JPS61502799A - 組換えｄｎａ分子、形質転換された微生物、並びにペニシリンｖアミダ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＤＮＡ分子、形質転換された微生物、並ひにペニシリンアミダーゼ類 本発明は、ペニシリンＶアミダーゼまたはその活性な誘導体をコードしている組 換えデオキシリボ核酸、並ひにその製造方法に関するものである。本発明はまた 、その様な組換えデオキシリボ核酸を含有している形質転換された微生物、並び にその製造方法に関するものである。さらにまた本発明は、その様な形質転換微 生物を、ペニシリンアミダーゼ類 誘導体の生産に用いることに関するものである。

ペニシリンアミダーゼ類（Ｅ、Ｃ，３，５，１，１１）は、ペニシラン酸の、６ −アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）および特殊な側鎖への加水分解を１触媒す る作用を有し、微生物間に広範に分布している〔パンダムおよびボエッッ（Ｖａ ｎｄａｍｍｅ　ａｎｄ　Ｖｏｅｔｓ）参照２３〕。コレラノ酵素は、半合成ペニ シリン類の製造において商業上重要である。フエノキノメチルペニンジン１こ特 異的に作用ス５ｐｈａｃｒｉｃｕｓ）　（カールセン（Ｃａｒｌｓｅｎ　）およ びエンボーグ（Ｅｍｂｏｒｇ）参照５〕を含むバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　） の数種の菌株によっても生産されるが、これは、主として菌類（［ｕｎｇｉ）に 見出されている。

この酵素を商業規模で生産するためには、ペニシリンＶアミダーゼの生産性が高 められた微生物を用いることか非常に望ましい。本発明は、その様な微生物を提 供するものである。

即ち、本発明は、いわゆる遺伝子工学に関するものであって、ペニシリン■アミ ダーゼに関する遺伝情報を有するデオキシリボヌクレオチド配列を含有する組換 えＤＮＡ分子を提供するものである。その様な組換えＤＮＡ分子、またはいわゆ るハイスリッドベクターを任意の適当な宿主微生物に導入し、咳微生物を培養し て所望の酵素物質を生産させることができる。ＤＮＡ転移ベクターおよび宿主微 生物を適切に選択することにより、非病原性であり、かつ、多量のベニンジン■ アミダーゼを生産する形質転換微生物を得ることかできる。宿主細胞内でベクタ ーＤＮＡが自己複製する結果、ペニシリンアミダーゼ類 が多量に生産されるので、本発明によるアミグーゼ生産量は、これまで使用され てきたＢ、スファエリカスよりも多い。

上記の比較的新らしい組換えＤＮＡ技術または遺伝子工学によれば、所望のタン パク質またはポリペプチドをコードしている特定のヌクレオチド配列を細菌性宿 主細胞または他の適当な宿主細胞に導入し、その結果、これら宿主に所望の特性 を付与することができる。

ＤＮＡは、化学合成、あるいは別の細菌株からの抽出、または他の生物からの抽 出等、様々な方法で調製され得る。この様な形質転換微生物の組み立てには、所 望のタンパク質またはポリペプチドをコードしている二本鎖ＤＮＡを調製し、こ のＤＮＡを適当なりローニングビヒクルまたはクローニングベクターの適当部位 に結合させて組換えＤＮＡ分子を形成させ（それらの内のあるものは所望のタン パク質暗号遺伝子を含有することになる）、この組換えＤＮＡ分子て適当な宿主 微生物を形質転換し、得られたクローンを、適当な手段を用いてタンパク質また はポリペプチドの暗号配列の存在に関してスクリーニングすることにより、１ま たはそれ以上の陽性クローンを選択し、これを増殖させる工程が含まれる。所望 により、１回またはそれ以上の再りローニノグ、あるいはサブクローニング（即 ち、タンパク質をコードしているＤＮＡを抽出して開裂させ、開裂して得たフラ グメントを第２のクローニングビヒクルまたはクローニングベクターに挿入し、 タンパク質またはポリペプチドの暗号遺伝子の存在に関してスクリーニングする こと）を行っても良い。

この様な組換えＤＮＡ技術を用いて、幾つかの細菌性または非細菌性のタンパク 質を得た例が文献に記載されている（この様な技術の大多数は大腸菌（エシェリ キア・コリ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ　）内で達成されている〕。

しかしながら従来の組換えＤＮＡ法のどれも、ペニンジン■アミダーゼの合成を 目的としていなかった。

本発明の目的は、組換えＤＮＡ技術を利用したベニノリンＶアミダーゼの生産を 達成することにある。この目的は、少なくとも部分的に未知の構造を含んでいる ＤＮＡ配列（即ち、ペニシリン■アミダーゼをコードしているＤＮＡ配列）を適 当な宿主内に見出し、この配列を、以下に述べる様に、極めて複雑なりＮＡ配列 混合物の中から分離することにより達成された。一度ＤＮＡ配列の同定がなされ ると、組換えＤＮＡ技術ニヨリ、ペニシリンＶアミダーゼのみならず、以下にサ ラに詳しく述べる様に、ペニシリンＶアミダーゼ活性を持っている修飾された酵 素産物、例えばペニシリンＶアミダーゼのフラグメント（断片）、あるいはペニ シリン■アミダーゼと他のタンパク質またはオリゴヌクレオチドとの融合タンパ ク質、を生産し得る微生物の調製も可能になる。

即ち、本発明は、組換えＤＮＡ技術によって形質転換された新規な微生物であっ て、ペニシリンＶアミダーゼを生産し得る微生物に関するものである。また本発 明は、組換えＤＮＡ技術によって宿主生物を形質転換することによって、その様 な微生物を製造する方法に関するものである。

また本発明は、ペニシリンＶアミダーゼをコードしているＤＮＡ配列を少くとも １個含有している上記の如き組換えＤ　Ｎ　Ａ分子、並びにその製造方法に関す るものである。

さらにまた本発明は、本発明の形質転換微生物を培養することによって、ペニシ リンＶアミダーゼを製造する方法に関するものである。

本明細書中、［ペニシリンＶアミダーゼ」という語句は、フェノキンメチルペニ シリンを加水分解して６−アミツペニソラン酸（５−ＡＰＡ）とフェノキシ−酢 酸とを生成させる反応を触媒することができる全ゆるタンパク質巨大分子を指す 。従って、ペニンジンＶアミターゼ分子（こは、例えはクローニングビヒクルの 組立てに際して挿入された化学的な合成に係るオリゴヌクレオチドに基ずく、こ のアミダーゼ分子と結合しテイル非ペニノリンＶアミダーゼペプチド配列を含ん でいるものも含まれる。

本明細書中で用いられるその他の語句を、以下に定ト、および含窒素異頃環塩基 から成、る単量体単位のＤＮＡまたはＲＮＡ。塩基占糖部分とは、グリコシド炭 素（ペントースの１′炭素原子）を介１７て結合しており、この塩基と糖占の組 合わせをヌクレオチドと称する。

塩基によってヌクレオチドは特性化される。ＤＮＡ塩、１．（は、アデニン（［ 、八−ｊ）、グアニン（ｒＧＪ　）、ソトンン（ｒｃＪ）およびチミン（ｒ　− ｒ　、Ｊ　’）の４イ固である。ＲＮ　Ａ塩基は、Ａ、ＧＳＣおよびウラシル（ 「Ｕ」）の４個である。

ＤＮＡ配列：隣接するペントースの３′炭素原子と５′炭素原子とのホスホトリ エステル結合によってヌクレオチドが次々につながってできた連続した直線状の もの。

コドン：３個のヌクレオチド（トリプレット）からなるＤＮＡ配列であって、メ ツセンジャーＲＮＡ（ｒｍＲＮＡＪ）を通じて、アミノ酸、翻訳開始シグナルま たは翻訳終止シグナルをコードしている配列。例えば、ヌクレオチドトリブレッ トＴＴＡ１ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびｃＴＧは７ミ／ｌｌ１ロイシ フ（ｒＬｅｕＪ）をコードしており、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳終止シ グナルを、そしてＡＴＧは翻訳開始シグナルをコードしている。

非染色体性の二本鎖ＤＮＡ配列であって、宿主細胞内で複製する配列である。単 細胞の宿主生物内にプラスミドが置かれると、このプラスミドのＤＮＡにより、 生物の特性が変化、あるいは生物が形質転換される。

例えば、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ）を担った遺伝子は、それまではテトラ サイクリン感受性であった宿主細胞を、テトラサイクリン耐性細胞に形ｎ転換す る。。

プラスミドによって形質転換された宿主細胞を「形質転換体」と称する。

ファージまたはバクテリオファージ：その多くは、タンパクｄ↑エンベロープま たはコート内（こ包成されたＤＮＡ配列をイ〕“する細菌性ウィルス。

クローニングビヒクル：宿主細胞内で復製可能なプラスミド、ファージＤＮＡま たは他のＤＮＡ配列であって、該ＤＮＡの基本的な生物学的機能、例えば複製、 コートタンパク質の生産等の機能の喪失、あるいはプロモーターまたは結合部位 の欠失を伴なうことなしに、配列決定し得る方法で切断することができる１また は少数個のヱンドヌクレアーゼ認識部位、あるいは制限部位を有すると共に、形 質転換された宿主細胞の同定（こ用いるのに適したマーカー（例えばテトラサイ クリン耐性または、アンピッリン耐性）を含有していることを特徴とするＤＮＡ 配列。クローニングビヒクルはベクターともいわれる。

宿主：クローニングビヒクルによる形質転換に際して、このクローニングビヒク ルを複製させ、そのものか有している他の生物学的機能（例えば、プラスミドか 含有している遺伝子の発現を通してポリペプチドまたはタンパク質を生産させる ）を達成させ得るものである。

クローニング：１個の生物または配列から、無性的な再生産により、その様な生 物またはＤＮＡ配列の集団を得るプロセス。

めに、遺伝子によってとられるプロセス１、それは転イと翻訳の組合わせから成 る。

転写：遺伝子からｍＲＮＡが生産されるプロセス１、翻訳＋　ｍＲＮＡからタン パク質またはポリペプチドか生産されるプロセス。

プロモーター：　ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する遺伝子上のＤＮ Ａ領域。

リポソーム結合部位：ｍＲＮＡ上の部位をコードし、ｍＲＮＡの・リポソームと の結合を助け、翻訳の開始を可能ならしめる、遺伝子上のＤＮＡ領域。このリポ ソーム結合部位は、遺伝子内で、プロモーターの後方、翻訳開始シグナルの前方 に位置している。

遺伝子：　ｍＲＮＡの鋳型として、特定のポリペプチドまたはタンパク質に固有 のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列。遺伝子は、プロモーター、リボン −ム結合部位、翻訳開始シグナルおよび構造ＤＮＡ配列とを含有している。外部 へ運搬される、あるいは分泌されるタンパク質またはポリペプチドの場合には、 遺伝子は、シグナルＤＮＡ配列をも含有している。

発現コントロール配列：クローニングビヒクル中のＤＮＡ配列であって、クロー ニングビヒクル中の遺伝子と機能的（操作可能）に結合した際、この遺伝子の発 現を調節（コントロール）し、制御する配列。

シグナルＤＮＡ配列：ボリペプチドまたはタンパク質のための遺伝子内に含まれ ているＤＮＡ配列であって、ｍＲＮＡの鋳型として、このポリペプチドまたはタ ンパク質のアミン末端の疎水性アミノ酸の配列、即ち、ポリペプチドまたはタン パク質のｆシグナル配列」または「疎水性リーダー配列」、をコードしているＤ ＮＡ配列。シグナルＤＮＡ配列は、ポリペプチドまたはタンパク質のための遺伝 子内において、該遺伝子の構造ＤＮＡ配列の直前であって、該遺伝子の翻訳開始 シグナル（ＡＴＧ）の後方に位置している。シグナルＤＮＡ配列は、ポリペプチ ドまたはタンパク質の前駆体に固有の、これらポリペプチドまたはタンパク質の ためのシグナル配列をコードしている。

前駆体：宿主細胞内で、シグナル配列を伴なって合成されたポリペプチドまたは タンパク質を指す。

下流および上流：暗号ＤＮＡ配列の上で、下流とは、転写される方向、即ち、５ ′から３′への方向を指す。上流とは、その反対方向を指す。

組換えＤＮＡ分子またはハイブリッドＤＮＡ　：異なるゲットに由来するＤＮＡ セグメントから成る分子であって、生きている細胞外で、末端−末端結合の結果 得られ、ある宿主細胞に感染し、その中に保持され得る分子。

構造ＤＮＡ配列：特定の成熟ポリペプチドまたはタンパク質（活性型のポリペプ チドまたはタンパク質）にとって特徴的なアミノ酸配列をコードしている、遺伝 子内のＤＮＡ配列。

本発明は、ペニシリンＶアミダーゼまたはそのあらゆる活性な誘導体をコードし ているデオキシヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ分子を提供するもので ある。該デオキシヌクレオチド配列の起源は本発明にとって重大なことではなく 、天然、合成または半合成の供給源等、いかなる供給源を用いても良い。ペニン ジンＶアミダーゼをコードしているＤＮＡの供給源は、大多数か細菌性供与体（ 例えはＢ、スファエリカス株）であるが、合成曲に生産された分子を用いること もてきる３゜ 本発明（こ従って組換えＩ）　Ｎ　Ａ分子を調製するには、＋ｊＩｌｌ限酵素を 用いて適当なりローニングビヒクルまタハヘ’ｌ　’Ｊ　−ヲ開裂させ、ペニシ リン■アミダーゼをコードしているＤ　Ｎ　Ａ配列またはフラグメントを開裂部 位に挿入し、組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を組立てる。この一般的手法は自体既知”で あり、ＤＮＡ配列を、開裂したクローニングビヒクルに結合させるだめの様々な 技術または方法は、文献に記載されている１６゜選択されたベクター内に挿入ず べきデオキシヌクレオチド配列の供給源として１１．スファエリカスを用いる場 合には、このＢ、スファエリカス株を酵素リゾチームで処理してプロトプラスト を形成させた後、これを溶解させ、ｐＮＡを抽出、単離してＤＮＡ製品を調製す る６、過当な制限酵素で部分消化することにより、　］）　Ｎ　Ａを適当な大き さのフラグメントに切断することができる。ベクターを、同一、または別の制限 酵素で処理した後、ベクターの開裂産物と上記の如く分断されたＤＮＡ産物とを 混合し、リガーゼ酵素の存在下、無作為に結合させる。ライゲート（結合）１〜 たＤＮＡフラグメントの組合わせ物を、適当な微生物細胞（例えば細菌）内での 生物学的な活性に基つき、スクリーニングすることができる。、ベクターまたは ベクター／バチラスＤＮＡの組合わせ物、のいずれかを含有している形質転換細 胞は、ベクター内に含まれている適当なマーカー（例えばデトラサイグリン耐性 ）に基づいて選択され得る。この様にして、多数（例、数十個）の、バチラスＤ ＮＡ含有クローンで構成される、Ｂ、スファエリカス菌株の遺伝子バンクが得ら れる。次いで、ペニシリンＶアミダーゼ生産性遺伝子を含有しているクローンま たはクローン類を、ペニシリンＶアミダーゼ活性のための適当な分析法、例えば 、５−ＡＰＡ生産物に対１−で感受性のある方法により検出することができる。

前記の如く、ペニシリン■アミダーゼ生産性のクローンのＤＮＡのフラグメント を、同一または別の宿主微生物にサブクローンしても良い。

本発明に用い得るクローニングビヒクルまたハコフタ−は、とりわけ形質転換す べき宿主細胞が何であるか、即ち、それが細菌、酵母、あるいは菌類等のいずれ であるかに依存する。有用なりローニングビヒクルは、例えは、染色体の、非染 色体の、または合成による、ＤＮＡ配列のセグメントで構成されており、例えは 、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２，２およびその誘導体を含む）の如き種 々の既知の細菌性プラスミド、ファー′シラムダの誘１体の如きファージＤＮＡ 、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせによるベクター、酵母プラスミド 、および特別に組立てられた構成的なプラスミド等がある。特定の宿主について 特別のクローニングビヒクルを選択することは、当該技術者にとって可能であり 、さらに彼らは、使用された制限酵素によって開裂部位が左右されるということ に基づき、特殊なりローニングじヒクルの各々におケルＤ　ＮＡ伸六入部位選択 することもできる。本発明に用いられるクローニングビヒクルは必ずしも選択さ れたＤＮＡフラグメントを挿入するための制限部位を有している必要はなく、そ の代り、このクローニングビヒクルとフラグメントとを、当該技術分野で周知の 別の方法１６により、結合させてもよい、 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の菌株〔例、大腸菌および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　）　、酵母並びに他の菌類、培養植物細胞、その他 の宿主類が含まれる。本発明においては、非病原性であるととから、土壌細菌の 枯草菌が最終的な宿主として特１こ有用と思われる。しかしながら、例えば、Ｂ 、スファエリカスの如く、既にペニシリンＶアミグーゼを産生じている菌株を、 本発明のペニンジン■アミダーゼをコードしている組換え分子で形質転換し、Ｂ 、スファエリカス細胞中のペニシリン■アミダーゼ暗号遺伝子の数を増加させる ことも、本発明の軸囲内に含まれる。酵母（その遺伝学はかなり良く知られてい る）もまた、本発明の方法１こより、ペニシリンＶアミダーゼ生産性の微生物に 形質転換する上で、好ましい最終的な宿主である。

本発明においては、供与体バチラス株のプロモーター配列と、ペニシリン■アミ ダーゼ暗号配列とを一緒にクローニングビヒクルに挿入するのが最も好ましい。

この様な例は、バチラス株の、プロモーターから終止コドンに至る全ペニシリン ■アミダーゼ暗号遺伝子がクローニングビヒクルに挿入される場合である。その 他、天然に存在しているベクターのプロモーターや、強力な外部プロモーターの 挿入によって修飾されたベクターのブロモ−ター等も用いることができる。

上で定義した、ペニンジンＶアミダーゼの活性な誘導（木をコードして゛いるＤ ＮＡは、ペニシリンＶアミダーゼをコードしているＤ　Ｎ　Ａ配列に部位特異的 な突然変異を誘導するこ乏により、得られる。また、遺伝子って記載２４〕、即 ち、２またはそれ以上の遺伝子の暗号配列を一緒に切り継き（スプライシング） することをこより、適当な宿主生物内で発現した際に、各々の遺伝子かコードし ている別々のタンパク質またはポリペプチドを融合した屯−分子として生産する ことができる結合遺伝子を形成させることからなる方法を利用することもできる 。本発明においては、ペニシリンＶアミダーゼ活性をコードしているＤＮＡ配列 と、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列とを結合 させ、該所望のタンパク質またはポリペプチドとペニシリン■アミダーゼとの融 合産物を発現し得る機能的な遺伝子を得るために、遺伝子融合法を用いる。

本発明によって得られたペニシリンＶアミダーゼ産物は、常法通り回収すること かできる。例えば、タンパク質またはポリペプチド産物のためのシグナル配列か 合成されず、産物が細胞内に留まっている場合、単離を有効に行う為には、ル削 １こ細胞を破壊ｌ、なければならない。その様な唇ｔ］胞壁の破壊は、例えば、 圧縮、超音波法、均質化、ガラスピーズとの振盪等により行うことがてきる。

以下に実施例を挙げ、本発明について詳細に説明するが、本発明はこれに限定さ れるものではない。これは単なる例示であり、バチラス株由来のペニシリンＶア ミダーゼ遺伝子を枯草菌および大腸菌にクローニングすることについて、添付図 面を参照しながら説明する。

第１図はミニ細胞製品、並びに、Ｂ、スファエリカスから得た精製（純化）ペニ シリン〜′アミダーゼの５ＰＳ−ＰＡＧＥ像である。同一のゲルに試料を適用し た後、このゲルを１／′２に分割し、それぞれのバンドをオー・トラジオグラフ ィー並ひにクマラン−（Ｃｕｍａ　ｓ、ｓ　ｙ　）染色により、観察した結果を 示している。

第２図はペニシリンＶアミダーゼの至適ｐＨを示すグラフである。

第３図は、ペニンジンＶアミダーゼ（こ関するラインライ−バー−パークのプロ ン１−（ＪＬ）、並びに、５９ｍＭ５−　Ａ　Ｐ　Ａ（０）および２．ＯｒｎＭ ７−Ｚ／キシ酢酸（＋）が共存する場合のラインライ−バー−パークのプロット を示すグラフである。

第４図はペニンジンＶアミダーゼをコードしている遺伝子をサブクローンするの に用いられるプラスミドの組立て模式図である。関連する制限部位が示されてい る。太い線の部分はプラスミドベクターを、細い線の部分は挿入フラグメントを 示している。関連する制限部位も示されている。

実施例における、出発、出発物質、緩衝液、細胞培地、および常に用いられる手 法を以下（こ示す。

出発物質 使用した細菌の菌株およびプラスミドを以下の表に示す。

表１ 菌株およびプラズミド　関連する特性　参考文献大腸菌ＨＢ　１０１　遺伝子組 立ての宿主　ボイヤーら（Ｂｏｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ）３バチラス・スファエリカ スペニシリンＶアミダービ産生ｍ　ＡＴＣＣ１４５７７セラチア・°２−ヒツセ ンス５−ＡＰＡ感受性　ＡＴＣＣ２７１７７枯草菌１６８　基準菌株　ＡＴＣＣ ６０５］犬腸閑Ｍ２１４１　ミニ細胞産生菌　ドーガンら（Ｄｏｕｇａｎ　ｅｔ 　ａｌ）８ｐＴＲ２６２陽性選択ベクター　ロパーツら（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｃ ａｌ）２１ＰＯＨ３５ｒｃ’、−＜＝、＋）　７Ｖ７：ダーＭ＋　”△ ★後に、本文中で説明する 緩衝液および培地 ルリアーブｏ　ス（Ｌｕｒｉａ−ｂｒｏｔｈ　、　ＬＢ　）　ニジフコ（Ｄｉｆ ｃｏ）　ト！Ｊ７’ドア１０ｃＳ’、ジフコ酵母エキス５ｇ、ＮａＣｇ　Ｏ，５ ！ｙ、ＬＭ　ＮａＯＨ２，ｙｎｌ　；　ＬＭ　ＮａＯＨでｐ）（７，Ｑに調節； オートクレーブ処理の後、２０％グルコース１０Ｉｌｌを添加。

ＬＡ−培地＝１％ジフコ寒天を補充したルリアーブロス。

トリス−Ｅ　Ｉ）　Ｔ　Ａ緩衝液（ＴＥ）二〇、００１　Ｍ　ＥＤＴＡおよびｏ 、ｏ１ｈｔトリス（ｐＨ７，８）。

ＮＹ−培地：ジフコ栄養ブロス８ｇ、ジフコ酵母工４　ス５　ｊｑ　１１　Ｍ　 Ｍｇ　５ｏ４５　ｄおよび２．ｍＡ’　１０　ｍｌ　ｍＭ　ＭｎＣ，ｇ２（オー トクレーブ処理後（こ添加）。

軟寒天：０．６％ジフコ寒天を補充したルリアーブロス、 抗生物質類は、ファイサー（Ｐｆｉｚｅｒ）　（テトラサイクリン）、アストラ （Ａｓｔｒａ　）　、スウェーデン（γンピ／リン）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）　 （クロラムフェニコール）および７エルメンタ（Ｆｅｒｍｃｎｔａ　）、スウェ ーデン（ペニシリン■、６−ＡＰＡおよびフェノキシ酢酸）から得た。３５Ｓメ チオニンはニューイングランド・ヌクレフ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ ｌｅａｒ　）から得た。

種々の方法は、特に断らない限り下記の如く１こして行われた。

形質転換ニブラスミドＤＮＡによる大腸菌に１２の形質転換は、モリソン（Ｍｏ ｒｒ　１ｓｏｎ　）１９の記載と全く同様に行われた。形質転換細胞の選択は、 単一のコロニーを適当な抗生物質（即ち、１０μｊｑ　／ａｔのテトラサイクリ ン）を含んだＬＡプレート（平板）上で平板培養することにより、常法通り行わ れた。枯草菌のプロトプラストを、チャン（Ｃｈａｎｇ）およびコ−ｘ　：／　 （Ｃｏｈｅｎ）７の記載と全く同様にして形質転換した。

プラスミドの単離ニブラスミドの大量生産は、タナ力（Ｔａｎａｋａ　）および ワイスブルム（Ｗｅｉｓｂｌｕｍ）２２（７）記載と全く同様にして行われた。

プラスミドのために、多数のクローンを計数するために、バーンボイム（Ｂ　ｉ 　ｒｎｂｏ　ｉｍ　）およびドリイ（Ｄｏｌｙ）’の「ミニアルカリ法（ｍｉｎ ｉ　ａｌｋａｌｉ　ｍｅｔｈｏｄ　）　Ｊをそのまま採用した。

ＤＮＡの制限酵素消化：ニューイングランド・バイオラボス、ウオ／Ｉ／　サム （Ｗａｌ　ｔｈａｍ　）、ＭＡ　、　Ｕ　Ｓ　Ａから購入した普通の制限酵素を 用いてＤＮＡを開裂させた。

通常の濃度および温度の下、業者指定の緩衝液中で制限酵素をＤＮＡに加えた。

ＤＮＡフラグメントのライゲーティング（結合）：全でのＤＮＡフラグメントは 、ニューイングランド・バイオラボ、ウオルザム、ＭＡ、ＵＳＡから購入したＴ ’　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｕガーゼを用い、業者指定の緩衝液中で、１４℃において 一夜ライゲートさせた。

アガロースゲル電気泳動：０．７％アガロースゲル電気泳動を、ヘリング（Ｈｅ ｌｌｉｎｇ）９　らの記載と全く同様にして、切断されたプラスミドフラグメン ト、スーパーコイル・プラスミド、および長さ１０００〜１．０．０００ヌクレ オチドのＤＮＡフラグメントを分けるために、行った。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動：１３％ポリアクリルアミドゲル゛屯気味気泳 動ラエムＩＪ　（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　）１４（７）記載と全く同様にして、分子 量５，０００〜１２０，０００　のタンパク質を分ける目的で行った。

Ｄ　Ｎ　Ａノ１［：　Ｂ、スファエリカスの染色体性ＤＮＡの調製は、全閉を溶 解した後、ドデンル硫酸すｌ−ＩＪウム（ＳＤＳ）処理に付し、フェノール抽出 することにＮａＣ１を含有する］、−Ｅ　ハフ　７７−中１０−３０％（Ｗ／ｖ ）ショ糖密度勾配〔マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの方法に従う〕を用い て分画した。大腸菌由来のプラスミドは、バーンボイ去およびドリイ（１）の記 載したアルカリ性溶解法により、調製した。枯草菌由来のプラスミドは、以下の 改良アルカリ性溶解法により、調製した。−夜培養物５　ｍｅを遠心し、得られ たペレットを全量５００μｅのリゾチーム溶液（０，３Ｍショ糖、２５ｍＭ　） リス／ＨＣＩ　ｐＨ８，０，０，０２％ブロムフェノールブルー、２５ｍＭ　Ｅ ＤＴＡおよび２Ｎ＋！７／ｍｔリゾチーム）に再懸濁した。この懸濁液を３７℃ で３０分間インキュベートした。ＮａＯＨ／ＳＤＳ溶液（０，３Ｍ　ＮａＯＨと ２％５ＤＳ）２５０μｇを加えた後、混合物を６５℃で２０分間インキュベート した。次いで、この溶液を８０μｅのフェノール／クロロホルム（フェノール５ ００ｇ、クロロホルム５００　ｄおよび水２００　ｍｌ　）で抽出し、層分離し た後、プラスミドＤＮＡを含む水層を、０．３Ｍ酢酸ナトリウムと１容量のイン プロパツールにより、沈殿させた。

ング：Ｂ、スファエリカスＤＮＡを有する大腸菌のクローンをＬ　、Ａ平板上で レプリカ培養し、−夜インキユベートした。次いて、これらにセラチＴ・マーセ ンセンスを含んだ軟寒天（−夜培養物Ｑ、　５　ｍｅ　／１００　ｒｄ　）　５ ｍｌとペニシリンｖ（４’４　／　ｍｅ　）を重層した４、平板を２８℃で一夜 インキユベートシ、メイヤー１７の記載に従って陽性クローンを検出した。陽性 クローンをより早く検出し得る別法も開発された。細胞を６−ニトロ−３−フェ ニルアセトアミド−安息香酸の２ｍＭ溶液中に懸濁し、加水分解を測定した。反 応生成物、５−アミノ−２−ニトロペンツイック・アシッドは、４０５１ｍにお ける光学密度の増加を記録することにより、定量的に測定され、また、肉眼検査 により、定性的に測定された。この基質は、グラディエンド・ゲル電気泳動にお ける酵素的染色にも使用された。６−ニトロ−３−フェノキシアセトアミドベン ツイック・アシッドは、フェニルアセテートをフェノキン酢酸で置き換える外は 、クランバッハ（Ｋｕｔｚｂｕｃｈ　）およびラウゼンプッシュ（Ｒａｕｓｅｎ ｂｕｓｃｈ　）　１３が以前に記載した方法に従って合成された。この生産物は 、フ。リシル（Ｆｌｏｒｉｓｉｌ■）カラトを用いて最終的に精製された。

ミニ細胞の精製および標識化：ミニ細胞は、ケネデイ（Ｋｅｎｎｅｄｙ　）１’ の記載した方法に従い、２図のンヨ糖密度勾配遠心法により、大腸菌株Ｍ　２１ ４１　から精製された。ミニ細胞の３５５−メチオニ、ン１こよる標識化は、モ リン（Ｍｏｌｉｎ）ら１８の方法に従い、グルコース、ナアミ／およびメチオニ ン測定（アッセイ）培地を補充した最小培地中で行われた。

ペニシリンＶアミダーゼ活性の測定：適当な抗生物質を含んだ液体培地中で細胞 を増殖させ、−夜増殖させた後、収穫１．た。細胞を１／１０容量の０．１Ｍク エン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５゜８）に再懸濁し、音波処理によって破壊した 。ホモジネートを遠心し、上清のペニシリンＶアミダーゼ活性を測定した。基準 測定混合物（全量５００μｅ）は　Ｑ、　Ｉ　Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ５，８）に３％（Ｗ／Ｖ）のペニシリン■（カリウム塩）を含有するものであ る。酵素（５０−２５０μｅ）の添加によって反応を開始し、混合物を３７℃で ５０分間、インキュベートした。沸騰している水浴中で９０秒間加熱することに より、反応を止めた。コーンフェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ　）１２の記載に従っ て５−　Ａ　Ｐ　Ａを定量した。反応生成物である５　−Ａ　Ｐ　Ａは、ロウエ （Ｌｏｗｅ　）ら１５の方法に従い、薄層クロマトグラフィーによっても同定さ れた。０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５−６，２）および０．１ Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，８−８，０）を用いて至適ｐＨをめた（第 ２図参照）。

１３、スファエリカスからのペニシリンＶアミダーゼの単％ｌＩ：Ｉ３．スファ エリカスを、１２ｇの発酵槽〔ケモフｘ　／ｌ／　ム（Ｃｈｅｍｏｆｅｒｍ　） 　）を用い、ＮＹ培地中で、ｐＨ調節を行わすに、ｌ　ｖｖｍの通気条件下、７ ００　ｒｐｍで撹拌しなから、３０℃で増殖させた。１０〜１１時間増殖させた 後、ＣＥＰＡ遠心機内で細胞を収穫した。１０Ｃの培養培地からの収量は８５ｇ （湿側ｌであった。

細胞ペーストを、５ＱｍＭりん酸カリウム緩衝液（ｐＬ４６．８）ｌこ懸濁（１ ６ｇ湿重量／６０ゴ）、シ、０℃で音波処理（５Ｘ４５Ｓ、７０Ｗ）Ｌ、て細胞 を破壊した。抽出物を４℃において、１５，０００　Ｘｇで３０分間遠心し、上 清を用いてカールセン（Ｃａｒｌｓｅｎ）およびエンボーグ（Ｅｍｂｏｒｇ　） ６　の記載した方法と実質上、同様にして酵素を精製した。４０％硫酸アンモニ ウム沈殿に付した後、７０％硫酸アンモニウムで酵素を沈降させた。沈殿を少量 の０．１　Ｍ　トリス／　ＨＣ（ｌおよびｌ　Ｑ　ｍＭ　ＥＤＴＡｐ）［ｓ、ｏ に再懸濁し、０．１　Ｍ　）リス／ＨＣｇとｌＱｍＭＥＤＴＡ　ｐＨ８，Ｑで平 衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａ＋ｉｅｘ■）Ｇ−２００ゲ７．＃ラムにか けた。同じ緩衝液を用いてカラムを溶離し、活性の高い両分をプールし、即座に ＤＥＡＥ−セファデックス０Ａ−５０カラムミンを標準に用い、ブランドフォー ド（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　）の方法（こより、測定した。ポリアクリルアミドゲル 電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　）　１４の記 載に従って行った。等電点電気泳動法は、ＬＫＢアンフォリンＰＡＧプレー１− 　（ｐＨ４，０−６，５）を用いて行った。

天然の酵素の分子量は、Ｇ３０００ＳＷゲルを充填したＬＫＢ　２１３５ウルト ラパツク（Ｕｌ　ｔｒａｐａｃ　）　Ｔ　Ｓ　Ｋカラムを用いて測定した。５０ ｍＭりん酸カリウム緩衝液（０，２Ｍ　ＮａＣｎでｐＨ７，０ｆこ調節）である 。

Ｂ、スファエリカスからのベニンジン■アミダーゼの精製および特性化二Ｂ、ス ファエリカスからペニシリンＶアミダーゼを精製した。精製方法、およびその結 果を表２にまとめた。

表２　Ｂ、スファエリカスからのベニ・、／リノＶアミダーゼの精製（要約） 精　製　容量　総活性　総タンパク　比活性　精　製　収率Ｉ　Ｇ、　（ｍ／り 　（Ｌ’）ａｆｉｔ（Ｍｌ？）ｌ）（ｔＪ／Ｑ）７Ａ’タ＝（％）音波処理　４ ４　１５４０　１１７０　１．３１　］　１００（１，ｉｌ（酸アンモニウム　 １６　８７４　３３３　２．６２　２．０　５６ａ　１単位（ＩＵ）とは、１分 間に６−’〜ＰＡ　１μｍｏｌ　を形成する触媒作用を示す酵素の量と足表する ４、コーン・フェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ　）】２の方法に従って測定した。１ １）　タンパク質量は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　）４の方法に従 って測定された。

最終製品の純度を５ｌ）Ｓ−ＰＡＧＥにより分析したところ（第１図）、タンパ ク質の総合有量の９５％咀上に対応して、分子ｉ！３５，０００　ｉこ主要なバ ンドが認められた。２つの別個の方法で天然の酵素の分子量を測定した。勾配電 気泳動の後、酵素染色することにより、公刊ｔ１．４，０００の１つのバンドが 得られ、ＨＰ　Ｌ　Ｃ−システム中でゲル濾過することにより、分子１ｔ１３， ５００を得た。このことは、天然の酵素が、分−１’！３５，０００の４個の同 一のサブユニットから１戎っていることを示唆するものてあ７石１、 天然酵素の等ｔＡｉ点を、等市点奄気泳動法で測定した結果、Ｉ）Ｉ　４，３の 位置１こ−Ｌバッドか認められた。３神々のｐＨ値（こおけ乙酵素活性を測定り １、至適））ｆ−１かｐＨ５，８付近であるＰＦ■−像を得た（第２図）。反応 速度に関する性質は第３図に示されている。１１ｍＭのＫｍは萌（こ公表された 値６より有意（こ低い。第３図から分る様に、両酵素産物はいずれも反応を阻害 する。、フェノキン酢酸は、非競合的な阻害剤（Ｋｉ　２５　ｒｎＭ　）てあり 、６−、　Ａ　Ｐ　Ａは競合的な阻害剤として作用する（　Ｋ　ｉ　５　ＱｍＭ ）。

ングおよび発現：Ｉ３．スファエリカスＤＮＡの遺伝子ノくンクを組立てた。染 色体ＤＮＡをＭｂｏＴで部分消化し、ショ糖密度勾配遠心法（１，０−３０％） で分画し、約１０キロベース（Ｋｂ）の７ラグメントを含んだ画分を混合１、Ｔ ：Ｂｃｉ　Ｉ　−ＴＪｊＡ裂ｐＴＲ２６２２１（！：　ライＹ　−トＬ、大腸菌 ＨＢ１０１の形質転換に用いた。約２２００のテトラサイクリン耐性クローンを マイクロタイタープレートに移し、−夜増殖させた後、フリーザー内で一８０℃ において保存した。セラチア（５ｃｒｒａＬｉａ　）重層法で約１０００個のク ローンをスクリーンし、２個の陽性クローン、ｐ　Ｏ）Ｉ　２およびｐ　ＯＨ３ を発見した。これら２個のプラスミドの内、小さい方のｐＯＨ３の制限地図を第 ４凶に示す。このプラスミドｐ　Ｏｔ−［３を伴なっている大腸菌株はＰ〜’　 Ａ３と命名され、既に、ドイツ・号ムルング・フォノ・ミクロオルガニズメン（ ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｅｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ ｎ　）に寄託されており、寄託番号ＤＳＭ　２９８２を得ている。ｐ　ＯＨ３内 の挿入体の大きさは９．ｌｋｂ　であることが示された。アミダーゼ活性を現わ す上で必要な挿入体ＤＮＡの最小のゲイスミドｐＯＨ３１は、Ｐｓｔ　■消化と 再ライゲーションで得た、２．２ｋｂフラグメントを含有するプラスミドｐＯＨ ３５と対照的に、機能的なアミダーゼ活性を有していない（表３）。ｐａｌ（３ ５からＣ１ａｌ：フラグメントを除去すると活性か消失することから、このフラ グメント内に、遺伝子の全て、または一部か存在していることが分る。得られた プラスミドｐ０１（３５は、何故か分らないか全ての単離されたクローン中で例 外的に、二量体の形で見出された（第４図）。枯草菌および大腸菌のためのシャ トルベクターは、ｐＯＨ３５のＨｉｎｄ■部位（（Ｈｉｎｄ　ｍ　開裂ｐｃ１９ ４１０（クロラムフェニフール・アセチル・トランズフエラーゼの遺伝子を有す る）を挿入することにより、組立てられた。得られたプラスミドを、ｐ　ＯＨ３ ８（’Ｓ　４図）と命名した。得られたプラスミドｐｏｔ（３８で枯草菌のプロ トプラストを形質転換した。クロラムフエニフールを含有する再生平板上で形質 転換体を選択した。プラスミドの精製および酵素消化の結果、全てのクロラムフ ェニコール耐性クローンがｐＯＨ３３を含有していることか分った。アミダーゼ 活性の発現は、細胞不含抽出物を用いて確認された。このプラスミドｐＯＨ３３ を伴なった枯草菌の菌株は、ＰＶＡ　３８と命名され、ドイツ・サムルング・フ ォノ・ミクロオルガニズメンに寄託されており、寄託番号ＤＳＭ２９８３を得て いる。大腸菌および枯草菌の細胞不含抽出物中のアミダーゼの比活性を表３に示 す。種々の大腸菌クローンの比活性は、Ｂ、スファエリカスの示す値よりも低い 。枯−ｑ菌（ｐＯＨ３８）　は、Ｂ、スファエリカスの２倍の活性を示ス。

表３　伸々の菌株およびクローンのペニン＋１　’ｙ　Ｖアミダーゼ比活性 閑　株　プラスミド　比活性（Ｕ、ｚ’、！ｉ’　）　”入ｉ陽菌ｔｌｌｓｌ　 Ｑｌ　ｐＯＨ３１１０ｐＯＨ３１０ ｐＯＨ３５１１０ ［）ＯＨ３６０ ｐＯＨ：３８　８２ 枯　草　菌　ｐＯＨ３８４１０ ｐ　Ｃ］、　９４　０ Ｂ、ス゛ノアエリカス　２４０ ａ　−フーンフエルド１２の方法に従って測定した。０の値は１（Ｊ、、１５７ 以Ｆに相当する。。

プラスミドにコードされているペニソリンＶアミダーゼの同定；プラスミドｐＯ Ｈ３５、ｐＢＲ３２２およびｐＵＮ　１０１を用いて大腸菌ミニ細胞株〜１２１ ４１を形質私侯１７た。、ミニ細胞を３５５−メチオニンで標識した。

Ｓ　Ｄ　５−ＰＡＧＥ上で分＝ｉ　Ｌだ憬、プラスミドにコードされているポリ ペプチドを同定した（第１図）。ｐ　ＯＨ２Ｓにコードされており、Ｂスファエ リカスから精製されたベニンジン＼′アミダーゼと一緒に泳動するタンパク質が 見い出された。

本発明の態様は上記の如く示されるが、本発明はこれら↓こ限定されるものでな く、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を逸脱することなく、本発 明の方法や組換え物質を様々をこ変化させ、さらに、改良を加えることかできる 。

このことは、本発明が、例えは所望のタンパク質またはポリペプチドをゴー　ド している１またはそれ以上の別々のデオキシヌクレオチド配列を含有しているク ローニングビヒタルをも包含するこさを意味している。

さらに本発明は、天然、合成、半合成のいずれの起源であっても、前記の定義に 従い、１個または複数個の塩基の置換、欠失、挿入または逆位等の突然変異によ ってペニシリンｖｒミダーゼまたはその活性なフラグメントをフードしているデ オキシヌクレオチド配列と関連つけることかできるデオキシヌクレオチド配列を 含有している組換えＤＮＡ分チをも含むものである１゜本明細書中（こ引用した 文献を以下に列挙する。

１　バー　ンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，）　、およびドーリイ（Ｊ 、　Ｄｏｌｙ、）　１９７９．　ヌクレイツク・アンラド・リサーチズ（Ｎｕｃ ｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　）　７：１５１３−１５２３２　ポリｙ＜　−（Ｂ ｏｌ　１ｖａｒ、　Ｆ、　）、　ａトリクｘ　７　ツ（ＲｏＬ。

Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ）　、クリ−ｙ　（Ｐ、Ｊ、　Ｇｒｅｅｎｅ）、ベトラツハ （Ｍ、Ｃ，Ｂｅｔｌａｃｈ　）　、　ヘイ不ツカ−（Ｈ，Ｌ、Ｈｅｙｎｅｋｅｒ 　）。

ホイヤー（１−（、〜Ｖ、Ｂｏｙｅｒ）、　りａす（Ｊ　、Ｈ，Ｃｒｏｓａ）　 、および７７　ル：］つ（Ｓ、Ｆａｌｋｏｗ　）　１ｇ７７、ジーン（Ｇｅｎｅ 、）　２：９５１１３ ：３　ボ・イヤー（Ｉもｏｙｃ　ｒ　、！−１．Ｗ、　）　、およびローランド 〜ヂュソー（１）、Ｒｏｕｉｌａｎｄ−１）ｕｓｓｏｉｘ　）　】９６９　、ジ ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ（Ｊ　、Ｍｏｌ　。

Ｂｉｏｌ）　４１：４５９−４７２ ４　ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ｍ、Ｍ、）　１９７６．７ナリテ イカ／Ｌ７−　バーｆ　オ’ｒ　ミス）シイ（Ａｎａ　１　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅ ｍ、）７５　：２４８−２５４ ５　カー／ｌ／　セフ　（Ｃａｒｌｓｅｎ、Ｆ、）、およびエンボーグ（Ｃ。

Ｆ、ｍｂｏｒｇ　）　１９８１．バイオチクノロシイ・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉ、ｅｔｔｅｒｓ）、　：３：３７５−３７８６　カールセン １′、、およびＣ６毛ンボーグ１．９８２　、ジエイ・ノｒム・チク・バイ尾− デク／　ａ　（Ｊ　、Ｃｈｅｍ、　Ｔｅｃｈ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　、）　３２　：　８０８−８１１７　チャフ　（Ｃｈａ ｎｇ、Ｓ、）、および−１−ｘ　７　（Ｓ　、ｊｓｉ、Ｃｏｈｅｎ、）】９７９ モル・ジエン・ジエネテ（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）１６８　：１１１− １１５ ８　ドウガン（Ｄｏｕｇａｎ　、　Ｇ、）　、およびソエラソ）（Ｄ。

５ｈｅｒｒａｔｔ、）　１ｇ７ｇ、モル・ジエン・ジェネテ（Ｍｏｌ　、Ｇｅｎ 、　Ｇｅｎｅｔ、）　１５１　：１５１−１６０９　ヘリング（Ｈｅｌｌｉｎｇ 、Ｒ，Ｂ、）、グツト７　：／　（ＨＪイ。

Ｇｏｏｄｍａｎ）およびボイヤー（Ｈ，Ｗ、Ｂｏｙｅｒ）　１９７４−　ジャー ナル・オブ・ヴイロロジイ（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　１４１０　ホリノウチ（Ｈｏ ｕｒｉｎｏｕｃｈｉ　、Ｓ、）、およびワイスプラム（Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌｕｍ　 ）　１９８２．ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅ目ｏ１． ）　１５０：８１５−８２５１１　ケ不ディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｎ−）　、ビュ ーティー／　（Ｌ、Ｂｅｕｔｉｎ）。

アクト７７　（Ｍ、Ａｃｔｍａｎ　）　、スキュレイ（Ｒ，Ｓ　ｋｕｒｒａｙ） 　。

５−　ムスドＪｌ／　７　（Ｕ、Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ）　、およびヘーリッヒ（ Ｐ、Ｈｅｒｒｌｉｃｈ　）　１９７７、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｃ）２７０　： 　５８０−５８５ １２　：Ｊ　−７／−ｒ−ルド（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、Ｊ、Ｍ、）　１９７８．ア ナリナイ力ルーバイオケミストリイ（、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）１３ｚ ”ツ＝ツバソバ（Ｋｕｔｚｂａｃｈ、Ｃ，）　、およびラウエンブソ７′、：＋ −（Ｅ、Ｒａｕｅｎｂｕｓｃｂ　）　ＩＱ７４．　ホツベー（−イラ−ズ・ｌ・ フイジオロジカル・ケミストリ・イ（１（ｏｐｐｅ−５ｅｙｌｃｒｓ　Ｚ　Ｉ’ ｈｙｓｉｏｌ　、Ｃ，ｈｅｍ、）３５４：４５−５３１４　ラエムリ（Ｌａｅｍ ｍｌ　ｉ、　ＬＪ、に、）　１９７０．＊　イ＋　ヤ−（Ｎａｔｕｒｅ）　２２ ７：６８０−６８５１５　ロウエ（Ｌｏｗｅ　、Ｄ、Ａ、　）　、ｏマンツク（ Ｇ、Ｋｏｍａｎｃｉｋ）　。

お上ひよラング−（Ｉ（、Ｐ、Ｆ、１ａｎｄｅｒ　）　１９８１　デベ・インタ ・ミクロバイオｏ　（Ｄｅｖ、Ｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ！、）２２：１６３− １８０ １６マニアテイス（Ｍａｎｉａｃ　ｉｓ　、Ｔ、）　、フリツチェ（Ｆ、、Ｆ。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ）、および４ｆ　ムブルツク（Ｊ、Ｓａｍｌ）ｒｏｏｋ　）１． ９８２．モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ ラトリイ（Ｍｏ　ｌ　ｅｃｕｌ　ａ　ｒｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１７　メイヤー（Ｍａｙｅｒ　、 　Ｈ，）　、コリンズ（Ｊ　、Ｃｏｌ　１１ｎｓ）　。

およびワガー（Ｆ、Ｗａｇｅｒ）　１９７９．　ｐ　４５９−４７０、ティミス およびプーラ−編（ＫＪＪ、Ｔｉｍｍ１ｓ　ａｎｄ　Ａ。

Ｐｕｈｌｃｒ（ｅｄｓ）　〕医学上、環境上、並ひに商業上重要なプラスミド（ Ｐｌａｓｍｉｃ（ｓ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃａ＋　、　ｅｎｖｉｒｏｎ、−ｍｅｎｔ ａｌ　ａｎｄ　ｃｏｒｎｍｅｒｃｉａｌ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ）バイオメディ カル・プレス、エルセヴイア／北オランダ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ 、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　）１８モリン（Ｍｏｌｉ ｎ、Ｓ、）、　スタウガー、ド（Ｐ、Ｓｔｏｕｇａａｒｄ）。

ライト（Ｊ　、Ｌｉｇｈｔ）　、ノルドストｏ　−ム（ＭＪＪｏｒｄ　−ｓ＋ｒ ｉ；ｍ）、およびノルドストｏ−ム（Ｋ、Ｎｏｒｄｓｔｒｉ；ｍ　）１９８１、 モル・ジエン・ジエネテ（Ｍｏｌ　、Ｇｅｎ、Ｇｃｎｅｔ、）１８１：１２３− １３０ １９　モＩ＋　７　ン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｉ）、Ａ、）　１９７９．Ｐ、３２ ６−３：Ｈウー編（Ｒ，Ｗｕ（ｅｄ、）　、　）酵素学における方２　（Ｍｃｔ ｈｏｄｓｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　Ｖｏｌ　５８．アカデミツク・プレ ス、＝　ニー　３−　り（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　）２０　二＃　７７　（Ｎｉｌｓｓｏｎ、　Ｂ、）、ウーレ７　（Ｍ　、Ｕｈ ｌｅｎ）　。

ジョセフ７　ン（Ｓ、Ｊｏｓｅｐｈｓｓｏｎ　）、ガーｙ−ンベック（Ｓ、Ｇａ ｔｃｎｂｅｃｋ）、およびフィリップｖン（Ｌ。

Ｐｈ１ｌｉｐｓｓｏｎ　）　１９８３．スフレイック・アシッド・リサーチズ（ Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　）　１１　：８０１９−８０３０２１　ロパ ーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｔ、Ｍ、）、　スフ　７バーグ（Ｓ、Ｌ。

Ｓｗａｎｂｅｒｇ　）　、ポテーテ（Ａ、Ｐｏｔｅｅｔｅ）　、ジーデル（Ｇ、 Ｒｉ　ｃｄｅ　ｌ　）　、およびバック？　７　（Ｋ、Ｂａｃｋｍａｎ　）　１ ９８０゜ジー：／　（Ｇｅｎｅ）　１２：１２３−１２７′２２　タナ力（Ｔａ ｎａｋａ　、Ｔ、）およびワイスフルム（Ｂ。

Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、）　１９７５−ジャーナル・オブ・バクテリｐＨ ＦＩＧ、４ Ｉ′ｍ＾”””””ＰＣＴ／ＳＥＢ５１００２８７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペニシリンＶアミダーゼ、またはフエノキシメチルペニシリンの６−アミノ ペニシラン酸とフエノキシ酢酸への加水分解を触媒し得るその誘導体をコードし ているデオキシヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子。 ２．ペニシリンＶアミダーゼまたはその誘導体をコードしている該デオキシヌク レオチド配列が、細菌性供与体から得られたものであることを特徴とする第１項 記載の組換えＤＮＡ分子。 ３．該細菌性供与体がバチラス・スフアエリカス株であり、該デオキシヌクレオ チド配列がバチラス供与体のペニシリンＶアミダーゼ遺伝子のプロモーター配列 を含有していることを特徴とする第２項記載の組換えＤＮＡ分子。 ４．該組換えＤＮＡ分子が組換えプラスミドであることを特徴とする第１項〜第 ３項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子。 ５．ペニシリンＶアミダーゼまたはその誘導体をコードしているデオキシヌクレ オチド配列を少なくとも１個クローニングビヒクルに挿入することを特徴とする 、第１〜第４項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子の製造方法。 ６．バチラスＤＮＡを制限酵素で消化することによつて該デオキシヌクレオチド 配列が得られたことを特徴とする第５項記載の方法。 ７．１またはそれ以上のサブクローニング工程を含むことを特徴とする第５項ま たは第６項記載の方法。 ８．第１項〜第４項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された微生 物。 ９．該微生物が細菌または酵母であることを特徴とする第８項記載の微生物。 １０．該微生物がエシエリキア、バチラス、スタフイロコッカスまたはストレプ トマイセスの菌株、好ましくは枯草菌株であることを特徴とする第８項記載の微 生物。 １１．該微生物が大腸菌ＰＶＡ３（ＤＳＭ２９８２）または枯草菌ＰＶＡ３８（ ＤＳＭ２９８３）であることを特徴とする第８項記載の微生物。 １２．宿主生物に第１項〜第４項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子を導入す ることを特徴とする第８項〜第１１項のいずれかに記載の形質転換された微生物 の製造方法。 １３．サブクローニング工程を少くとも１回含むことを特徴とする第１２項記載 の方法。 １４．第８項〜第１１項のいずれかに記載の形質転換された微生物を適当な栄養 培地で培養し、生産された所望の生成物を単離することを特徴とするペニシリン Ｖアミダーゼまたはその誘導体の製造方法。 １５．第１４項記載の方法で生産されたことを特徴とするペニシリンＶアミダー ゼまたはその誘導体。