JP2537764B2 - 高発現ベクタ―、バチルス属細菌、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、枯草菌を代表とするバ
チルス属細菌で利用可能な新規な高発現ベクター、この
ベクターを保有するバチルス属細菌、およびこのバチル
ス属細菌によるペプチド又は蛋白質の製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術と発明が解決しようとする課題】枯草菌
（Bacillus subtilis）を代表とするバチルス（Bacill
us）属細菌は、古くから種々の菌体外酵素の生産菌とし
て、工業的に利用されている。例えば、枯草菌の仲間
は、日本において古くから納豆の製造に使用されてお
り、大腸菌などで問題となるエンドトキシンを生産しな
いこと、人体に寄生しないことなどの理由から、極めて
安全性の高い微生物である。このように、枯草菌は、ペ
プチド又は蛋白質の工業的な生産菌として、優れた性質
を有し、その有用性が注目されている。例えば、特開昭
５６−１３７９８６号公報には、前記菌体外酵素の遺伝
子のプロモーター、ＳＤ配列（シャイン−ダルガーノ(S
hine-Dalgarno)配列）、シグナル遺伝子をコードするＤ
ＮＡをクローニングし、その下流に目的とするペプチド
又は蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを枯草菌
に導入し、目的とするペプチド又は蛋白質を菌体外に分
泌生産させている。

【０００３】しかしながら、枯草菌におけるペプチド又
は蛋白質の生産は、枯草菌自体が産生するα−アミラー
ゼやプロテアーゼなどが主である。すなわち、枯草菌が
高い分泌生産能を有するにも拘らず、他の微生物由来の
酵素及び比較的分子量の小さな哺乳類の生理活性ペプチ
ドなどを生産させると、菌体自体が菌体外に多量に分泌
する各種のプロテアーゼにより生産物が分解され、高い
収率で有用生産物を回収できない。

【０００４】そこで、宿主枯草菌のプロテアーゼ活性を
低下させるための研究がなされている。例えば、プロテ
アーゼ活性の低い枯草菌として、枯草菌の主たる菌体外
プロテアーゼである中性プロテアーゼ及びアルカリプロ
テアーゼの両者を欠失したバチルス・サブチリス（Baci
llus subtilis）１０４ＨＬ株［バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ(Biochem. Biophys.Res. Commun.), 128; 601-606, 1
985］が知られている。また、本出願人は、特開昭６４
−３７２８４号公報において、バチルス・サブチリス１
０４ＨＬ株に、pap 遺伝子を導入したバチルス・サブチ
リスＤＹ−１６株（微工研菌寄第９４８８号）を提案し
た。

【０００５】一方、枯草菌ベクターの開発も、宿主の開
発と同様に古くから行なわれている。例えば、枯草菌自
体や、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス
・リケニホルミスなどの類縁菌のα−アミラーゼ、また
は中性及びアルカリプロテアーゼの遺伝子のプロモータ
ー、リボソーム結合領域（ＳＤ配列）、シグナル配列を
利用した分泌ベクターが発表されている。これらの分泌
ベクターにより、それぞれ本来のα−アミラーゼやプロ
テアーゼの分泌だけでなく、例えばプロテインＡなどの
他の有用酵素、およびインターフェロン、ヒト成長ホル
モンなどの生理活性ペプチドを生産できる。

【０００６】しかしながら、枯草菌が分泌生産という有
用性を有するにも拘らず、大腸菌に比べて、遺伝子組換
えの宿主としての利用が遅れている。このことは、遺伝
子産物の生産量が少ないことに起因する。すなわち、大
腸菌系では、多くの強いプロモーター系と、極めて正確
な制御系とが確立され、これらが多コピープラスミド上
で安定に機能している。これに対して、枯草菌の系にお
いては、多くの試みにも拘らず、大腸菌のように確立さ
れた系は、存在しない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、バチルス属細菌内に安定に保持され、かつペプチド
又は蛋白質を菌体外に多量に分泌生産させることができ
る高発現ベクターを提供することにある。

【０００８】本発明の他の目的は、前記高発現ベクター
を保有し、ペプチド又は蛋白質を菌体外に多量に分泌生
産するバチルス属細菌を提供することにある。

【０００９】本発明のさらに他の目的は、ペプチド又は
蛋白質を効率よく多量に得ることができるペプチド又は
蛋白質の製造方法を提供することにある。

【００１０】

【発明の構成】本発明者らは、高い分泌能を有するバチ
ルス属細菌に着目し、その分泌ベクターの開発を鋭意研
究した結果、枯草菌において一般に使用されているベク
タープラスミドｐＵＢ１１０のクローニングサイトＢａ
ｍＨＩ切断部位またはその近傍に、高い翻訳能力を有す
る遺伝子を特定の方向に導入すると、分泌ベクターが少
なくともバチルス属細菌内で安定に保持され、かつ分泌
ベクターにより所望の遺伝子産物が多量に分泌発現する
ことを見いだし、本発明を完成した。

【００１１】すなわち、本発明は、少なくともｐＵＢ１
１０のＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの
塩基配列を含むｐＵＢ１１０由来のベクターであって、
ＢａｍＨＩ切断部位またはその近傍に、ＳｐｈＩ切断部
位からＢａｍＨＩ切断部位への方向に、ＳＤ配列を有す
るペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が連結されて
いると共に、前記ＳＤ配列の５′側にα−アミラーゼ遺
伝子のプロモーターが連結されている高発現ベクターを
提供する。

【００１２】本発明は、前記高発現ベクターを保有する
バチルス属細菌を提供する。

【００１３】さらに本発明は、前記バチルス属細菌を培
養し、産生したペプチド又は蛋白質を回収するペプチド
又は蛋白質の製造方法を提供する。

【００１４】本明細書において、塩基配列における核酸
の表示はＩＵＰＡＣにより採択されている表示法に従う
ものとする。

【００１５】本発明の高発現ベクターは、ベクタープラ
スミドｐＵＢ１１０に由来し、ｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ
切断部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含ん
でいる。ｐＵＢ１１０はその全塩基配列を有している必
要はなく、少なくともＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩ切断部
位を有していればよく、ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＩ切断部位を有するｐＵＢ１１０由来のベクター
であってもよい。なお、ｐＵＢ１１０は黄色ブドウ状球
菌［スタフィロコッカス(Staphylococcus ) ］属に由来
する多コピープラスミドであり、カナマイシン耐性遺伝
子を有し、その制限地図は確立されている。図１にベク
タープラスミドｐＵＢ１１０の制限酵素地図の概要を示
す。

【００１６】ｐＵＢ１１０とペプチド又は蛋白質をコー
ドする遺伝子との連結部位は、制限酵素ＢａｍＨＩ部位
に限らず、その近傍、例えば、ＢａｍＨＩ部位からＥｃ
ｏＲＩ部位までの間などであってもよい。すなわち、Ｅ
ｃｏＲＩ部位や、ＢａｍＨＩ部位からＥｃｏＲＩ部位ま
での領域に存在するＡｖａＩ部位、ＸｂａＩ部位に、ペ
プチド又は蛋白質をコードする遺伝子を連結してもよ
い。

【００１７】クローニングサイトＢａｍＨＩ切断部位ま
たはその近傍には、高い翻訳能力を有する遺伝子、すな
わちＳＤ配列を有するペプチドまたは蛋白質をコードす
る遺伝子が連結されている。

【００１８】本発明の主たる特徴は、前記ペプチド又は
蛋白質をコードする遺伝子が、従来とは逆の方向である
ＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切断部位への方向、す
なわちカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に導入されて
いると共に、前記ＳＤ配列の５′側にα−アミラーゼ遺
伝子のプロモーターが連結されている点にある。このよ
うな特定の方向にペプチド又は蛋白質をコードする構造
遺伝子を導入し、且つ前記プロモーターを連結すると、
宿主微生物により、ペプチド又は蛋白質を多量に分泌生
産させることができる。

【００１９】前記ペプチド又は蛋白質は、特に限定され
ず、酵素、原核細胞および真核細胞を問わず、動物性細
胞由来のペプチド又は蛋白質であってもよい。ペプチド
及び蛋白質には、例えば、インスリン、ガストリン、各
種オピオノイドペプチド、上皮細胞成長因子、エンドセ
リン、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチ
ド［Vasoactive Intestinal Polypeptide （ＶＩ
Ｐ）］、心房性利尿ホルモン（ＡＮＰ）、サブスタンス
Ｐ、カルシトニン、インシュリン様成長因子Ｉ，ＩＩ、
ガラニン、モチリン、バソプレシン、インターフェロ
ン、ＩＬ−２などの各種の生理活性ペプチドまたはこれ
らの前駆体；α−アミラーゼ、プロテインＡ、ヒルジ
ン、エグリンＣ、分泌性白血球由来プロテアーゼインヒ
ビターなどの阻害剤、ヒトアルブミン、血液凝固因子、
リンフォカイン、神経成長因子、肝細胞再生因子などの
各種の分化誘導因子、成長因子などの蛋白質またはこれ
らの前駆体が含まれる。

【００２０】前記ＳＤ配列は、特に制限されず、例え
ば、枯草菌の１６Ｓ−ｒＲＮＡの配列に対応して合成し
た下記のＳＤ配列であってもよく、 ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡ
ＴＴＣ 下記のＳＤ配列などであってもよい。

【００２１】５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴ
ＡＧＡＡＴＴＣ ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣ ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＡＴ ５′−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴ これらのＳＤ配列を導入すると、僅の発現の差異が認め
られるものの、ベクタープラスミドによる効果が本質的
に損われるものではない。ＳＤ配列は、リボソーム結合
部位として機能し、その下流には、開始コドンが存在す
る。

【００２２】なお、従来、ｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ切
断部位が関与して、何かしらの転写が行なわれているこ
とが知られていた［Bruchner, R.,et al., Gene 32, 15
1-160 (1984)およびCurran, J.F., and Stewart, C.J.,
Virology, 142, 98-111 (1985) ］。しかしながら、こ
の知見を積極的に利用した例はない。このことは、各種
のファクターが転写の強さについて及ぼす影響を正確に
定量化できていなかったことに他ならない。

【００２３】前記ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝
子を、ＳＤ配列およびα−アミラーゼ遺伝子のプロモー
ターと共に、ベクターＤＮＡに前記特定の方向に連結す
ることにより、ＳＤ配列の強さに応じてペプチド又は蛋
白質を生産できる。前記プロモーターとしては、例え
ば、枯草菌自体や、バチルス・アミロリクエファシエン
ス、バチルス・リケニホルミスなどの類縁菌のα−アミ
ラーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。

【００２４】構造遺伝子の下流、すなわちペプチド又は
蛋白質をコードする遺伝子の３′側に、ターミネーター
が連結されていなくても、ベクターによる効果が特に損
われることはないが、構造遺伝子の下流には、ターミネ
ーターが連結されているのが好ましい。ターミネーター
は、特に限定されず、例えば、枯草菌のアルカリプロテ
アーゼ遺伝子のターミネーターや、これに対応して化学
合成したターミネーターなどであってもよい。

【００２５】本発明の高発現ベクターおよびこのベクタ
ーを保有するバチルス属細菌は、種々の方法で構築でき
る。例えば、ｐＵＢ１１０を制限酵素ＢａｍＨＩで解裂
し、アルカリホスファターゼで処理する。また、所望の
ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の５′側にプロ
モーターおよびＳＤ配列を、３′側にターミネーターを
連結し、ＤＮＡ断片を調製する。このＤＮＡ断片をｐＵ
Ｂ１１０のＢａｍＨＩ部位に導入する。なお、前記ＤＮ
Ａ断片とＢａｍＨＩ部位とのサイトが合わない場合に
は、両断片を平滑末端としたり、適当な制限酵素リンカ
ーを用いればよい。ｐＵＢ１１０にペプチド又は蛋白質
をコードする遺伝子が導入されたキメラプラスミドによ
り、宿主微生物であるバチルス属細菌を形質転換する。
得られた形質転換株から、カナマイシン耐性遺伝子と同
じ方向に前記遺伝子が導入されたプラスミドを選択する
ことにより、前記高発現ベクターを保有するバチルス属
細菌が得られる。

【００２６】しかし、この方法では、前記制限酵素によ
る切断部位が、目的とするペプチド又は蛋白質ペプチド
の遺伝子に存在しない場合には、ｐＵＢ１１０のＢａｍ
ＨＩ部位に構造遺伝子を両方向に導入し、得られたキメ
ラプラスミドの中から、目的とするベクターを捜し出す
必要がある。この方法では、目的蛋白質が枯草菌由来の
α−アミラーゼであっても、カナマイシン耐性遺伝子と
同じ方向に遺伝子が導入されたプラスミドを得る確率
は、通常、比較的小さい。すなわち、枯草菌由来の構造
遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に導入され
たプラスミドは、逆方向に導入されたプラスミドに比べ
て、例えば、１／４０程度しか得られない。さらに、枯
草菌以外のペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を導
入すると、枯草菌の生育阻害が顕著となり、目的とする
プラスミドが得られにくくなる。このことを解決するた
めには、例えば、次の２つの方法が採用できる。

【００２７】第１の方法では、ｐＵＢ１１０をＢａｍＨ
ＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼ
で処理する。一方、所望のペプチド又は蛋白質をコード
する遺伝子の５′側をＢａｍＨＩ部位、３′側をＥｃｏ
ＲＩ部位となるように切断するか、又は合成ＤＮＡリン
カーを用いてＤＮＡ断片を調製する。そして、ｐＵＢ１
１０のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位の間に、前記ＤＮＡ
断片を方向性をもって導入する。なお、この方法におい
て、ｐＵＢ１１０を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩ、制
限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩなどで切断し、上記と同様
にして、目的の遺伝子を方向性を考慮して導入してもよ
い。

【００２８】第２の方法では、先ずｐＵＢ１１０を制限
酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとで切断し、得られた約１キ
ロベースペア（Ｋｂｐ）の遺伝子断片を、大腸菌のベク
ター、例えば、プラスミドｐＵＣ１９などのポリリンカ
ーサイトＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ間に導入する。得られた
プラスミドのｐＵＢ１１０に由来する遺伝子のうち、例
えば、ＢａｍＨＩ部位に、前記ペプチド又は蛋白質をコ
ードする遺伝子を導入し、宿主大腸菌、例えばＨＢ１０
１などを形質転換する。得られた形質転換株からプラス
ミドを調製し、目的の方向に遺伝子が導入されたプラス
ミドを選択する。この際、ｐＵＢ１１０上に、カナマイ
シン耐性遺伝子と同じ方向に構造遺伝子が導入されたプ
ラスミドが多量に得られる。例えば、目的の方向に構造
遺伝子が導入されたプラスミドと、逆方向に構造遺伝子
が導入されたプラスミドとの割合は、１：１程度であ
る。

【００２９】前記構造遺伝子がクローニングされたプラ
スミドのうち、ｐＵＢ１１０に由来する領域を、例え
ば、制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩなどのように目的遺
伝子を導入可能な制限酵素で切出す。一方、上記と同じ
制限酵素、例えば、ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとでｐＵＢ１
１０を切断し、前記切出したＤＮＡ断片と連結し、宿主
であるバチルス属細菌を形質転換する。得られた形質転
換株の殆どは、目的とするペプチド又は蛋白質を多量に
生産できる方向に連結されたプラスミドを保有する。

【００３０】前記のようにして得られた高発現ベクター
により、宿主バチルス属細菌を形質転換することによ
り、ペプチド又は蛋白質を多量に生産する微生物が得ら
れる。前記ベクターによるバチルス属細菌の形質転換
は、慣用の方法、例えば、チャン(Chang) らのプロトプ
ラスト化法［Chang, S., et al., Mol. Gen. Genet., 1
68, 111-115 (1979)］などを利用して行なうことができ
る。

【００３１】前記宿主微生物は、バチルス（Bacillus）
属の微生物であり、その菌株は、遺伝子産物が安定であ
る限り特に制限されない。好ましい宿主は、安全性が高
く、菌体外にペプチド又は蛋白質を多量に分泌するバチ
ルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）である。さら
に、バチルス・ズブチリスの中で、突然変異などの手法
により菌体外へのプロテアーゼ活性を低下させた菌株が
好ましい。このような菌株をプラスミドにより形質転換
する場合には、分子量の小さなペプチドであっても、宿
主由来のプロテアーゼによる分解を抑制できる。

【００３２】プロテアーゼ活性の低い枯草菌としては、
例えば、前記バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株；バチ
ルス・サブチリスＤＹ−１６株（微工研菌寄第９４８８
号）；アルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの生
産能を欠き、かつプロテアーゼ活性が野生株の３％以下
である枯草菌に、spo OA△677 変異遺伝子を導入した菌
株などが挙げられる。特に好ましい菌株には、例えば、
特願平１−２８１４４０号において、本出願人が提案し
たように、バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株にspo OA
△677 変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＳＰ
０１１株（微工研菌寄第１０９８７号）、バチルス・サ
ブチリスＤＹ−１６株にspo OA△677 変異遺伝子を導入
したバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株（微工研菌寄第
１０９８８号）などが含まれる。

【００３３】特にバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株
は、野生株に比べてプロテアーゼ活性が１／５０００以
下であり、生産物の安定性が極めて良好であること、ア
ミノ酸要求性を２種類有し、胞子を形成しないため、自
然界における生育が不可能と考えられることから、実験
室における遺伝子組換えだけでなく、有用生産物の工業
生産のための宿主として極めて有用な菌である。

【００３４】なお、spo OA変異は、胞子形成の最も初期
の段階において胞子形成を遮断する突然変異である。こ
の変異遺伝子は、枯草菌が熱、紫外線、化学薬品及び乾
燥などに晒された場合、通常自然に生存する形態である
胞子を生成する能力を破壊する。この突然変異を起す具
体的な方法として、ＫＮＯ₃ をＮ源とする培地で、対数
増殖期末期に達した枯草菌の細胞を繰り返し継代培養す
る方法が知られている（別冊蛋白質核酸酵素、細菌ファ
ージ遺伝実験法、第213 頁 (1972) ）。

【００３５】前記ペプチド又は蛋白質は、前記形質転換
されたバチルス属細菌を培養することにより得られる。
形質転換されたバチルス属細菌の培養は、慣用の液体培
養に準じて行なうことができる。すなわち、形質転換株
の培養は、慣用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素
源、増殖因子成分などを含む液体培地で、振盪培養又は
通気撹拌培養法により行なうことができる。培地のｐＨ
は、例えば、７〜８程度である。培養は、微生物の培養
に採用される通常の条件、例えば、温度１５〜４５℃、
好ましくは２５〜４０℃、培養時間６〜６０時間程度の
条件で行なうことができる。

【００３６】なお、宿主微生物が生産したペプチド又は
蛋白質の分離精製は、慣用の方法、例えば、塩析、溶媒
沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、ＳＤＳ−ア
ガロースゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法、電気溶出(electro elution) 法、イオ
ン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマト
グラフィー法、逆相高速液体クロマトグラフィー法や、
これらを組合せた方法で行なうことができる。ペプチド
などが菌体内やペリプラズムに蓄積される場合には、慣
用の方法、例えば、菌体を破砕し、前記分離精製に供す
ることにより、ペプチド又は蛋白質を得ることができ
る。

【００３７】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、以下
の実施例により限定されるものではない。

【００３８】実施例１ アッセイ系としてα−アミラーゼ遺伝子を選び、分泌生
産されるα−アミラーゼの量を指標として、高発現の分
泌ベクターを構築した。 （１）バチルス・サブチリスＳＰＬ１４株の作製spo OA遺伝子及びリンコマイシン耐性遺伝子（以下、Ｌ
ｉｎ^r と称する）を有する枯草菌として知られているバ
チルス・サブチリスＡＴＣＣ３９０９６株を、表１に示
すＬＢ培地を用いて３７℃で対数増殖期まで振盪培養し
た。

【００３９】

【表１】 培養液５０ｍｌ中の菌体を集め、斉藤・三浦の方法［H.
Saito, K. Miura, Biochem. Biophis. Acta, 72, 619
(1963)］により染色体ＤＮＡを抽出精製した。

【００４０】得られた染色体ＤＮＡを用いてコンピテン
トセル形質転換法によりバチルス・サブチリスＤＹ−１
６株を形質転換した。形質転換した枯草菌を、ヒスチジ
ンを５０ｍｇ／ｌ含む最小寒天培地にまき、３７℃で４
８時間培養した。胞子形成能欠損株を、以下の指標に従
って選択した。

【００４１】１．胞子形成培地に植菌し、そのコロニー
がメラニン色素生産能を失ったこと ２．８０℃、１０分の熱処理に耐性を示すこと ３．顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと 以下の方法でプロテアーゼ活性を測定し、得られた胞子
欠損株１７３株のうち最もプロテアーゼ活性の低下した
株を選出した。

【００４２】先ず、１％カゼインを含むＬＢ寒天平板培
地に、それぞれの胞子欠損形質転換株と、バチルス・サ
ブチリスＤＹ−１６株を別々に植菌し、３７℃で２４時
間培養した。菌体が分泌するプロテアーゼによりカゼイ
ンが分解されるので、カゼインの分解に伴なって形成さ
れる菌体の周りのハローの大きさを指標として、親株で
あるバチルス・サブチリスＤＹ−１６株よりもプロテア
ーゼ生産能が低下した４０株を分離した。

【００４３】さらに、これらの株をＬＢ培地で液体培養
し、その培養上清に存在するプロテアーゼ活性を、ＦＩ
ＴＣ−カゼイン（ジクマ社）を基質として測定した。す
なわち、バチルス・ズブチリスＤＹ−１６及びプロテア
ーゼ活性が低下した形質転換株４０株をそれぞれ、ＬＢ
培地１０ｍｌを用いて一晩培養し、その培養液１ｍｌを
遠心分離し、その上清をプロテアーゼ酵素液とした。

【００４４】酵素液５０μｌと、０．２μｇのＦＩＴＣ
−カゼインとを、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．
５）および２ｍＭのＣａＣｌ₂ の緩衝液中（２００μ
ｌ）で３７℃で２時間反応した。反応液に２００μｌの
７．５％トリクロロ酢酸を添加し、遠心分離した後、そ
の上清１００μｌに、５００ｍＭトリス−塩酸（ＰＨ
８．５）９００μｌを添加し、プロテアーゼ活性を、螢
光光度計を用い、波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ
₆₀₀ ）により測定した。

【００４５】なお、プロテアーゼ活性（ＰＵＤ）は、３
７℃、ｐＨ７．５において、カゼインから１分間に１μ
モルのチロシンＴｙｒに相当するトリクロロ酢酸可溶性
ペプチドを遊離する酵素量を１ＰＵＤとして、算出し
た。その結果、プロテアーゼ活性が親株バチルス・サブ
チリスＤＹ−１６株に比べ極端に低下した４株（バチル
ス・サブチリスＳＰＬ９，１１，１４，３９）を得た。

【００４６】これら４株のプロテアーゼ活性をさらに詳
しく測定した。バチルス・サブチリスＤＹ−１６株及び
プロテアーゼ活性が低下した形質転換株４株を１０ｍｌ
のＬＢ培地で１８時間培養した後、５０ｍｌのＭｅｄｉ
ｕｍ Ａ培地に菌体を移し、培養２４時間及び４８時間
後の培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。その結
果を表２に示す。

【００４７】

【表２】 得られたこれらの株は、親株に比べプロテアーゼ活性が
１／２０以下と低いことが確認された。特にバチルス・
サブチリスＳＰＬ１４株は、プロテアーゼ活性が低い。
また、いずれの株においてもヒスチジンとロイシンに対
する要求性を有しており、遺伝子組換え実験における宿
主として要求される複数の栄養要求性を確認した。これ
らの菌株は、ペプチドを効率よく生産できる宿主とし
て、安全かつ有効に用いることができる。 （２）α−アミラーゼ遺伝子のプローモーターの合成 以下のような枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のプローモー
ター配列をそれぞれ化学合成し、両遺伝子をアニーリン
グした後、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩの間に
挿入し、図２に示すようにプラスミドｐＭＤ３００３を
構築した。

【００４８】 5'- AATTCAGGATCCTTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTGT TTTGATAGAGTGATTGTGATAATTTAAAATGTAAGCGTGAACAA AATTCTCCAGT-3' 5'-ACTGGAGAATTTTGTTCACGCTTACATTTTAAATTATCAC AATCACTCTATCAAAACAACTTGGCAGAGTGAATACAAATCAAGG ATCCTG-3' （３）ＳＤ配列の合成 枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子及び黄色ブドウ球菌由来
のプロテインＡ遺伝子のＳＤ配列、及び枯草菌１６Ｓリ
ボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の配列を参考として、以下
の塩基配列で表されるＳＤ配列を、ＡＢＩ社ＤＮＡ合成
装置を用いて合成した。なお、遺伝子の５′側にはプロ
ーモーターとの連結部位であるＸｂａＩ部位を、３′領
域にはα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列との連結部
位であるＮｒｕＩ部位を導入した。下記配列の下線部は
ＳＤ配列を示す。

【００４９】 ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴＣＧ ＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣ （４）α−アミラーゼ遺伝子 バチルス・サブチリス１Ａ４１２株［オハイオ州立大学
のバチルス・ジェネティク・ストック・センター（Baci
llus Genetic Stock Center)(BGSC)より入手した］から
前記斉藤・三浦の方法により調製した染色体ＤＮＡ１０
μｇを、１００μｌのＳａｕ３ＡＩ溶液［１０ｍＭのト
リス−塩酸（ｐＨ７．５）、７ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１０
０ｍＭのＮａＣｌ）に溶解し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを
１単位加え、３７℃で１０分間反応させ、フェノール溶
液［フェノールをＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス−塩酸
（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）で飽和したもの］
を添加し、反応を停止した後、エタノール沈澱物とし
て、枯草菌染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩの部分分解物を
得た。

【００５０】一方、１μｇの枯草菌ベクターｐＵＢ１１
０を、ＢａｍＨＩ溶液［１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）、７ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１００ｍＭのＮａＣ
ｌ、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．０１％の
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）］中で５単位の制限酵素Ｂ
ａｍＨＩと３７℃で１時間反応させ、フェノール溶液で
処理した後、エタノール沈澱物をｐＵＢ１１０のＢａｍ
ＨＩ分解物として得た。

【００５１】次いで、得られた上記二つのＤＮＡ断片の
リゲーションを行った。すなわち、上記のようにして調
製したそれぞれのＤＮＡ断片を、１０μｌのリゲーショ
ン溶液［６６ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、６．
６ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭのジチオスレイトール
（ＤＴＴ）、および０．１ｍＭのアデノシン三リン酸
（ＡＴＰ）］に溶解した後、混合し、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼ１０単位を添加し、２０℃で１時間反応を行った。

【００５２】このＤＮＡ溶液を用いて、バチルス・サブ
チリス１Ａ２８９株（ＢＧＳＣより入手）をプロトプラ
スト化法（Chan, S., Cohen, N., Molec, gen. Genet.,
168, 111-115 (1979) ）により形質転換した。

【００５３】形質転換株を寒天培地で培養し、カナマイ
シン耐性を示す約２万個のコロニーが得られ、寒天平板
培地上でのヨード・デンプン反応により、このうち１株
が菌体外にα−アミラーゼを分泌生産していることが確
認された。

【００５４】この株からプラスミドＤＮＡを分離し、制
限酵素による解析を行なったところ、図３に示すような
制限酵素地図が得られ、前記プラスミドをｐＤＣＡ１０
０と命名した。ｐＤＣＡ１００は、ｐＵＢ１１０のＢａ
ｍＨＩ部位に３．１ＫｂのＳａｕ３ＡＩ断片が挿入され
た７．６Ｋｂのプラスミドである。前記３．１ＫｂのＳ
ａｕ３ＡＩ断片の中には、枯草菌由来のα−アミラーゼ
遺伝子［Yamazaki, H.et al., J. Bacteriol., 156 , 3
27 (1984)］と全く同じ制限酵素パターンが認められた
ことから、α−アミラーゼ遺伝子がクローニングされて
いることが確認された。

【００５５】ｐＤＣＡ１００のα−アミラーゼ遺伝子と
同一と考えられるα−アミラーゼ遺伝子が導入された菌
株は、アメリカ合衆国オハイオ大学バチルス・ジェネテ
ック・ストック・センター（ＢＧＳＣ）にＥＣＥ３５株
として登録されている。 （５）α−アミラーゼ遺伝子とＳＤ配列の連結 クローニングされたα−アミラーゼ遺伝子と合成ＳＤ配
列とを、以下の塩基配列で表される合成遺伝子を介して
連結した。

【００５６】 5'-CGAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTTGCTGGA TTTTTATTGCTGTTTTATTTGGTTCTGGCAGGAC-3' 5'-CGGTCCTGCCAGAACCAAATAAAACAGCAATAAAAATCCA GCAAATAACGGCAGTAAAGAGGTTTTGAATCGTTTCG-3' この合成遺伝子は、α−アミラーゼ遺伝子のシグナル配
列部分のアミノ酸配列（Yamazaki, H. et al., J. Bact
eriol., 156 , 327 (1984)）に従って塩基配列を決定
し、化学合成した。常法に従って精製した後、アニーリ
ングし、合成ＤＮＡリンカーとした。 （６）ターミネーターの作製 枯草菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子のターミネーター
を参考として、以下のターミネーターをそれぞれ合成し
た。なお、５′末端側には、ＢｇｌＩＩ部位を、３′末
端側にはＳｐｈＩ部位を設けた。また、３′末端のすぐ
近くにはＢａｍＨＩ部位を設けた。合成した後、両合成
遺伝子をアニーリングし、ターミネーター断片とした。

【００５７】 5'-GATCTATAAAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCTTCTTT TTATTTGTCAGCATCCTGATGTTGGATCCGCATG-3' 5'-CGGATCCAACATCAGGATGCTGACAAATAAAAAGAAGCAGG TATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTATA-3' （７）ＳＤ配列、α−アミラーゼ遺伝子、ターミネータ
ーの連結 ＳＤ配列、α−アミラーゼ遺伝子、ターミネーターを、
図４に示すように連結し、プラスミドｐＭＤ３０６２を
得た。すなわち、ＤＮＡ合成したＳＤ配列、リンカーＤ
ＮＡ、ターミネーター断片をＤＮＡキナーゼを用いてカ
イネーションした。α−アミラーゼ遺伝子は、ｐＤＣＡ
１００から、ＨｐａＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ＥｃｏＲＩ
−ＢｃｌＩ断片として回収した。これらの遺伝子と、ア
ルカリホスファターゼ処理したｐＵＣ１９のＸｂａＩ−
ＳｐｈＩ切断断片と、α−アミラーゼ遺伝子部分を混合
し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１
株を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換
株の中から、目的とするプラスミドｐＭＤ３０６２を得
た。 （８）ｐＭＤ３０８２Ｂ１の構築とα−アミラーゼの生
産 プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１の構築図を図５に示す。

【００５８】先ず、ｐＭＤ３００３を制限酵素ＢａｍＨ
ＩとＸｂａＩとで切断し、プローモーターを切り出し
た。また、ｐＭＤ３０６２をＸｂａＩとＢａｍＨＩとを
用いて切断し、ＳＤ配列からターミネーターまでの領域
を含むα−アミラーゼ遺伝子部分を得た。そして、これ
らの遺伝子を、アルカリホスファターゼ処理したｐＵＢ
１１０のＢａｍＨＩ消化物と混合し、ＤＮＡリガーゼを
用いて連結し、バチルス・サブチリスＳＰＬ１４株をプ
ロトプラスト化法により形質転換した。

【００５９】得られたカナマイシン耐性形質転換株の中
から、α−アミラーゼ生産能を示す２００株の形質転換
株を分離した。これらの形質転換株の中から、α−アミ
ラーゼ遺伝子の方向性の異なる２種類のプラスミドが得
られた。ｐＵＢ１１０中のカナマイシン耐性遺伝子と同
じ方向で遺伝子が導入されたプラスミドをｐＭＤ３０８
２Ｂ１、その逆方向に導入されたプラスミドをｐＭＤ３
０８２Ｂ２とした。それらの構成比は前者：後者＝１：
４０であった。

【００６０】次いで、これらのプラスミドを有するバチ
ルス・サブチリスＳＰＬ１４株を１２時間浸透培養し、
得られたα−アミラーゼ活性を比較検討したところ、ｐ
ＭＤ３０８２Ｂ１の方がｐＭＤ３０８２Ｂ２よりも約３
倍のα−アミラーゼを生産し、培養１２時間後には２０
００ユニット／ｍｌのα−アミラーゼを生産した（表３
参照）。なお、α−アミラーゼ活性は、不破らの方法
（Fuwa, H., J. Biochem, 41, 583-603 (1954)）に従っ
て測定した。

【００６１】

【表３】（９）プローモーターを除去したときのα−ア
ミラーゼ活性 ｐＭＤ３０８２Ｂ１をＸｂａＩで切断し、ＳＤ配列、α
−アミラーゼ遺伝子、ターミネーター遺伝子部分を回収
し、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＵＣ１１８のＸｂａ
Ｉ切断部位に連結した。α−アミラーゼ遺伝子の５′側
に、ｐＵＣ１１８に存在するポリリンカー部位であるＢ
ａｍＨＩ部位を位置させて連結したプラスミドをｐＭＤ
３０００１とした。

【００６２】このｐＭＤ３０００１を、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩにより切断することにより、プローモーターが存在
しないα−アミラーゼ遺伝子を回収できる。そこで、ｐ
ＭＤ３００１をＢａｍＨＩで切断した後、アルカリホス
ファターゼで処理したｐＵＢ１１０のＢａｍＨＩ切断断
片と混合し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、バチ
ルス・サブチリスＳＰＬ１４株を形質転換した。得られ
たカナマイシン耐性形質転換株を培養し、それぞれプラ
スミドＤＮＡを調製し、α−アミラーゼ遺伝子の方向性
を調べたところ、ｐＵＢ１１０にα−アミラーゼ遺伝子
がカナマイシン耐性遺伝子と同じ方向に導入されたプラ
スミドｐＭＤ３０８２Ｂ１△と、逆方向に導入されたｐ
ＭＤ３０８２Ｂ２△を得た。プラスミドｐＭＤ３０８２
Ｂ１△およびｐＭＤ３０８２Ｂ２△の構築図を図６に示
す。

【００６３】それぞれのプラスミドを保有するバチルス
・サブチリスＳＰＬ１４株を培養し、得られた培養濾液
中のα−アミラーゼ活性を調べたところ、表４に示す結
果を得た。すなわち、ｐＭＤ３０８２Ｂ２△を保有する
バチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、培養１２時間後
にα−アミラーゼを１０ユニットしか生産せず、プラス
ミドを保有していないＳＰＬ１４株の生産するα−アミ
ラーゼ活性と変りがなかった。一方、ｐＭＤ３０８２Ｂ
１△を有するバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株は、培
養１２時間後にα−アミラーゼを８００ユニット／ｍｌ
生産した。

【００６４】

【表４】 実施例２ プラスミドｐＵＢ１１０を制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃ
ｏＲＩで切断し、ＳｐｈＩ部位からＥｃｏＲＩ部位まで
の小さな約１Ｋｂｐの断片を得た。プラスミドｐＵＣ１
９を制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵ
Ｃ１９のポリリンカーサイトに、ＤＮＡリガーゼを用い
て前記約１Ｋｂｐの断片を導入し、プラスミドｐＵＣ１
９−１１０Ｂを構築した。プラスミドｐＵＣ１９−１１
０Ｂの構築図を図７に示す。

【００６５】このプラスミドベクター上のｐＵＢ１１０
部分に存在するＢａｍＨＩ部位を酵素ＢａｍＨＩにより
解裂し、アルカリホスファターゼ処理した。また、前記
ｐＭＤ３０８２Ｂ１からα−アミラーゼ遺伝子部分を制
限酵素ＢａｍＨＩで切断し回収した。両遺伝子断片を混
合し、リガーゼにより連結し、大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換した。

【００６６】得られたアンピシリン耐性を有する形質転
換株から、プラスミドを調製し、遺伝子の導入方向を調
べたところ、供試４８株のうち２３株が、目的の方向に
遺伝子が導入されたプラスミドを有していた。

【００６７】得られたプラスミドを、制限酵素ＳｐｈＩ
とＥｃｏＲＩとで切断し、ＤＮＡ断片を調製した。ま
た、ｐＵＢ１１０を制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩとで
切断し、ＤＮＡリガーゼを用いて、前記ＤＮＡ断片と連
結することにより、遺伝子を、目的のカナマイシン耐性
遺伝子と同じ方向に１００％導入できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】ベクタープラスミドｐＵＢ１１０の概略制限酵
素地図である。

【図２】プラスミドｐＭＤ３００３の構築図である。

【図３】プラスミドｐＤＣＡ１００の制限酵素地図であ
る。

【図４】プラスミドｐＭＤ３０６２の構築図である。

【図５】プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１の構築図であ
る。

【図６】プラスミドｐＭＤ３０８２Ｂ１△及びｐＭＤ３
０８２Ｂ２△の構築図である。

【図７】プラスミドｐＵＣ１９−１１０Ｂの構築図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/28 (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:125）

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくともｐＵＢ１１０のＳｐｈＩ切断
   部位からＢａｍＨＩ切断部位までの塩基配列を含むｐＵ
   Ｂ１１０由来のベクターであって、ＢａｍＨＩ切断部位
   またはその近傍に、ＳｐｈＩ切断部位からＢａｍＨＩ切
   断部位への方向に、ＳＤ（Shine-Dalgarno）配列を有す
   るペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子が連結されて
   いると共に、前記ＳＤ配列の５′側にα−アミラーゼ遺
   伝子のプロモーターが連結されている高発現ベクター。
2. 【請求項２】 ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子
   の３′側にターミネーターが連結されている請求項１記
   載の高発現ベクター。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の高発現ベクター
   を保有するバチルス属細菌。
4. 【請求項４】 請求項３記載のバチルス属細菌を培養
   し、産生したペプチド又は蛋白質を回収するペプチド又
   は蛋白質の製造方法。