JPH01502478A - 線維芽細胞のヒトβ１―インターフェロンの合成をコードする組換えプラスミドＤＮＡ ｐＰＲ―ＩＦＮβ１―１３、それの操作方法、および同プラスミドＤＮＡを含有する、ヒトβ１―インターフェロンを生産する大腸菌 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 線維芽細胞のヒトβ１−インターフェロンの合成をコードする組み換えプラスミ ドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３、それの操作方法、および同プラスミドＤ ＮＡを含有する、ヒトβ１−インターフェロンを生産する大腸菌ＶＮＩＩＧｅｎ ｅｔｉｋａＶＬ　９０３（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３）　株発明の分野 本発明は、遺伝子操作およびバイオテクノロジーの技術に関し、そしてより詳し くは、線維芽細胞のヒトβ１−インターフェロンの合成をコードする新規な組み 換えプラスミドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３、それの調製方法、および同 プラスミドＤＮＡを取り込んでいる、ヒトβ１−インターフェロンの生産体であ る大腸菌ＶＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３　（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３ ）株に関する。 先行技術 インターフェロンは、ウィルス感染または種々の誘導因子の作用に応じて、分化 したヒト細胞により合成されるタンパク質である。現時点で入手できる実験デー タは、個々の細胞、組織および全体として生体の処理におけるインターフェロン の抗ウィルス作用、抗細菌増殖作用および免疫調節作用を指摘している。それの 多方面にわたる特徴および生体にとっての重要性に関して、インターフェロンの 機構が免疫機構と比較できる。抗原と同じく、生物学的および化学的特性並びに それらを生産する細胞の種類に依存して、ヒトのインターフェロンは３つのグル ープ：α−白血球、β−線維芽細胞、γ−免疫に分類され、これらはそれぞれ主 に白血球、線維芽細胞およびＴ−リンパ球により生産される。 現在までの医療におけるインターフェロンの通用の範囲は−ａに限定される。こ れらの適用は、角膜炎および皮膚病、種々のウィルス（インフルエンザ、アデノ ウィルス）により誘導される呼吸感染、Ｂ型肝炎などの治療である。 しかしながら、インターフェロンの作用のしくみ、それらの構造的および機能的 特徴並びにそれらの臨床上の可能性は、まだ十分に研究されていない、このこと は、主として、タンパク源としてのヒトの細胞の誘導的培養法の利用に基づ〈従 来の方法により分取量の°純粋なインターフェロンを得ることの難しさに関係し ている。さらに、この場合に合成されたインターフェロンは、概して、構造的お よび機能的特徴において異なっている形態および異なるサブタイプの混合物を含 んで成る。 手順として細胞の利用に基づく、特に新しい遺伝子環境にある異種遺伝子の発現 を保証する組み換えプラスミドを含有する大腸菌、枯草菌、シュードモナス菌の 種々の菌株の利用に基づく、ヒトのインターフェロンα、βおよびＴの調製方法 が多数知られている。線維芽細胞のヒトインターフェロン（ＩＦＮβ１）の場合 は、大腸菌の細胞においてＩＦＮβ１遺伝子の発現を保証するために大腸菌の遺 伝子（ｔｕｆ　Ｂ　、ｒｅＣＡ）およびオペロン（ｌａｃ　ＵＶ　５ｔｒｐ）並 びにコリファージ（ＰＬ　λ）の、転写および翻訳のシグナルの支配下に成熟イ ンターフェロンのコード部分を設定して使用される。微生物学的合成の結果とし て合成される成熟β１−インターフェロン（約１９．０００ダルトンの分子量を 有する）は、炭化水素成分のないこと、およびメチオニンの代わりにＮ−ホルミ ルメチオニン末端残基が得られ得ることにより特徴づけられる。しかしながら、 この相違は、線維芽細胞において生産される天然の糖タンパク質と比較した場合 、ＩＦＮβ１遺伝子のタンパク質生成物の生物学的活性に変化をきたすものでは ない、この微生物学的方法により合成されるβ１−インターフェロンは、細胞レ セプターとの相互作用の分子機構の研究のためおよび医療においての両方に利用 され得る。 線維芽細胞のヒトのβ１−インターフェロンの合成をコードする組み換えプラス ミド、例えばｐｃ１８５７およびｐＰＬ　ｃ　２４５ＨＦＩＦ２５、並びにこれ らのプラスミドを含有する大腸菌５Ｇ４０４４株が当業界において知られている （Ｒｅｍａｕｔ　Ｅ、、５ｔａｕｓｓｅｎｅｓＰ、、Ｆｉｅｒｓ　Ｇ、、１９８ ３．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄａ　Ｒｅｓ、１１．４６７７−４６８８）　。 組み換えプラスミドＤＮＡ　ｐＰＬ　ｃ２４５ＨＦＩＦ２５におけるＩＦＮβ１ 遺伝子の転写は、バクテリオファージλの制御機構ＰＬｏＬにより調節され、そ して該遺伝子のタンパク質生産物の翻訳の開始は、？ｉＳ２ファージのレプリカ ーゼ遺伝子のＳＤ配列に基づきリポソームが結合するハイブリッド領域の操作に よって行われる。上記に指定した菌株の培養により保証されるヒトβ１−インタ ーフェロンの最大収率は、プラスミドを含有する大腸菌細胞の全タンパク質の４ ％である。 前記の菌株は、Ｐ、プロモーターの助けでなされるＩＦＮβ１遺伝子の調節され た発現が、そこに配置された温度感受性遺伝子を制御するｃｌｔｓ８５７を有す る付加的プラスミドｐｃ１８５７を必要とすることにより特徴づけられる。この ことは、プラスミドｐｃ１８５７およびｐＰＬ　ｃ２４５ＨＦＩＦ２５との間の 相同領域で（７）ｒｅｃＡ−依存性の組み換えのために、大スケールの生産にお ける菌株の培養条件下で組み換えプラスミドの潜在的不安定さを生む。さらに、 リポソームが結合するハイブリッド領域の構成のためにＭＳ２ファージのレプリ カーゼ遺伝子の比較的短いＳＤ配列を使用することで、線維芽細胞のインターフ ェロンの転写開始の際のリポソームとの有効な相互作用が不十分であるために大 腸菌の転写機構の潜在的力を十分に発揮することが不可能になる。一方、プラス ミドｐＰＬ　ｃ２４５ＨＰＩＦ２５においてＩＦＮβ１遺伝子の３′端領域にρ −非依存性の転写ターミネータ−がないことは、複製能力の有意な減少をもたら し、そしてＩＦＮβ１遺伝子の転写開始をになうλファージの高効率のＰＬプロ モーターの抑制条件下で組み換えプラスミドの減少さえも起こり得る。 このこと全てが、ＩＦＮβ１遺伝子産物の高レベルな生合成を達成できなくし、 そして大スケールでの培養の際に生産菌株のバイオマス中のβ１−インターフェ ロンの含量のさらなる低下を生み、従って純粋なタンパク質の回収を複雑にしそ して所望の生産物の収率を低下させる。 発明の開示 組み換えプラスミドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３、それの操作の方法オヨ ヒソレヲ含有する大腸菌株ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３　（ｐＰＲ −ＩＦＮ９１−１３）は、新規でありそして今までの文献がら未知のものである 。 本発明は、線維芽細胞のヒトβ１−インターフェロンの合成をコードする新規な 組み換えプラスミドＤＮＡの準備、それの操作方法、および高収率におけるβ１ −インターフェロンの調製を保証するであろう同プラスミドを含有する、ヒトβ １−インターフェロンを生産する新規な高生産性の菌株に向けられる。 この目的は、本発明に係るヒトβ１−インターフェロンの合成をコードする組み 換えプラスミドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３が３、９００ｂ、　ｐ、のサ イズであり、そして次の構成単位：　ｐＰＲ４０とｐＭＬ２４をもとに作製され たベクタープラスミドｐＰＲ１２４Ｂの３．４００ｂ、ｐ、のサイズを有するＢ ａ＋＋＋ＨＩ　−Ｂｇｌ　ＩｔフラグメントおよびプラスミドｐｌＮβ−ｔｒｐ ７の５１０ｂ＋ｐ、のサイズを存するＥｃｏＲＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメントから 成り、そして次の特徴を有するニ ー複製の開始およびそれの制御をになう領域−ＣｏｌＥｌ−レプリコン、λファ ージのリプレッサー遺伝子ｃＩｔｓ８５７　、アンピシリン耐性遺伝子ＡＰ’　 、　ｆｄファージの一縫列の複数のρ−非依存性転写ターミネーター、制御領域 ｐｌｏ、　、それ自体にメチオニンのコドンを有する線維芽細胞のヒト成熟イン ターフェロンＩＦＮβ１の配列のコード部分およびｃｒｏ遺伝子のＳＤ配列を取 り込んでいる； −ｃｒｏ遺伝子の制御領域、β−１インターフエロンのコード領域およびｆｄフ ァージの転写ターミネータ−の連結は、ＩＦＮβ１遺伝子の前方にリポソームの 結合するハイブリッド領域がくるように行われ、この領域は次のヌクレオチド配 列：５　’　−−−−ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＴＧ　−−−−３’（配列中 、ＴＡＡＧＧＡＧＧＴ−λファージのｃｒｏ遺伝子のＳＤ配列、ＡＴＧ−線維芽 細胞のインターフェロンのメチオニンコドン）を有し、そしてＩＦＮβ１遺伝子 の終結コドンの直後にｆｄファージの一縦列の複数のρ−非依存性転写ターミネ ーターがくるように行われるニ 一座標がカウントの始め（０）であるＣ１ａｌ　、　ＰｖｕＩＩ　（約１．１１ ０）　、ＢｇｌＩＩ　（約１．４８０）　、　ＡｃｃＩ　（約１．８７０）　、 　Ｐｖｕｌ　（約３．３６０）のユニークな制限酵素認識部位を有し；これはＡ １１−Ｕｎｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂ ｉｏｔｉｃｓの微生物寄託機関に１９８７年１２月１日に寄託され、そして第１ ８２５号のもとに登録されている。 本発明に係る組み換えプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３は、λバクテリオフ ァージの制御領域ｐＨＯＩｌの支配下でＩＦＮβ１遺伝子の発現を保証する。　 ｃｌｔｓ８５７遺伝子−λバクテリオファージの先行するプロモーターからの転 写開始のレギュレーターである−およびプロモーターＸＰＲの支配下にあるＴＦ Ｎβ１−１３遺伝子が、同一の組み換えプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３の 中に配置される。この状況は、組み換えＤＮＡ分子を有する菌株の培養の間の潜 在的な不安定さを回避することを可能にする。何故なら、本発明に係る構造にお いては、生産体の菌株の中に付加的プラスミドが存在しないためにｒｅｃＡ−依 存性の組み換えが全く起こらないからである。 本発明はまた、組み換えプラスミドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３を操作す る方法に関し、その方法は、プラスミドｐＰＲ４０およびｐ？１Ｌ２４をもとに 作製されたベクタープラスミドｐＰＲ１２４Ｂを、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ ＩおよびＢｇｌＩ［により切断し、そして形成されたベクター分子の大きい方の フラグメントと成熟インターフェロンのコード領域を含むプラスミドｐｌＮＦβ −ｔｒｐ７のＥｃｏＲｌ−５ａｕ３Ａフラグメントとを連結し；そのようにして 作製された組み換えプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１２３において、ｃｒｏ遺 伝子のＳＤ配列とβ１−インターフェロンの最初のコドン（メチオニン）とを隣 接化し、そのためには該プラスミドＤ　Ｎ　Ａを制限酵素Ｂａｗｌ　Ｉにより加 水分解し、一部分のヌクレオチドを、反応混合物中のヌクレオシドの不完全なセ ットの条件下で現れる大腸菌のＤＮＡ−ポリメラーゼＩのエンドヌクレアーゼ活 性により除去し、該ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにより発酵的に切断し、Ｓｌ− エンドヌクレアーゼで処理して該ＤＮＡの一本鎖の部分を除去し、次いで二本鎖 の末端を大腸１！ｆＤＮＡ−ポリメラーゼＩのフレノウ断片により修復し、そし て形成された線状のＤＮＡ分子壱Ｔ４ファージのＤＮＡ−リガーゼにより環状に し；生じた調製物を大腸菌Ｃ６００細胞を形質転換させるために使用し、アンピ シリンを有する培地において該細胞を２８°Ｃの温度で培養して形質転換体を選 択し、続いて４２°Ｃの温度で減少する増殖速度を有するコロニーを選択し、そ の後、このようにして選択されたコロニーから組み換えプラスミドｐＰＲ−ＩＦ Ｎβ１−１３を単離する；ことを含んで成る。 λバクテリオファージのｃｒｏ遺伝子の最も長い（大腸菌およびコリファージの マトリックスＲＮＡについて既知のものの中で）ＳＤ配列がヒトの成熟β１−イ ンターフェロンのコード部分と結合している、組み換えプラスミドｐＰＲ−ＩＦ Ｎβ１−１３の操作のための本性の利用は、マトリックスＲＮ　Ａの５′端領域 の最適な一次構造および立体構造を存するような、ＩＦＮβ１遺伝子のりボゾー ムと結合するハイブリッド領域の構造をもたらす、既知の方法に比べて本発明に 係る操作方法は、プラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３上のＩＦＮβ１遺伝子の ３′−非翻訳部位に一縦列の複数のρ−非依存性転写ターミネーターが存在する ことを保証し、それ故にプロモーターＰａの抑制条件下でのプラスミドＤＮＡの 複製と線維芽細胞のインターフェロン遺伝子の高効率の転写との間の干渉作用を 防ぐ。 前記のものとは別に、本発明はまた、ヒトβ１−インターフェロンを産生ずる大 腸菌Ｖ１］Ｇｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３　（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３）株 に関し、この菌株は、本発明に係るプラスミドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１ ３を取り込んでおり、そして大腸菌の中へのプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１ ３の導入による遺伝子操作の方法により得られ、この菌株は１９８７年１２月１ 日にＡｌ１−υｎ１ｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）ｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｔ ｉｂｉｏｔｉｃｓの微生物寄託機関に寄託され、そしてＮ１１８２５のもとに登 録されている。 本発明に係る菌株は、大スケールの培養条件下でヒトβ１−インターフェロンの 安定した蓄積を保証し、そして細胞タンパク質の全量の約５−１Ｏ％に相当する 約２　ＸＩＯ”　Ｕ／ｄの所望の生産物の収率を獲得することを可能にする。 発明を実施するための最良の形式 本発明に従うて組み換えプラスミドｐＰＲ−ＴＦＮβ１−１３を操作する方法は 、幾つかの段階において実施される。 第１段階においては、ベクタープラスミドｐＰＲ１２４が操作される。 このために、エンドヌクレアーゼＢａ１３１による削除がプラスミドｐＰＲ４０ のＤＮＡ　（Ｍｏｌｅｋｕｌｙａｒｎａｙａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｙａ、１９Ｂ？、 第２１巻、第５号、ｌ’ｌｏｓｃｏｗ、第１３０９−１３２１）中の制限酵素Ｂ ｇｌｌ［１ｍ部位において行われる。 このようにしてプラスミドｐＰＲＩｏｏが得られ、このプラスミドにおいては、 ＢａｍＲＩ認識部位がλファージのリポソーム結合部位のすぐ後に位置しており 、そのため開始コドンＡＵＧの領域において次の配列： ＡＬＩＧＧＡＴＣＣ Ｂａ蒙）ＩＩ が形成される。 その後、遺伝子操作の典型的な方法を使って、プラスミドｐＰＲＩ００の最小の Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｂａｗｌ　１フラグメントをプラスミドｐＭＬ２４の最大のＰｓ ｔ　Ｉ　−ＢａｍＢ　Ｉフラグメントと連結してプラスミドｐＰＲＩ２４を形成 させ、その中に制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩの認識部位をオリゴヌクレオチドリンカー を介して導入する。二のようにしてプラスミドｐＰＲ１２４Ｂが得られる。 第２段階においては、中間体プラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１２３を操作する 。 このようにして得られたベクタープラスミドｐＰＲ１２４Ｂを、制限酵素ｇｃｏ ＲｌおよびＢｇｌ　ＩＩにより切断し、そして形成されたベクター分子の中で大 きい方のフラグメントをプラスミドｐＩＮβｔｒｐ−７由来の成熟β１−インタ ーフェロンのコード部分を含むＥｃｏＲ１−３ａｕ３Ａフラグメントと連結させ て中間体プラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβｌ−１２３を与える。 第３段階は、プラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３の操作を行う、このためには 、中間体プラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１２３におけるｃｒｏ遺伝子のＳＤ− 配列とβ１−インターフェロンの最初のコドンとの隣接化のために、該プラスミ ドＤＮＡを制限酵素Ｂａｗｌ　１により加水分解し、一部のヌクレオチドを大腸 菌のＤＮＡ−ポリメラーゼｌのエンドヌクレアーゼ活性により除去し、該ＤＮＡ を制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断し、Ｓｌ−エンドヌクレアーゼで処理し、続い て大腸菌のＤＮＡ−ポリメラーゼＩのフレノウ断片により二本鎖末端の完全な修 復を行い、そして生じた線状のＤＮＡ分子の環化をＴ４ファージのＤＮＡ−リガ ーゼにより行う、このようにして得られた調製物は、大腸菌Ｃ６００細胞を形質 転換するのに使用され、その形質転換体は、アンピシリンを有する培地上で２８ °Ｃの温度で該細胞を培養して選択され、次いで４２°Ｃの温度で低下する増殖 速度をもつものについて選択される。このようにして選択されたクローンからプ ラスミドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３が単離される。 本発明に係る大腸菌ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３　（ｐＰＲ−ＩＦ Ｎβ１−１３）株は、組み換えプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３での受容株 の形質転換、続いて２８°Ｃの温度でのアンピシリンを有する培地上での組み換 えクローンの選択、そしてその菌株を４２℃の温度で１−２時間培養することに より保証されるＰａ−プロモーターの抑制の後の形質転換細胞の抽出物において 線維芽細胞のβ１−インターフェロンの活性の測定、により製造される。受容体 として、大１１ｉ菌Ｃ６００株および大腸菌に１２株の他の誘導体が使用され得 る。 大腸菌ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３　（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３ ）株は次の特徴により特徴づけられる。 形態的特徴、（１，２−１，６）　ｘ　（２，０−６）μの直桿状、低運動性、 先様型を生ずることもできる、グラム陰性、非−胞子生成。 培養上の特徴。細胞は、濃厚または液体の通常の合成培地、半合成培地および複 合培地上で良好に増殖する。寒天状にしたＨｏｔｔｉｎｇｅｒのブロスまたはＬ −ブロス上で増殖させると、それらは粘液で覆われた、丸形の、少し曇ったコロ ニーを形成する。カザミノ酸を有するＭ９またはＬ−プロスのような液体培地上 で増殖させると、それらは均一な懸濁液を形成する。 生理−生化学的特徴、細胞は、５〜４０°Ｃ（最適３５°Ｃ）の範囲の温度、６ ．５〜７．５の範囲のｐｔｔで増殖することができる。炭素源として、アミノ酸 および炭水化物（例えばサッカロース）が利用される。窒素源は、アンモニウム の形の無機塩、並びにペプトン、トリプトン、酵母抽出物およびアミノ酸の形の 有機化合物により提供され得る。 抗生物質に対する耐性、該菌株は、液体または寒天状にした普通培地において増 殖する時、１００■／ｌまでの濃度でアンピシリンに耐性である。 プラスミドの安定性。一連の連続的再接種（少なくとも６ケ月間）を伴う寒天培 地の保管の際および抗生物質を有する液体培地中での奥部培養の間に、該プラス ミドの再構成は全く起こらない。 コノように調製された大腸菌ＶＮ１１Ｇｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３　（’ｐ ＰＲ−ＩＦＮβ１−１３）は、線維芽細胞のヒトβ１−インターフェロンの高効 率の生産体であり、そしてβ１−インターフェロンの商業的スケールの生産に利 用され得る。 本発明は、添付した図を参照しながら、前記プラスミドの操作方法、前記菌株の 生産方法、それの培養方法の特定Ｂ様の例によりさらに説明される。 第１図−組み換えプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３の物理−遺伝子地図； 第２図一本発明に従ったプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３の調製の図解。 例１ 組み換えプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３　（第１図）は、幾つかの段階に おいて作製される。 第１段階−ベクタープラスミドｐＰＲ１２４Ｂの操作このために、プラスミドｐ ＰＲ１”　＠を次のように操作する。 １０■ｈトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０、６ｍＭ　Ｉ’１ｇＣｊ！□、６１２− メルカプトエタノール、１５０ｍＭ　ＮａＣ１！を含む６０ｍの制限用緩衝液− １中で制限酵素ＢｇｌＩ［により、プラスミドｐＰＲ４０３０ｇを分解する。該 ＤＮＡを２倍容のエタノールで沈澱せしめる。 その沈澱物を２０１ｉの水に溶解せしめる。エンドヌクレアーゼＢａ１３１での ６　Ｄ　Ｎ　Ａの処理は、３ｍＭ　ＮａＣ１，６０ｍＭ　ＣａＣｊ！、。 ６０＋＋＋Ｍ　１１ｇｃｆ　ｚ　１１００　ｍＭ　）リス−ＨＣＡ　、　ｐＨ８ ，０、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸む緩衝液３０Ｊｌｉ中３０゛Ｃの温度 で３分間行われる。該ＤＮＡを２倍容のエタノールで沈澱せしめる。 その沈澱物を１０μの水に溶解せしめる。エンドヌクレアーゼＢａｍＨｌでの該 ＤＮＡの処理は前記の制限用緩衝液−１を含む３０ｄの試料において行われる。 該ＤＮＡの一本鎖の３′端領域の完全化は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌのフレ ノウ断片を用いた処理により、１０ｍＦ！　）リス−ＨＣｌ！、　ｐＨ８，０、 １０ｍＭＭｇＣ４，、デオキシリボヌクレオシド三すン酸各３０−によるＤＮＡ ｔＰｉ製物２ｎ、前記酵素５単位を含む２０ｄの試料において行われる。その反 応混合物からＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、そして１００Ｉの水に溶解せし める。線状プラスミドＤＮＡの連結は、ライゲーション用緩衝液（６０ｇ＊Ｍ　 ）リス−ＨＣ４、ｐＨ７，６、１０ｍＭ　ＭｇＣｆ　ｚ　、　１０ｆ１０ｆｆ１ メルカプトエタノ−ｉし、０．４腸Ｈアデノシン三リン酸）および１ｉＩＩｌの 該ＤＮＡを含む試料において、Ｔ４ファージのＤＮＡ−リガーゼにより行われる 。生じた混合物は、大腸菌Ｃ６００細胞の形質転換のために利用される。形質転 換の効率は、１ｎのもとのプラス岨ドｐＰＲ４０当たり５Ｘ１０’コロニーであ る。　ＢｉｒｎｂｏｉｓおよびＤｏｌｉにより提唱された改良法により、アンピ シリン耐性（１００Ｒ／−）のコロニーからプラスミドＤＮＡを回収しそして制 限分析のために使用する。結果として、Ｂａｗｌ　１のユニークな切断領域を含 むプラスミドｐＰＲＩＯｏが得られる。その後、プラスミドｐＰＲＩ２４が操作 される。 このために、プラスミドｐＭＬ２４のＤＮＡ２羅を、４０ｄの制限用緩衝液−１ 中で制限酵素Ｂａ■ＩＩおよびＰｓｔｌにより同時に切断する。連結は、制限酵 素Ｂａ５ＨＩおよびＰｓｔＩを用いたプラスミドｐＰＲ１００のＤＮＡの切断に おいて得られたフラグメントを用いて、ＴファージのＤＮＡ−リガーゼにより０ ℃の温度で行われる。生じたＤＮＡｔＰＪ製物は、大腸ｍｃｓｏｏｍ胞の形質転 換のために利用され、該細胞を４２°Ｃの温度で培養して、アンピシリンを有す る培地における選択、続いて３００Ｉｇ／−のクロラムフェニコールを有する培 地における選択を行う、このようにして選択されたコロニーからプラスミドを単 離し、そして制限分析により研究する。結果として、制限酵素Ｂａ５ＨＩのユニ ークな切断領域を含むプラスミドｐＰＲＩ２４が得られる。その後、プラスミド ｐＰＲ１２４のＤＮＡ３Ｋを、１０５Ｍ　）リス−ＦＩＣＩＩ　、　ｐＨ７，９ 、６＋Ｉｌｌ’ｌ　ＭｇＣｊ！ｚ　、　６ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１ ５０＋＊Ｍ　ＮａＣ１を含む４０ｊｉの制限用緩衝液−１中で、制限酵素Ｘｂａ 　Ｉにより切断する。該ＤＮＡを２倍容のエタノールで沈澱せしめる。その沈澱 物を１５Ｉの水に溶解せしめる。該ＤＮＡの一本鎖の３′端領域の完全化は、大 腸１１ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片を用いる処理により、１０＋ｅＭ　 ）リス−ＴＪＣＩ！　、　ｐＨ８，０、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　ｔ、デオキシリ ポヌクレオシド三すン酸各３０声によるＤＮＡｍ製物２Ｋ１前記酵素５単位を含 む２０ｄの試料において行われる。その反応混合物からＤＮＡをエタノールで沈 澱せしめ、そして１００Ｉの水に溶解せしめる。線状プラスミドとＢｇｌ　ｎリ ンカ−との連結は、ライゲーション用緩衝液（６０ｍＭ）リス−ＨＣ１，ｐＨ７ ，６、１０ｍＭ　ＭｇＣｆｚ　、　１０ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０． ４＋＋＋Ｍアデノシン三リン酸）、２Ｒの該プラスミドＤＮＡおよび０．５　ｎ の該リンカ−を含む試料において、Ｔ４ファージのＤＮＡ−リガーゼにより、１ ６℃の温度で１２時間行われる。連結の後、反応混合物から該ＤＮＡをエタノー ルで沈澱せしめ、溶解せしめ、そして制限用緩衝液−２（６１トリス−ＨＣ＃　 、　ｐＨ７，６、６ｍＭ　！１１ｇＣ１ｚ　、　６ｍＭ　２−メルカプトエタノ ール、５０ｗ＋Ｍ　ＮａＣｆ　）を含む４０ｄの試料において、制限酵素Ｂｇｌ Ｉ［により酵素加水分解せしめる。該Ｄ　Ｎ　Ａを再びエタノールで沈澱せしめ 、溶解せしめ、そして該ＤＮＡの環化を確実にする；このために、２４０ｄのラ イゲーション用緩衝液中の該プラスミドＤＮＡ！ｉ製物１ｇをＴ４のＤＮＡ−リ ガーゼで処理する。生じた混合物は、大腸菌Ｃ６００細胞の形質転換に利用され る。 形質転換の効率は、１ｎの在来プラスミドｐＰＲ１２４当たり５Ｘ１０’コロニ ーに及ぶ、アンピシリン耐性（１００ａ／ａｔ）のコロニーを選択し、Ｂｉｒｎ ｂｏｉ−およびＤｏｌｉにより提唱された改良法に従って、該プラスミドＤＮＡ をそこから単離し、そしてこのＤ　Ｎ　Ａを制限分析に使用する。結果として、 プラスミドｐＰＲ１２４Ｂが得られ、最初のベクター分子ｐＰＲＩ２４と対比す ると、前にを効なＸｂａ　Ｉ認識配列の代わりにユニークなりｇｌＩＩ制限部位 を有する（第２図）＝第２段階−中間体ブラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１２３ の操作、ベクターｐＰＲ１２４Ｂの中に、線維芽細胞のヒトインターフェロンの コード配列がプラスミドｐｌＮβ−ｔｒｐ７から導入される。このために、ＤＮ Ａ　ｐＩＮβ−ｔｒｐ７１ＯＲを制限用緩衝液−２を含む１００Ｉの試料中で制 限酵素ＥｃｏＲ１およびＳａｕ　３Ａで一緒に処理する。生じた調製物を１．１ ％低融点アガロースゲル上に負荷し、そしてトリス−酢酸塩系において電気泳動 する。５１０ｂ、ｐ。 の長さのＤＮＡフラグメントを含むゲル断片を切りとり、そしてｍＤＮＡをゲル から溶出させる。このようにして作製されたＤＮＡフラグメント（約１ｇ）をプ ラスミドｐＰＲ１２４Ｂの中に挿入する。このために、ＤＮＡ　ｐＰＲＩ２４１ ｇを制限用緩衝液−２の中の２０ｄの試料において制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢ ｇｌ　ｍにより切断する。生じた調製物をフェノールで除タンパクせしめ、該Ｄ ＮＡをエタノールで沈澱させ、そして１０ＩのＩＩｆＯに溶かす、切断されたプ ラスミドｐＰＲ１２４ＢをプラスミドｐｌＮβ−ｔｒｐ７の単離されたフラグメ ントとを一緒にし、そしてライゲーシッン用緩衝液の中の２０ｄの試料において Ｔ４のＤＮＡ−リガーゼで処理する。このようにして得られたＤＮＡ１ｉ製物は 、４２℃の温度での該細胞の培養に基づくアンピッリンを有する培地上での選択 、続いて２０ＯＮ／−のクロラムフェニコールを有する培地上でのＣ＠”−クロ ーンの選択を伴って、大腸菌Ｃ６００細胞の形質転換に利用される。このように して選択されたクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析により 研究する。生じたプラスミドにおいては、ベクターｐＰＲ１２４Ｂの中のクロラ ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのＣ端部分をコードしているＥｃｏ ＲＩ　−Ｂｇｌ　ｎフラグメントが、ヒトの成熟β−インターフェロンのコード 配列で置き換わっている。このプラスミドは、ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１２３と記 され、そして次の段階の操作過程で使用される。 第３段階−プラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３の操作。プラスミドｐＰＲ−Ｉ ＦＮβ１−１２３を１５０Ｊ１１の制限用緩衝液−１中で制限酵素Ｂａａ＋ＨＩ により切断する。該ＤＮＡをフェノールで除タンパクし、そしてエタノールで沈 澱させる。その沈澱物を４０ｍのＥｇｏに溶かす。大腸菌のＤＮＡ−ポリメラー ゼの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性によるＤＮＡの限定消化のために、生じ たＤＮＡｔ）ｉ製動を、５０ＩＩＭトリスーＨＣｊ！　（ｐ）１８．０）、１０ ．ＣＩ？ｌエチレンジアミン四酢酸、５＋ｎＭ　ＭｇＣｆ！　ｚ、　１００−デ オキシアデノシン三リン酸（次いでデオキシグアノシン三リン酸）および２ｅ単 位のＤＮＡ−ポリメラーゼを含む１５０Ｉの試料中でインキュベートする０反応 を止め、該ＤＮＡを沈澱させ、そしてその沈澱物を再び４０Ｊｌ！の１＋１０に 溶かす、生じた調製物１０．１を５０Ｉｚ１の制限用緩衝液−２中で制限酵素Ｅ ｃｏＲＩで処理し、ついで該Ｄ　Ｎ　Ａをフェノールで除タンパクしそしてエタ ノールを沈澱させる。その沈澱物を３０ｄのＨ２Ｏに溶かす。 該ＤＮＡ調製物の一本鎖の末端部分の除去は、Ｓｌ−エンドヌクレアーゼを使っ て、３０ｍＭ　ＣＨｓＣＯＯＮａ（ｐＨ４，４）　、　４．５ｍＭＺｎ５Ｏ，２ ５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｌＱｇのＤＮＡ、　２００単位のＳｌ−エンドヌクレアー ゼを含む１００Ｊ１１の試料において行われる０反応を２０℃の温度で行い、そ の後、混合物をフェノール処理しそしてエタノールで核酸を沈澱させる。その沈 澱物を２０ｄのＢ１０に溶かす、このようにして得られたＤＮＡＩＩ製物４ｎ製 動前記の条件下で大腸菌のＤＮＡ−ポリメラーゼ■のフレノウ断片で処理して、 おそらく出現する一本鎖の分子末端を二本鎖のものに完全にする０反応をフェノ ールでの除タンパクにより止め、該核酸をエタノールで沈澱させ、そして２ｏｉ ！１のＢ、Ｏに溶かす。 二本鎖の末端を有する線状の該ＤＮＡ分子の連結は、６０ｓ＋Ｍトリスーｔｌｃ ｊ　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ　、　１０５Ｍジチオスレイトー ル、４ｓ＋Ｍアデノシン三リン酸、８質量％のポリエチレングリ）−ル６００． ４ｇ（７）！１ＤＮＡ、１００１位（７）Ｔ４（７）ＤＮＡＴＪ、ｆ−ゼを含む ５０ＩＩｌの試料において１６℃の温度で行われる。 反応が完了した後、その試料を４倍まで希釈し、そしてエタノールにより核酸を 沈澱させる。水に溶解したＤ　Ｎ　Ａ　２　ｇを、３０ｄの制限用緩衝液−２中 で制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩで処理し、該ＤＮＡをエタノールで反応混合物から沈澱 させ、水に溶解し、そして２００Ｉのライゲーシッン用緩衝液中でＴ４のＤＮＡ −リガーゼで処理する。生じたＤＮＡ１ｉＷ物は、上記に記載したように大腸菌 Ｃ６００細胞の形質転換に使用され、次いで２８℃の温度での一日間の該細胞の 培養に基づくアンピシリンを有する培地上での形質転換体の選択を行う、そのよ うにして調製された形質転換体の中で４２℃の温度で低下する増殖能力を冑する ものを選択する。これらのクローンからそのプラスミドＤＮＡを前述のように単 離し、そして制限分析を行う。 このようにして得られたプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３におけるＩＦＮβ １遺伝子の前方のリポソームの結合するハイブリッド領域の一次構造を同定する ために、対応するＤＮＡ３０ｐｆ：を１００Ｉの制限用緩衝液−２中で制限酵素 Ｂｉｎｄ　■で処理し、その調製物を密度勾配（４−１２％）ポリアクリルアミ ドゲル上に負荷し、そしてトリス−酢酸塩系において電気泳動する。　Ｍａｘａ ａ＋−Ｇｉｌｂｅｒｔ法を使って、約１９０　ｂ、ｐ、の長さのＤＮＡフラグメ ントをゲルから溶出させる。；次いでそれを、前述の線状プラスミドｐｉ”ＲＩ ２４へのＢｇｌＩＩ−リンカ−の付加の方法と同様にして、Ｂａ５ｅ　ｌリンカ −を用いてＴ４のＤＮＡ−リガーゼにより拡張せしめる。該ＤＮＡをエタノール により反応混合物から沈澱させ、そしてその沈澱物を２０　ｐｌの水に溶解し、 ３０１！１の制限用緩衝液−１中で制限酵素ＢａｍＨＩにより開裂せしめ、フェ ノールでの除タンパクを行い、再びエタノールで沈澱させ、そして水に溶解させ る。 Ｂａｌｌ１ｌ　Ｉでの切断により形成された、バタテリオファージＭ１３ｓ＋ｐ ｌＯのＤＮＡの複製型における該ＤＮＡフラグメントの分子クローニング、５′ −ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む指示培地 上での組み換えファージの選択、−重鎖のファージＤＮＡの単離、および限定マ トリックスコピーの方法ＣＦ、Ｓｅｎｇｅｒにより提唱された方法）によるクロ ーン化されたフラグメントの一次構造の決定は、つぎの標準的方法により行われ る。　Ｓｅｎｇｅｒの方法によりプラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３において 発見されたリポソームの結合するハイブリッド領域のヌクレオチド配列は、次の ようである： ５′・・・ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＴＧ・・・３′　（配列中、ＴＡＡＧＧ ＡＧＧＴ−λファージのｃｒｏ遺伝子のＳＤ配列；およびＡＴＧ−β１−インタ ーフェロンのメチオニンコドン）。 例２ 線維芽細胞のヒトβ１−インターフェロンの生産体−大腸菌ＶＮＩＩＧｅｎｅｔ ｉｋａ　ＶＬ　９０３　（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３）株は次のようにして作製 される。 線維芽細胞のヒトのインターフェロンの合成をコードしているプラスミドｐＰＲ −ＩＦＮβ１−１３は、例１において記載したものと同様な形質転換により、大 腸菌〜’ＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３株（ｔｈｅ　Ａ１１−Ｌ！ｎ１ ｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｔｉｃｓ　ａｎｄ 　５ｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ ｍｓの微生物寄託機関に寄託され、そして第ＢＫＩＩＦ　Ｂ−３５４６号のもと に登録されている）の細胞中に導入する。大腸菌ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ〜’ Ｌ　９０３株の細胞の形質転換の効率は、１ｊ！ｇのもとのプラスミドｐＰＲ− ＩＦＮβ１−１３のＤＮＡ当たり約１０６コロニーである。その形質転換体は、 アンピシリン（１００ｘ／　ｒｎｌ　）を含む培地上で咳！：ｌ胞を２８°Ｃの 温度で１日間培養した後に選択される０選択されたクローンからプラスミドＤＮ Ａを回収し、そしてそれがＤＮＡ調製物製動Ｒ−ＩＦＮβ１−１３に等しいこと が制限分析により証明される。このようにして大腸菌ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ 　ＶＬ　９０３　（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３）株が得られる。 大腸菌ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３　（ｐＰＲ−ＩＦＮβｌ−１３ ）株の生産能力を決定するために、プラスミドを含有する細胞を、５０Ｒ／−の アンピシリンを含む斜面の標準的なＨｏｔｔｉｎｇｅｒ寒天培地上で２８°Ｃの 温度で１４時間増殖させる。その斜面上で増殖したバイオマスは、接種材料の調 製のために使用される。 このために、該細胞を、１１００ａ／−のアンピシリンを含むＨｏｔｔｉｎｇｅ ｒ培地１００−の入った７５０−のＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコのなかに移し 、そして２４０　ｒ、ｐ、ｍ、の振とう機上で２８°Ｃの温度で６時間増殖させ る。その接種培養物の光学濃度は１．５＝２．５単位である。 醗酵は、ｐＨ１温度、撹拌および通気速度を調節するシステムを備えた醗酵槽中 で行われる。醗酵には、１００Ｒ／−のアンピシリンおよび１０　ｇ／Ｉ−のグ ルーコースを有するＨｏｔｔｉｎｇｅｒ培地が使用される。接種培養物は５−１ ０質量％の量で導入される。培養は、６．６−６．８のｐＨで、アンモニア水を 補充することによりこのレベルを維持しながら行われる。＠酵の最初の部分は、 ５５０ｎｍで３．５の光学濃度まで、２８°Ｃの温度で醗酵を行い、その後に温 度を４２−４５℃に上げることにより５分間熱誘導をもたらし、そして同じ、温 度で２時間＠酵を行う。 その過程Ｏ完了とともに、インク・−フェロンの活性を測定するために、遠心に より培養液１−から細胞を沈澱せしめ、その沈澱物を、７．２のｐＨを有する０ 、０２Ｍリン酸塩緩衝液中のドデシル硫酸ナトリウムの１％ン容液液１ｒｎｌ懸 濁し、そして１００℃の温度で２−４分間加熱する。そ直の後、沈澱物を遠心に より分離し、上清画分中に含まれるインターフェロンの活性を、標準法により、 または水痘性口内炎ウィルスの細胞変性効果からの二倍体のヒト線維芽細胞の保 護により、または免疫酵素測定法により測定する。標準参考として、標準白血球 インターフェロンＭＰＣＢ　６９／１９（Ｇｒｅａｔ　Ｂｒ１ｔａｉｎ）に対し て力価滴定されたβ−インターフェロンの調製物（“Ｔｏｒｅｙ”、　Ｊａｐａ ｎ）を使用する。 種々の方法により測定された大腸菌ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３（ ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３）株の細胞中で合成された線維芽細胞のヒト−インタ ーフェロンの活性は、細菌培養物１１当たり２Ｘ１０”国際単位より高い。 細胞タンパク質全体における合成された線維芽細胞のインターフェロンの割合の 測定のために、遠心により培養液１−から細胞を沈澱せしめ、そして上記に記載 したように処理する；その調製物を０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの存在下１ ５％ポリアクリルアミドゲルにおいて、標準手順に従って電気泳動により分離す る。ポリアクリルアミドゲルにおいて分離されたタンパク質を、標準手順に従っ てクーマシーＲ−２５０“５ｅｒｖａ″（Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液中で 染色する。そのゲルを自動レーザーデンシトメーターにおいてスキャンした後に 、ゾーン中のタンパク質の含量を測定する。該細胞中で合成された線維芽細胞の 成熟インターフェロン（１９ｋＤ）に相当するゾーンの同定は、マーカータンパ ク質の電気泳動移動度との比較に基づいて行われ、また、分離されたタンパク質 画分のニトロセルロースフィルター上へのイムツブフット、およびβ−インター フェロンに対するマウスのモノクローナル抗体と西洋ワサビからのペルオキシダ ーゼを結合したウサギの抗マウス抗体とを含む溶液中で該フィルタ・−を処理す ることによるインターフェロンのゾーンの同定も、行われる。 β１−インターフェロンに相当、するゾーンにおけるタンパク質含量は、本発明 に係るプラスミドを含有する大腸菌の細胞Ｅ、Ｃｏ１１　ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉ ｋａ　ＶＬ　９０３（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３）株の全タンパク質の約１０％ である。 産業上の利用可能性 線維芽細胞のヒトβ１−インターフェロンの合成をコードする本発明に係る組み 換えプラスミ’Ｆ　ｐＰＲ−ＩＦｓβ１−１３は、高活性を有するヒトβ１−イ ンターフェロンの調製において有用である。 本発明に係る大腸菌νＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３　（ｐＰＲ−ＩＦ Ｎβ１−１３）株−β１−インターフェロンの生産体は、微生物学的および医療 的産業分野において有用である。 手続補正書（方式） 平成１年６月　１　日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＳＵ８８１０００３３ ２　発明の名称 線維芽細胞のヒトβ１−インターフェロンの合成をコードする組み換えプラスミ ドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３、それの操作方法、および同プラスミドＤ 　Ｎ　、Ａを含有する、ヒトβ１−インターフェロンを生産する大腸菌ＶＮ１１ Ｇｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ　９０３（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３）株３、補正をす る者 事件との関係　特許出願人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１６、補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書 （内容に変更なし） ８、添付書類の目録 明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通国際調査報告 ０発　明　者　イゾトバ　ララ　セメンフナ０発　明　者　リザフスカヤ　アン チ　スタニスラボフナ ＠発明者　アレクセンコ　アンドレイ　ベトロビチ ０発　明　者　コストロフ　セルゲイ　ビクトロビチ ０発　明　者　コレバテイハ　マリナ　アレクセエフナ ０発　明　者　ゲルビンス力ス　バルデマラスビタウトビチ ０発　明　者　ノンフス力ヤ　エレナ　アレクセエフナ ０発　明　者　エフドニナ　リュドミラ　フラデイミロフナ ０発　明　者　リフシラ　ビタリ　アル力デイエビチ ０発　明　者　ブムヤリス　フラダスーアルギルダス　フラドビチ ０発　明　者　ボルホフ　セルゲイ　イオノビソビエト連邦、　１０７３９２． モスコー、ウリツア　ボルシャヤ　チェルキゾフスカヤ、デー、１１．クバルチ ーラ　１０９ソビエト連邦、　１２５０８３．モスコー、ウリツア　ベルハナヤ 、マスロフカ、デー、２．クバルチーラ　４３ ソビエト連邦、　１２７５４０．モスコー、ウリツア　ドウブニンスカヤ。 デー、１６．コルプス　２．クバルチーラ　２７８ソビエト連邦、　１２５５０ ２．モスコー、ウリツア　フェスティバルナヤ、デー、６７、クバルチーラ　１ １９ソビエト連邦、　１２１００２．モスコー、スタロコンユシエンニイペレウ ロク、デー、１９．クバルチーラ　９ ソビエト連邦、　２３２０４３．ビルンユス、ウリツア　アルヒテクトウ。 デー、　１１８．　クバルチーラ　２０ソビエト連邦、　１１５４３０．モスコ ー、バラクラフスキ　プロスペクト、デー、４．コルプス　６．クバルチーラ　 ３８７ソビエト連邦、　１１５１４６．モスコー、コロメンスキ　ブロエズド、 デ＋、　１４．コルブス　２．クバルチーラ　４２１ソビエト連邦、　１１３２ ０８．モスコー、スムスコイ　ブロエズド、デー、５．コルプス　１．クバルチ ーラ　Ｕソビエト連邦、　２３２０５１．ビルンユス、ウリツア　エイドユクヤ ビチャウス、デー、２３．クバルチーラ　６ソビエト連邦、　１１９０３４．モ スコー、ウリツア　オストジエン力、デー、７．クバルチーラ　４９

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．線維芽細胞のヒトβ１−インターフェロンの合成をコードする組み換えブラ スミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３であって、それは３，９００ｂ．ｐ．のサイズ を有し、下記の構成単位：−ｐＰＲ４０およびｐＭＬ２３から作製されたベクタ ープラスミドｐＰＲ１２４Ｂの３，４００ｂ．ｐ．のサイズを有するＢａｍＨＩ −ＢｇｌＩＩフラグメント； −５１０ｂ．ｐ．のサイズを有するプラスミドｐＩＮβ−ｔｒｐ７のＥｃｏＲＩ −Ｓａｕ３Ａフラグメント；から成り、そして次の特徴： −複製開始およびそれの制御をになう領域−ＣｏｌＥＩ−レプリコン、λファー ジのリプレツサー遺伝子ｃｌｔｓ８５７、アンピシリン耐性遺伝子Ａｐｒ，ｆｄ ファージの一縦列の複数のρ−非依存性転写ターミネーター、制御領域ＰＲＯＲ 、およびそれ自体にメチオニンコドンを有する線維芽細胞のヒトの成熟インター フェロンＩＦＮβ１の配列をコードするλｃｒｏ遺伝子のＳＤ配列を組み込んで いること； −λｃｒｏ遺伝子の制御領域、β１−インターフェロンのコード部分およびｆｄ ファージの転写のターミネーターの連結は、ＩＦＮβ１遺伝子の前方にリボソー ムを結合するハイブリッド領域が形成され、この領域は、次のヌクレオチド配列 ：５′−・・・ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡＴＧ・・・−３′（配列中、ＴＡＡ ＧＧＡＧＧＴ−λファージのｃｒｏ遺伝子のＳＤ配列；ＡＴＧ−インターフェロ ンのメチオニンコドン）を有し、そしてＩＦＮβ１遺伝子の終結コドンの直後に ｆｄファージの一縦列の複数のρ−非依存性転写ターミネーターが置かれるよう に行われていること； −その座標がカウントの初め（０）である制限酵素ＣｌａＩ，ＰｖｕＩＩ（約１ ，１１０），ＢｇｌＩＩ（約１，４８０），Ａｃｃｌ（約１，８７０），Ｐｖｕ Ｉ（約３，３６０）のユニークな認識部位を有し；ｔｈｅ　Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ 　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓの微 生物寄託機関に寄託されそして第１８２５号のもとに登録されていること；を有 することを特徴とするプラスミド。
2. ２．請求項１に記載の組み換えプラスミドＤＮＡを操作する方法であって、プラ スミドｐＰＲ４０およびｐＭＬ２４Ｂを基にして操作されたベクタープラスミド ｐＰＲ１２４Ｂを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩにより切 断しそして形成されたベクター分子の大きい方のフラグメントとヒトの成熟１− インターフェロンのコード領域を含むプラスミドｐＩＮβ−ｔｒＰ７のＥｃｏＲ Ｉ−Ｓａｕ３Ａフラグメントとを連結し；そのようにして作製された組み換えプ ラスミドｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１２３において、ｃｒｏ遺伝子のＳＤ配列と１− インターフェロンの第１コドン（メチオニン）との隣接化を行い、そのためには 該プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩにより加水分解し、反応混合物中にヌ クレオシド三リン酵の不安全なセットの条件下で現れる大腸菌のＤＮＡ−ポリメ ラーゼＩのエンドヌクレアーゼ活性により、ヌクレオチドの一部分を除去し；該 ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにより酵素的に切断し、Ｓ１−エンドヌクレアーゼ で処理して一本鎖ＤＮＡの部分を除去し、次いで二本鎖の末端を大腸菌のＤＮＡ −ポリメラーゼのクレノウ断片により修復し、そして生じた線状のＤＮＡ分子を Ｔ４ファージのＤＮＡ−リガーゼにより環状にし；生じた調製物を、大腸菌Ｃ６ ００細胞を形質転換させるために使用し、該細胞をアンピシリンを有する培地上 で２８℃の温度で培養して形質転換体を選択し、続いて４２℃で低下する増殖速 度を示すクローンを選択し、その後で、選択されたクローンから組み換えプラス ミドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦβ１−１３を単離する；ことを特徴とする方法。
3. ３．請求項１に記載の組み換えプラスミドＤＮＡｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３を含 有する、ヒトβ１−インターフェロンの生産体としての大腸菌ＶＮＩＧｅｎｅｔ ｉｋａ　ＶＬ９０３（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−４３）株であって、組み換えプラス ミドＤＮＡ　ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３を大腸菌の中へ導入することによる遺伝 子操作の方法により製造され、Ａｌｌ−ＵｎｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔ ｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓの微生物寄託機関に１９８７年１２ 月１日寄託され、そして第１８２５号のもとに登録されている、大腸菌ＶＮＩＩ Ｇｅｎｅｔｉｋａ　ＶＬ９０３（ｐＰＲ−ＩＦＮβ１−１３）株。