KR880002319B1 - 유전자 조환에 의한 사람알파 인터페론의 제조방법 - Google Patents

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Description

유전자 조환에 의한 사람알파 인터페론의 제조방법

제1도는 알파 인터페론 코딩 유전자의 양말단부위 변형방법의 개략도이고,

제2도는 tac프로모우터에 알파인퍼페론 코딩 유전자를 삽입시키는 방법에 관한 개략도이며,

제3도는 tac프로모우터 부위 및 이의 재조합 플라스미드 내에서의 인터페론의 위치를 나타내는 개략도이다.

본 발명은 조환 DNA 기술(Recombinant DNA Technology)을 이용하여 재조합된 합성유전자를 조작하므로써 인체의 성숙백혈구 인터페론을 제조하는 방법에 관한것으로, 목적하는 단백질 특히 인체의 성숙 백혈구 인터페론을 코딩하는 유전자의 발현을 효율적으로 하기 위하여 유전자를 강력한 프로모우터(promoter)에 삽입시키고 이를 대장균에서 다시 안정하게 하여준 후, 형질 전환된 미생물을 성장시켜 목적하는 인체의 성숙 백혈구 인터페론이 발현되도록 함을 그 특징으로 하는 것이다.

인체의 백혈구 인터페론(Le IFN)은 이삭과 린텐만 (proc. R.SOC. BIochem. 147, 258-267(1957))에 의해 최초로 발견되어 항바이러스 작용이 있음이 밝혀진 이래, 현재까지 이것의 성격을 규명하고 정제하려는 노력이 계속되어 오고 있는 실정이다. 이 인터페론은 이의 표적세포에 작용하여 이웃한 다른 세포에 바이러스의 감염을 막을 수 있는 일련의 단백질군으로 세포증식억제 및 면역반응을 조절할 수 있는 특징이 있다.

따라서, 인터페론의 이와같은 작용을 이용하여 바이러스성 질환 및 악성종양 치료제로서 백혈구 인터페론을 임상적으로 사용하기 위한 많은 노력이 이루어져 왔다.

백혈구 인터페론은 분자량이 약 17,500에서 21,000 범위에 있는 것으로(Rubinstein etal., PNAS, USA76, 640-644, 1979, Zoon etal., ibid, 76, 5601∼5605, 1979).

최근에는 조환 DNA 재조합기술의 발전에 따라 그 특성 규명 및 대량생산에 획기적인 전기를 가져오게 되었다.

(Nagata etal., Nature, 284, 316-320, 1980, Mantei etal., Gene 10, 1-10, 1980, Taniguchi etal., Nature, 285, 547-549, 1980).

조환형 재조합 DNA의 기술을 이용하면 단백질을 코딩하는 유전인자를 분리하여 인위적으로 합성하고 이를 플라스미드라는 유전 운반체를 사용하여 대장균과 같은 숙주세포의 형질을 전환시키므로써 미생물로 하여금 고등동물의 단백질을 발현하여 생성하게 할수 있다.

그러나 일반적으로 사용되는 플라스미드 바이클(Vehicle)을 그대로 사용할 경우, 형질전환의 빈도가 극도로 약하고 단위 g당 단백질의 활성도가 낮기때문에 강력하면서도 인위적으로 조절할수 있는 프로모우터 사용의 필요성이 대두되었다.

이와같은 프로모우터에는 trp등을 사용하는 것이 통례로 되어 있으나 이 trp프로모우터를 사용하면 배지에의 trp농도를 조절하거나 고갈시켜야 하는 번거로움뿐만 아니라 그 수율이 낮은 단점이 있었다.

또한, 비독성 유전인자 생성물의 과량생성물의 과량생산은 숙주세포에 해로우므로 숙주-백터시스템의 안전성을 감소시키고 클로운화 유전인자의 복제, 해독능력을 감소시키므로 박테리아 성장중에 표시를 개선하도록 조절하여야 하였으나, tac프로모우터를 사용할 경우에는, 이러한 욕구를 충족 시킬수 있어 숙주의 사멸없이 유전인자 생성물인 인터페론을 다량으로 획득할 수 있었다.

따라서 본 발명은 이러한 조절인자의 조절방법과 이러한 벡터가 소유하고 있는 클로닝 부위에 맞게 클로닝 하고자 하는 유전자의 양말단위를 변형시켜 합성된 백혈구 인터페론을 코딩하는 유전자를 tac(trp-lac)프로모우터에 연결시키므로써 프로모우터의 조절을 용이하게 함은 물론, 형질발현의 빈도까지도 높일 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

여기에서 tac프로모우터는 trp과 lac의 합성 프로모우터로서 전사개시점(transcription initiation site)에서 역으로 각각 -35와 -10에 위치하고 있으며 작동유전자(operator)를 연결하여 둠으로써 프로모우터의 발현을 조절할 수 있게 된것이다.

이와같은 구조로 되어있는 tac프로모우터는 trp에 비해 상당히 강한 RNA 폴리머라제(polymerase)친화성을 지니고 있으므로 삽입된 유전자의 발현빈도를 그만큼 높일수 있는 것이다.

따라서 본 발명은 클로운화 유전자의 발현을 IPTG를 사용하므로써 유도할 수 있었다.

인터페론을 코딩하는 유전자를 공지의 플라스미드인 tAC프로모우터 벡터에 클로닝하기 위해서는 코딩 유전자의 클로닝부위의 효소학적, 분자생물학적 변형이 필수불가결한 것으로 여러가지 공지의 방법이 사용될 수 있으나 본 발명에서는 가능한 모든 방법을 사용할 수 있었다.

아가로스 전기영동에 의해 분리된 인터페론을 코딩하는 유전자의 말단부위는 접합말단(Cohesive end)을 지니고 있으며 이는 제한요소인 EcoRIo이나, EcoRI와 Pstl를 동시에 처리하였을 경우에도 모두 적용된다.

따라서 본 발명에서는 이 접합말단을 제거하기 위해 효소나 T₄DNA 폴리머라제를 사용하여 유전말단부위를 변형시키고, 변형된 말단부위를 다시 클로닝 부위의 상보성을 위해 T₄DNA 폴리머라제 및 8개의 합성 뉴클레오티드로 구성된 링커를 사용하여 변형시키므로써 단백질을 코딩하는 유전자의 인터페론 말단부위를 효소학적으로 변형시킬 수 있었다. (제1도 참조).

본 발명의 숙주세포로는 사용 가능한 상당수가 본 발명의 숙주-벡터 컴비네이션에 사용된다. 특정숙주의 선택은 기술상 알려진 요소의 수에 따라 결정되는 것으로, 요소의 예로는 단백질의 독성, 사용된 벡터의 안정성, 목적하는 단백질의 회수용이성, 표시성질 및 생체내에서의 안전성등을 들수 있다. 일반적으로 이러한 제한 내에서 유용하게 사용하는 숙주로는 E. Coli, 슈도모나스, 바실러스 섭틸리스 및 이스트, 펀지, 동물 또는 식물 숙주들로 본 발명에 사용된 숙주는 E. Coli JM 103(KFCC 10187) (△lac pro, thi, str A, ead A, SbcB 15, hsd R4, SuPE, F'tra D36, pro AB, lac I^q, Z△M15)이다.

이 균주는 숙주내의 조절자인 I위치에 돌연변이 된 것으로서 보통이 숙주보다 약10배 정도 많은 조절인자가 생성되므로 tac프로모우터내의 조절위치인 오퍼레이터와 반응하므로써 삽입 유전자의 초기과잉 생산을 제어할 수 있으며, IPIG (Isopro- pylthio-β-galactoside)를 사용하므로서 목적 단백질 합성물의 발현을 유도할수 있는 것이다.

본 발명에서 구성된 재조합 플라스미드는 기존의 tac프로모우터 함유벡터에 인터페론 코딩 시퀸스를 삽입시킨것을 특징으로 하는 것으로, 우선 tac프로모우터 함유벡터를 제한 효소 Bam Hl으로 처리한후, 카프인테스타인 알칼라인 포스타제(Calq Intestine Alkcline phosphatase, 이하 CLAP라 한다)로 처리하여 준비된 인터페론 코딩 유전자를 T₄DNA리가제를 사용하여 재조합 시키므로써 재조합된 플라스미드는 앰피실린에 저항성이 있으며 조건에 따라 인터페론의 생성을 유도할 수 있는 것이다.

따라서 본 발명은 제2도와 제3도와 같이 인터페론 코딩 유전자를 함유하는 tac프로모우터 벡터의 재조합을 이룰수 있었다.

이와같이 구성된 재조합 플라스미드는 lac(오퍼레이트)에 조절인자가 결합되어 있으므로 E.Coli 균주에 형질을 도입시킨후, 인터페론의 생성을 유도하기 위하여 IPTG를 사용하면 전사를 일으킬 수 있기 때문에 강력하게 인터페론의 생성을 유도할수 있는 것이다.

즉 본 발명에서는 lac프로모우터 및 lac프로모우터 함유벡터에 인터페론 유전자를 삽입시키고 이를 IPTG를 사용하여 인터페론의 형질발현을 유도할 수 있었다.

따라서 제2도 및 제3도와 같은 본 발명의 최종 재조합 플라스미드는 다음과 같은 특징을 갖게 되는 것이다.

1) 앰피실린에 내성을 가지며, 2) tac프로모우터를 함유하므로 trp프로모우터, lac프로모우터, lac오퍼레이터등을 포함하고 3) 말단부위가 변형된 인터페론 코딩 유전자를 가지며, 4) IPTG를 사용함에 의한 인터페론의 생성을 유도할수 있는 5) 근원유전자이다.

상술한 바와같이 본 발명에 의해 제조된 재조합 플라스미드를 공지의 방법에 따라 염화칼슘으로 처리된 대장균에 삽입시켜 형질이 전환된 본 발명의 사용균주(KFCC 10187)를 얻고 이를 IPTG가 함유된 배지에서 배양하면 주생성물로 인터페론을 얻을 수 있었다.

따라서, 본 발명은 알파인터페론 코딩 유전자를 전기 영동 분리하여 목적하는 벡터에 연결하기 위해 클로닝 부위를 T₄DNA폴리머자제로 처리한후, 여기에 BamHl 링커를 사용하여 적절히 조작한 알파 인터페론 코딩유전자를 BamHl 및 CIAP로 처리된 tac프로모우터를 함유한 클로닝 벡터의 정확한 위치에 클로닝시키고 이 tac프로모우터를 함유한 벡터를 대장균에 삽입, 형질을 전환시켜 DNA-DNA접합방법으로 선별하여 우수한 균주(KFCC 10187)를 사용하여 인터페론의 발현을 유도하는 방법이다.

또한, 본 발명을 이용하면 클로닝 부위가 다른 여러단백질 코딩 유전자를 tac벡터에 삽입하므로써 최종 목표로하는 단백질의 형질 발현을 유도할 수도 있는 특징을 갖는다.

다음의 실시예에서 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다.

[실시예1]

알파인터페론 코딩 유전자의 말단부위 변형

알파인터페론을 코딩하는 유전자 함유벡터로부터 제한효소 EcoR1를 사용하여 절단한후, 0.8% 아가로스 전기영동하여 분리하고, 이 유전자를 페놀과 클로로포롬을 1 : 1로 혼합한 유기용매를 사용하여 추출한후, Sephadex G-50 스펀칼럼 크로마토 그래피하여 잔재 아가로스를 완전히 제거하였다.

이 유전자에 2배의 차가운 에탄올을 첨가하고 -20℃에서 하룻밤 냉동보관 하였다가 1200rpm에서 1시간 동안 원심분리하였다. 에탄올을 완전히 제거한후 여기에 각각 33mM 트리스-아세테이트(pH 7.9), 66mM 포타슘아세테이트, 10mM 마그네슘아세테이트, 5mM 디티오트레이톨, 1㎎/㎖ BSA로 완충용액 시스템을 맞춘다음, 4개의 서로 다른 데옥시 뉴클레오티드를 첨가한후 T₄DNA폴리머라제를 사용하여 37℃에서 20분간 중합반응 시켰다.

이 반응물을 상술한 페놀 추출 및 에탄올에 침전시킨다음, 몰비가 1 : 5가 되도록 화학합성된 BamHl링커를 사용하여 25mM 트리스 염산염(pH 7.4), 5mM마그네슘클로라이드, 5mM디티오트레이톨, 0.25mM스퍼민, 1mM ATP의 완충용액 시스템하에서 T₄DNA폴리머라제를 사용하여 중합반응시킨 다음, 이 반응물을 다시 제한효소 BamHl 에 맞는 공지된 완충용액 시스템으로 사용하여 바꾼후 다시 BamHl을 사용하여 37℃에서 하룻밤 방치시켜 사용되지 않거나 중합접합된 BamHl을 완전히 소화 시켰다.

이를 다시 1%아가로스 전기영동하여 BamHl 링커가 붙어있는 알파인터페론 유전자만을 분리하여 회수 하였다. 알파인터페론 코딩 유전자의 말단에 BamHl링커의 접합여부를 비방사선동위원소법으로 확인하기 위해, 상기 유전자를 다시 50mM 트리스염산염(PH 7.4), 10mM 마그네슘 클로라이드, 10mM 디티오트레이롤, 0.5mM 스퍼민, 2mM ATP의 완충용액 넣어 T₄DNA 폴리머라제를 사용하여 자체 중합반응시켜 1%의 아가로스 전기 영동을 걸었을때 다중체의 밴드가 확인됨으로써 접합되었음을 알았다.

[실시예 2]

tac 프로모우터 함유벡터의 준비

tac프로모우터를 함유한 벡터를 제한효소 BamHl으로 완전 소화 하였다. 이는 2㎍벡터를 37℃에서 2시간 반응 시키고 완충용액은 공지된 시스템을 사용한 것이다.

이때 반응 비율은 반응액 40㎍에 제한효소 10단위를 사용하였다.

반응이 완결된후 0.8%의 아가로스 전기영동으로 완전히 소화됨을 확인한 다음, 페놀/클로로포름법으로 추출한후 2배의 차거운 에탄올을 -20℃에서 하룻밤 방치 하였다가 상술한 에탄올을 침전법으로 원심분리하여 침전시켰다.

이를 50㎍의 50mM 트리스염산염 (pH 7.4)에 용해시킨후, 약 50 단위의 CIAP를 사용하여 5'말단부위의 인산을 제거하여 상기 페놀 추출법과 에탄올 침전법을 사용하여 순수한 클로닝벡터를 준비하였다. 이 벡터를 알파인터페론 코딩 유전자의 삽입 클로닝벡터로 사용하였다.

[실시예 3]

알파인터페론 코딩 유전자와 tac프로모우터를 함유한 벡터와 연결

실시예1과 실시예2에서 각각 준비된 뉴클레오티드를 실시예1과 같이 반응시켜 재조합플라스미드를 합성하였다.

이때 두 뉴클레오타이드를 상기 반응용액에 동량 혼합하였으며 이의 연결을 확인하기 위해 반응액을 소량 취하여 1% 아가로스 전기영동법으로 표준시료와 함께 분석하였다.

[실시예 4]

형질 전환 및 재조합 유전자의 분석

실시예3에서 얻어진 재조합 플라스미드를 Mandel etal. (J.Mol. Bial 53, 159-162, 1970)의 방법 및 Kushner(In Gene, Eng Ed by Boyer etal. 1978)의 방법을 변형하여 대장균에 형질전환하고 이를 앰피실린 50㎍/㎖이 함유된 배지에서 내성을 보이는 균주만을 선별하였다. 이 선별균주로 부터 tac프로모우터 뒷부분에 알파인터페론 코딩유전자를 가지고 있는 재조합 플라스미드 포함 균주(KFCC 10187)만 선택적으로 선별하기 위하여 Grum Stein 과 Hogness(PNAS, 72, 3961, 1975) 및 Rigby etal, (J. MOL. Biol, 113, 237, 1977)방법을 변형하여 인시튜 콜로니하이브리디제이션(in Situ Colony Hybridization)을 실시하였다. 이때 사용된 프로브는 실시예 1에서 제조된 알파인터페론 코딩 유전자 전사이즈를 사용하였다.

[실시예 5]

형질전환된 균주(KFCC 10187)에서의 알파인터페론의 발현

비독성 단백질의 과잉생산은 세포의 사활에 영향을 주므로 본 발명에서는 실시예 4에서 선별된 균주의 알파인터페론 코딩 유전자의 형질발현을 유도하기 위해 하룻밤 배양시킨 배양액을 신선한 배지에 옮겨준후, 흡광도 600에서 0.6일때 100mM 의 IPTG를 첨가하였다.

IPTG는 비메타볼라이트이므로 계속 되풀이 사용할수 있으나 IPTG대신에 락토스를 첨가한 경우에는 사용상 불편이 있었다. 이후 각시간마다 10³의 세포를 분리하여 7M의 구아니딘 염산염으로 세포를 파괴한후 알파인터페론을 수득하였다.

Claims (1)

1. 알파 인터페론 코딩 유전자의 양쪽 말단부위를 T₄DNA폴리머라제로 효소학적 변형을 가하여 블런트(blunt)로 하고 여기에 화학 합성된 BamHl링커를 접합시키고 이를 BamHl으로 효소 처리하여 적절히 조작된 tac프로모우터가 함유된 클로닝 벡터에 연결시킨 다음 재조합 플라스미드를 제조한후, 이를 대장균에 형질전환시켜 얻어진 균주(KFCC 10187)를 IPTG 및 기타 유발물질을 포함하는 배지에서 배양하여 알파인터페론을 수득함을 특징으로 하는 유전자 조환에 의한 사람 알파인터페론의 제조방법.

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