JP3138001B2 - 発現制御ベクター及び該ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 - Google Patents
発現制御ベクター及び該ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法Info
- Publication number
- JP3138001B2 JP3138001B2 JP03089017A JP8901791A JP3138001B2 JP 3138001 B2 JP3138001 B2 JP 3138001B2 JP 03089017 A JP03089017 A JP 03089017A JP 8901791 A JP8901791 A JP 8901791A JP 3138001 B2 JP3138001 B2 JP 3138001B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vector
- expression control
- microorganism
- control vector
- brevis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーに
関するものであり、更に詳細には、本発明は、新規発現
制御ベクター及び発現制御ベクターに外来遺伝子を結合
してなるベクターをバチルス・ブレビスに保有せしめて
なる微生物、並びに該微生物を培養し、培養物中に外来
遺伝子産物を生成蓄積せしめこれを採取することを特徴
とする該産物の製造法に関する。
関するものであり、更に詳細には、本発明は、新規発現
制御ベクター及び発現制御ベクターに外来遺伝子を結合
してなるベクターをバチルス・ブレビスに保有せしめて
なる微生物、並びに該微生物を培養し、培養物中に外来
遺伝子産物を生成蓄積せしめこれを採取することを特徴
とする該産物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】鵜高らはバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼを生産しな
い菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・ブ
レビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０−５
８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９号公報参
照）の主要菌体外タンパク質（Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６７，１２３９（１
９８７）；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８，
（１９８７）および特開昭６２−２０１５８３号公報に
それぞれ“ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａ
ｎｄ ｍｉｄｄｌｅｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ”、“主
要菌体外タンパク質”として記載されている。）遺伝子
のプロモーターおよび該主要菌体外タンパク質の１種で
あるＭＷタンパク質（ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ）のシグナルペプチドをコードする領域を用い
て分泌ベクターを作製し、本菌株を宿主としてα−アミ
ラーゼ（特開昭６２−２０１５８３号公報、Ｈ．Ｙａｍ
ａｇａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１
２３９（１９８７）やブタペプシノーゲン（鵜高重三、
日本農芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７
−８３８；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８
（１９８７））の分泌生産に成功している。
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼを生産しな
い菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・ブ
レビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０−５
８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９号公報参
照）の主要菌体外タンパク質（Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６７，１２３９（１
９８７）；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８，
（１９８７）および特開昭６２−２０１５８３号公報に
それぞれ“ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａ
ｎｄ ｍｉｄｄｌｅｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ”、“主
要菌体外タンパク質”として記載されている。）遺伝子
のプロモーターおよび該主要菌体外タンパク質の１種で
あるＭＷタンパク質（ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ）のシグナルペプチドをコードする領域を用い
て分泌ベクターを作製し、本菌株を宿主としてα−アミ
ラーゼ（特開昭６２−２０１５８３号公報、Ｈ．Ｙａｍ
ａｇａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１
２３９（１９８７）やブタペプシノーゲン（鵜高重三、
日本農芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７
−８３８；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８
（１９８７））の分泌生産に成功している。
【０００３】また、高木らはバチルス・ブレビスの中で
プロテアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１（なお、この菌株は本明細書におけるバ
チルス・ブレビス１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）
と同一菌株である）を分離し、これを宿主として耐熱性
α−アミラーゼの高分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｅｍ．，５８，２７７９−２３８０（１９８９）や、
山形らによるヒトＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５８９−３
５３９（１９８９））に成功している。
プロテアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１（なお、この菌株は本明細書におけるバ
チルス・ブレビス１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）
と同一菌株である）を分離し、これを宿主として耐熱性
α−アミラーゼの高分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｅｍ．，５８，２７７９−２３８０（１９８９）や、
山形らによるヒトＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５８９−３
５３９（１９８９））に成功している。
【０００４】
【発明が解決しようとる課題】バチルス・ブレビスを宿
主菌とする外来遺伝子産物の生産性については、遺伝子
組換え技術を適用する以前の生産量及び大腸菌を宿主菌
とする系に比べ飛躍的に向上しているが、産業上有用な
物質を安価に供給するにはもう一段の技術開発が必要と
されている。従来、バチルス・ブレビスを宿主菌とする
系で使用しているベクターは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０をベースとす
るもので、バチルス・ブレビス内に安定に保持するため
には抗生物質等の薬剤の存在が必須であること、また高
コピープラスミドであり、短期間に多量の遺伝子発現が
起こるために、宿主菌であるバチルス・ブレビスに重大
なダメージを与え、結果として、遺伝子産物の生産が少
ないということが頻繁に認められた。また、外来遺伝子
産物の中には、宿主菌であるバチルス・ブレビスの生育
に悪影響を及ぼすものもあり、該遺伝子産物の生産と同
時に生育が阻害され、その結果として遺伝子産物の生産
も少ない場合も推測されている。
主菌とする外来遺伝子産物の生産性については、遺伝子
組換え技術を適用する以前の生産量及び大腸菌を宿主菌
とする系に比べ飛躍的に向上しているが、産業上有用な
物質を安価に供給するにはもう一段の技術開発が必要と
されている。従来、バチルス・ブレビスを宿主菌とする
系で使用しているベクターは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０をベースとす
るもので、バチルス・ブレビス内に安定に保持するため
には抗生物質等の薬剤の存在が必須であること、また高
コピープラスミドであり、短期間に多量の遺伝子発現が
起こるために、宿主菌であるバチルス・ブレビスに重大
なダメージを与え、結果として、遺伝子産物の生産が少
ないということが頻繁に認められた。また、外来遺伝子
産物の中には、宿主菌であるバチルス・ブレビスの生育
に悪影響を及ぼすものもあり、該遺伝子産物の生産と同
時に生育が阻害され、その結果として遺伝子産物の生産
も少ない場合も推測されている。
【０００５】従って、宿主菌との適合性、調和性がよく
かつ菌の増殖と外来遺伝子産物の生産時期を人為的に制
御可能な宿主ベクター系が開発されれば、宿主菌の増殖
も良好で、外来遺伝子産物の生産量も多い条件を設定可
能となる。
かつ菌の増殖と外来遺伝子産物の生産時期を人為的に制
御可能な宿主ベクター系が開発されれば、宿主菌の増殖
も良好で、外来遺伝子産物の生産量も多い条件を設定可
能となる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記した業界のニーズに
加え、更に、バチルス・ブレビスが汎用性の高い宿主と
して利用可能であること、また同菌がコンピテントな菌
を冷凍保存できること、そしてまた電気パルス法等によ
り形質転換が容易であることに鑑み、バチルス・ブレビ
スの工業的有用性に着目して、バチルス・ブレビスで安
定でかつ外来遺伝子産物の人為的生産制御が可能なベク
ターを開発すべく鋭意検討した結果、大腸菌ｌａｃオペ
レータ遺伝子、大腸菌リプレッサー構造遺伝子をバチル
ス・ブレビスで発現可能なプラスミドの一部に挿入する
ことにより非常に有効なベクターを構築することに成功
し本発明を完成した。
加え、更に、バチルス・ブレビスが汎用性の高い宿主と
して利用可能であること、また同菌がコンピテントな菌
を冷凍保存できること、そしてまた電気パルス法等によ
り形質転換が容易であることに鑑み、バチルス・ブレビ
スの工業的有用性に着目して、バチルス・ブレビスで安
定でかつ外来遺伝子産物の人為的生産制御が可能なベク
ターを開発すべく鋭意検討した結果、大腸菌ｌａｃオペ
レータ遺伝子、大腸菌リプレッサー構造遺伝子をバチル
ス・ブレビスで発現可能なプラスミドの一部に挿入する
ことにより非常に有効なベクターを構築することに成功
し本発明を完成した。
【０００７】即ち、本発明はバチルス・ブレビスで安定
に発現し、且つ、外来遺伝子産物の人為的生産制御可能
なベクターに関するものである。また、更に、本発明は
このベクターに目的とする外来遺伝子を結合してなる発
現制御ベクター、該ベクターを保有する形質転換体、及
び該形質転換体を培養することによる外来遺伝子産物の
非常に効率のよい大量分泌生産法に関するものである。
に発現し、且つ、外来遺伝子産物の人為的生産制御可能
なベクターに関するものである。また、更に、本発明は
このベクターに目的とする外来遺伝子を結合してなる発
現制御ベクター、該ベクターを保有する形質転換体、及
び該形質転換体を培養することによる外来遺伝子産物の
非常に効率のよい大量分泌生産法に関するものである。
【０００８】以下、本発明について詳しく説明する。
【０００９】発明ベクターの構築に使用するプラスミド
としては、バチルス・ブレビスで発現可能なプラスミド
であれば何れでも良いが、例えば、ＭＷＰのプロモータ
ー領域を持つプラスミドｐＮＵ２１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．，１７１，１０１０−１０１６（１９８９）
が有効に使用される。プラスミドの調製としては、既知
の方法、例えば田中らの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１２９，１４８７−１４９４（１９７７））が挙
げられる。
としては、バチルス・ブレビスで発現可能なプラスミド
であれば何れでも良いが、例えば、ＭＷＰのプロモータ
ー領域を持つプラスミドｐＮＵ２１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．，１７１，１０１０−１０１６（１９８９）
が有効に使用される。プラスミドの調製としては、既知
の方法、例えば田中らの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１２９，１４８７−１４９４（１９７７））が挙
げられる。
【００１０】プロモーターとしてはバチルス・ブレビス
で機能するものであれば何でも良いが、バチルス・ブレ
ビス由来のプロモーターが好ましく、例えば前述のバチ
ルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）の主要
菌体外タンパク質遺伝子（ＭＷＰ遺伝子）のプロモータ
ー及びバチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１０８７）のプロモーターなどが挙げられる。プロモ
ーター領域を含有するＤＮＡは上記プロモーター以外に
ＳＤ配列、翻訳開始コドンなどを有していることが必要
である。
で機能するものであれば何でも良いが、バチルス・ブレ
ビス由来のプロモーターが好ましく、例えば前述のバチ
ルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）の主要
菌体外タンパク質遺伝子（ＭＷＰ遺伝子）のプロモータ
ー及びバチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１０８７）のプロモーターなどが挙げられる。プロモ
ーター領域を含有するＤＮＡは上記プロモーター以外に
ＳＤ配列、翻訳開始コドンなどを有していることが必要
である。
【００１１】上記のように、バチルス・ブレビス４７の
ＭＷＰプロモーター領域を含有するＤＮＡは既知である
ので（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１３１２−
１３２０（１９９）、必要部分を制限酵素で切断してお
き、これをサブクローニング用ベクター（形質転換体と
してＥ．ｃｏｌｉを用いてる場合には、ｐＵＣ１１８、
ｐＵＣ１１９等のｐＵＣ系プラスミド又はｐＢＲ３２２
系のプラスミドが好適である）に挿入し、そのＤＮＡで
Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換しておけば、目的とするプロモ
ーター領域を含有するＤＮＡが保存される。従って必要
ある場合に、形質転換体からプラスミドを取出し調製し
ておけば、目的とするプロモーターを含むＤＮＡ断片を
取り出すことが出来る。
ＭＷＰプロモーター領域を含有するＤＮＡは既知である
ので（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１３１２−
１３２０（１９９）、必要部分を制限酵素で切断してお
き、これをサブクローニング用ベクター（形質転換体と
してＥ．ｃｏｌｉを用いてる場合には、ｐＵＣ１１８、
ｐＵＣ１１９等のｐＵＣ系プラスミド又はｐＢＲ３２２
系のプラスミドが好適である）に挿入し、そのＤＮＡで
Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換しておけば、目的とするプロモ
ーター領域を含有するＤＮＡが保存される。従って必要
ある場合に、形質転換体からプラスミドを取出し調製し
ておけば、目的とするプロモーターを含むＤＮＡ断片を
取り出すことが出来る。
【００１２】発現制御ベクターに使用する、オペレータ
ー、リプレッサー遺伝子はバチルス・ブレビスで発現可
能であれば何れでもよく、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａ
ｃオペレーター、リプレッサー遺伝子等があげられる。
ー、リプレッサー遺伝子はバチルス・ブレビスで発現可
能であれば何れでもよく、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａ
ｃオペレーター、リプレッサー遺伝子等があげられる。
【００１３】また、本発明の発現制御ベクターに連結す
る外来遺伝子はバチルス・ブレビスで発現可能な遺伝子
であれば何れでもよく、例えば、ヒト唾液腺アミラーゼ
遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ
のα−アミラーゼ遺伝子等が挙げられる。
る外来遺伝子はバチルス・ブレビスで発現可能な遺伝子
であれば何れでもよく、例えば、ヒト唾液腺アミラーゼ
遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ
のα−アミラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００１４】プラスミドを構築する方法としては、常法
が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニング、
ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，１９８２）に記載の方法等が例示される。
が適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニング、
ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，１９８２）に記載の方法等が例示される。
【００１５】Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ４７のＭＷＰプロモータ
ー領域を含むＤＮＡ断片は前記の方法で得られる。この
断片中のプロモーターとＳＤ配列との間にｌａｃオペレ
ーターをコードする合成ＤＮＡを挿入すれば、プロモー
ター、オペレーター、ＳＤを含むＤＮＡ断片が得られる
（ＭＯ）。
ー領域を含むＤＮＡ断片は前記の方法で得られる。この
断片中のプロモーターとＳＤ配列との間にｌａｃオペレ
ーターをコードする合成ＤＮＡを挿入すれば、プロモー
ター、オペレーター、ＳＤを含むＤＮＡ断片が得られる
（ＭＯ）。
【００１６】Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃリプレッサー遺伝子
を保有するプラスミドは既知である。これを制限酵素処
理し、得られたリプレッサー遺伝子を、Ｂ．ｂｒｅｖｉ
ｓ４７のＭＷＰプロモーターのうちＰ４、Ｐ５プロモー
ターの下流に連結し、これをｐＮＵ２１０のＭＷＰプロ
モーター領域を取り除いたベクターに導入し、ｌａｃリ
プレッサー遺伝子を持ったプラスミドｐＮＵ５５０を得
た。
を保有するプラスミドは既知である。これを制限酵素処
理し、得られたリプレッサー遺伝子を、Ｂ．ｂｒｅｖｉ
ｓ４７のＭＷＰプロモーターのうちＰ４、Ｐ５プロモー
ターの下流に連結し、これをｐＮＵ２１０のＭＷＰプロ
モーター領域を取り除いたベクターに導入し、ｌａｃリ
プレッサー遺伝子を持ったプラスミドｐＮＵ５５０を得
た。
【００１７】バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−
７２２４）のＭＷＰプロモーター領域の下流にバチルス
・リケニホルミスのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）の遺伝子
を連結したＤＮＡフラグメントを保有するプラスミドは
既知であるので（Ｊ．Ｂｃａｔｅｒｉｏｌ．，１６９，
１２３９−１２４５（１９８７）、これに制限酵素処理
しＢＬＡ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を得、プラスミ
ドｐＮＵ５５０とＭＯの３断片をつないでバチルス・ブ
レビスを形質転換して、３断片が正しくつながった発現
制御ベクターｐＮＵ５５０−ＢＬＡを得た。
７２２４）のＭＷＰプロモーター領域の下流にバチルス
・リケニホルミスのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）の遺伝子
を連結したＤＮＡフラグメントを保有するプラスミドは
既知であるので（Ｊ．Ｂｃａｔｅｒｉｏｌ．，１６９，
１２３９−１２４５（１９８７）、これに制限酵素処理
しＢＬＡ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を得、プラスミ
ドｐＮＵ５５０とＭＯの３断片をつないでバチルス・ブ
レビスを形質転換して、３断片が正しくつながった発現
制御ベクターｐＮＵ５５０−ＢＬＡを得た。
【００１８】このようにして調製した発現制御ベクター
ｐＮＵ５５０にＭＯＭＷＰプロモーター、シグナルペプ
チドの下流側に（図４）、目的とする外来遺伝子を常法
にしたがってｉｎｆｒａｍｅに挿入し、微生物を形質転
換すれば、外来遺伝子の発現をｌａｃオペレ−タ−によ
り制御し、かつ多量に分泌生産しうる形質転換体を得る
ことができる。したがって、本発明によれば所望する外
来遺伝子で適宜微生物を形質転換することができ、この
ようにして得られた形質転換体を培養することによっ
て、目的とする外来遺伝子産物を多量に得ることができ
る。
ｐＮＵ５５０にＭＯＭＷＰプロモーター、シグナルペプ
チドの下流側に（図４）、目的とする外来遺伝子を常法
にしたがってｉｎｆｒａｍｅに挿入し、微生物を形質転
換すれば、外来遺伝子の発現をｌａｃオペレ−タ−によ
り制御し、かつ多量に分泌生産しうる形質転換体を得る
ことができる。したがって、本発明によれば所望する外
来遺伝子で適宜微生物を形質転換することができ、この
ようにして得られた形質転換体を培養することによっ
て、目的とする外来遺伝子産物を多量に得ることができ
る。
【００１９】外来遺伝子を組み込んだベクターで形質転
換する微生物としては、バチルス・ブレビスに属する微
生物であれば何でも良く、例えばバチルス・ブレビス４
７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、バチルス・ブレビスＨ
ＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）が挙げられる
が、好適にはバチルス・ブレビスＨＰＤ３１が用いられ
る。バチルス・ブレビスを形質転換する方法は、公知の
方法でよく、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法
（Ｊ．Ｂｃａｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０（１９
８３））またはＴａｋａｇｉ等の方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１９
８９））等が例示される。
換する微生物としては、バチルス・ブレビスに属する微
生物であれば何でも良く、例えばバチルス・ブレビス４
７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、バチルス・ブレビスＨ
ＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）が挙げられる
が、好適にはバチルス・ブレビスＨＰＤ３１が用いられ
る。バチルス・ブレビスを形質転換する方法は、公知の
方法でよく、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法
（Ｊ．Ｂｃａｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０（１９
８３））またはＴａｋａｇｉ等の方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１９
８９））等が例示される。
【００２０】得られた形質転換体の培養に用いる培地
は、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を
産生しうるものであれば如何なるものでも良い。
は、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を
産生しうるものであれば如何なるものでも良い。
【００２１】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、毒素、有機酸などが考えられる。
該培地に含有される窒素源としては、カゼイン、ポリペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と無
機窒素源を主とする合成培地を用いて培養しても良い。
栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培
地に添加すればよい、該栄養物質としては、アミノ酸
類、ビタミン類、核酸、塩類などが挙げられる。
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、毒素、有機酸などが考えられる。
該培地に含有される窒素源としては、カゼイン、ポリペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と無
機窒素源を主とする合成培地を用いて培養しても良い。
栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培
地に添加すればよい、該栄養物質としては、アミノ酸
類、ビタミン類、核酸、塩類などが挙げられる。
【００２２】また、培養に際して必要があれば、培地に
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリンなどが加えられる。更に必要により、消泡
剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤などを培地
に加えてもよい。
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリンなどが加えられる。更に必要により、消泡
剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤などを培地
に加えてもよい。
【００２３】培地の初発ｐＨは５．０〜９．０であり、
さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通
常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃で
あり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好まし
くは２４〜９６時間である。
さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通
常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃で
あり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好まし
くは２４〜９６時間である。
【００２４】培養終了後、それ自体公知の方法、例えば
遠心分離、ろ過などで菌体と上清とを分離する。
遠心分離、ろ過などで菌体と上清とを分離する。
【００２５】形質転換する微生物として、例えばバチル
ス・ブレビスＨＰＤ３１等を使用すれば、電気パルス法
等によって容易に形質転換することができるのみでな
く、目的とする産物を菌体外に生産するというすぐれた
性質を有しているので、上記のようにして得られた培養
上清に含まれる外来遺伝子産物は、例えば塩析、等電点
沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ハイド
ロオキシアパタイト、高速液体クロマトグラフィーなど
に従って精製すればよく、このようにして目的とする外
来遺伝子産物を容易に得ることが出来る。
ス・ブレビスＨＰＤ３１等を使用すれば、電気パルス法
等によって容易に形質転換することができるのみでな
く、目的とする産物を菌体外に生産するというすぐれた
性質を有しているので、上記のようにして得られた培養
上清に含まれる外来遺伝子産物は、例えば塩析、等電点
沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ハイド
ロオキシアパタイト、高速液体クロマトグラフィーなど
に従って精製すればよく、このようにして目的とする外
来遺伝子産物を容易に得ることが出来る。
【００２６】以下、本発明を実施例により更に詳しく説
明する。
明する。
【００２７】
【実施例１】
【００２８】
【（１）オペレーターの導入方法】ＭＷＰのプロモータ
ー領域（Ｊ．Ｂｃａｔｅｒｉｏｌ．，１７１，１０１
０，１０１６（１９８９））の持つプラスミドｐＮＵ２
１０を制限酵素ＡｐａＬＩで消化後Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒ
ａｇｍｅｎｔで平滑末端にし、ＢａｍＨＩリンカーをリ
ガーゼにより付加した。次にＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ
で消化し、２０６ｂｐのフラグメントを回収した。この
フラグメントをｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩサイトに挿入
し、プラスミドｐＨＴＯ１（つまりｐＨＴ１）を得た。
５’ＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＡＡＴＴ
３’及び５’ＡＡＴＴＧＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＣＡＡＴ
ＴＣＣＡ３’の２本のＤＮＡをＤＮＡ合成機にて作製
し、Ｔ４Ｐｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅで
５’ＯＨ末端をリン酸化後、アニーリングし、合成オペ
レーターを作製した。
ー領域（Ｊ．Ｂｃａｔｅｒｉｏｌ．，１７１，１０１
０，１０１６（１９８９））の持つプラスミドｐＮＵ２
１０を制限酵素ＡｐａＬＩで消化後Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒ
ａｇｍｅｎｔで平滑末端にし、ＢａｍＨＩリンカーをリ
ガーゼにより付加した。次にＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ
で消化し、２０６ｂｐのフラグメントを回収した。この
フラグメントをｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩサイトに挿入
し、プラスミドｐＨＴＯ１（つまりｐＨＴ１）を得た。
５’ＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＡＡＴＴ
３’及び５’ＡＡＴＴＧＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＣＡＡＴ
ＴＣＣＡ３’の２本のＤＮＡをＤＮＡ合成機にて作製
し、Ｔ４Ｐｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅで
５’ＯＨ末端をリン酸化後、アニーリングし、合成オペ
レーターを作製した。
【００２９】プラスミドｐＨＴＯ１（ｐＨＴ１）をＳｓ
ｐＩで部分分解後、アルカリフォスファターゼ処理し、
合成オペレーターを挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０３
を形質転換した。形質転換体からプラスミドを抽出し、
ＤＮＡ塩基配列を決定し、正しい位置に正しい方向で挿
入されたプラスミドｐＨＴＯ２（つまりｐＨＴ２）を得
た（図２、図３）。
ｐＩで部分分解後、アルカリフォスファターゼ処理し、
合成オペレーターを挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０３
を形質転換した。形質転換体からプラスミドを抽出し、
ＤＮＡ塩基配列を決定し、正しい位置に正しい方向で挿
入されたプラスミドｐＨＴＯ２（つまりｐＨＴ２）を得
た（図２、図３）。
【００３０】
【（２）プロモーター／オペレーター（ＭＯ）の構築】
ＭＷＰタンデムプロモーターで最も強力なＰ２プロモー
ターのみを利用するため以下の操作を行った。図３の２
６７〜２７２及び４６６〜４７１にＮｃｏＩサイト（Ｃ
ＣＡＴＧＧ）を導入するため、部位特異的変異を行った
・部位特異的変異はＰＣＲ法によった。
ＭＷＰタンデムプロモーターで最も強力なＰ２プロモー
ターのみを利用するため以下の操作を行った。図３の２
６７〜２７２及び４６６〜４７１にＮｃｏＩサイト（Ｃ
ＣＡＴＧＧ）を導入するため、部位特異的変異を行った
・部位特異的変異はＰＣＲ法によった。
【００３１】
【（Ｉ）２６７〜２７２にＮｃｏＩサイトの導入】ｐＮ
Ｕ２１０のＭｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（１〜３
１１、図３）をｐＵＣ１１９ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ
に挿入したプラスミドｐＵＣ１１９−ＭＷＶを得た。合
成ＤＮＡプライマー５’ＧＴＴＴＴＴＣＧＴＧＴＧＣＣ
ＡＴＧＧＴＡＴＴＡＡＡＣ３’及びＭ１３プライマー
（５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ３’（宝酒
造製））を熱変性して一本鎖にしたｐＵＣ１１９−ＭＷ
Ｖとアニーリングして、ＤＮＡポリメラーゼを用いて相
補鎖を合成した（ＭＷＶ−Ｎｃｏ）。
Ｕ２１０のＭｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（１〜３
１１、図３）をｐＵＣ１１９ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ
に挿入したプラスミドｐＵＣ１１９−ＭＷＶを得た。合
成ＤＮＡプライマー５’ＧＴＴＴＴＴＣＧＴＧＴＧＣＣ
ＡＴＧＧＴＡＴＴＡＡＡＣ３’及びＭ１３プライマー
（５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ３’（宝酒
造製））を熱変性して一本鎖にしたｐＵＣ１１９−ＭＷ
Ｖとアニーリングして、ＤＮＡポリメラーゼを用いて相
補鎖を合成した（ＭＷＶ−Ｎｃｏ）。
【００３２】
【（ＩＩ）４６６〜４７１にＮｃｏＩサイトの導入】合
成ＤＮＡプライマー５’ＧＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＣＣＡ
ＴＧＧＡＡＴＴＧ３’とＭ１３プライマーＲＶを用いｐ
ＨＴＯ２（ｐＨＴ２）を鋳型として上と同じ操作にて目
的ＤＮＡ断片を得た（ＭＷＶ−Ｎｃｏ）。
成ＤＮＡプライマー５’ＧＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＣＣＡ
ＴＧＧＡＡＴＴＧ３’とＭ１３プライマーＲＶを用いｐ
ＨＴＯ２（ｐＨＴ２）を鋳型として上と同じ操作にて目
的ＤＮＡ断片を得た（ＭＷＶ−Ｎｃｏ）。
【００３３】
【（ＩＩＩ）プロモーター／オペレーターの構築】先に
得たＤＮＡ断片（ＭＷＶ−Ｎｃｏ）をＰｓｔＩ、Ｎｃｏ
Ｉで消化して１９．３ｂｐ断片を得た。また上で得たＤ
ＮＡ断片（ＭＷＶ−Ｎｃｏ）をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで
消化して１１１ｂｐ断片を得た。これらの２断片と、ｐ
ＵＣ１１９を予じめＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断して得
たプラスミドと、をリガーゼ処理して、プラスミドｐＵ
Ｃ１１９−Ｍ１２を得た。
得たＤＮＡ断片（ＭＷＶ−Ｎｃｏ）をＰｓｔＩ、Ｎｃｏ
Ｉで消化して１９．３ｂｐ断片を得た。また上で得たＤ
ＮＡ断片（ＭＷＶ−Ｎｃｏ）をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで
消化して１１１ｂｐ断片を得た。これらの２断片と、ｐ
ＵＣ１１９を予じめＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断して得
たプラスミドと、をリガーゼ処理して、プラスミドｐＵ
Ｃ１１９−Ｍ１２を得た。
【００３４】更に、Ｐ１プロモーター領域を除去するた
め、ｐＵＣ１１９−Ｍ１２をＲｓａＩ消化後ＢａｍＨＩ
リンカーを付与し、ＢａｍＨＩ消化にて得た２０６ｂｐ
断片をｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩサイトに導入し、プラ
スミドｐＵＣ１１９−ＭＯを得た。そのプロモーター／
オペレーター領域を図４に示す。
め、ｐＵＣ１１９−Ｍ１２をＲｓａＩ消化後ＢａｍＨＩ
リンカーを付与し、ＢａｍＨＩ消化にて得た２０６ｂｐ
断片をｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩサイトに導入し、プラ
スミドｐＵＣ１１９−ＭＯを得た。そのプロモーター／
オペレーター領域を図４に示す。
【００３５】
【（３）リプレッサーの導入方法】大腸菌ｌａｃリプレ
ッサー遺伝子（ｌａｃＩ）を含む既知のプラスミドｐＭ
Ｃ９（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８０，３０１５−３０１９（１９８３））を原料とし、
図５及び図６に示した方法にしたがって、プラスミドｐ
ＪＴＯ１を調製した。
ッサー遺伝子（ｌａｃＩ）を含む既知のプラスミドｐＭ
Ｃ９（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８０，３０１５−３０１９（１９８３））を原料とし、
図５及び図６に示した方法にしたがって、プラスミドｐ
ＪＴＯ１を調製した。
【００３６】このようにして調製したｐＪＴＯ１のｌａ
ｃＩのプロモーター領域をＭＷＰのプロモーター領域と
つなぎ換えるため、両遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧ近
傍にＢｓｐＨＩサイト（ＴＣＡＴＧＡ）を部位特異的変
異により導入した。変異は、“Ｔｈｅ Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓ
ｔｅｍ”（アマーシャム社製）により行った。
ｃＩのプロモーター領域をＭＷＰのプロモーター領域と
つなぎ換えるため、両遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧ近
傍にＢｓｐＨＩサイト（ＴＣＡＴＧＡ）を部位特異的変
異により導入した。変異は、“Ｔｈｅ Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓ
ｔｅｍ”（アマーシャム社製）により行った。
【００３７】まずｌａｃＩ５’上流をＭ１３にサブクロ
ーニングするため、ｐＪＴＯ１をＡｐａＬＩで切断した
後、これを平滑末端化し、ＢａｍＨＩリンカーを付与
し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１断片（４１８ｂｐ）をＭ１
３ｍｐ１９ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した
（ｍｐ１９−ｌａｃＩＦ）。この１本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、合成プローブ５’ＧＧＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＧ
ＡＡＡＣＣＡ３’にて変異処理を行ない、ＢｓｐＨＩサ
イトを導入したｍｐ１９−ｌａｃＩＦ−ＢｓｐＨを得
た。一方、ＭＷＰプロモーター領域の翻訳開始点にＢｓ
ｐＨＩサイトを導入するため、ｐＨＴＯ１（ｐＨＴ１）
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ２０６ｂｐをＭ１３ｍｐ１８
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。プラスミド
Ｍ１３ｍｐ１８ＭＷＰを鋳型として、合成プローブ５’
ＣＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＴＴＣ３’にて
ＢｓｐＨＩサイトを導入したｍｐ１８−ＭＷＰ−Ｂｓｐ
Ｈを得た。
ーニングするため、ｐＪＴＯ１をＡｐａＬＩで切断した
後、これを平滑末端化し、ＢａｍＨＩリンカーを付与
し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１断片（４１８ｂｐ）をＭ１
３ｍｐ１９ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した
（ｍｐ１９−ｌａｃＩＦ）。この１本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、合成プローブ５’ＧＧＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＧ
ＡＡＡＣＣＡ３’にて変異処理を行ない、ＢｓｐＨＩサ
イトを導入したｍｐ１９−ｌａｃＩＦ−ＢｓｐＨを得
た。一方、ＭＷＰプロモーター領域の翻訳開始点にＢｓ
ｐＨＩサイトを導入するため、ｐＨＴＯ１（ｐＨＴ１）
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ２０６ｂｐをＭ１３ｍｐ１８
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。プラスミド
Ｍ１３ｍｐ１８ＭＷＰを鋳型として、合成プローブ５’
ＣＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＴＴＣ３’にて
ＢｓｐＨＩサイトを導入したｍｐ１８−ＭＷＰ−Ｂｓｐ
Ｈを得た。
【００３８】先に得たｍｐ１９−ｌａｃＩＦ−ＢｓｐＨ
をＥ．ｃｏｌｉ ＧＭ１１９で増幅した後（ｍｐ１９−
ｌａｃＩＦ−ＢｓｐＨ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ１１９）、
これをＡｐａＬＩ、ＢｓｐＨＩで切断し、３３２ｂｐの
ＤＮＡ断片を回収した。一方、ｐＪＴＯ１をＡｐａＬＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、８００ｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。また上記によって得たｍｐ１８−ＭＷＰ−
ＢｓｐＨをＥｃｏＲＩ、ＢｓｐＨＩで切断して、２０５
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。次いで、これら３種のＤＮＡ
断片と、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
とをライゲーションして、ｐＵＣ−ＭＷＰ−ｌａｃＩを
得た（図７）。
をＥ．ｃｏｌｉ ＧＭ１１９で増幅した後（ｍｐ１９−
ｌａｃＩＦ−ＢｓｐＨ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ１１９）、
これをＡｐａＬＩ、ＢｓｐＨＩで切断し、３３２ｂｐの
ＤＮＡ断片を回収した。一方、ｐＪＴＯ１をＡｐａＬＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、８００ｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。また上記によって得たｍｐ１８−ＭＷＰ−
ＢｓｐＨをＥｃｏＲＩ、ＢｓｐＨＩで切断して、２０５
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。次いで、これら３種のＤＮＡ
断片と、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
とをライゲーションして、ｐＵＣ−ＭＷＰ−ｌａｃＩを
得た（図７）。
【００３９】得られたｐＵＣ−ＭＷＰ−ｌａｃＩをＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断後ＫｌｏｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔにて
平滑末端化し、更にＥｃｏＲＩで切断し約１．５ｋｂの
断片を得た。この断片を、ｐＮＵ２１０をＡｖａＩＩで
切断後平滑末端化し、さらにＥｃｏＲＩで切断したプラ
スミドに導入した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩで
切断し平滑末端化し、ＢａｍＨＩリンカーを付与後Ｂａ
ｍＨＩで切断し、リガーゼ反応を行ない、プラスミドｐ
ＮＵ５５０を得た（図８）。
ｎｄＩＩＩで切断後ＫｌｏｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔにて
平滑末端化し、更にＥｃｏＲＩで切断し約１．５ｋｂの
断片を得た。この断片を、ｐＮＵ２１０をＡｖａＩＩで
切断後平滑末端化し、さらにＥｃｏＲＩで切断したプラ
スミドに導入した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩで
切断し平滑末端化し、ＢａｍＨＩリンカーを付与後Ｂａ
ｍＨＩで切断し、リガーゼ反応を行ない、プラスミドｐ
ＮＵ５５０を得た（図８）。
【００４０】
【（４）ｐＮＵ５５０−ヒト唾液腺アミラーゼ遺伝子
（外来遺伝子Ｘ）の構築】ヒト唾液腺アミラーゼ（ＨＡ
ＭＹ）遺伝子がＭＷＰプロモーターシグナル配列とつな
がったプラスミドｐＴＳ７（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｂｉｏｔｈｎｏｌ．，３４，２９７−３０２（１
９９０））をＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｍ
ＷＰシグナル配列の１部とアミラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片１．６ｋｂを得た。
（外来遺伝子Ｘ）の構築】ヒト唾液腺アミラーゼ（ＨＡ
ＭＹ）遺伝子がＭＷＰプロモーターシグナル配列とつな
がったプラスミドｐＴＳ７（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｂｉｏｔｈｎｏｌ．，３４，２９７−３０２（１
９９０））をＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｍ
ＷＰシグナル配列の１部とアミラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片１．６ｋｂを得た。
【００４１】一方、ｐＵＣ１１９−ＭＯをＢａｍＨＩ−
ＡｐａＬＩで切断し、プロモーター、オペレーター、シ
グナルの一部を含むＤＮＡ断片２０４ｂｐを得た。これ
ら断片をｐＵＣ１９ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩに挿
入し、プラスミドｐＵＣ−ＭＯ−ＨＡＭＹを得た。この
プラスミドをＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し１．
８ｋｂＤＮＡ断片を回収し、ｐＮＵ５５０ ＢａｍＨＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩに挿入し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ
３１の形質転換を行った。形質転換株のＩＰＴＧ（イソ
プロピルβ−Ｄ（−）チオガラクトピラノシド）による
誘導の有無を調べ、誘導のかかった形質転換体から得た
プラスミドをｐＮＵ５５０−ＨＡＭＹとした（図８）。
ＡｐａＬＩで切断し、プロモーター、オペレーター、シ
グナルの一部を含むＤＮＡ断片２０４ｂｐを得た。これ
ら断片をｐＵＣ１９ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩに挿
入し、プラスミドｐＵＣ−ＭＯ−ＨＡＭＹを得た。この
プラスミドをＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し１．
８ｋｂＤＮＡ断片を回収し、ｐＮＵ５５０ ＢａｍＨＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩに挿入し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ
３１の形質転換を行った。形質転換株のＩＰＴＧ（イソ
プロピルβ−Ｄ（−）チオガラクトピラノシド）による
誘導の有無を調べ、誘導のかかった形質転換体から得た
プラスミドをｐＮＵ５５０−ＨＡＭＹとした（図８）。
【００４２】
【実施例２】実施例１で得たｐＮＵ５５０−ＨＡＭＹを
保持したＢ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を５’ＰＹ培地
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９
−２２８０（１９８９））にＩＰＴＧを１ｍＭ加えた培
地と無添加の培地に植え、３０℃で８５時間振とう培養
した。上記の培養液を遠心分離し、その上清のアミラー
ゼ活性を可溶性澱粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｓｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９
０−２９８（１９７８））で測定し、図９の結果を得
た。狙いどうり、ｐＮＵ５５０−ＨＡＭＹを保持する
Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１はＩＰＴＧで誘導するこ
とにより培地にヒト唾液腺アミラーゼを分泌生産した。
ＩＰＴＧ無添加の対照では生産しなかった。
保持したＢ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を５’ＰＹ培地
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９
−２２８０（１９８９））にＩＰＴＧを１ｍＭ加えた培
地と無添加の培地に植え、３０℃で８５時間振とう培養
した。上記の培養液を遠心分離し、その上清のアミラー
ゼ活性を可溶性澱粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｓｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９
０−２９８（１９７８））で測定し、図９の結果を得
た。狙いどうり、ｐＮＵ５５０−ＨＡＭＹを保持する
Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１はＩＰＴＧで誘導するこ
とにより培地にヒト唾液腺アミラーゼを分泌生産した。
ＩＰＴＧ無添加の対照では生産しなかった。
【００４３】従って、ｐＮＵ５５０−Ｘの系を使った生
産制御が可能であることが確認された。
産制御が可能であることが確認された。
【００４４】
【実施例３】Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−
７２２４）のＭＷＰプロモーター及びシグナルペプチド
（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９−１２
４５（１９８７）の下流にＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，９６，１１４７−１１５６（１９８５））を
直結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓで安定に保持されるプラスミ
ドｐＨＹ４８１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，４９，１０７６−１０７９（１９８５））に挿入
したプラスミドｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１６９，１２３９−１２４５（１９８７））をＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化後更にＡｐａＬＩで消化し、ＢＬＡ
遺伝子を含むＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をえた。
７２２４）のＭＷＰプロモーター及びシグナルペプチド
（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９−１２
４５（１９８７）の下流にＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，９６，１１４７−１１５６（１９８５））を
直結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓで安定に保持されるプラスミ
ドｐＨＹ４８１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，４９，１０７６−１０７９（１９８５））に挿入
したプラスミドｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１６９，１２３９−１２４５（１９８７））をＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化後更にＡｐａＬＩで消化し、ＢＬＡ
遺伝子を含むＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をえた。
【００４５】実施例１で得たｐＮＵ５５０−ＨＡＭＹを
ＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ＨＡＭＹを除
き、ＢＬＡ遺伝子を含むＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片を挿入しｐＮＵ５５０−ＢＬＡを得、更に、Ｂ．ｂｒ
ｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換した。
ＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ＨＡＭＹを除
き、ＢＬＡ遺伝子を含むＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片を挿入しｐＮＵ５５０−ＢＬＡを得、更に、Ｂ．ｂｒ
ｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換した。
【００４６】この形質転換体を、５’ＰＹ培地（Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９−２２８
０（１９８９））にＩＰＴＧを１ｍＭ加えた培地と無添
加の培地に植え、３０℃で８５時間振とう培養した。上
記の培養液を遠心分離し、その上清のアミラーゼ活性を
可溶性澱粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｓ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０−２９８
（１９７８））で測定し、図１０の結果を得た。実施例
２と同様、狙いどうり、ｐＮＵ５５０−ＢＬＡを保持す
るＢ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１はＩＰＴＧで誘導する
ことにより培地にヒト唾液腺アミラーゼを分泌生産し
た。ＩＰＴＧ無添加の対照では生産しなかっバチルス・
リケニホルミスのα−アミラ−ゼを分泌生産した。
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９−２２８
０（１９８９））にＩＰＴＧを１ｍＭ加えた培地と無添
加の培地に植え、３０℃で８５時間振とう培養した。上
記の培養液を遠心分離し、その上清のアミラーゼ活性を
可溶性澱粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｓ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０−２９８
（１９７８））で測定し、図１０の結果を得た。実施例
２と同様、狙いどうり、ｐＮＵ５５０−ＢＬＡを保持す
るＢ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１はＩＰＴＧで誘導する
ことにより培地にヒト唾液腺アミラーゼを分泌生産し
た。ＩＰＴＧ無添加の対照では生産しなかっバチルス・
リケニホルミスのα−アミラ−ゼを分泌生産した。
【００４７】従って、ｐＮＵ５５０−Ｘの系を使った生
産制御が可能であることが更に確認された。
産制御が可能であることが更に確認された。
【００４８】
【発明の効果】本発明に係る新規な発現制御ベクターｐ
ＮＵ５５０は、発現コントロール能力にすぐれているだ
けでなく各種の外来遺伝子を適宜挿入することができる
ので、外来遺伝子産物の生産性を大幅に高めることがで
きる。
ＮＵ５５０は、発現コントロール能力にすぐれているだ
けでなく各種の外来遺伝子を適宜挿入することができる
ので、外来遺伝子産物の生産性を大幅に高めることがで
きる。
【図１】発現制御ベクターｐＮＵ５５０の制限酵素地図
である。
である。
【図２】オペレーターの挿入方法を図示した図面であ
る。
る。
【図３】プラスミドｐＨＴ２における、ＭＷＰプロモー
ターとー各領域を含む領域の塩基配列図である。
ターとー各領域を含む領域の塩基配列図である。
【図４】プラスミドｐＵＣ１１９−ＭＯのプロモータ
ー、オペレーター領域を含む領域の塩基配列図である。
ー、オペレーター領域を含む領域の塩基配列図である。
【図５】ｐＪＴＯ１（ｌａｃＩ遺伝子を有するｐＵＣ１
９）ベクターの構築図（１）である。
９）ベクターの構築図（１）である。
【図６】ｐＪＴＯ１（ｌａｃＩ遺伝子を有するｐＵＣ１
９）ベクターの構築図（２）である。
９）ベクターの構築図（２）である。
【図７】ｌａｃＩリプレッサー遺伝子の導入図である。
【図８】ｐＮＵ５５０−Ｘの構築図である。
【図９】Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１／ｐＮＵ５５０
−ＨＡＭＹの培養時間とアミラーゼ活性との関係図であ
る。
−ＨＡＭＹの培養時間とアミラーゼ活性との関係図であ
る。
【図１０】Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１／ｐＮＵ５５
０−ＢＬＡの培養時間とアミラーゼ活性との関係図であ
る。
０−ＢＬＡの培養時間とアミラーゼ活性との関係図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:08） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 下記の図１に示す制限酵素地図で示され
る発現制御ベクターｐＮＵ５５０。 【図１】 - 【請求項２】 下記の図２に示す制限酵素地図で示され
る発現制御ベクターｐＮＵ５５０に外来遺伝子を結合し
てなる発現制御ベクターｐＮＵ５５０−Ｘ。 【図２】 - 【請求項３】 請求項２に記載の発現制御ベクターｐＮ
Ｕ５５０−Ｘを保有する微生物。 - 【請求項４】 請求項２に記載の発現制御ベクターｐＮ
Ｕ５５０−Ｘを保有すバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）。 - 【請求項５】 請求項２に記載の発現制御ベクターｐＮ
Ｕ５５０−Ｘを保有するバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１）（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１０８７）。 - 【請求項６】 請求項３に記載の発現制御ベクターｐＮ
Ｕ５５０−Ｘを保有する微生物を培養することを特徴と
する外来遺伝子産物の製造法。 - 【請求項７】 外来遺伝子産物がヒト唾液腺アミラーゼ
またはバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼである
ことを特徴とする請求項６に記載の外来遺伝子産物の製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03089017A JP3138001B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | 発現制御ベクター及び該ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03089017A JP3138001B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | 発現制御ベクター及び該ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04304889A JPH04304889A (ja) | 1992-10-28 |
| JP3138001B2 true JP3138001B2 (ja) | 2001-02-26 |
Family
ID=13959141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03089017A Expired - Fee Related JP3138001B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | 発現制御ベクター及び該ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3138001B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994019474A1 (en) * | 1993-02-22 | 1994-09-01 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Process for producing human growth hormone |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP03089017A patent/JP3138001B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04304889A (ja) | 1992-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100200166B1 (ko) | 알칼리성 단백질 가수분해효소 및 그것의 제조방법 | |
| JP2766621B2 (ja) | 組み換えｇ−ｃｓｆ | |
| Beer et al. | Cloning, expression, characterization and role of the leader sequence of a lipase from Rhizopus oryzae | |
| JP2727391B2 (ja) | 高発現ベクター及び該高発現ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 | |
| JP3012026B2 (ja) | 高発現ベクター及び該高発現ベクター を保有する微生物並びに該微生物を 用いる有用物質の製造法 | |
| US5719021A (en) | Protein activation | |
| EP0482879B2 (en) | Protease from Bacillus licheniformis | |
| Heng et al. | Expression and secretion of an acid-stable α-amylase gene in Bacillus subtilis by SacB promoter and signal peptide | |
| Olędzka et al. | High-level expression, secretion, and purification of the thermostable aqualysin I from Thermus aquaticus YT-1 in Pichia pastoris | |
| JP3138001B2 (ja) | 発現制御ベクター及び該ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 | |
| JP3550409B2 (ja) | ジクチオステリウムのジペプチジルアミノペプチダーゼ | |
| JPH0474997B2 (ja) | ||
| JP2005229807A (ja) | トランスグルタミナーゼの製造法 | |
| JPS62201583A (ja) | バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法 | |
| JP2004313169A (ja) | 組換え枯草菌 | |
| JP3734593B2 (ja) | 新規発現プラスミドベクター及び該発現プラスミドベクターを保有するバチルス属細菌を用いた異種遺伝子産物の製造法 | |
| JP3504955B2 (ja) | 新規ｄｎａ断片、これを保有するプラスミドベクター及び組換え微生物並びにこれを用いる蛋白質の製造法 | |
| RU2127758C1 (ru) | Способ получения рекомбинантной стрептокиназы | |
| JP3164181B2 (ja) | 新規発現ベクタ−、該発現ベクタ−を保有する微生物、該微生物を用いる有用物質の製造法 | |
| JP3696322B2 (ja) | 新規ｈｓ遺伝子及び該遺伝子を異種遺伝子産物をコードする構造遺伝子の下流に連結した発現プラスミド並びに該発現プラスミドを保有する形質転換体を用いた異種遺伝子産物の製造法 | |
| JPH0638741A (ja) | ヒラメ成長ホルモンの製造法 | |
| JP2537764B2 (ja) | 高発現ベクタ―、バチルス属細菌、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 | |
| IE57952B1 (en) | Expression plasmids useful in b.subtilis | |
| JPH0227988A (ja) | ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの大量生産方法 | |
| KR100243526B1 (ko) | 아스퍼질러스 플레버스로부터 분리한 아미노펩티다제 및 그를 이용한 재조합 단백질의 아미노말단에 부착된 메티오닌 잔기의 제 거방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |