SU1703692A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека - Google Patents
Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека Download PDFInfo
- Publication number
- SU1703692A1 SU1703692A1 SU874191345A SU4191345A SU1703692A1 SU 1703692 A1 SU1703692 A1 SU 1703692A1 SU 874191345 A SU874191345 A SU 874191345A SU 4191345 A SU4191345 A SU 4191345A SU 1703692 A1 SU1703692 A1 SU 1703692A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- interferon
- ppr
- gene
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к микробиологической и медицинской промышленности. Цель - повышение уровн фибробластного интерферона (б 1) человека в клетках штамма-продуцента . Сконструирована рекомби- нантна плазмида pPR-IFN/3 1-13, котора обеспечивает регулируемый синтез фибробластного интерферона человека в клетках E.coli под контролем промоторно-оператор- ной области PRORбактериофага А. С помощью плазмиды pPR-lFN / 1-13 получен штамм E.coli ВНИИГенетика vl.903 (pPR-IP№1-13), продуцирующий фибробластный интерфе- рон в количестве 2 -109 международных ед. интерферона на 1 л бактериальной культуры , что составл ет около 10% от суммарного клеточного белка. 3 с.п. ф-лы. (/)
Description
Изобретение относитс к микробиологической и медицинской промышленности, молекул рной биологии и генно-инженер- ной биотехнологии и представл ет собой сконструированную рекомбинантную плаз- мидную ДНК. обеспечивающую микробиологический синтез фибробластного интерферона человека, способ ее конструировани и штамм E.coli, содержащий эту рекомбинантную плазмиду,- продуцент/ I- интерферона человека.
Целью изобретени вл етс повышение уровн фибробластного интерферона человека в клетках штамма-продуцента.
Нова плазмида /3 1-13, котора имеет длину около 3.9 тыс.н.п.. обеспечивает экспрессию гена IFN/3 под контролем регул торной области PROR бактериофага Я, состоит из большого (,4 т.н.п.) ВамН1-Вд1 Н-фрагмента векторной плазми- ды pPR124, модифицированной введением в ее состав олигонуклеотидного BgLII-лин- кера, и ЕсоР -5аиЗА-фрагмента плазмиды plN /3-trp-7 длиной 510 н.п.
Способ конструировани рекомбинзнт- ной плазмиды pPR-IFN/ 1-13 заключаетс в том, что в состав вектора pPR124 с помощью олигонуклеотидного линкера ввод т уникальный участок узнавани рестриктазы BgLII, затем образующуюс таким образом плазмиду pPR124B расщепл ют рестрикци- онными эндонуклеазами EcoRI и Bglfl и
4 О
Ч
Ю
ю
провод т соединение большего из образующихс фрагментов векторной молекулы с ЕсоШ-ЗаиЗА-фрагментом, содержащим кодирующую часть зрелого/ 1-интерферона из плазмиды plN/ -trp7, в полученной таким образом рекомбинантной плазмиде pPR- IFN/ 1-123 провод т сближение SD-после- довательности гена его и первого кодона/3 I интерферона, дл чего плазмидную ДНК гидролизуют рестриктазой BamHI, удал ют часть нуклеотидов с помощью экзонуклеаз- ной активности ДНК-полимеразы | E.coli, расщепл ют ДНК рестриктазой EcoRJ, обрабатывают Sf-эндонуклеазой с последующим полным восстановлением двуцепочечных концов с помощью, Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы j E.coli и обеспечивают циклизацию образовавшихс линейных молекул ДНК ДНК-лигазой фага Т4. Полученным препаратом трансформируют клетки E.coli С.600, отбирают трансформанты на среде с ампициллином при культивировании клеток при 28°С с последующей селекцией на пониженную скорость роста при 42°С. Из отобранных таким образом клонов выдел ют плазмидную ДНК.
Штамм E.coli ВНИИгенетика V4 903 (pPR-IFN ft 1-13), регистрационный номер 1825,в коллекции культур микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков - продуцент фиб- робластного $ 1) интерферона человека.
Штамм получают трансформацией E.coli ВНИИгенетика VL903 (ВКПМ В-3546) рекомбинантной плазмидой pPR-IFN уЗ 1-13 с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде с ампициллином при 28°С и определением активности фибробласт- интерферона в экстрактах клеток Фонсформантов после дерепрессии PR- промотора, достигаемой культивированием ojiai ма в течение 1-12 ч при 42°С. В качестве реципиента могут быть также использованы штаммы E.coli C600, E.coli ВНИИгенетика VL 902 и другие производные E.coli K12.
Штамм E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-JFN/3 ИЗ) характеризуетс следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки пр мые, палочковидной формы (1,2-1,6) х х(2,0-6,0) мкм, слабоподвижные, способные к образованию нитевидных форм, грамотри- цательные, неспороносные.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на плотных и жидких простых синтетических, полусинтетических и комплексных средах. При росте на агаризован- ном бульоне Хоттингера или L-бульоне
образуют ослизненные, круглые, слабоматовые колонии. При выращивании в жидких средах типа L-бульона или М9 с казамино- выми кислотами образуют равномерную взвесь.
Физиологе-биохимические признаки. Клетки способны к росту в диапазоне 5- 40°С (оптимум 35°С) при рН 6,7-7,5. В качестве источника углерода используют
аминокислоты и углеводы (например сахарозу ). Источником азота могут служить минеральные соли в аммонийной форме, а также органические соединени в виде пептона , триптона, дрожжевого экстракта и
аминокислот.
Устойчивость к антибиотикам. Штамм устойчив к ампициллину в концентрации до 100 мг/л при выращивании в жидких и на агаризованных питательных средах.
Стабильность плазмиды. При хранении клеток на агаризованной среде (сроком до одного мес ца), при серии последовательных пересевов(в течение не менее 6 мес цев) и в процессе глубинного культивировани в жидкой среде с антибиотиком не происход т потери и перестройки плазмиды .
П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pPR-lFN/3 1-13.
Рекомбинантную плазмид у pPR-IFN/)- 13 получают в несколько этапов.
Этап Г - конструирование векторной плазмиды pPR124B.
3 мкг ДНК плазмиды pPR124 расщепл ют рестриктазой Xba.l в 70 мкл буфера дл рестрикции - I, содержащего 10 мМ трис- HCI, рН 7,9, 6 мМ MgCl2, 6 мМ 2-меркаптоэ- танола, 150 мМ NaCI. ДНК переосаждают двум объектами этанола. Осадок раствор ют в 15 мкл Н20. Достройку одноцепочных 3-концевых участков ДНК провод т обработкой Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы lE.coli в пробе объемом 20 мкл, содержащей 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 10 мМ
MgCl2, 2 мкг препарата ДНК, по 30 мкМ дезоксирубонуклеозидтрифосфатов, 5 ед. феомента, ДНКиз реакционной смеси переосаждают этанолом и раствор ют в 100 мкл Н20.
Воссоединение линеаризованной плаз- мидной ДНК с Bgfll-линкерами провод т при 16°С в течение 12 ч с помощью ДНК-ли- газы фага Т4 в пробе, содержащей буфер дл лигиоовани (60 мМ трис-HCI рН 7,6,
10 мМ MgCla, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,4 мМ АТФ), 2 мкг плазмидной ДНК и 0,5 мкглинкеров. После проведени лигиро- вани ДНКиз реакционной смеси осаждают этанолом, раствор ют и подвергают ферментативному гидролизу рестриктазой в пробе объемом 40 мкл, содержащей буфер дл рестрикции - 2 (6 мМ трис-HCI рН 7,6, б мМ MgCl2, 6 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ NaCI). ДНК вновь осаждают этано- лом, раствор ют, 1 мкг препарата плаз- мидной ДНК в 240 мкл буфера дл лигировани обрабатывают ДНК-лигазой Т4. Полученной смесью трансформируют клетки E.coli C600.
Эффективность трансформации составл ет до 5-10 колоний на 1 мкг нативной плазмиды pPR124. Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину (100 мкг/мл), из них выдел ют плазмидную ДН К и используют ее дл рестрикционного анализа. В результате получают плазмиду pPR124B, котора в отличии от исходной векторной молекулы pPR124 содержит уникальный участок расщеплени Bgfll вместо имевшейс последовательности узнавани .
Этап 2 - конструирование промежуточной плазмиды pPR-IFN/З И23.
В состав вектора pPR124B интегрируют кодирующую последовательность фиброб- ластного интерферона человека из плазмиды pJN/ -trp-7. Дл этого 10 мкг ДНК /3-trp-7 обрабатывают совместно рестрикта- зами E.coRj и ЗаиЗА в пробе объемом 100 мкл, содержащей буфер дл рестрикции - 2. Полученный препарат нанос т на гель 1 1 %- ной легкоплавкой агарозы и подвергают электрофорезу в трис-ацетатной буферной системе. Полоску гел , содержащую фрагмент ДНК длиной 510 н.п.. вырезают и ДНК элюируют из гел .
Полученный таким образом фрагмент ДНК ( 1 мкг) интегрируют в плазмиду PPR124B. Дл чего 1 мкг ДНК pPR124B расщепл ют рестриктазами EcoRI и Bgfll в пробе объемом 20 мкл в буфере дл рестрикции - 2. Полученный препарат подвергают фенольной депротеинизации, ДНК осаждают этанолом и раствор ют в 10 мкл Н20-0,5 мкг ДНК расщепленной плазмиды pPR124B объедин ют с 1 мкг выделенного фрагмента плазмиды plN/ -trp-7 и обрабатывают ДНК-лигазой Т4 в пробе объемом 30 мкл, в буфере дл лигировани . Полученным препаратом ДНК провод т трас- формацию клеток E.coli C600 с отбором трансформантов на среде с ампициллином с последующей селекцией Cm -клонов на среде с 200 мкг/мл хлорамфеникола при культивировании клеток при 42°С.
Из отобранных таким образом клонов выдел ют плазмидную ДНК и исследуют с помощью рестрикционного анализа. В полученной плазмиде E.coRI - Bgfll-фрагмент.
кодирующий С-концевую часть хлорамфе- николацетилтрансферазы в составе векюра pPR124B, замещен на кодирующую последовательность зрелого / -интерферона
человека, Данна плазммда обозначена pPR-IFN/31-123.
Этап 3 - конструирование плазмиды pPR-IFN I-13.
30 мкг ДНК плазмиды pPR-IFN /3 j-123
расщепл ют рестриктазой ВагпН в 150 мкл буфера дл рестрикции - 1, ДНК подвергают фенольной депротеинизации и осаждают этанолом. Осадок раствор ют в 40 мкл НаО. Дл ограниченной деградации ДНК с помощью У -5 экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы 1 E.coli полученный препарат ДНК инкубируют в пробе объемом 150 мкл, содержащей 50 мМ трис-HCI, рН 8,0, М ЭДТА; 5 мМ MgCl2. 100 мкМ ДАТФ,
а затем дГТФ и 20 ед. ДНК-полимеразы. Реакцию останавливают, провод т переосаждение ДНК и осадок вновь раствор ют в 40 мкл НаО. 10 мкг полученного препарата обрабатывают рестриктазой E.coRI в 50 мкл
буфера дл рестрикции - 2, провод т фе- нольную депротеинизацию, осаждение ДНК этанолом и раствор ют осадок в 30 мкл.
Удаление однонитевых концевых участ
ков полученного препарата ДНК провод т при помощи эндонуклеазы 1 в пробе объемом 100 мкл, содержащей 30 мМ СНзСООМа, рН 4,4г4,5 мМ ZnS04, 250 мМ NaCI, 10 мкг ДНК, 200 ед. Sl-эндонуклеазы.
Реакцию провод т при 20°С, после чего смесь подвергают фенольной обработке и переосаждению нуклеиновой кислоты этанолом . Осадок раствор ют в 20 мкл ЬЬО. 4 мкг полученного таким образом препарата
ДНК обрабатывают Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 E.col в указанных услови х дл достройки возможно имеющихс одноцепочечных концов молекул до двухцепочечных. Реакцию останавливают
фенольной депротеинизацией, нуклеиновые кислоты осаждают этанолом и раствор ют в 20 мкл Н20.
Лигирование линейных молекул ДНК с двуцепочечными концами провод т при
16°С в пробе объемом 50 мкл, содержащей 60 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ MgCl2. 1C мМ дитиотреитол, 4 мМ АТФ, 8%-ный полиэти- ленгликоль - 6000. 4 мкг ДНК, 100 ед. ДНК- лигазы Т4. После завершени реакции
пробу разбавл ют водой в четыре раза и провод т осаждение нуклеиновых кислот этанолом. 2 мкг растворенной в НаО ДНК обрабатывают рестриктазой ВдП в 30 мкл буфера дл рестрикции - 2. ДНК осаждают
из реакционной смеси этанолом, раствор ют в воде и обрабатывают ДНК-лигазой Т 4 в 200 мкл буфера дл лигировани .
Полученный препарат ДНК используют дл трансформации клеток E.coli C600 указанным образом с последующей селекцией трансформантов на среде с ампициллином при культивировании клеток в течение суток при 28°С. Среди полученных трансформантов отбирают варианты, обладающие пониженной способностью к росту при 42°С. Из указанных клонов выдел ют плазмидную ДНК, указанным образом и подвергают ре- стрикционному анализу.
Дл установлени первичной структуры гибридного участка св зывани рибосом перед геном FN ft 1 в полученной плазмиде pPR-iFN/ ИЗ 30 мкг соответствующей ДНК обрабатывают рестриктазой HlndM в 100 мкл буфера дл рестрикции - 2, нанос т на градиентный (4-12%) полиакриламидный гель. Электрофорез провод т в трис-ацетат- ной буферной системе.
Фрагмент ДНК длиной-190 н.п. элюиру- ют из гел по методу Максама-Гилберта, к нему присоедин ют с помощью ДНК-лигазы Т4 BamHJ-линкеры Callaborative Research (США)аналогично указанному способу. ДНК переосаждают этанолом, осадок раствор ют в 20 мкл НаО, расщепл ют рестриктазой ВатНГ в 30 мкл буфера дл рестрикции - 1, депротеинизируют фенолом, осаждают этанолом и раствор ют в НаО.
Молекул рное клонирование образующегос при расщеплении BamHj фрагмента ДНК в составе репликативной формы ДНК бактериофага М13 тр 10, селекци реком- бинантных фагов на индикаторной среде, содержащей 5-бром-4-хлор-3-индолил- /3 -D-галактозид (X-gal), выделение одноцепо- чечной фаговой ДНК и определение первичной структуры клонированного фрагмента с помощью метода ограниченного матричного копировани (метод Ф.Сенгера) осуществл етс в соответствии с хорошо разработанными стандартными методами. Установленна методом Сенгера нуклеотид- на последовательность гибридного участка св зывани рибосом в составе плазмиды pPR-IFN 1-13 вл етс следующей: 5 -...TAAGGAGGTTGGATG...-3 , где TAAGGAGGT - SD-последовательность гена его фага A, a ATG - метиониновый кодон {$ -интерферона.
П р и м е р 2. Получение штамма E.coli ВНИИгенетика VE. 903 (pPR-IFN fi 1-13) - продуцента фибробластного интерферона человека.
Плазмиду pPR-IFN ft j-13, кодирующую синтез фибробластного интерферона человека , трансформацией ввод т в клетки штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 из коллекции ВНИИгенетика (регистрационный номер ВКПМ В-3546 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов). Эффективность трансформации клеток E.coli ВНИИгенетика VL 903 составл ет около
10 клонов на 1 мкг нативной ДНК плазмиды pPR-IFN/ J-13. Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), после культивировани клеток в течение суток при 28°С. Из отобранных
клонов выдел ют плазмидную ДНК и подтверждают ее идентичность препарату ДН К pPR-JFN/3i-13 с помощью рестрикционного анализа. Полученный штамм E.coli ВНИИгенетика VL903 (pPR-iFN/H-13) депонирован
во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов.
П р и м е р 3. Определение продуктивности штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IFN/ J-13) - продуцента фибробластного интерферона человека.
Дл определени продуктивности штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR- IFN /J 1-13) плазмидсодержащие клетки выращивают при 28°С на скошенной
агаризованной стандартной среде Хоттин- гера, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 14 ч. Выросшую на кос ках биомассу используют дл получени посевного материала. Дл этого клетки перенос т в
колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 100 мл среды Хоттингера, со 100 мкг/мл ампициллина и выращивают при 28°С на качалке при 240 об/мин в течение 6 ч. Оптическа плотность посевной культуры
составл ет 1,5-2,5 ед.
Ферментацию провод т в ферментере, оснащенном системами дл регулировани рН, температуры, скорости перемешивани и аэрации. Дл ферментации используют
среду Хоттингера со 100 мкг/мл ампиципли- на и 10 г/л глюкозы. Посевную культуру внос т в количестве 5-10%. Культивирование осуществл ют при рН 6,6-6,8, поддержива этот уровень подачей аммиачной воды. Первую часть ферментации до 0. Дб50 3,5 провод т при 28°С, а затем осуществл ют термоиндукцию, повыша температуру до 42-45°С в течение 5 мин, после чего продолжают ферментацию еще 2 ч при той же гемпературе .
После окончани процесса дл определени активности интерферона клетки из 1 мл культуральной жидкости осаждают центрифугированием , осадок ресуспендируют в
1 мл 1 %-ного раствора додецилсульфата натри в 0,02 М фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 1% 2-меркаптоэтанола, и прогревают 2-4 мин при 100°С. После этого осадок отбрасывают центрифугированием и активность интерферона, содержащегос в надосадочной фракции; определ ют стандартными методами или по защите диплоидных фибробластов человека от цито- патического действи вируса везикул рного стоматита, или методами иммуноферментного анализа. В качестве стандартов используют препараты /J -интерферона (Тогеу, Япони ), оттитрованные по стандарту лейкоцитарного интерферона МРСВ 69/19 (Великобритани ) или Р9 (СССР).
По различным методам определени активность фибробластного интерферона человека , синтезируемого в клетках штамма E.coli ВНИИгенетика VL903 (pPR-lFNyS-13), составл ет более 2-10 международных ед./л бактериальной культуры.
Дл определени доли синтезированного фибробластного интерферона от суммарного клеточного белка клетки из 1 мл культуральной жидкости осаждают центрифугированием и обрабатывают указанным образом, препарат раздел ют электрофорезом в присутствии 0,1 % додецилсульфата натри в 15%-ном полиакриламидном геле. Белки, разделенные в полиакриламидном геле, прокрашивают в растворе Кумасси Р-250. Количественное содержание белков в зонах определ ют после сканировани гел на автоматическом лазерном денситометре KB 2202 фирмы KB (Швеци ). Идентификацию зоны, соответствующей синтезированному в клетках зрелому фибробластному интерферону (19 кД), провод т на основе сравнени с электрофоретической подвижностью маркерных белков, а также с помощью имму- ноблотинга разделенных белковых фракций на нитроцеллюлозные фильтры и идентификации зоны интерферона с помощью обработки фильтров в растворах, содержащих мышиные моноклинальные антитела против -интерферона и антимышиные кроличьи антитела , конъюгированные с пероксидазой из хрена. После соответствующей процедуры окрашивани зона интерферона выгл дит темной полосой коричневого цвета на неокрашенном фоне нитроцеллюлозного фильтра.
Содержание белка в зоне, соответствующей ft 1-интерферону. составл ет около 10% от суммарного белка плазмидсодержа- щих клеток E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IFN/8l -13).
Таким образом, изобретение в услови х крупномасштабного культивировани клеток Escherichia coli позвол ет достичь выхода более 2 х 109 ед./л, что соответствует 5-10% от общего клеточного белка.
Claims (3)
1. Рекрмбинантна плазмидна ДНК pPR-IFN/ ИЗ, кодирующа синтез фибробластногоинтерферона/50 )человека, длиной около 3,9 тыс.н.п., содержаща
BamHJ-BgLII-фрагмент векторной плаз- миды pPR 124 (размером 3,4 т.н.п.), модифицированный введением в ее состав
олигонуклеидного BgLII линкера, EcoRf- ЗапЗА-фрагмент длиной 510 н.п. плазмиды pJN/ -tvp7, который содержит участок, ответственный за инициацию репликации и ее регул цию,- CoLEI-репликон (ovi CoLEI),
ген репрессора cltS 857 фага Я, , ген устойчивости к ампициллину (Арг), Тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd(tfd),
регул торную область (РкОк),
SD-последовательность гена его (SDcro), кодирующую последовательность зрелого фибробластного интерферона человека (TFN/J I) с собственным метиониновым кодоном (f-Met),
соединение регул торной области гена его А, кодирующей части / 1-интерферона и терминаторов транскрипции fd, которое осуществлено так, что перед геном JFN/JI образован гибридный участок св зывани рибосом, имеющий следующую нук- леотидную последовательность: 5 -... TAAGGAGGTTGGATG... -3 , где TAAGGAGGT - SD-последовательность гена его фага, АТС - метиониновый кодон интерферона, а непосредственно за терминирующим кодоном гена iFN /3 расположен тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd,
уникальные участки узнавани рестриктаз cLal, координата которого вл етс началом отсчета (0), Pvui (1110), BgLII (-1480). АсеТН870), Pvul (J360).
2. Способ конструировани рекомби- нантной плазмиды pPR-lFN/3 T-13, заключающийс в том. что в состав pPR 124 с помощью олигонуклеотидного линкера ввод т уникальный участок узнавани рестрик- тазы BgLII. в результате получают плазмиду pPR124B, которую затем расщепл ют рестрикционными эндонуклеазами EcoRl и BgLII, провод т соединение большего из образующихс фрагментов векторной молекулы с EcoR -Sau3A фрагментом плазмиды pJN ft -trp7, содержащим кодирующую
часть зрелого j-интерферона, в полученной таким образом рекомбинантной плаз- миде провод т сближение SD-последо- вательности гена его и первого (метионино- вого) кодона ft -интерферона. дл чего плазмидную ДНК гидролизуют рестрикта- зой BamHI, удал ют часть нуклеотидов с помощью экзонуклеазной активности ДНК- полимеразы I, про вл ющейс в услови х неполного набора нуклеозидтрифосфатов в реакционной смеси, ферментативно расщепл ют ДНК рестриктазой EcoR l. обрабатывают Sl-эндонуклеазой дл удалени одноцепочечных участков ДН К и последующего полного восстановлени двуцепо- чечных концов с помощью Кленовского
фрагмента ДНК-полимеразы E.coli и обеспечивают циклизацию образующихс линейных молекул ДНК ДНК-лигазой фага Т4, полученным таким образом препаратом трансформируют клетки E.coli C600 с отбором трансформантов на среде с ампицилли- ном при культивировании клеток при 28°С с последующей селекцией клонов, обладающих пониженной скоростью роста при 42°С, после чего из отобранных клонов выдел ют рекомбинантную плазмидную ДНК pPRHFN /SI-13.
3. Штамм бактерий Escherichia coli ВНИИА 1825 - продуцент фиброблэстно- го (/ I) интерферона человека.
0
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU874191345A SU1703692A1 (ru) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека |
| CH381588A CH676996A5 (ru) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | |
| DE19883890050 DE3890050T1 (de) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | Rekombination-plasmid-dns ppr-ifn(beta)1-13 die die synthese des menschlichen fibroblast-(beta)1-interferons kodiert, verfahren zum konstruieren derselben und stamm der bakterien |
| JP50208988A JPH01502478A (ja) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | 線維芽細胞のヒトβ１―インターフェロンの合成をコードする組換えプラスミドＤＮＡ ｐＰＲ―ＩＦＮβ１―１３、それの操作方法、および同プラスミドＤＮＡを含有する、ヒトβ１―インターフェロンを生産する大腸菌 |
| PCT/SU1988/000033 WO1988005819A1 (en) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IFNbeta1-13, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN FIBROBLAST beta1-INTERFERON, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFNbeta1-13) AS PRODUCER OF HUMAN beta1-INTERFERON, CONTAINING IT |
| HU881692A HUT50871A (en) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | Process for producing recombinant plasmid dna encoding human fibroblast-beta 1-interferon and escherichia coli comprising same |
| NL8820103A NL8820103A (nl) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | Recombinant plasmide dna - phr-ifnbeta 1-13 coderende synthese van fibroblastisch humaan beta1-interferon, werkwijze ter bereiding ervan en een stam van de bacterie escherichia coli vniigenetika vl 903 (phr-ifnbeta1-13), die humaan beta1-interferon vormt, die dit bevat. |
| FI884556A FI884556A0 (fi) | 1987-02-09 | 1988-10-04 | Rekombinantplasmid-dna ppr-ifn 1-13, som kodas foer syntes av maenniskans fibroblast- 1-interferon, foerfarande foer framstaellning daerav och e.coli innehaollande detta. |
| SE8803567A SE8803567L (sv) | 1987-02-09 | 1988-10-07 | Rekombinantisk, syntesen av maenniskofibroblast-beta-interferon kodande p lasmid-dnappr-ifn beta -13, foerfarande foer konstryering av naemnda plasmid-dna och maennisko-beta 1-interferon-producerande, naemnda plasmid-dna innehaallande bakteriestam av arten escherichia coli vniigenetika v1 903 (ppr-ifnbeta-13) |
| GB8823728A GB2208866A (en) | 1987-02-09 | 1988-10-10 | Recombinant plasmid dna ppr-ifn¼-13, coding for synthesis of human fidroblast ¼-1 interferon, and strain of bacteria escherichia coli vniigenetika vl903 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU874191345A SU1703692A1 (ru) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1703692A1 true SU1703692A1 (ru) | 1992-01-07 |
Family
ID=21284355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU874191345A SU1703692A1 (ru) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01502478A (ru) |
| CH (1) | CH676996A5 (ru) |
| FI (1) | FI884556A0 (ru) |
| GB (1) | GB2208866A (ru) |
| HU (1) | HUT50871A (ru) |
| NL (1) | NL8820103A (ru) |
| SE (1) | SE8803567L (ru) |
| SU (1) | SU1703692A1 (ru) |
| WO (1) | WO1988005819A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0593792B2 (en) * | 1992-10-14 | 2004-01-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine |
| EA013263B1 (ru) * | 2004-12-20 | 2010-04-30 | Кадила Хелзкэр Лимитед | Способ получения интерферона-бета |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
-
1987
- 1987-02-09 SU SU874191345A patent/SU1703692A1/ru active
-
1988
- 1988-02-08 WO PCT/SU1988/000033 patent/WO1988005819A1/ru active Application Filing
- 1988-02-08 NL NL8820103A patent/NL8820103A/nl unknown
- 1988-02-08 CH CH381588A patent/CH676996A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-08 JP JP50208988A patent/JPH01502478A/ja active Pending
- 1988-02-08 HU HU881692A patent/HUT50871A/hu unknown
- 1988-10-04 FI FI884556A patent/FI884556A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-10-07 SE SE8803567A patent/SE8803567L/ not_active Application Discontinuation
- 1988-10-10 GB GB8823728A patent/GB2208866A/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Nucleis acids Research, 1983, v. 11, p. 467-4688. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI884556A (fi) | 1988-10-04 |
| JPH01502478A (ja) | 1989-08-31 |
| SE8803567D0 (sv) | 1988-10-07 |
| CH676996A5 (ru) | 1991-03-28 |
| NL8820103A (nl) | 1989-01-02 |
| HUT50871A (en) | 1990-03-28 |
| WO1988005819A1 (en) | 1988-08-11 |
| GB8823728D0 (en) | 1988-12-07 |
| GB2208866A (en) | 1989-04-19 |
| FI884556A0 (fi) | 1988-10-04 |
| SE8803567L (sv) | 1988-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4666848A (en) | Polypeptide expression using a portable temperature sensitive control cassette with a positive retroregulatory element | |
| US7588755B1 (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human fibroblast interferon-like polypeptides | |
| US5089400A (en) | Polypeptides and process for the production thereof | |
| US4792523A (en) | 3'Expression enhancing fragments and method | |
| JPH0248235B2 (ru) | ||
| CZ282154B6 (cs) | Lidský imunitní interferon a jeho derivát, isolát DNA se sekvencí kodující lidský imunitní interferon, rekombinantní klonovací vektor, replikovatelný expresní vektor, rekombinantní mikroorganismus nebo buněčná kultura, farmaceutický přípravek, způsob výroby lidského imunitního interferonu a jeho použití | |
| NL8104400A (nl) | Microbiele bereiding van menselijk fibroblast interferon. | |
| NZ204384A (en) | Alpha-interferon encoding plasmids and nucleotide sequences;production of alpha-interferon by recombinant dna technology | |
| AU2001284914B2 (en) | Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides | |
| Thummel et al. | Properties of simian virus 40 small t antigen overproduced in bacteria | |
| AU2001284914A1 (en) | Phage-dependent Superproduction of Biologically Active Protein and Peptides | |
| EP0147178B1 (en) | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria | |
| SU1703692A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека | |
| US5037744A (en) | Process for the microbiological preparation of human serum albumin | |
| HU194316B (en) | Process for preparing alpha-l human leukocyte interferone | |
| EP0133321B1 (en) | Dna gene, process for production thereof and plasmid containing the same | |
| EP0279665B1 (en) | A method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby | |
| GB2104901A (en) | Expression vectors | |
| Carter et al. | A comparison of DNA cleavage by the restriction enzymes SalPI and PstI | |
| SU1703693A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека | |
| EP0183571A2 (en) | Cosmid vectors | |
| WO1992019737A1 (en) | Process for producing a monocyte chemotactic factor polypeptide and a strain for the production thereof | |
| CA1275954C (en) | 3'-expression enhancing fragments and method | |
| EP0113372A1 (en) | Vector | |
| Champness et al. | Bacteriophage T4 gol site: sequence analysis and effects of the site on plasmid transformation |