하이브리드 RBS에서의 여러가지 변화를 줄 수 있는 수단을 제공한다. EcoR 1 또는 xbaI를 사용하여 링커영역내를 절단하고 클레노우 폴리머라제 I을 사용하여 생성된 말단을 채워 평활말단을 재연결시켜 표3에 나타낸 여러가지 서열을 수득한다. 이득 작제물을 형질전환된 이.콜라이 균주 RRI(pRK 248cIts)내에서 FIF 발현에 대하여 시험한다. FKP를 발현시킬 수 있는 PL-FIF 플라스미드의 능력을 시험하기 위해서, pRC 21/FIF, pRC 22/FIF, pRC211/FIF, pRC221/FIF, pRC212/FIF 및 pRC222/FIF중에서 선택된 한개의 플라스미드로 형질전환된 각각의 세포배양물을 사용하여 하기 과정을 진행시킨다. 세포를 M9-글루코스 배지중의 30℃에서 배양시켜 세포밀도를 2-3×10세포/ml로 증식시키고, 42℃에서 약 120분간 유도시킨 다음 샘플 1ml를 취하여 원심분리하여 세포를 모으고 7M 구아니딘-HCI(5×10세포/ml)중에 재현탁시켜 세포를 용해시킨다. 세포조각을 원심분리하여 제거하고 처음의 5배로 희석하여 상등액을 항바이러스 활성에 대해 검정한다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure kpo00009
[실시예 5]
인간 면역 인터페론(IFI) 유전자를 포함하는 PL-발현 벡터를 작제한다. IFI 유전자의 공급원은 pHIT3709이며, 이것은 PstI 부위에 삽입된 IFI mRNA의 1100bp CDNA 복제물을 갖는 PBR 322의 유도체이다. 이 삽인체상에 존재하는 IFI의 암호화 서열은 일반식 I로 나타난다(제7도 참조). IFI 유전자를 포함한 플라스미드 pHIT 3709는 다음의 방법에 따라 작제한다.
(i) IFI을 암호화하는 mRNA의 분리
인간의 말초혈액에서 얻은 백혈구를 12-0-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA) 15mg/m1 및 콘 카나발린 A 40㎍/m1를 함유한 RPMI 1640배지(10% 소의 태아 혈청을 함유한다)중의 37℃에서 배양시켜 IFI를 유도한다. 24시간 배양 후 유도된 인간 백혈구(1×1010세포)를 테플론 균질기중에서 티오구아니딘 용액(5M 구아니딘 티오시아네이트, 5%머캅토에탄올, 5mM 트리스-HCI(pH 7.6), 10mM EDTA)로 파괴시키고 변형시킨다. 그런 다음에, 나트륨 N-라우로일 사르코시네이트를 4%의 농도로 가하고, 균질화시킨 후, 혼합물을 염화세슘 용액(5.7M 염화세슘, 0.1M EDTA) 6ml상에서 형층시키고 15℃에서 벡크만 SW 27 회전기를 30시간 동안 24,000rpm으로 사용하여 원심분리시켜 RNA 침전물을 수득한다.
이 RNA 침전물을 0.25% N-라우로일 사르코시네이트중에 용해시킨 다음 에탄올로 침전시켜 RNA 8.3㎎을 수득한다. 이 RNA를 고농도 염 용액(0.5M NaCl, 10mM 트리스-HCI(pH 7.6), 1mM EDTA,0.3% SDS)중에서 올리고(dT) 셀룰로즈 컬럼상에 흡착시키고 폴리(A)-함유 mRNA를 저농도 염용액(10mM 트리스-HCI(pH 7,6), 1mM EDTA, 0.03% SDS)으로 용출시킨다. mRNA 700㎎을 수거한다.
이 mRNA를 다시 에탄올로 침전시킨 다음 10mM-트리스-HCI(pH 7.6), 2mM EDTA 및 0.3% SDS 의 용액 0.2ml중에 용해시키고, 65℃에서 2분간 처리한 다음,. 21시간 동안 25,000rpm으로 20℃에서 베크만 SW 27회전기를 사용하여 10 내지 30% 자당 밀도 구배 원심분리시켜 22개 분획으로 분별시킨다. 각 분획의 분취량을 제노푸스 라비스(Xenopus laevis) 난모세포내에 주사하고 합성된 단백질을 인터페론 활성에 대하여 검정한다. 이의 방법에서, 분획 12(침강계수가 12 내지 14S로 이다)의 mRNA의 마이크로그램 당 195국제 인터페론 단위의 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이렇게 하여 수득된 분획 12중의 mRNA는 중량이 약 20㎍이다.
(ii) 일본쇄 DNA의 합성
상기 mRNA 5㎍, 올리고(dT) 50㎍, 100단위의 역 전사효소(reverse transcriptase), 각각 1mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP. 8mM MgCl2, 50mM KCI, 10mM 디티오트레이톨 및 50mM 트리스-HCI(pH 8.3)를 함유한 반응 혼합물 100㎍를 42℃에서 1시간동안 배양시키고, 페놀로 탈단백질화 시킨다.
음 70℃에서 20분간 0.1N NaOH로 처리하여 RNA를 분해시킨다.
(iii) 이본쇄 DNA의 합성
상기에서 합성된 일본쇄 상보 DNA를 100단위의 역전사효소 각각 1mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 8mM MgC12, 50mM KCI, 10mM 디티오트레이톨 및 50mM 트리스-HCI(pH 8.3)이 함유된 반응혼합물 50μl중의 42℃에서 2시간동안 반응시켜 이본쇄 DNA를 합성한다.
(iv) dC 테일의 첨가
상기 이본쇄 DNA를 0.1M 나트륨 아세테이트(pH 4.5), 0.25M NaCl, 1.5mM ZnSO4가 함유된 반응혼합물 50μl중의 뉴클레아제 S-1 60단위로 실온에서 30분간 처리한다. 반응 혼합물을 페놀로 탈단백질화하고, DNA를 에탄을로 침전시킨 다음, 0.14M 칼륨 카코딜레이트, 0.3M 트리스(PH 7.6), 2mM 디티오트레이톨, 1mM CoCl2, 0.15mM dCTP 및 말단 트랜스페라제 30단위가 함유된 혼합물의 30℃에서 3분동안 말단 트랜스페라제 반응시켜 ds DNA의 각 3'-말단에 약 20개의 데옥시시티딘 잔기를 첨가시킨다.
이러한 일련의 반응으로, 이본쇄 데옥시시터딘-쇄-포함 DHA 약 300㎍을 수득한다.
(v) 이.콜라이 플라스미드 pBR 322의 분해 및 dG 테일의 첨가
이 콜라이 플라스미드 pBR 322 DNA 10㎍을 50mM NaCl, 6mM 트리스-HCI(pH 7.4). 6mM MgCl2, 6mM 2-머캅토에탄올 및 소혈청 알부민 110㎍/ml가 함유된 반응혼합물 50㎍중의 제한효소 PstI 20단위로 37℃에서 3시간동안 처리한다. 반응혼합물을 페놀로 탈단백질화하고 DNA를 0.14M 칼륨 카코딜 레이트, 0.3M 트리스(pH 7.6), 2mM디티오트레이톨, 1mM CoCl2및 0.15mM dGTP가 함유된 반응혼합물을 50/m1중의 말단 트랜스페라제 30단위로 37℃에서 3분간 처리한다.
(vi) cDNA의 어닐링(Annealing) 및 이.콜라이의 형질전환
0.1M NaCl, 50mM 트리스-HCI(pH7.6) 및 1mM EDTA가 함유된 용액중의 상기 수득된 dC-테일합성 ds DNA 0.1㎍ 및 상기 dG-테일 플라스미드 pBR 322 DNA 0.5㎍을 65℃로 2분간 가열한 다음 45℃로 2시간 가열하고 이어서 서서히 냉각시켜 어닐링시킨다. 이.콜라이 X1776을 에나(Enea) 등의 방법[J.Mol. Biol .96,495(1975)]으로 형질전환시킨다.
(vii) cDNA를 포함한 플라스미드의 분리
약 8,500테트라사이클린-내성 콜로니를 분리하고 각 콜로니의 DNA를 니트로 셀룰로즈 필터에 고정시킨다[M.Grunstein 및 D.S.Hogness, Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 72, 3961 (1975)].
별도로 그레이등에 의해 문헌[Nature 295, 503(1982)]에 보고된 바 있는 IFI의 아미노산 서열을 기본으로 하여 아미노산 서열 Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp(1-5) 및 Lys-Gln-Asp-Met-Asn-Val(77-82)에 상응하는 두개의 염기서열5'
Figure kpo00010
및 5'
Figure kpo00011
을 트리에스테르 방법[R.Crea등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 75 5765(1978)]에 따라 화학적으로 합성한다. 이들 올리고 뉴클레오타이드 0.2㎍을 50mM 트리스-HCI(pH 8.0). 10mM NgC12, 10mM 머르캅토에탄올 및 50μCi-32P-ATP가 함유된 반응혼합물 50μ1중의 T4폴리뉴클레오타이드 키나제 3단위로 37℃에서 1시간동안 처리한다.
5'-말단을 32P로 표지한 올리고뉴클레오타이드를 탐침(probe)으로서 사용하고 라운(Lawn)등의 방법[Nucleic Acids Res.9, 6103(1981)]에 따라 상기된 니트로셀룰로즈 필터상의 DNA로 어닐링시킨다. 자동방사기록법으로, 상기의 두올리고뉴클레오타이드 탐침과 반응한 4개의 콜로니를 동정한다.
플라스미드 DAN를 번보임(Birnboim) 및 돌리(Doly)의 방법[Nucleic Acids Res. 1, 1513(1979)]으로 이들 각각의 콜로니의 세균 세포로부터 분리한다. 플라스미드 DAN의 삽입체를 PstI 제한효소로 절단시킨다. 분리된 플라스미드 중에서 가장 긴 cDNA 삽입체를 함유하는 것을 선택하고 이를 "pHIT 3709"로 명명한다.
이 플라스미드의 제한효소 지도는 제9도에 도시되어 있다. PHIT 3709 플라스미드내에 삽입된 mRNA 서열의 일차 구조(염기 서열)를 생거등의 방법[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 5463(1977)] 및 맥삼-길버트 방법으로 결정하였다. 상기의 일차 구조는 제10도에 도시되어 있다.
이 일차 구조는 그레이등이 보고한 IFI cDNA의 구조와 일치하며, 단 아미노산 위치 140이 CAA(Cln)대신에 CGA(Arg)로 암호화되어 있다.
일차 구조에서, 이 플라스미드는 IFI 단백질을 전부 암호화한 영역을 포함하고 있음은 확실하다. 이러한 사실은 이.콜라이와 같은 숙주가 플라스미드에 삽입된 DNA 서열을 또다른 발현 플라스미드로 전달하여 면역 인터페론의 생성을 가능케 해준다는 것을 나타낸다.
[실시예 6]
900bp BstN 1 단편을 IFI의 암호화 서열 430bp 및 3'-비암호화 영역 470bp를 포함하는 pHIT 3709로부터 분리한다. 이 단편에서는 IFI의"시그널" 부분의 서열 및 완성된 단백질의 처음 3개 아미노산에 대한 코돈이 존재하지 않는다. 결손 코돈을 복구하고 개시 Met 코돈을 제공하기 위해서, 합성 올리고뉴클레오타이드를 제조하여 900bp 단편에 연결시킨다(제11도 참조). 합성부분이 BstN 1 말단 둘다를 EcoR 1 말단으로 전환시킨다. 생성된 단편을 EcoR 1에 의해 제한된 벡터 pRC 22내로 클로닝시킨다. 삽입체의 배향을 3'-암호화 영역내에서 절단하는 Bg1Ⅰ으로 제한 분석하여 결정한다.
IFI 유전자를 포함한 pRC 22벡터(pRC 22/IFI-900으로 표시됨)를 프로모터 유전자 연결부위를 따라 서열분석하여 모든 연결단계가 예상대로 일어났는지 확인한다(제11도 참조).
IFI 유전자의 발현을 시험하기 위해서, 이.콜라이 균주 RRI(pRK 248 cIts/pRC 22/IPI-900)을 3-4×108세포/M9-글루코즈 배지중의 30℃에서 배양시켜 3-4×108세포/ml의 농도로 증식시킨 다음, 42℃에서 1시간 유도시킨다. 유도에 앞서, 추가의 글루코즈 및 카사미노산을 각각 1.0% 및 0.5%씩 가한다. 10ml 샘플을 취하여 원심분리시켜 세포를 모으고, 50mM 트리스(pH 7.4) 0.1ml, 10% 자당중에 재현탁시킨 다음 현탁액을 드라이아이스/에탄올욕중에서 신속히 냉동시킨다. 세포를 20℃에서 녹인다음 빙욕으로 옮긴다.
NaCl 100mM, EDTA 10mM, 스페르미딘 20mM 및 라이소자임 200㎍/ml를 가한다. 혼합물을 얼음물에서 45분간 방치한 다음 37℃에서 2분간 배양시킨다. 세포조각을 원심분리하여 제거하고 상등액을 WISH 세포상에서 IFI 항바이러스 활성에 대하여 검정한다. 이 초기 시험은 세포 추출물 ml당 IFI 활성 1280 단위의 수율로 생성된다.
유도의 동력학을 측정하기 위하여 상기 과정을 반복한다. 샘플하나를 대조군으로 하여 30℃에 방치하고, 다른 샘플을 42℃에서 30, 60, 90, 120 및 180분간 유도시킨 후 취한다. 샘플을 상술한 방법으로 진행시킨다. 표4에 나타난 결과에서, 30℃에서는 활성이 나타나지 않으며 뒤이은 42℃에서의 유도후 탐지된 활성양은 약 90분쯤에서 최대이면서 점차로 감소된다는 것을 보여준다.
[표 4]
Figure kpo00012
[실시예 7]
pRC 22/IFl-900 DAN를 EcoR 1으로 제한시키고 IFI이 함유된 900bp 단편을 분리하여 EcoR 1에 의해 제한된 pRC 23내에 삽입시킨다(제12도), 생성된 작제물 pRC 23/IFI-900은 pRC 22/IFI내의 RBS외는 현저히 다른 RBS를 함유한다(제11도 및 제12도를 비교). IFI 유전자의 발현을 시험하기 위해서, 균주 RRI(PRf 248 clts, pRC 23/1Fl-900)을 M9-글루코즈 배지중의 30℃에서 배양하여 304×108세포/ml 농도로 증식시킨 다음 42℃에서 1시간 동안 유도시킨다. 유도전에, 추가의 글루코즈 및 카사미노 산을 각각 1.0 및0.5%로 가한다. 10m1샘플을 취하여 원심분리시켜 세포를 모으고, 50mM 트리스(pH 7.4) 0.1ml, 1.0%자당중에 재현탁시키고, 현작액을 드라이아이스/에탄올욕에서 신속히 냉동시킨다. 세포를 20℃에서 녹인다음 빙욕으로 옮긴다. NaCl 100mM, EDTA 10mM, 스페르미딘 20mM 및 라이소자임 200㎍/ml를 가한다. 혼합물을 얼음에서 45분간 방치한 다음, 37℃에서 2분간 배양시킨다. 세포조각을 원심분리하여 제거하고 상등액을 WISH 세포상에서 IFI 항바이러스 활성에 대해 검정한다.
이.콜라이 균주 RR 1을 형질전환시키는데 pRC 23/IFI를 사용할 경우, 표 5에 나타낸 바와같이 pRC 22/IFI보다 IFI활성이 약 4배 크다.
[표 5]
Figure kpo00013
[실시예 8]
pRC 23/IFI를 두부위중 단지 하나만이 절단되는 조건하에서 EcoR 1으로 제한시킨다. 생성된 분자를 클레노우 폴리머라제 I으로 처리하여 EcoR 1 말단을 채운다. 평활말단을 T4DNA 리가제로 연결시키구 DNA를 사용하여 RRI(PRK 248 cTts)를 형질전환시킨다. 형질전환체를 IFI 유전자의 출발위치에 EcoR 1부위의 손실에 대하여 스크린하고 2개의 양성형질 전환체를 수득한다.
이중에 pRC 231/1Fl-900으로 표시되는 하나를 사용하여, 이.콜라이 균주 RR 1을 형질전환시켜 IFI를 발현시킨다. IFI 유전자의 발현을 시험하기 위해서, 이 균주 RRI(pRK 248 cIts, pRC 231/1Fl-900)을 M9-글루코즈 배지중의 30℃에서 배양시켜 3-4× 108세포/ml의 농도로 증식시킨 다음 42℃에서 1시간 동안 유도시킨다. 유도하기 전에, 추가의 글루코즈 및 카사미노 산을 각각 1,0 및 0.5%로 가한다. 샘플 10ml를 취하여 원심분리시켜 세포를 모으고 0.1ml의 50mM트리스(pH 7.4). 10% 자당중에 재현탁시키고 현탁액을 드라이아이스/에탄올욕중에서 신속히 냉동시킨다. 세포를 20℃에서 녹인 다음 빙욕에 옮긴다.
NaCl 100mM, EDTA 10mM, 스페르미딘 20mM 및 라이소자임 200㎍/m1를 가한다. 혼합물을 얼음위에서 45분간 방치한 다음 37℃에서 2분간 배양시킨다. 세포조각을 원심분리하여 제거하고 상등액을 WISH 세포상에서 IFI 항바이러스 작용에 대하여 검정한다. 그 결과는 표 5에 나타내었다.
기술된 pRC 23/IFI는 링커영역이 6 내지 10 확장되어 변형되도록 고안되었다. LeIF-A 발현 벡터에 대한 동일한 변형으로 10 내지 20배의 발현 증가 결과가 얻어졌다. IFI의 경우, 6bp의 거리는 IFI의 발현에 대하여 10bp보다 더욱 양호한 것으로 나타난다.

Claims (10)

  1. a) 박테리오파아지 λ로부터 유도된 프로모터 및 오퍼레이터 DNA 서열, 하이브리드 리보좀 결합부 위의 암호화 DNA 서열 및 인터페론의 암호화 DNA 서열을 포함하는 인터페론을 발현할 수 있는 벡터로숙주 유기체를 형질전환시키고, b) 형질전환된 숙주 유기체를 배양증식시켜 발현 벡터의 인터페론 유전자에 의해 암호화된 인터페론을 생성시키며, c) 형질전환된 유기체를 용해시키고, d) 생성된 용해물로부터 인터페론을 회수함을 특징으로 하여, 인터페론을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 숙주 유기체가 λ 박테리오파아지로부러 유도된 온도 민감성 리프레서 단백질의 암호화 돌연변이 cI 리프레서 유전자를 염색체상에 함유하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계(a)에서 사용된 발현 벡터가 λ 박테리오파아지로부터 유도된 온도 민감성 리프레서 단백질의 암호화 돌연변이 cI 리프레서 유전자를 함유하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계(a)후에 또는 단계(a)와 동시예 숙주 유기체를 λ 박테리오파아지로부터 유도된 온도 민감성 리프레서 단백질의 암호화 돌연변이 cI 리프레서 유전자를 발현시킬 수 있으며 단계(a)의 발현 벡터와 완전히 양존가능한 독립된 복제벡터로 형질전환시키는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 숙주 유기체를 약 30℃ 내지 약 36℃의 온도에서 배양증식시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계 b) 바로직전에 배양온도를 온도 민감성 리프레서 단백질이 불활성화 되는 온도까지 상승시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 온도 민감성 리프레서 단백질이 완전히 불활성화되는 온도가 약 37℃ 내지 약 42℃인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계 c)의 용해과정을 효소적으로 수행하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 인터페론을 크로마토그래피로 회수하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 크로마토그래피가 항체친화성 크로마토그래피인 방법.
KR1019830003155A 1982-07-12 1983-07-11 인터페론의 제조방법 KR900005776B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US397388 1982-07-12
US397,388 1982-07-12
US06/397,388 US4582800A (en) 1982-07-12 1982-07-12 Novel vectors and method for controlling interferon expression

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR840005490A KR840005490A (ko) 1984-11-14
KR900005776B1 true KR900005776B1 (ko) 1990-08-11

Family

ID=23570982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019830003155A KR900005776B1 (ko) 1982-07-12 1983-07-11 인터페론의 제조방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4582800A (ko)
EP (1) EP0099084B1 (ko)
JP (2) JPS5928479A (ko)
KR (1) KR900005776B1 (ko)
AT (1) ATE43635T1 (ko)
DE (1) DE3379959D1 (ko)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0088540A3 (en) * 1982-02-22 1984-10-17 Biogen, Inc. Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides
IL68100A0 (en) * 1982-03-24 1983-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Novel dna and use thereof
JPH0787797B2 (ja) * 1982-05-20 1995-09-27 サントリー株式会社 ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法
EP0114777B1 (fr) * 1983-01-21 1990-08-01 Transgene S.A. Nouveaux vecteurs d'expression et leur application à la préparation d'une protéine ayant l'activité de l'antitrypsine-alpha 1 humaine
FR2541579B1 (fr) * 1983-02-24 1987-12-18 Inst Organicheskogo Sinteza Ak Interferon n leucocytaire humain et procede d'obtention de celui-ci dans les cellules bacteriennes
JPH0740925B2 (ja) * 1983-03-14 1995-05-10 協和醗酵工業株式会社 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド
FR2556365B1 (fr) * 1983-12-09 1987-07-31 Transgene Sa Vecteurs de clonage et d'expression de l'interferon-g, bacteries transformees et procede de preparation de l'interferon-g
JPS60172999A (ja) * 1983-12-20 1985-09-06 Suntory Ltd 新規な塩基性ポリペプチドおよびその製造法
ATE66251T1 (de) * 1983-12-23 1991-08-15 Pfizer Expressionsplasmide fuer die herstellung eines heterologen proteins in bakterien.
US4935370A (en) * 1983-12-23 1990-06-19 Pfizer Inc. Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria
US4711845A (en) * 1984-08-31 1987-12-08 Cetus Corporation Portable temperature-sensitive control cassette
US5248666A (en) * 1984-03-23 1993-09-28 Oncogen Methods for inhibiting neoplastic cell proliferation using platelet factor 4
WO1985005618A1 (en) * 1984-06-06 1985-12-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for preparing interferon derivative
BE901119A (fr) * 1984-11-23 1985-03-15 Wallone Region Procede de preparation de plasmides vecteurs capables de transformer un hote bacterien escherichia coli et d'y promouvoir et controler l'expression d'un adn heterologue.
US4772555A (en) * 1985-03-27 1988-09-20 Genentech, Inc. Dedicated ribosomes and their use
US5618715A (en) * 1985-12-20 1997-04-08 Oncogen Limited Partnership Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity
GB8701848D0 (en) * 1987-01-28 1987-03-04 Celltech Ltd Polypeptides
SU1703692A1 (ru) * 1987-02-09 1992-01-07 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека
JPH01503513A (ja) * 1987-03-02 1989-11-30 オンコゲン 血小板関連増殖調節剤
DE3711881A1 (de) * 1987-04-08 1988-10-27 Merck Patent Gmbh Verfahren zur herstellung von glucosedehydrogenase aus bacillus megaterium
US5250415A (en) * 1987-04-08 1993-10-05 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Process for the preparation of glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium
JPS6463395A (en) 1987-05-04 1989-03-09 Oncogen Oncostatin m and novel composition having antitumor activity
JP2970811B2 (ja) * 1987-10-30 1999-11-02 オンコゲン ア リミテッド パートナーシップ 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム
CA1335357C (en) * 1987-10-30 1995-04-25 Timothy M. Rose Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells
EP0314184B1 (en) * 1987-10-30 1995-12-13 Bristol-Myers Squibb Company Expression plasmids
US5268284A (en) * 1988-03-11 1993-12-07 The Upjohn Company Ribosome binding site
GR1002113B (en) * 1988-09-02 1996-02-02 Oncogen Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells
US5726039A (en) * 1994-07-21 1998-03-10 Yissum Research Development Co. Of The Hebrew University Of Jerusalem Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures
ES2178101T3 (es) * 1994-12-09 2002-12-16 Imp College Innovations Ltd Genes de virulencia en la region vgc2 de salmonella.
GB9712370D0 (en) * 1997-06-14 1997-08-13 Aepact Ltd Therapeutic systems
EP1970449B1 (en) * 1998-09-04 2010-11-03 Emergent Product Development UK Limited Attenuated salmonella SPI2 mutants as antigen carriers
GB9910812D0 (en) * 1999-05-10 1999-07-07 Microscience Ltd Vaccine composition
GB0008419D0 (en) * 2000-04-05 2000-05-24 Bioinvent Int Ab A method for invitro molecular evolution of antibody function
GB0008966D0 (en) 2000-04-13 2000-05-31 Imp College Innovations Ltd Vectors for gene therapy
GB0217033D0 (en) 2002-07-23 2002-08-28 Delta Biotechnology Ltd Gene and polypeptide sequences
GB0226105D0 (en) * 2002-11-08 2002-12-18 St Georges S Entpr Ltd Pain relief agents
GB0304993D0 (en) * 2003-03-05 2003-04-09 Univ Nottingham Trent Novel screening method
US8420087B2 (en) * 2004-01-05 2013-04-16 Antisoma Research Limited Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
GB0420091D0 (en) * 2004-09-10 2004-10-13 Univ Nottingham Trent Medical implant materials
US20060193849A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
GB0514661D0 (en) * 2005-07-16 2005-08-24 Medical Res Council Methods
DE602005016112D1 (de) 2005-09-05 2009-10-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumorassoziierte Peptide, die HLA Klasse I oder II-Moleküle binden, und anti-Tumor Impfstoffe
ATE461214T1 (de) 2005-09-05 2010-04-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumor-assoziierte peptide, welche an unterschiedliche menschliche leukozytenantigene der klasse ii binden
GB0519398D0 (en) * 2005-09-23 2005-11-02 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
GB0607354D0 (en) * 2006-04-12 2006-05-24 Bioinvent Int Ab Agent, Composition And Method
GB0607798D0 (en) * 2006-04-20 2006-05-31 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides and use thereof
US20090181115A1 (en) * 2006-05-31 2009-07-16 Wendy Filsell Method of Screening for Compounds That Alter Skin and/or Hair Pigmentation
US8080634B2 (en) 2007-07-27 2011-12-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunogenic epitope for immunotherapy
CA2694808C (en) 2007-07-27 2015-10-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against neuronal and brain tumors
ES2399088T3 (es) 2007-11-01 2013-03-25 Perseid Therapeutics Llc Polipéptidos y ácidos nucleicos inmunosupresores
US20100249373A1 (en) * 2007-11-27 2010-09-30 Richard Martin Ogborne Screening methods
PL2105501T3 (pl) 2008-03-27 2016-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Innowacyjna immunoterapia przeciwko nowotworom neuronów i mózgu
DK2119726T5 (en) 2008-05-14 2018-03-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel and powerful MHC class II peptides derived from survivin and neurocan
WO2009158240A1 (en) 2008-06-16 2009-12-30 Emergent Product Development Uk Limited Salmonella vectored vaccines against chlamydia and methods of use
DK2172211T3 (en) 2008-10-01 2015-02-16 Immatics Biotechnologies Gmbh Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of glioblastoma (GBM) and other cancers
GB0905790D0 (en) 2009-04-03 2009-05-20 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides and use thereof
WO2011079902A2 (en) 2009-12-18 2011-07-07 Biolnvent International Ab Biological materials and uses thereof
GB201019331D0 (en) 2010-03-19 2010-12-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Methods for the diagnosis and treatment of cancer based on AVL9
GB201004551D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201020995D0 (en) 2010-12-10 2011-01-26 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
GB2490655A (en) 2011-04-28 2012-11-14 Univ Aston Modulators of tissue transglutaminase
GB201115280D0 (en) 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
GB201219678D0 (en) 2012-11-01 2012-12-12 Benf Ab Ketone body inhibitors and uses thereof
US9624527B2 (en) 2013-03-01 2017-04-18 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Quantification of vaccine compositions
TWI777197B (zh) 2013-08-05 2022-09-11 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物（六）
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
GB201408255D0 (en) 2014-05-09 2014-06-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML)
GB201411037D0 (en) 2014-06-20 2014-08-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemai (CLL)
GB201501017D0 (en) 2014-12-23 2015-03-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
GB201507030D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
GB201507719D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers
GB201511546D0 (en) 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
MA42294B1 (fr) 2015-07-01 2020-11-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers
PT3319985T (pt) 2015-07-06 2021-01-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novos péptidos e combinação de péptidos para uso em imunoterapia do cancro do esófago e outros cancros
GB201513921D0 (en) 2015-08-05 2015-09-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers
GB201522667D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
GB201602918D0 (en) 2016-02-19 2016-04-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against NHL and other cancers
CN116375797A (zh) 2016-03-01 2023-07-04 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于膀胱癌和其他癌症免疫治疗的肽、肽组合物和细胞类药物
PL3430037T3 (pl) 2016-03-16 2022-12-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfekowane komórki t oraz receptory komórek t do stosowania w immunoterapii przeciwnowotworowej
TWI826891B (zh) 2016-03-16 2023-12-21 德商英麥提克生物技術股份有限公司 轉染 t 細胞和 t 細胞受體用於癌症免疫治療
BR112018070067A2 (pt) 2016-04-06 2019-02-12 Immatics Biotechnologies Gmbh peptídeos e combinações de peptídeos para uso em imunoterapia contra lma e outros cânceres
TWI796299B (zh) 2016-08-26 2023-03-21 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於頭頸鱗狀細胞癌和其他癌症免疫治療的新型肽和支架
MA47367B1 (fr) 2017-01-27 2023-06-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers
TW201841937A (zh) 2017-04-10 2018-12-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於白血病和其他癌症免疫治療的新穎肽和肽組合物
US11427614B2 (en) 2017-04-10 2022-08-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination thereof for use in the immunotherapy against cancers
CN111548405A (zh) 2017-04-10 2020-08-18 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于癌症免疫治疗的肽及其肽组合物
CA3068852A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against lung cancer, including nsclc, sclc and other cancers
WO2019007974A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Immatics Biotechnologies Gmbh NOVEL PEPTIDES AND COMBINATION OF PEPTIDES FOR USE IN IMMUNOTHERAPY OF LUNG CANCER, INCLUDING NSCLC, CPPC AND OTHER CANCERS
DE102018107224A1 (de) 2018-02-21 2019-08-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
TW202016131A (zh) 2018-05-16 2020-05-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於抗癌免疫治療的肽
US10925947B2 (en) 2018-06-29 2021-02-23 Immatics Biotechnologies Gmbh A*03 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods
TW202019955A (zh) 2018-07-31 2020-06-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 B*07 限制肽和肽組合的抗癌免疫治療和相關方法
US11945850B2 (en) 2018-09-17 2024-04-02 Immatics Biotechnologies Gmbh B*44 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods
TW202024121A (zh) 2018-09-18 2020-07-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 A*01 限制肽和肽組合物在抗癌免疫治療中的用途和相關方法
TW202039535A (zh) 2018-12-18 2020-11-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 B*08限制肽和肽組合物抗癌免疫治療和相關方法
TW202229312A (zh) 2020-09-29 2022-08-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 由非ｈｌａ－ａ*０２顯露以用於不同類型癌症之免疫治療的醯胺化肽及其脫醯胺化對應物
DE102020125457A1 (de) 2020-09-29 2022-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
TW202241925A (zh) 2021-01-15 2022-11-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於不同類型癌症免疫治療的ｈｌａ展示肽

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8000127A (nl) * 1979-01-15 1980-07-17 Harvard College Werkwijze voor het vormen van prokaryotische of eukaryotische proteinen alsmede een daarbij toepasbaar gekoppeld gen.
SE8101665L (sv) * 1980-03-17 1981-09-18 Harvard College Polypeptidframstellning
ES500966A0 (es) * 1980-04-03 1982-12-16 Biogen Nv Un metodo de producir un polipeptido que muestra una actividad immunologica obiologica de interferon de fibroblasto hu- mano.
PH22618A (en) * 1980-06-06 1988-10-28 Biogen Nv Improved vectors and method for making such vectors and for expressing cloned genes
ZA814375B (en) * 1980-07-01 1982-07-28 Hoffmann La Roche Interferons and process for their preparation
DK489481A (da) * 1980-11-10 1982-05-11 Searle & Co Plasmidvektor og frmgangsmaade til fremstilling deraf
IL68100A0 (en) * 1982-03-24 1983-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Novel dna and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP0099084A2 (de) 1984-01-25
JPH0248235B2 (ko) 1990-10-24
JPH0141312B2 (ko) 1989-09-05
DE3379959D1 (en) 1989-07-06
EP0099084B1 (de) 1989-05-31
JPS5928479A (ja) 1984-02-15
EP0099084A3 (en) 1985-01-09
ATE43635T1 (de) 1989-06-15
US4582800A (en) 1986-04-15
JPS60149397A (ja) 1985-08-06
KR840005490A (ko) 1984-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR900005776B1 (ko) 인터페론의 제조방법
JP2659530B2 (ja) ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造
Paluh et al. High level production and rapid purification of the E. coli trp repressor
HU197349B (en) Process for producing cloning vectors usable for the expression of growth hormones
Filutowicz et al. Autorepressor properties of the π-initiation protein encoded by plasmid R6K
PL149079B1 (en) Method of obtaining polypeptides of ifn-beta type
JPS62501538A (ja) ａｒａＢプロモーターを含有する複製可能な発現ビヒクル
US4795706A (en) Novel expression control sequences
NZ206700A (en) Improvement in genetic production of proteins using promoter/operator/ribosome binding site sequence
US5063158A (en) Recombinant DNA expression vector comprising both transcriptional and translational activating sequences
EP0146901B1 (en) A promotor and use thereof
EP0534705A2 (en) Expression of low molecular weight recombinant polypeptides
EP0314184B1 (en) Expression plasmids
US5576190A (en) Bacteriophage Lambda pL promoters
KR940004543B1 (ko) 이.콜라이의 trp 발현 시스템을 갖는 벡터를 제조하는 방법
WO1990004026A1 (en) New plasmid constructions for high level production of eukaryotic proteins
CA1307482C (en) Vectors and expression sequences for production of polypeptides
EP0471514A2 (en) Improved bacteriophage lambda pL promoters
KR890002417B1 (ko) 대장균에 인간의 면역 인터페론(Hu-IFN-γ) 생산특성을 부여하는 플라스미드 pKB-1000-γ의 제조방법
JPH0928380A (ja) ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子
EP0493926A1 (en) A method for enhancing the structural stability of recombinant DNA expression vectors
JP2628883B2 (ja) 魚類の成長ホルモン遺伝子、該遺伝子の組換え体プラスミド、該組換え体プラスミドを含む徴生物、該徴生物による魚類の成長ホルモンの製法及び該成長ホルモンによる魚類の成育促進法
KR890003086B1 (ko) 유전자 재조합 기술에 의한 사람 알파 인터페론의 제조방법
KR880002319B1 (ko) 유전자 조환에 의한 사람알파 인터페론의 제조방법
EP0547873A2 (en) A novel translational activating sequence

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
G160 Decision to publish patent application
O035 Opposition [patent]: request for opposition
J2X1 Appeal (before the patent court)

Free format text: APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

Free format text: TRIAL NUMBER: 1992201000272; APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

E701 Decision to grant or registration of patent right
O073 Decision to grant registration after opposition [patent]: decision to grant registration
NORF Unpaid initial registration fee