JPH0227988A - ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの大量生産方法 - Google Patents
ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの大量生産方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は第1図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子
、或いは下記の塩基配列のDNA断片5゛端AAATT
G TAGTAATGAA AAACAGTATTAT
ATCATAAT GAATTGGTAT CTT
AATAAAA GAGATGGAGGTAACTT
ATG 3′端 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを、GATGGAGGはリポソーム結合部位を表
す、) を5′端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み、微生物
内で発現可能な発現プラスミド、該プラスミドを保持し
ヒトリゾチーム遺伝子を生産する微生物、および該微生
物を培養することを特徴とするヒトリゾチームの製造方
法に関する。
、或いは下記の塩基配列のDNA断片5゛端AAATT
G TAGTAATGAA AAACAGTATTAT
ATCATAAT GAATTGGTAT CTT
AATAAAA GAGATGGAGGTAACTT
ATG 3′端 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを、GATGGAGGはリポソーム結合部位を表
す、) を5′端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み、微生物
内で発現可能な発現プラスミド、該プラスミドを保持し
ヒトリゾチーム遺伝子を生産する微生物、および該微生
物を培養することを特徴とするヒトリゾチームの製造方
法に関する。
〈従来技術〉
ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳リンパ腺
、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、N−アセチ
ルグルコサミンとN−アセチルムラミン酸量のβ−1,
4結合を加水分解するムラミダーゼとしての酵素活性を
有していることが知られている。ヒト乳由来のりゾチー
ムは130個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列は
既に知られている。(m津ら「溶菌酵素J55〜58頁
講談社すイエンティフィク(1977) ) ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有し、食
品等の防腐剤あるいは医薬品としては、抗菌剤、非アレ
ルギー性の抗炎症薬として利用することができる。ヒト
リゾチームはヒトの乳、尿等から単離することができる
が、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすには
効率が悪く実用的ではない。
、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、N−アセチ
ルグルコサミンとN−アセチルムラミン酸量のβ−1,
4結合を加水分解するムラミダーゼとしての酵素活性を
有していることが知られている。ヒト乳由来のりゾチー
ムは130個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列は
既に知られている。(m津ら「溶菌酵素J55〜58頁
講談社すイエンティフィク(1977) ) ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有し、食
品等の防腐剤あるいは医薬品としては、抗菌剤、非アレ
ルギー性の抗炎症薬として利用することができる。ヒト
リゾチームはヒトの乳、尿等から単離することができる
が、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすには
効率が悪く実用的ではない。
一方、微生物内で遺伝子を増巾させ、遺伝子由来の産物
を大量に生産させる、いわゆる遺伝子組換え技術は9、
ヒトホルモンやヒト由来の酵素の生産にきわめて有用で
ある。遺伝子産物の生産性を高めるためには、■遺伝子
のコピー数の増大、■#RNAの安定性の増大、■5R
NAからの蛋白合成活性(翻訳活性)の増大が有効であ
ることが知られている。翻訳活性の増大において、構造
遺伝子のDNA塩基配列とりポゾーム結合部位近傍のD
NA配列が特に重要であることが知られている。ヒトリ
ゾチームに関して、組換えDNA技術による生産につい
て既に報告されている(特開昭61−78383、特開
昭63−52876、)が、より生産性の高い発現プラ
スミドの構築、生産微生物の創製、製造方法の開発が望
まれている。
を大量に生産させる、いわゆる遺伝子組換え技術は9、
ヒトホルモンやヒト由来の酵素の生産にきわめて有用で
ある。遺伝子産物の生産性を高めるためには、■遺伝子
のコピー数の増大、■#RNAの安定性の増大、■5R
NAからの蛋白合成活性(翻訳活性)の増大が有効であ
ることが知られている。翻訳活性の増大において、構造
遺伝子のDNA塩基配列とりポゾーム結合部位近傍のD
NA配列が特に重要であることが知られている。ヒトリ
ゾチームに関して、組換えDNA技術による生産につい
て既に報告されている(特開昭61−78383、特開
昭63−52876、)が、より生産性の高い発現プラ
スミドの構築、生産微生物の創製、製造方法の開発が望
まれている。
〈課題解決の手段〉
本発明者らはヒトリゾチームの生産を高めるために、ヒ
トリゾチーム遺伝子の塩基配列のコドン選択と、ヒトリ
ゾチーム遺伝子上流のりボゾーム結合部位配列について
種々研究を行った。その結果、第1図記載の塩基配列の
ヒトリゾチーム遺伝子を有する発現プラスミド或いは特
許請求の範囲第2項記載の塩基配列のDNA断片を5゛
端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含有する発現プラス
ミドで形質転換された微生物が効率良くヒトリゾチーム
を生産することを見い出した。更に、発現プラスミドが
、第1図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子と上記
DNA断片をともに有する場合、さらに好ましいことを
見い出した。
トリゾチーム遺伝子の塩基配列のコドン選択と、ヒトリ
ゾチーム遺伝子上流のりボゾーム結合部位配列について
種々研究を行った。その結果、第1図記載の塩基配列の
ヒトリゾチーム遺伝子を有する発現プラスミド或いは特
許請求の範囲第2項記載の塩基配列のDNA断片を5゛
端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含有する発現プラス
ミドで形質転換された微生物が効率良くヒトリゾチーム
を生産することを見い出した。更に、発現プラスミドが
、第1図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子と上記
DNA断片をともに有する場合、さらに好ましいことを
見い出した。
第1図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子は酵母用
のコドンを基準にして合成されたヒトリゾチーム合成遺
伝子(例えば特開昭63−22190 )のアルギニン
とリジンに相当するコドンの一部を”Lys : AA
G−+AAA、 ”Arg : AGA −* CGC
。
のコドンを基準にして合成されたヒトリゾチーム合成遺
伝子(例えば特開昭63−22190 )のアルギニン
とリジンに相当するコドンの一部を”Lys : AA
G−+AAA、 ”Arg : AGA −* CGC
。
””Arg: AGA−+ CGTl”’ Arg :
AGA −+ CGC16角rg : AGA
−+ CGT、 12’Arg : AGA
−) CGC。
AGA −+ CGC16角rg : AGA
−+ CGT、 12’Arg : AGA
−) CGC。
”Arg: AGA→CGTへと変換した合成ヒトリゾ
チーム遺伝子である。
チーム遺伝子である。
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
1、 ヒトリゾチーム遺伝子の作成
第1図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子を作成す
る方法としては、DNA合成手法による全合成法、既知
のヒトリゾチーム遺伝子のサイトダイレクチイツト ミ
エークジェネシス(sitedirected mui
tagenesis(D、Pl、GloverらDNA
cl。
る方法としては、DNA合成手法による全合成法、既知
のヒトリゾチーム遺伝子のサイトダイレクチイツト ミ
エークジェネシス(sitedirected mui
tagenesis(D、Pl、GloverらDNA
cl。
ning) )による法あるいは既知のヒトリゾチーム
遺伝子の一部を合成りNAフラグメントと差し換えてコ
ドンを変換する方法などを用いることができる。
遺伝子の一部を合成りNAフラグメントと差し換えてコ
ドンを変換する方法などを用いることができる。
以下、既知のヒトリゾチーム遺伝子(例えば特開昭63
−22190)の一部を差し換える方法につき説明する
。差換え用のDNAフラグメントの具体例として下記の
配列(第1図記載の配列中、塩基番号第291番以降の
塩基配列)のDNAフラグメントを挙げることができる
。
−22190)の一部を差し換える方法につき説明する
。差換え用のDNAフラグメントの具体例として下記の
配列(第1図記載の配列中、塩基番号第291番以降の
塩基配列)のDNAフラグメントを挙げることができる
。
51 丁AAA CGCGTCGTTCGTGACC
CACA AGGTATCCGC3’ T GCGC
AGC^^G CACTGGGTGT TCCATAG
GCGGCTTGGGTCG CTTGGCGTAA
CCGTTGTCAA AACCGCGACGCGA
ACCCAGCGAACCGCATT GGC^^CA
GTT TTGGCGCTGにの様な配列を有する上
記の2零@DNAは、例えば、該2本鎖をいくつかのフ
ラグメントに分け、それらを化学的合成し、各々のフラ
グメントを連結して得ることができる。各フラグメント
の塩基配列は、互いに一部が重複することが好ましい、
このようなフラグメントの具体例は以下に示した17〜
36塩基からなるフラグメントHLY−18〜25であ
る。
CACA AGGTATCCGC3’ T GCGC
AGC^^G CACTGGGTGT TCCATAG
GCGGCTTGGGTCG CTTGGCGTAA
CCGTTGTCAA AACCGCGACGCGA
ACCCAGCGAACCGCATT GGC^^CA
GTT TTGGCGCTGにの様な配列を有する上
記の2零@DNAは、例えば、該2本鎖をいくつかのフ
ラグメントに分け、それらを化学的合成し、各々のフラ
グメントを連結して得ることができる。各フラグメント
の塩基配列は、互いに一部が重複することが好ましい、
このようなフラグメントの具体例は以下に示した17〜
36塩基からなるフラグメントHLY−18〜25であ
る。
+1LY−185’TAAACGCGTCG丁TCGT
C3’+1LY−193’TGCGCAGCAAGCA
CTGGGTGTTCCATA 5’oLY−205’
ACCCACAAGGTATCCGCGCTTGGGT
CGCT 3’1(LY−213’GGCGCGAA
CCCAGCGAACCGCATTGGCAA 5’H
LY−225”TGGCGTAACCGTTGTCAA
AACCGCGACGTC3′)ILY−233’CA
GTTTTGGCGCTGCAGGCAGTTATGC
^^G5’HLY−245’CGTCAATACGTT
CAAGGTTGTGGTGTCTAAT 3“HL
Y−253°TTCCAACACCACAGATTAC
TAG 5’((HLY−18,20,22,24)お
よび(HLY−19,21,23,25)が各DNA鎖
を形成する。 HIJ−19はIILY−18オヨび2
0ト、HLY−20はHLY−19および21と重複す
るというように、各フラグメントの塩基配列は順次重複
している) フラグメントの合成は、例えば、固相法ホスホアミダイ
ド法を利用したModel 380 DNAシンセサイ
ザー〔アプライドバイオシステムズ(^pplied
Biosys Less)社製〕等により容易に行える
0合成したIIIJ−19〜24断片の5゛末端をリン
酸化し、未処理(7)HLY−18断片、IILY−2
5断片とを反応させ、反応により生じたIILY−18
〜25断片の結合物を抽出、精製し、該D N A断片
結合物を回収する。
C3’+1LY−193’TGCGCAGCAAGCA
CTGGGTGTTCCATA 5’oLY−205’
ACCCACAAGGTATCCGCGCTTGGGT
CGCT 3’1(LY−213’GGCGCGAA
CCCAGCGAACCGCATTGGCAA 5’H
LY−225”TGGCGTAACCGTTGTCAA
AACCGCGACGTC3′)ILY−233’CA
GTTTTGGCGCTGCAGGCAGTTATGC
^^G5’HLY−245’CGTCAATACGTT
CAAGGTTGTGGTGTCTAAT 3“HL
Y−253°TTCCAACACCACAGATTAC
TAG 5’((HLY−18,20,22,24)お
よび(HLY−19,21,23,25)が各DNA鎖
を形成する。 HIJ−19はIILY−18オヨび2
0ト、HLY−20はHLY−19および21と重複す
るというように、各フラグメントの塩基配列は順次重複
している) フラグメントの合成は、例えば、固相法ホスホアミダイ
ド法を利用したModel 380 DNAシンセサイ
ザー〔アプライドバイオシステムズ(^pplied
Biosys Less)社製〕等により容易に行える
0合成したIIIJ−19〜24断片の5゛末端をリン
酸化し、未処理(7)HLY−18断片、IILY−2
5断片とを反応させ、反応により生じたIILY−18
〜25断片の結合物を抽出、精製し、該D N A断片
結合物を回収する。
このようにして得られた合成フラグメント結合物をヒト
リゾチーム遺伝子の残りの部分(変換しない部分)と連
結する。
リゾチーム遺伝子の残りの部分(変換しない部分)と連
結する。
該ヒトリゾチーム遺伝子断片(変換しない部分)は、例
えば、pPLHLY−1(特開昭61−78383、或
いは特開昭61−78387 ’)等のヒトリゾチーム
遺伝子含有プラスミドから、適当な制限酵素下で切出す
ことにより得られる。フラグメントの合成、精製、5゛
−水#1基のリン酸化及びフラグメントの連結はそれ自
体公知の方法(例えば特開昭63−22190)に従っ
て行う事ができる。
えば、pPLHLY−1(特開昭61−78383、或
いは特開昭61−78387 ’)等のヒトリゾチーム
遺伝子含有プラスミドから、適当な制限酵素下で切出す
ことにより得られる。フラグメントの合成、精製、5゛
−水#1基のリン酸化及びフラグメントの連結はそれ自
体公知の方法(例えば特開昭63−22190)に従っ
て行う事ができる。
2、リボゾーム結合部位を含有するDNA断片の作成
特許請求の範囲第2項記載の塩基配列のDNA断5°端
AAATTG TAG↑^ATG^^^^ACAGTA
TTATATCATAA丁 GAATTGGTAT
CTTAATAAAA GAGATGGAGGTAA
CTTATG 3’端 (上記のDNA配列中、下線を付した^TGは翻訳開始
コドンを、GATGGAGGはリポソーム結合部位)を
作成する。
AAATTG TAG↑^ATG^^^^ACAGTA
TTATATCATAA丁 GAATTGGTAT
CTTAATAAAA GAGATGGAGGTAA
CTTATG 3’端 (上記のDNA配列中、下線を付した^TGは翻訳開始
コドンを、GATGGAGGはリポソーム結合部位)を
作成する。
この様な配列を含有する2零11jD NAは、例えば
下に示した20〜26塩基からなるフラグメント(HL
Y 37〜44)を化学的に合成し、各々のフラグメン
トを連結して得られる。
下に示した20〜26塩基からなるフラグメント(HL
Y 37〜44)を化学的に合成し、各々のフラグメン
トを連結して得られる。
+114−375’GATCCTCTAGAGTCAA
ATTGT 3’HLY−383’GAGATCTCA
GTTTAACATCATTACTT 5’HLY−
395°AGTAATGAAAAACAGTATTAT
ATCAT 3’IJIJ−403’TTTGTCAT
AATATAGTATTACTTAA 5゜+1LY−
415’AATGAATTGGTATCTTAATAA
AAC3’+11J−423°CCATAGAATTA
TTTTCTCTACCTC5’+114−435’A
GATGGAGGTAACTTATGAAAGTTTT
3’HLY−443’CATTGAATACTTTC
AAAAGC5((HLY−37,39,41,43)
および(IILY−38,40,42、44)が各DN
A1jを形成する。)フラグメントの合成、精製、5”
−水酸基のリン酸化及びフラグメントの連結は上記のヒ
トリゾチーム遺伝子合成の場合と同様に行う事ができる
。
ATTGT 3’HLY−383’GAGATCTCA
GTTTAACATCATTACTT 5’HLY−
395°AGTAATGAAAAACAGTATTAT
ATCAT 3’IJIJ−403’TTTGTCAT
AATATAGTATTACTTAA 5゜+1LY−
415’AATGAATTGGTATCTTAATAA
AAC3’+11J−423°CCATAGAATTA
TTTTCTCTACCTC5’+114−435’A
GATGGAGGTAACTTATGAAAGTTTT
3’HLY−443’CATTGAATACTTTC
AAAAGC5((HLY−37,39,41,43)
および(IILY−38,40,42、44)が各DN
A1jを形成する。)フラグメントの合成、精製、5”
−水酸基のリン酸化及びフラグメントの連結は上記のヒ
トリゾチーム遺伝子合成の場合と同様に行う事ができる
。
3、ヒトリゾチーム遺伝子およびリボゾーム結合部位を
有するDNA断片の調製 本発明のヒトリゾチーム遺伝子及びリボゾーム結合部位
(SD配列)を含むDNA断片は以下のように調製でき
る0例えば上記lのようにして作成した第1図記載の塩
基配列のヒトリゾチーム遺伝子のフラグメントをS0配
列含有DNAフラグメントと結合することにより調製で
きる。SD配列含有DNAフラグメントとしては、Mu
ファージ由来のもの(例えばppntv〜2或いはpL
Y−32(特開昭6352876)に使用)等が使用で
きるが、上記2の配列のDNA断片が特に好ましい。
有するDNA断片の調製 本発明のヒトリゾチーム遺伝子及びリボゾーム結合部位
(SD配列)を含むDNA断片は以下のように調製でき
る0例えば上記lのようにして作成した第1図記載の塩
基配列のヒトリゾチーム遺伝子のフラグメントをS0配
列含有DNAフラグメントと結合することにより調製で
きる。SD配列含有DNAフラグメントとしては、Mu
ファージ由来のもの(例えばppntv〜2或いはpL
Y−32(特開昭6352876)に使用)等が使用で
きるが、上記2の配列のDNA断片が特に好ましい。
或いは上記2の配列のSO配列含有DNAフラグメント
をヒトリゾチーム遺伝子の残りの部分と結合することに
より1JIIIできる。ここにおいて、用いるヒトリゾ
チーム遺伝子は、例えば特開昭61−78383に記載
のpPHIJ−1より切り出す方法、或いは末法をもち
いて調製できるが、第1図記載の塩基配列のヒトリゾチ
ーム遺伝子が好ましい、第1図記載の塩基配列のヒトリ
ゾチーム遺伝子及び上記2の配列のDNAフラグメント
をともに含むDNA断片の作成の具体的な例を以下に挙
げる。特開昭61−78383或いは特開昭61−78
387で記載されているヒトリゾチーム遺伝子を含む組
換えプラスミドppLIILY−1を制限酵素5au3
AI−Ddelで消化し、得られたヒトリゾチーム遺伝
子を含む断片を常法により単離する。上記lの合成りN
AフラグメントをT4DNAリガーゼで結合し、5au
3Arで消化したフラグメントをptlc18に挿入し
たp[、Y−34を作成する;続いてこの9LY−34
を制限酵素Taqlで消化し、得られたヒトリゾチーム
遺伝子を含む断片を常法により単離し、上記2の合成り
NAフラグメントをT4DNAリガーゼで結合し、5a
u3AIで切断することにより調製することができる。
をヒトリゾチーム遺伝子の残りの部分と結合することに
より1JIIIできる。ここにおいて、用いるヒトリゾ
チーム遺伝子は、例えば特開昭61−78383に記載
のpPHIJ−1より切り出す方法、或いは末法をもち
いて調製できるが、第1図記載の塩基配列のヒトリゾチ
ーム遺伝子が好ましい、第1図記載の塩基配列のヒトリ
ゾチーム遺伝子及び上記2の配列のDNAフラグメント
をともに含むDNA断片の作成の具体的な例を以下に挙
げる。特開昭61−78383或いは特開昭61−78
387で記載されているヒトリゾチーム遺伝子を含む組
換えプラスミドppLIILY−1を制限酵素5au3
AI−Ddelで消化し、得られたヒトリゾチーム遺伝
子を含む断片を常法により単離する。上記lの合成りN
AフラグメントをT4DNAリガーゼで結合し、5au
3Arで消化したフラグメントをptlc18に挿入し
たp[、Y−34を作成する;続いてこの9LY−34
を制限酵素Taqlで消化し、得られたヒトリゾチーム
遺伝子を含む断片を常法により単離し、上記2の合成り
NAフラグメントをT4DNAリガーゼで結合し、5a
u3AIで切断することにより調製することができる。
(第2図)4、&lみ換えプラスミドの作成
前記3の様にして調製したヒトリゾチーム遺伝子を宿主
内で増殖可能なプラスミドベクター又は宿主内で増殖、
発現が可能な様に構成されたプラスミドベクターの適当
な挿入部位に組込む。
内で増殖可能なプラスミドベクター又は宿主内で増殖、
発現が可能な様に構成されたプラスミドベクターの適当
な挿入部位に組込む。
組込み操作そのものは分子生物額の分野で公知の常法に
従って行うことができる。
従って行うことができる。
本発明によるヒトリゾチーム遺伝子の増殖はp8R32
2,p(IC18等の公知の種々のプラスミドベクター
を用いて行う事ができる。また、プラスミドDNAの単
離精製も分子生物額の分野で公知の常法に従って行う事
ができる。
2,p(IC18等の公知の種々のプラスミドベクター
を用いて行う事ができる。また、プラスミドDNAの単
離精製も分子生物額の分野で公知の常法に従って行う事
ができる。
本発明によるヒトリゾチームの直接発現は宿主細胞によ
って適宜の方法をとり得るが大腸菌に於いてはlacプ
ロモーター(例えばFuller Gene旦、43
〜54(1982)参照)、trpプロモーター(例え
ばWindassら、Nucledjc Ac1ds
Res、、10.6689〜6657 (1982)参
照)、tacプロモーター(例えばBoyerら、Pr
oc、 Natl、 Acad、 Set、 LISA
l 80121〜25 (1983)参照)、P、プロ
モーター(例えばdeHasethら、Nucleic
Ac1dsRes、+ n、 773〜7g?、
(1983)参照)、Ptプロモーター(例えば□sr
。
って適宜の方法をとり得るが大腸菌に於いてはlacプ
ロモーター(例えばFuller Gene旦、43
〜54(1982)参照)、trpプロモーター(例え
ばWindassら、Nucledjc Ac1ds
Res、、10.6689〜6657 (1982)参
照)、tacプロモーター(例えばBoyerら、Pr
oc、 Natl、 Acad、 Set、 LISA
l 80121〜25 (1983)参照)、P、プロ
モーター(例えばdeHasethら、Nucleic
Ac1dsRes、+ n、 773〜7g?、
(1983)参照)、Ptプロモーター(例えば□sr
。
−ら、Gene、 17.45〜54(1982)参照
)及びIPpPtプロモーターえばNakaauraら
、I!MBOJ1771〜775(1982)参照)等
を有する公知の種々の発現ベクター(fPlえば中村、
化学と生物毅、47〜5B(1982)及びMania
tisらMo1ecular Clonrng 403
〜433(1982)を用いて行うことができる。
)及びIPpPtプロモーターえばNakaauraら
、I!MBOJ1771〜775(1982)参照)等
を有する公知の種々の発現ベクター(fPlえば中村、
化学と生物毅、47〜5B(1982)及びMania
tisらMo1ecular Clonrng 403
〜433(1982)を用いて行うことができる。
これらの発現ベクターのうちの一具体例はpMY12−
6 Asp−1である。
6 Asp−1である。
また発現組み換えプラスミドのうち好ましい具体例は本
発明の目的にかなうように作成されたpt。
発明の目的にかなうように作成されたpt。
Y−60である。 pt、y−soはpMY12−61
1層p−1のBamHI切断部位に上記3で調製した5
au3AI断片(約0.5Kbρ)を挿入することによ
り造成できる。 pMY12−6 Ai*ρ−1および
puc系プラスミドについては、公知である0例えば、
pMY12−6 A+wp−ILt pH’!12−6
(例えばTsurisoto ら、Mo1.Gen、
Genet、 18779〜86(1982)参照)
とPBV234 (例えば0htsuboら、毅245
〜254.(1982)参照)とがら造成する事ができ
る。
1層p−1のBamHI切断部位に上記3で調製した5
au3AI断片(約0.5Kbρ)を挿入することによ
り造成できる。 pMY12−6 Ai*ρ−1および
puc系プラスミドについては、公知である0例えば、
pMY12−6 A+wp−ILt pH’!12−6
(例えばTsurisoto ら、Mo1.Gen、
Genet、 18779〜86(1982)参照)
とPBV234 (例えば0htsuboら、毅245
〜254.(1982)参照)とがら造成する事ができ
る。
5、形質転換
(1) 宿主菌
本発明のヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ発現&ll換
えプラスミドを宿主細胞へ導入することによりヒトリゾ
チームを生産する微生物を得ることができる。宿主細胞
の具体例はE、col+294 (例えばBacksa
n+ Proc、 Natl、 Acad、
Sci、 USA ヱ3 4174〜4178(1
976)参照〕である。
えプラスミドを宿主細胞へ導入することによりヒトリゾ
チームを生産する微生物を得ることができる。宿主細胞
の具体例はE、col+294 (例えばBacksa
n+ Proc、 Natl、 Acad、
Sci、 USA ヱ3 4174〜4178(1
976)参照〕である。
ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプラスミドによ
る形質転換は上記の宿主に限定されるものではなく、公
知の種々のE、coli K−12株誘導体(例えばB
achsann、 Bacteriol、 Rev、
36525〜557 (1972)参照)を使用するこ
とができる。
る形質転換は上記の宿主に限定されるものではなく、公
知の種々のE、coli K−12株誘導体(例えばB
achsann、 Bacteriol、 Rev、
36525〜557 (1972)参照)を使用するこ
とができる。
これらのE、coliに一12株誘導体の多くのものは
公認の微生物機関、例えばAmerican Type
Cu1ture Co11ection(ATCC)
に、寄託されており、そこから分譲が可能である。(例
えばIITCCカタログ参照)。
公認の微生物機関、例えばAmerican Type
Cu1ture Co11ection(ATCC)
に、寄託されており、そこから分譲が可能である。(例
えばIITCCカタログ参照)。
また分子生物学の分野で公知の如く、適当なベクターを
選べばより広範囲の細菌種より適当な宿主を選択する事
も可能である。
選べばより広範囲の細菌種より適当な宿主を選択する事
も可能である。
(2)形質転換
形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行う事ができる(例えばCohen ら、P
roc、Natl、Acad、Sci、USA、 69
.2110〜2114(1972)及びManiati
sらMo1ecular CIoning+ 249〜
(3) 形質転換体 形質転換体の一興体例は、E、coli 249をpt
y−6゜で形質転換させて得た形質転換体である。これ
を1!、coli 249(pLV−60) と命名し
た。この形質転換体、大腸菌294 (pLY−60)
株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した(微工
研菌寄第10116号)。
法に従って行う事ができる(例えばCohen ら、P
roc、Natl、Acad、Sci、USA、 69
.2110〜2114(1972)及びManiati
sらMo1ecular CIoning+ 249〜
(3) 形質転換体 形質転換体の一興体例は、E、coli 249をpt
y−6゜で形質転換させて得た形質転換体である。これ
を1!、coli 249(pLV−60) と命名し
た。この形質転換体、大腸菌294 (pLY−60)
株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した(微工
研菌寄第10116号)。
6、ヒトリゾチームの生産、単離および定量この様にし
て得た形質転換体を、分子生物学および醗酵学の分野で
公知の方法に従って培養すれば、ヒトリゾチームが生産
される。この場合、培養を適当な誘導条件で行えばヒト
リゾチームの生産をを利に行うことができる。
て得た形質転換体を、分子生物学および醗酵学の分野で
公知の方法に従って培養すれば、ヒトリゾチームが生産
される。この場合、培養を適当な誘導条件で行えばヒト
リゾチームの生産をを利に行うことができる。
培養後のヒトリゾチームの単離は、公知の方法を適宜組
み合わせて行なえる0例えば、大腸菌の場合、国体を超
音波などの方法で破砕し、遠心分離することによりヒト
リゾチームからなる凝集体を濃縮、回収する。
み合わせて行なえる0例えば、大腸菌の場合、国体を超
音波などの方法で破砕し、遠心分離することによりヒト
リゾチームからなる凝集体を濃縮、回収する。
二の凝集体を可溶化還元後、適当な酸化還元系(例えば
グルタチオン又はシスティンの酸化型及び還元型の混合
物)により再生し、活性なヒトリゾチームを得ることが
できる。
グルタチオン又はシスティンの酸化型及び還元型の混合
物)により再生し、活性なヒトリゾチームを得ることが
できる。
単離したヒトリゾチームは公知のラジオイムノアッセイ
(例えばYuzurihaらChes、Pharm、
Bull、272802〜2806(1979)及びY
uzurihaらChes、Pharm、Bull、2
6908〜914(1978)参照)、酵素活性測定法
(例えば5idhanら、Agric、Biol、Ch
es、451817〜1823(1981)及びMor
sky Anal、 Biochem、 12877〜
85(1983)参照)、5DS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動のクマジープリリアントブルーR−250
による発色、逆相11PLC等を用いて検出、定量する
ことができる。前述したようにDNA技術によるヒトリ
ゾチームの生産に関しては報告されているが(例えば特
開昭6l−78383)、本発明により多量のヒトリゾ
チームを生産することが可能になったため回収精製操作
も容易となった。
(例えばYuzurihaらChes、Pharm、
Bull、272802〜2806(1979)及びY
uzurihaらChes、Pharm、Bull、2
6908〜914(1978)参照)、酵素活性測定法
(例えば5idhanら、Agric、Biol、Ch
es、451817〜1823(1981)及びMor
sky Anal、 Biochem、 12877〜
85(1983)参照)、5DS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動のクマジープリリアントブルーR−250
による発色、逆相11PLC等を用いて検出、定量する
ことができる。前述したようにDNA技術によるヒトリ
ゾチームの生産に関しては報告されているが(例えば特
開昭6l−78383)、本発明により多量のヒトリゾ
チームを生産することが可能になったため回収精製操作
も容易となった。
実施例
DNAフーグメントのA
上に示した様に設計したフラグメンl−HIJ−18〜
HLY−25,HLY−37〜HLY−44の各フラグ
メントを固相法ホスホアミダイド法を利用したMode
l 380 D NAシンセサイザー〔アプライドバイ
オシステムズ(Applied Biosystess
)社製〕により合成した。DNAの合成およびその精製
は特開昭63−22190に記載されている方法に準じ
た。各フラグメントは下に示した00□。ユニット取得
した。
HLY−25,HLY−37〜HLY−44の各フラグ
メントを固相法ホスホアミダイド法を利用したMode
l 380 D NAシンセサイザー〔アプライドバイ
オシステムズ(Applied Biosystess
)社製〕により合成した。DNAの合成およびその精製
は特開昭63−22190に記載されている方法に準じ
た。各フラグメントは下に示した00□。ユニット取得
した。
HLY−181,22211LY−191,3311L
Y−200,58HLY−210,55111J−22
0,45+1LY−230,56HLY−241,08
HLY−251,97)ILY−372,34HIJ−
384,3511LY−396,14HLY−402,
13HLY−413,80HIJ−424,721ルY
−434,13+1LY−444,88ヒトリゾチーム
プラスミドLY−60の 染筆2図のスチームに従
いヒトリゾチーム発現プラスミドpLY−60の構築を
行った。
Y−200,58HLY−210,55111J−22
0,45+1LY−230,56HLY−241,08
HLY−251,97)ILY−372,34HIJ−
384,3511LY−396,14HLY−402,
13HLY−413,80HIJ−424,721ルY
−434,13+1LY−444,88ヒトリゾチーム
プラスミドLY−60の 染筆2図のスチームに従
いヒトリゾチーム発現プラスミドpLY−60の構築を
行った。
ステップl:合成フラグメントのリン酸化及び連結反窓
上記2種の合成フラグ/ :/ ) (IILY−18
〜25. HLY−37〜44)をアニーリングし、次
いで連結した。
〜25. HLY−37〜44)をアニーリングし、次
いで連結した。
まず肛Y−19,HLY−20,HLY−21,HLY
−22,HLY−2311LY−24断片各2.51g
を66whM ) !J ス塩fa (pi 7,5)
10mM阿g Ch 、 1mMATP、1■Hスペル
ミジン、55単位T4ポリヌクレオチドキナーゼ(全酒
造)を含む100#N反応液で37℃、1時間反応させ
、5”末端をリン酸化した。
−22,HLY−2311LY−24断片各2.51g
を66whM ) !J ス塩fa (pi 7,5)
10mM阿g Ch 、 1mMATP、1■Hスペル
ミジン、55単位T4ポリヌクレオチドキナーゼ(全酒
造)を含む100#N反応液で37℃、1時間反応させ
、5”末端をリン酸化した。
反応液をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタ
ノール沈澱でDNAを回収した。このHLY−19〜2
4断片各2.5ttgと未処理のHLY−18断片1.
4 tt g 、 HLY−25断片1.8ttgとを
66mM トリス塩酸(pH7,5)、10mM Mg
C1g、1mM^TP、 1m11スペルミジン、1
750単位T4リガーゼ(全酒造)を含む200μi反
応液中で16℃、越夜で反応させた0反応により生じた
HLY−18〜25断片の結合物をフェノール:クロロ
ホルム混液で抽出後、エタノール沈澱により約18tt
gの精製DNA断片として回収した。
ノール沈澱でDNAを回収した。このHLY−19〜2
4断片各2.5ttgと未処理のHLY−18断片1.
4 tt g 、 HLY−25断片1.8ttgとを
66mM トリス塩酸(pH7,5)、10mM Mg
C1g、1mM^TP、 1m11スペルミジン、1
750単位T4リガーゼ(全酒造)を含む200μi反
応液中で16℃、越夜で反応させた0反応により生じた
HLY−18〜25断片の結合物をフェノール:クロロ
ホルム混液で抽出後、エタノール沈澱により約18tt
gの精製DNA断片として回収した。
HLv−37〜44ニツイテも同様に行った。 HL’
1−38゜HLY−39,IILY−40,HLY−4
1,IILY−42,IILY−43断片各約5μgを
66mM )リス塩酸(pH7,5) 110ff1
MgCl□。
1−38゜HLY−39,IILY−40,HLY−4
1,IILY−42,IILY−43断片各約5μgを
66mM )リス塩酸(pH7,5) 110ff1
MgCl□。
1gMATP、 1+1Mスペルミジン、55単位T4
ポリヌクレオチドキナーゼ(全酒造)を含む100μ1
反応液で37°C11時間反応させ、5゛末端をリン酸
化した。
ポリヌクレオチドキナーゼ(全酒造)を含む100μ1
反応液で37°C11時間反応させ、5゛末端をリン酸
化した。
反応液をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタ
ノール沈澱でDNAを回収した。この肛Y−38〜43
断片各4.5#gと未処理のIlt、Y−37,44断
片各3.5ggとを665M )リス塩酸(pH7,5
)、10mM MgC1、,1mMATP、 1閤−ス
ペルミジン、1750単位T4リガーゼ(全酒造)を含
む200μ!反応液中で16°C越夜で反応させた0反
応により生じたHLY−38〜43断片の結合物をフェ
ノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈澱に
より約34μgの精製DNA断片として回収した。
ノール沈澱でDNAを回収した。この肛Y−38〜43
断片各4.5#gと未処理のIlt、Y−37,44断
片各3.5ggとを665M )リス塩酸(pH7,5
)、10mM MgC1、,1mMATP、 1閤−ス
ペルミジン、1750単位T4リガーゼ(全酒造)を含
む200μ!反応液中で16°C越夜で反応させた0反
応により生じたHLY−38〜43断片の結合物をフェ
ノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈澱に
より約34μgの精製DNA断片として回収した。
ステップ2:ヒトリゾチーム遺伝子と合成フラグメント
結合物との連結 コンセンサス5DSI域を有する418bpのヒトリゾ
チーム遺伝子を大腸菌発現ベクターPMY12−6A−
p−1に組みこんだpPLHLY−1(特開昭61−7
8383、或いは特開昭61−78387に記載の方法
で製造できる)680Mgをlo*M )リス塩酸(p
H7,5)、10鵬M MgCh、50mMNaC1,
1mM0T?存在下、150単位の制限酵素5au3A
Iおよび150単位のDdel(ともに全酒造)を加え
、800μl中で37℃、1時間反応させた。生じた3
11b、の断片を5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し該結合物を含むゲルを切出し、該結合物を電気
泳動的に溶出しブタノールで濃縮し、フェノール:クロ
ロホルム混液で抽出後、エタノール沈澱により約15μ
gのDNAを回収した、このDNA0.2ggと先はど
のHLY−18〜IILY−25結合物0.7μgを6
6mM )リス塩酸(pH7,5)、6.6−M Mg
CIg 、 10mMDT7 、1gM^TP、 35
0単位T4DNAリガーゼ存在下で、5opiの反応液
中16℃、越夜で反応させた。この反応で生じた結合物
を10a+M )リス塩酸(pH7,5)、50mM
NaC1,10+++M河gc1..1mMDT?、
10単位の制限酵素5au3AI存在下、40ul中、
37°C,3時間で反応し、切断した0反応液をフェノ
ール:クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈澱でD
NAを回収した。この断片を20ul中前記の条件で5
.5単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼと37°C1
1時間反応させ、5゛末端をすべてリン酸化した。この
439b9の断片を5%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離回収した。この断片中には先の合成オリゴ
ヌクレオチドHLY−18〜HLY−25を含む全ヒト
リゾチーム遺伝子が存在するステップ3:クローニング
ベクターの調製1ugの発現ベクターpUc1B (全
酒造)5ggを50s+M )リス塩酸(pH7,5)
、100s+M NaCl、105M Mgc:lt、
1mMDTT、20単位の制限酵素Ram旧(全酒造)
の存在下、60ttl中、37°C,2時間反応させた
。
結合物との連結 コンセンサス5DSI域を有する418bpのヒトリゾ
チーム遺伝子を大腸菌発現ベクターPMY12−6A−
p−1に組みこんだpPLHLY−1(特開昭61−7
8383、或いは特開昭61−78387に記載の方法
で製造できる)680Mgをlo*M )リス塩酸(p
H7,5)、10鵬M MgCh、50mMNaC1,
1mM0T?存在下、150単位の制限酵素5au3A
Iおよび150単位のDdel(ともに全酒造)を加え
、800μl中で37℃、1時間反応させた。生じた3
11b、の断片を5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し該結合物を含むゲルを切出し、該結合物を電気
泳動的に溶出しブタノールで濃縮し、フェノール:クロ
ロホルム混液で抽出後、エタノール沈澱により約15μ
gのDNAを回収した、このDNA0.2ggと先はど
のHLY−18〜IILY−25結合物0.7μgを6
6mM )リス塩酸(pH7,5)、6.6−M Mg
CIg 、 10mMDT7 、1gM^TP、 35
0単位T4DNAリガーゼ存在下で、5opiの反応液
中16℃、越夜で反応させた。この反応で生じた結合物
を10a+M )リス塩酸(pH7,5)、50mM
NaC1,10+++M河gc1..1mMDT?、
10単位の制限酵素5au3AI存在下、40ul中、
37°C,3時間で反応し、切断した0反応液をフェノ
ール:クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈澱でD
NAを回収した。この断片を20ul中前記の条件で5
.5単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼと37°C1
1時間反応させ、5゛末端をすべてリン酸化した。この
439b9の断片を5%ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離回収した。この断片中には先の合成オリゴ
ヌクレオチドHLY−18〜HLY−25を含む全ヒト
リゾチーム遺伝子が存在するステップ3:クローニング
ベクターの調製1ugの発現ベクターpUc1B (全
酒造)5ggを50s+M )リス塩酸(pH7,5)
、100s+M NaCl、105M Mgc:lt、
1mMDTT、20単位の制限酵素Ram旧(全酒造)
の存在下、60ttl中、37°C,2時間反応させた
。
エタノール沈澱でDNAを回収後、50μx l?I
トリス塩酸(pH8,0)及び2単位のアルカリ性ホ
スファターゼ(全酒造)で65°C1時間処理し、5°
末端のリン酸基を除去した。その後フェノール:クロロ
ホルム混合液で抽出後エタノール沈澱で、DNAを回収
した。
トリス塩酸(pH8,0)及び2単位のアルカリ性ホ
スファターゼ(全酒造)で65°C1時間処理し、5°
末端のリン酸基を除去した。その後フェノール:クロロ
ホルム混合液で抽出後エタノール沈澱で、DNAを回収
した。
ステップ4:クローニングプラスミドFLY−34の構
築 ステップ2および3で調製した439bpの5au3^
lDNA断片およびベクターpt+c 1Bをそれぞれ
0.5μgずつ混合し、350単位の74 D N A
リガーゼを含む反応液で16℃越夜反応させた。この反
応液を使ってカルシウム処理した大腸El 294株を
形質転換した。アンピシリン耐性菌を50mg/j!ア
ンピシリンを含むし寒天培地(10g/lポリペプトン
、5g/lイーストエキストラクト、5g/ J!
Nacl、 1.5%寒天)上で選択した。得られた
コロニーよりプラスミドDNAをアルカリ法(Mole
culan Claning(1982) Cl5 )
ニより抽出精製し、各m制mm素で切断して、切断パ
ターンを解析し、439bpの5au3^lDNA断片
の組み込まれたプラスミドをpLv−34とした。(第
2図参照) ステップ5:ヒトリゾチーム遺伝子を含むTaql断片
の調製 pL’1−34200.u gをIOIIM トリス塩
酸(pH7,5)、10mVIMgC1m、505M
NaC1、15M0T?存在下、240単位の制限酵素
↑aql (宝酒造)を加え800pl中で65℃、1
時間反応させ生じた401bpの断片を5%ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離し該結合物を含むゲルを切
出し、該結合物を電気泳動的に溶出しブタノールで濃縮
し、フェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノー
ル沈澱により約10#gのDNAを回収した。このDN
A3μgとステップlで得たHLY−37〜HLY−4
4結合物5.Otigを66−Mトリス塩酸(pH7,
5)、6.6mM MgC1m、10sMDTT。
築 ステップ2および3で調製した439bpの5au3^
lDNA断片およびベクターpt+c 1Bをそれぞれ
0.5μgずつ混合し、350単位の74 D N A
リガーゼを含む反応液で16℃越夜反応させた。この反
応液を使ってカルシウム処理した大腸El 294株を
形質転換した。アンピシリン耐性菌を50mg/j!ア
ンピシリンを含むし寒天培地(10g/lポリペプトン
、5g/lイーストエキストラクト、5g/ J!
Nacl、 1.5%寒天)上で選択した。得られた
コロニーよりプラスミドDNAをアルカリ法(Mole
culan Claning(1982) Cl5 )
ニより抽出精製し、各m制mm素で切断して、切断パ
ターンを解析し、439bpの5au3^lDNA断片
の組み込まれたプラスミドをpLv−34とした。(第
2図参照) ステップ5:ヒトリゾチーム遺伝子を含むTaql断片
の調製 pL’1−34200.u gをIOIIM トリス塩
酸(pH7,5)、10mVIMgC1m、505M
NaC1、15M0T?存在下、240単位の制限酵素
↑aql (宝酒造)を加え800pl中で65℃、1
時間反応させ生じた401bpの断片を5%ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離し該結合物を含むゲルを切
出し、該結合物を電気泳動的に溶出しブタノールで濃縮
し、フェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノー
ル沈澱により約10#gのDNAを回収した。このDN
A3μgとステップlで得たHLY−37〜HLY−4
4結合物5.Otigを66−Mトリス塩酸(pH7,
5)、6.6mM MgC1m、10sMDTT。
1mMATP、350単位T4DNAリガーゼ存在下で
、100μ2の反応液中16℃、越夜で反応させた。こ
の反応で生じた結合物をlomM )リス塩酸(all
7.5)、50wM NaC1,105M MgCl
意、1mM0T?、 20単位の制限酵素5au3AI
存在下、40μj’中、37℃、4時間で反応し、切断
した0反応液をフェノール:クロロホルム混液で抽出後
、エタノール沈澱でDNAを回収した。この断片を30
al中前記の条件で11単位のT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ(宝酒造)と37℃、1時間反応させ、5゛末端
をすべてリン酸化した。この483bpの断片を5%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分離回収した。こ
の断片中には先の合成オリゴヌクレオチドを含む全ヒト
リゾチーム遺伝子が存在する。
、100μ2の反応液中16℃、越夜で反応させた。こ
の反応で生じた結合物をlomM )リス塩酸(all
7.5)、50wM NaC1,105M MgCl
意、1mM0T?、 20単位の制限酵素5au3AI
存在下、40μj’中、37℃、4時間で反応し、切断
した0反応液をフェノール:クロロホルム混液で抽出後
、エタノール沈澱でDNAを回収した。この断片を30
al中前記の条件で11単位のT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ(宝酒造)と37℃、1時間反応させ、5゛末端
をすべてリン酸化した。この483bpの断片を5%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分離回収した。こ
の断片中には先の合成オリゴヌクレオチドを含む全ヒト
リゾチーム遺伝子が存在する。
ステップ6:発現ベクターの!llI!pMY12−6
^@9−11.5μgを50mM )リス塩酸(pH7
゜5)、100mM NaC1,105M MgC1t
、1ml’lDT?、 60単位の制限酵素BamHI
の存在下、60#137℃、12時間反応させた(宝酒
造)。
^@9−11.5μgを50mM )リス塩酸(pH7
゜5)、100mM NaC1,105M MgC1t
、1ml’lDT?、 60単位の制限酵素BamHI
の存在下、60#137℃、12時間反応させた(宝酒
造)。
エタノール沈澱でDNAを回収後、60ttl LM
トリス塩M (pH8,0)及び2単位のアルカリ性フ
ォスファターゼ(宝酒造)で65℃、1時間処理し、5
°末端のリン酸基を除去した。その後、フェノール:ク
ロロホルム混合液で抽出後、エタノール沈澱でDNAを
回収した。
トリス塩M (pH8,0)及び2単位のアルカリ性フ
ォスファターゼ(宝酒造)で65℃、1時間処理し、5
°末端のリン酸基を除去した。その後、フェノール:ク
ロロホルム混合液で抽出後、エタノール沈澱でDNAを
回収した。
ステップ7:発現プラスミドpt、y−soの構築およ
び組換え体の取得 ステップ6で調製したベクター0.4μgと先はどの4
83bp断片を20μi中350単位のT4DNAリガ
ーゼ(宝酒造)を含む反応液で16℃、越夜で反応させ
た。この反応液を使ってカルシウム処理した大腸菌29
4株を形質転換した。
び組換え体の取得 ステップ6で調製したベクター0.4μgと先はどの4
83bp断片を20μi中350単位のT4DNAリガ
ーゼ(宝酒造)を含む反応液で16℃、越夜で反応させ
た。この反応液を使ってカルシウム処理した大腸菌29
4株を形質転換した。
アンピシリン耐性菌を50+*g/eアンピシリンを含
むし寒天培地(10g/fポリペプトン、5g/ffi
イーストエキストラクト、5g/ J! NaC1,
1,5%寒天)上で選択した。得られたコロニーよりプ
ラスミドDNAをアルカリ法(Molecular C
loning(1982) Cl5)により抽出、精製
し、各種制限酵素で切断して切断パターンを解析し第2
図に示される様にヒトリゾチーム遺伝子が組み込まれた
ものを選びだした。
むし寒天培地(10g/fポリペプトン、5g/ffi
イーストエキストラクト、5g/ J! NaC1,
1,5%寒天)上で選択した。得られたコロニーよりプ
ラスミドDNAをアルカリ法(Molecular C
loning(1982) Cl5)により抽出、精製
し、各種制限酵素で切断して切断パターンを解析し第2
図に示される様にヒトリゾチーム遺伝子が組み込まれた
ものを選びだした。
I77”f−シリλ九里
E、coli 294(pLY−60)を5afの修正
し培地(10g/lポリペプトン、5g/2イーストエ
キストラクト、5g/ I NaC1,50mg/
l アンピシリン)に接種し、30℃で一夜培養した
。培養液1I11を新たな上記培地1001dに加え、
30℃で1〜6時間培養した後、41°Cで誘導し、さ
らに2〜10時間焙養を継続した。
し培地(10g/lポリペプトン、5g/2イーストエ
キストラクト、5g/ I NaC1,50mg/
l アンピシリン)に接種し、30℃で一夜培養した
。培養液1I11を新たな上記培地1001dに加え、
30℃で1〜6時間培養した後、41°Cで誘導し、さ
らに2〜10時間焙養を継続した。
適当時間培養した後、培養液をとり菌体を遠心分離した
。
。
リゾチームの定量
大腸菌294 (pLY−60)株で生産されたリゾチ
ームの検出定量を逆相HPLCにより行った。比較例と
して大腸1i1294 (pPHLV−2)株(特開昭
63−52876)、大腸菌294 (pLY−32)
株(特開昭63−52876)で生産されたヒトリゾチ
ームを定量した。
ームの検出定量を逆相HPLCにより行った。比較例と
して大腸1i1294 (pPHLV−2)株(特開昭
63−52876)、大腸菌294 (pLY−32)
株(特開昭63−52876)で生産されたヒトリゾチ
ームを定量した。
大腸菌294 (pLY−60)株及び大腸菌294
(PPLIILY−2)株、294 (pLY−32)
株を1001d修正し培地で30℃振盪培養しODa&
s 1.0〜1.8に達した時から3〜6時間培養した
。墳養液を遠心分離し、菌体を集め−BO℃で凍結させ
た0次に室温で融解させた屠体を505M NaHzP
Oa−NazHPOa (pH6,2)に懸濁し、超音
波破砕を行った。破砕液を10倍容量の6.6月グアニ
ジン塩酸バッフy −(pH8,5)3.3(w/v)
%DTTを含む)に懸濁した後、HPLC2よりヒトリ
ゾチーム量を測定した。 HPLCによる測定は逆相系
担体(YMC−Pack AP−303、山村化学研究
社製)を用い、0.12%TFAを含む0.1M Na
C1水溶液中ア七トニトリルの直線濃度勾配による分析
条件で行った。
(PPLIILY−2)株、294 (pLY−32)
株を1001d修正し培地で30℃振盪培養しODa&
s 1.0〜1.8に達した時から3〜6時間培養した
。墳養液を遠心分離し、菌体を集め−BO℃で凍結させ
た0次に室温で融解させた屠体を505M NaHzP
Oa−NazHPOa (pH6,2)に懸濁し、超音
波破砕を行った。破砕液を10倍容量の6.6月グアニ
ジン塩酸バッフy −(pH8,5)3.3(w/v)
%DTTを含む)に懸濁した後、HPLC2よりヒトリ
ゾチーム量を測定した。 HPLCによる測定は逆相系
担体(YMC−Pack AP−303、山村化学研究
社製)を用い、0.12%TFAを含む0.1M Na
C1水溶液中ア七トニトリルの直線濃度勾配による分析
条件で行った。
結果を表1に示した。
表1
pLY−60のヒトリゾチーム遺伝子はpPHIJ−2
+ρLY−32の保持するヒトリゾチーム遺伝子コドン
を先に示した7ケ所変換している。(第1図)またpL
Y−60で形質転換された大腸菌により生産されたヒト
リゾチームを通常の方法により再生・精製し、Micr
;ococcus 1ysodeickticusを使
用したturpility活性測定法(A、B、C,、
50(3)、 713−723゜1986)により比活
性を測定したところ、12000units/−gであ
った。
+ρLY−32の保持するヒトリゾチーム遺伝子コドン
を先に示した7ケ所変換している。(第1図)またpL
Y−60で形質転換された大腸菌により生産されたヒト
リゾチームを通常の方法により再生・精製し、Micr
;ococcus 1ysodeickticusを使
用したturpility活性測定法(A、B、C,、
50(3)、 713−723゜1986)により比活
性を測定したところ、12000units/−gであ
った。
発明の効果
ヒトリゾチーム遺伝子上流に下記の塩基配列のDNA断
片 5’* AAATTG TAGTAATG^^AAAC
AGTAT?^T^丁C^τAAT G^^TTG1
.TAT CTTAATAAAA GAGATGG
AGGTAACTT ATG 3’端 を連結すること、および第1図記載の塩基配列で特定さ
れるヒトリゾチーム遺伝子を用いることにより、ヒトリ
ゾチームの発現量が増加し、容品に効率よく調製するこ
とが可能となった。上記のヒトリゾチーム遺伝子及び上
記のりボゾーム結合部位含有DNA断片をともに含む場
合、特に発現量が高くなる。
片 5’* AAATTG TAGTAATG^^AAAC
AGTAT?^T^丁C^τAAT G^^TTG1
.TAT CTTAATAAAA GAGATGG
AGGTAACTT ATG 3’端 を連結すること、および第1図記載の塩基配列で特定さ
れるヒトリゾチーム遺伝子を用いることにより、ヒトリ
ゾチームの発現量が増加し、容品に効率よく調製するこ
とが可能となった。上記のヒトリゾチーム遺伝子及び上
記のりボゾーム結合部位含有DNA断片をともに含む場
合、特に発現量が高くなる。
第1図はpLY−60に挿入されているヒトリゾチーム
遺伝子の全塩基配列を示す、上段は塩基配列を下段はア
ミノ酸配列を示す、塩基番号4番目から393番目まで
の領域がヒトリゾチームをコードする領域である。塩基
番号1番目から3番目のATGは翻訳開始コドンである
。 第2図は発現プラスミドpLY−60の構築方法を示し
ている。縦線ブロック、黒色ブロックが新たに合成した
断片である。 第 1 図
遺伝子の全塩基配列を示す、上段は塩基配列を下段はア
ミノ酸配列を示す、塩基番号4番目から393番目まで
の領域がヒトリゾチームをコードする領域である。塩基
番号1番目から3番目のATGは翻訳開始コドンである
。 第2図は発現プラスミドpLY−60の構築方法を示し
ている。縦線ブロック、黒色ブロックが新たに合成した
断片である。 第 1 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)第1図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子を
含み、微生物菌体内でヒトリゾチームを発現することを
特徴とする発現プラスミド (2)下記の塩基配列のDNA断片を5′端に有するヒ
トリゾチーム遺伝子を含み、微生物菌体内でヒトリゾチ
ームを発現することを特徴とする発現プラスミド 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを、GATGGAGGはリボソーム結合部位を表
す。) (3)ヒトリゾチーム遺伝子が第1図記載の塩基(4)
発現プラスミドpLY−60 (5)特許請求の範囲第1項、第2項、第3項又は第4
項記載のプラスミドにより形質転換されヒトリゾチーム
を生産する微生物 (6)大腸菌(E.coli)であることを特徴とする
特許請求の範囲第5項記載の微生物 (7)E.coli294(pLY−60) (8)特許請求の範囲第5項、第6項又は第7項記載の
微生物を培養することを特徴とするヒトリゾチームの製
造法 (9)第1図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子 (10)下記の塩基配列のDNA断片を5′端に有する
ヒトリゾチーム遺伝子 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを、GATGGAGGはリボソーム結合部位を表
す。) (11)ヒトリゾチーム遺伝子が第1図記載の塩基配列
である特許請求の範囲第10項記載のヒトリゾチーム遺
伝子
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17775388A JPH0227988A (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの大量生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17775388A JPH0227988A (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの大量生産方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0227988A true JPH0227988A (ja) | 1990-01-30 |
Family
ID=16036525
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP17775388A Pending JPH0227988A (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの大量生産方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0227988A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0707070A1 (en) | 1994-07-18 | 1996-04-17 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for enhancing disease and pest resistance of plants |
WO2002070715A1 (fr) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Long Yu | Lysozime de type g humain, sa sequence codante, son procede de preparation et ses utilisations |
-
1988
- 1988-07-15 JP JP17775388A patent/JPH0227988A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0707070A1 (en) | 1994-07-18 | 1996-04-17 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for enhancing disease and pest resistance of plants |
WO2002070715A1 (fr) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Long Yu | Lysozime de type g humain, sa sequence codante, son procede de preparation et ses utilisations |
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