JPH0659218B2 - Ｄｎａ導入ベクタ− - Google Patents

Ｄｎａ導入ベクタ−

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JPH0659218B2
JPH0659218B2 JP53063756A JP6375678A JPH0659218B2 JP H0659218 B2 JPH0659218 B2 JP H0659218B2 JP 53063756 A JP53063756 A JP 53063756A JP 6375678 A JP6375678 A JP 6375678A JP H0659218 B2 JPH0659218 B2 JP H0659218B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 本発明は、ある特定の蛋白質に対する遺伝情報コードを
含有する特定のニユクレオチド配列の分離、この特定の
ニユクレオチド配列を有するDNAの合成およびそのDNAを
複製しうる微生物宿主にそのDNAを導入することに関す
る。さらに具体的には、本発明はインシユリン遺伝子お
よび成長ホルモン遺伝子の分離、それらの精製、微生物
宿主への導入および複製およびそれに続くそれらの特徴
付けに関する。新規生成物が本発明により製造しうる。
これらの生成物は、高等生物に由来する特定のニユクレ
オチド配列を含有するリコンビナントプラスミド、およ
び高等生物に由来する特定のニユクレオチド配列を、そ
の遺伝的構成の１部として含有する新規微生物に関して
いる。
本明細書中で使用する略号はつぎのようである。
DNAの塩基配列の生物的意義は、遺伝情報の貯蔵であ
る。知られているようにDNA中の塩基の配列は、細胞に
より製造されるすべての蛋白質のアミノ酸配列を規定す
るコードとして用いられることが知られている。さら
に、配列のうちのある部分は、調節の目的に使用され
て、作られる各蛋白質のタイミングおよび量を制御す
る。これらの制御要素の本質は部分的にのみ理解されて
いるにすぎない。最後に、各鎖中の塩基の配列は、細胞
分裂にともなうDNA複製のための鋳型として用いられ
る。
DNA中の塩基配列情報が蛋白質のアミノ酸配列を決定す
る方式は、その広い意味において、すべての生きた生物
に普遍的である基本的なプロセスである。蛋白質中にふ
つうに見出だされる各アミノ酸は、１種または１種より
多くのトリニユクレオチドまたはトリプレツト配列によ
り決定される。それゆえに、それぞれの蛋白質には、蛋
白質のアミノ酸配列に対応し配列している１連のトリプ
レツトを含有するDNAの対応する断片が存在する。この
遺伝コードは表に示してある。
ニユクレオチドの配列情報をアミノ酸配列構造に変換す
る生物的プロセスにおいて、転写と称せられる第１の段
階が行なわれる。この段階で、製造されようとする蛋白
質を規定する配列を有するDNAの部分的断片がまずRNAに
より複写される。RNAは、DNAに類似するポリニユクレオ
チドであるが、リボースに代えてデオキシリボースがそ
してチミンに代えてウラシルが用いられる。RNAは、DNA
における場合と同じ種類の塩基対の関係に入りうる。そ
の結果、DNAニユクレオチド配列のRNA転写は、複写され
る配列に対して相補的となる。このようなRNAはメツセ
ンジヤーRNAと言われる。その理由は、遺伝的装置と細
胞の蛋白質合成装置との中間に存在するからである。
細胞中で、特定のアミノ酸配列の合成を結果する、細胞
中の多数の酵素およびオルガネラを包含する複雑なプロ
セス中の鋳型として、mRNAが使用される。このプロセス
はmRNAの翻訳といわれる。
しばしば、プロセシングと称せられる追加の段階があ
る。これは翻訳プロセスにより合成されたアミノ酸配列
を機能蛋白質に変換するものである。ひとつの例として
インシユリンの場合がある。
キー：各３文字トリプレツトは、左側が５′末端で右側
が３′末端であるDNAのトリニユクレオチドを表わす。
文字は、ニユクレオチド配列を形成するプリンまたはピ
リミジン塩基を代表する。
Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン Ｘ＝ＹがＡまたはＧならばＴまたはＣ Ｘ＝ＹがＣまたはＴならばＣ Ｙ＝ＸがＣならばＡ、Ｇ、ＣまたはＴ Ｙ＝ＸがＴならばＡまたはＧ Ｗ＝ＺがＡまたはＧならばＣまたはＡ Ｗ＝ＺがＣまたはＴならばＣ Ｚ＝ＷがＣならばＡ、Ｇ、ＣまたはＴ Ｚ＝ＷがＡならばＡまたはＧ QR＝ＳがＡ、Ｇ、ＣまたはＴならばTC QR＝ＳがＴまたはＣならばAG Ｓ＝QRがTCならばＡ、Ｇ、ＣまたはＴ Ｓ＝QRがAGならばＴまたはＣ Ｊ＝ＡまたはＧ Ｋ＝ＴまたはＣ Ｌ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ Ｍ＝Ａ、ＣまたはＴ インシュリンのすぐ前のプリカーサーは単一ポリペプチ
ドであつて、プロインシュリンといわれ、別のペプチド
Ｃにより結合される２個のインシュリン鎖ＡおよびＢを
含有する。Steiner,D.F.,Cunningham.D.,Spigelman,L.
およびAten,B.,Science 157,697(1967).最近、インシュ
リンmRNAの最初の翻訳生成物はプロインシュリン自体で
なく、プロインシュリンのアミノ末端上に２０個より多
くの追加のアミノ酸を含有するプリプロインシュリンで
あると報告されている。たとえば、Cahn,S.J.,Keim,P.
およびSteiner,D.F.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73,1964
(1976)およびLomedico,P.T.およびSaunders,G.F.,Nncl.
AcidsRes.3,381(1976)をみよ。プリプロインシュリン分
子の構造は、模式的に、NH2−（プリ−ペプチド）−Ｂ
鎖−（Ｃペプチド）−Ａ鎖−COOHで表わされる。
医学的または研究上重要な多くの蛋白質は、哺乳動物の
ような高等生物の細胞中に見出されるかまたは作られ
る。これらには、たとへば、ホルモンインシュリン、他
のペプチドホルモンたとへば成長ホルモン、血圧の調節
に用いられる蛋白質、および産業、医学または研究上に
重要な種々な酵素がある。生物体より抽出により使用し
うる量の蛋白質をうることはしばしば困難で、この問題
はヒトに由来する蛋白質の場合に特に重要である。それ
ゆえに、生物体の外部にある細胞でそのような蛋白質を
かなりの量製造しうる技術が必要とされる。ある場合に
は、組織培養の技術により適当なセルラインをうること
ができる。しかし、組織培養における細胞の生長は遅
く、培地は高価で、条件は正確に調節されねばならず、
収量は低い。さらに、望む分化された特徴を有する培養
セルラインを維持することはしばしば困難である。
それと対照的に、細菌のような微生物は、化学的に明確
な培地中に発育することが比較的に容易である。発酵技
術は高度に発達しており、よく制御されうる。微生物の
発育は迅速で高収量が可能である。さらにある種の微生
物は遺伝的に完全に特徴付けられてあり、事実、もつと
も良く特徴付けられそしてもつともよく理解されている
微生物のうちのひとつである。
それゆえに、医学的に重要な蛋白質の遺伝子コードの導
入を、蛋白質をふつうに製造する生物から適当な微生物
に対して行なうことがきわめて望ましい。このようにし
て、調節された発育条件で、望む量の蛋白質を微生物に
より製造することが可能である。そのようにして、望む
蛋白質を製造する全体としての費用の実質的減少が達成
されうる。さらに、特定の蛋白質の生産を決定する遺伝
的配列を明確な遺伝的背景を有する微生物に、分離し導
入させうるということは、そのような蛋白質の合成がど
のように調整されそして合成後の蛋白質がどのようにプ
ロセスされるかを研究するために大きな価値を有する研
究手段を提供する。さらに、分離された遺伝的配列は、
改変された治療上または機能上の性質を有する改変蛋白
質をコードするように改変されうる。
本発明は、上記の引用された目的を達成するための手段
を提供する。酵素により触媒される反応を包含する１連
の複雑な段階を包含する方法を記載する。従来からの技
術において理解されているこれら酵素反応の性質もあわ
せて記載する。
リバーストランクリプターゼは、RNA鋳型、オリドデオ
キシニユクレオチイドプライマーおよび４個のデオキシ
ニユクレオシドトリホスフエートつまりdATP、dGTP、dC
TPおよびTTPの存在で、RNA鋳型鎖に相補的なDNAの合成
を触媒する。この反応は、オリドーデオキシニユクレオ
チドプライマーのmRNAの３′末端への非共有性結合によ
り開始され、生長する鎖の３′末端へ、mRNAニユクレオ
チド配列との塩基対の関係により決定されるに従い、適
切なデオキシニユクレオシドの段階的添加が続く。生成
する分子は、もとのRNAを、DNAの一重鎖ループによりそ
れに結合されたDNAの相補鎖とあわせて含有するヘアピ
ン構造として記載されうる。逆転写はまた一重鎖DNA鋳
型を用いる類似の反応を触媒しうる。この場合、生ずる
生成物は、１組の末端を結合させている一重鎖DNAのル
ープを有する２重鎖DNAヘアピンである。Aviv,H.および
Leder,P.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA69,1408(1972)および
Efstratidias,A.,Kaftos,F.C.Maxam,A.F.およびManiati
s,T.,Cell7,279(1976)をみよ。
制限エンドニユクレアーゼは、２重鎖DNA中のホスホジ
エステル結合を水解しうる酵素で、それにより連続DNA
鎖中に切断を生ずる。DNAが閉じられたループの形状の
場合には、ループは直線状構造となる。この型の酵素の
主要な特徴は、その水解作用が、ある特定のニユクレオ
チド配列が存在する部分に及ぼされることである。この
ような配列は、該制限エンドニユクレアーゼに対する認
識サイトと言われている。制限エンドニユクレアーゼは
種々の原料から分離され、それらの認識サイトのニユク
レオチド配列に関連して特徴付けられている。ある制限
エンドニユクレアーゼは、両方の鎖を同じ点で切断し、
ブラントエンド(bluntend)を生ずる。別の制限エンドニ
ユクレアーゼは、相互に数個のニユクレオチドだけ隔て
られている結合を水解して、切断された分子のそれぞれ
の端に一重鎖トランドの部分を生ずる。そのような一重
鎖の末端は自己相補的でそれゆえに結合性があり水解さ
れたDNAを再結合さすのに用いられうる。そのような酵
素により切断を受けうるDNAであれば同じ認識サイトを
含むはずであり、同じ結合性の末端を生じ、それで、制
限エンドニユクレアーゼで処理された異質な配列DNA
を、同様に処理された他の配列に結合さすことができ
る。Roberts,R.J.,Crit.Rev.Biochem.4,123(1976)をみ
よ。制限サイトは比較的に常であるが、制限サイトの配
列を有する２重鎖オリゴニユクレオチドの化学的合成に
より、制限エンドニユクレアーゼの一般的用途がおおい
に拡大されて来た。それゆえに単に適当な制限オリゴニ
ユクレオチドを分子の末端に付着させそして生成物を適
当な制限エンドニユクレアーゼの水解作用に処し、それ
により必要な結合性の末端を生じさすことにより、見掛
け上DNAのいかなる断片も任意の他の断片にカツプルさ
せることができる。Heyneker,H.L.,Shine,J.,Goodman,
H.M.,Boyer,H.W.,Rosenberg,J.,Dickerson,R.E.,Naran
g,S.A.,Itakura,K.,Lin,S.およびRiggs,A.D.,Nature 26
3,748(1976)およびScheller,R.H.,Dickerson,R.E.,Boye
r,H.W.,Riggs,A.D.およびItakura,K.,Science 196,177
(1977)をみよ。
Slエンドニユクレアーゼは、１重鎖DNAまたは別様に
は、２重鎖DNA中の１重鎖のギヤツプまたはループのホ
スホジエステル結合を水解しうる一般的特異性を有する
酵素である。Vogt,V.M.,Eur.J.Biochem.33,192(1973)を
みよ。
DNAリガーゼは、それぞれ、５′ホスフエートおよび
３′ヒドロキシルを有する２個のDNAフラグメントのあ
いだのホスホジエステル結合の形成を触媒しうる酵素で
ある。そのような結合は、結合性の末端により相合わさ
れた２個のDNA断片より形成されうるごときものであ
る。この酵素の普通の機能は、他は２重鎖であるDNA分
子中の１重鎖の切れ目（nick）を結ぶことに存すると考
えられる。しかし、適当な条件では、DNAリガーゼはブ
ラントエンドを結ぶことは触媒でき、ブラントエンドを
有する２個の分子が共有結合されうると考えられる。Sg
aramella,V,Van de Sande,J.H.,およびKhorana,H.G.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 67,1468(1970)をみよ。
アルカリホスホターゼは、DNA上の５′末端ホスフエー
トを含むホスフエートエステルを水解しうる一般的特異
性を有する酵素である。
本発明の一般的方法において記載しようとするさらに別
の段階は、プラスミドのようなDNAベクターにある特殊
なDNAフラグメントを挿入しようとすることである。プ
ラスミドとは、宿主細胞自体のゲノム以外に、微生物細
胞中に存在することのある、みづから複製してゆくDNA
単位に対して用いられる用語である。プラスミドは宿主
細胞の染色体に遺伝的に結合されていない。プラスミド
DNAは、一般的に数百万分子量の程度二重鎖環状分子と
して存在する。しかし、あるものは１０8分子量より大
で、そしてそれらは、細胞の全DNAの少量パーセントし
か占めない。プラスミドDNAは、一般的に宿主細胞DNAよ
り、大きさが非常に異なるので分離しうるのがふつうで
ある。プラスミドは宿主細胞の分裂速度とは無関係に複
製されてゆく。そしてある場合には、複製の速度研究者
が発育条件を変えることにより調節しうる。プラスミド
は閉じられた環として存在するけれども、人工的手段に
より、DNAフラグメントをプラスミドに導入し、分子量
の増大したリコンビナントプラスミドを形成させうる。
しかも、複製能力またはそれの有する遺伝子のいずれを
も表現する能力に実質的に影響することはない。それゆ
えに、プラスミドは、DNAのフラグメントを新しい宿主
細胞に導入するための有用なベクターとして役立つ。リ
コンビナントDNA工学に有用なプラスミドは、典型的に
は、それらを選択する目的に有用であるうる遺伝子、た
とへば薬剤抵抗性のための遺伝子である。
本発明の実施を説明するために、ラツトインシユリン遺
伝子の分離および導入を詳細に記載する。インシユリン
を選んだのは、臨床医学および基礎研究の点から中心的
な意義を有するからである。記載する方法は、この方面
でふつうの技術を有する者であれば、ヒトを含めた他の
生物のインシユリン遺伝子の分離にも応用しうる。
インシユリンは１９２２年に最初に分離された。現在、
このホルモンを糖尿病の治療に用いることはよく知られ
ている。屠殺場はインシユリン原としての牛および豚の
膵臟を提供するけれども、糖尿病の数が世界的に増加し
ているのでホルモンの不足が生じつつある。さらに、あ
る糖尿病患者では、牛および豚のインシユリンにアレル
ギー反応を示し、有害作用を伴なう。それゆえに、世界
的需要を満足するに十分量のヒトのインシユリンを生産
しうることがきわめて望ましい。細菌中にヒトのインシ
ユリンを製造することは、この望ましい目的を達成しう
る技術である。しかし、本発明の前には、この望ましい
目的に至る進歩は、インシユリン遺伝子を細菌中に導入
する技術が開発されていないので、阻まれていた。本発
明はそのような技術を提供するのである。
ある特定の蛋白質に対する遺伝コードである特定の配列
を有するDNAをうることができれば、それを化学的また
は生物学的手段により改変し、終局的に生ずる特定の蛋
白質を改変することも可能となる。このことは、たとへ
ば、特定の医学的要求に適するように作られた改変イン
シユリンを製造することを可能とする。インシユリンの
不可欠な機能上の性質を有するインシユリンに関連する
アミノ酸配列を生じさせうる遺伝的能力を、それゆえに
微生物に与えうる。そのような考え方を生長ホルモンの
場合にも適用させうる。
ある特定の高等生物の正常な代謝に必要なある特定の蛋
白質に対する遺伝コードを、細菌のような微生物に導入
しうる能力は、そのような蛋白質を培養生産するための
重要な能力を開く。ついで、このことは、そのような蛋
白質の生産に正常に機能する高等生物の能力が損われた
場合に、本発明に準じて改変された微生物により生産さ
れる蛋白質で、そのような蛋白質の生産を増加させるか
または置き代えるという重要な可能性を提供し、そして
たとへば、本発明に準じて生産される微生物と慢性また
は急性の欠乏症を有するヒトとのあいだ共生的関係を確
立する可能性を示唆し、本明細書に記載のように遺伝的
に改変した微生物をヒトに移植するか別様に結合させ
て、ヒトの代謝における病理的欠陥を補償することを可
能とする。
本発明の要約 遺伝情報を含有するある特定のニユクレオチド配列を分
離し、その特定のニユクレオチド配列を有するDNAの合
成および合成DNAを宿主微生物に導入するための方法が
記載される。
本発明は例として、ラツトのプリプロインシユリンのた
めの構造遺伝子、ラツト生長ホルモンのための遺伝子お
よびヒト成長ホルモンのための遺伝子を含む。細菌に導
入される特定のDNA配列を用いる。それで、この方法
は、高等生物よりたとへば哺乳動物の望むDNA配列のい
ずれでも、いずれかの微生物へ移入さすのによく応用さ
れうると考えられる。この場合の高等生物とは、分化し
た組織を有する任意の真核生物として定義されうる。そ
れらは、昆虫、軟体動物、植物、哺乳動物を含めた脊椎
動物、哺乳動物には牛、豚、霊長類がある。この技術で
いう微生物とは、プロテイスト（protist）の用語に含
まれるような顕微鏡的な生きている生物で、原核生物で
も真核生物でもよく、たとへば細菌、プロトゾア、藻お
よびかびがあり、かびには酵母に含まれる。このプロセ
スで、選択された細胞集団を改良された方法でまず分離
する。完全なままのmRNAは、見掛け上すべてのRNAse活
性が抑制された新規方法で細胞より抽出する。完全なま
まのメツセンジヤーRNAは抽出物よりカラムクロマトグ
ラフイーで精製し、相補鎖（cDNA）を合成するのに必要
とされる４個のデオキシニユクレオシドトリホスフエー
トの存在で作用する。リバーストランスクリプターゼを
作用させる。リバーストランスクリプターゼを用いたこ
の最初の反応生成物を、そのリボニユクレオチド配列を
選択的に除く方法に処する。もとのmRNAに相補的な残存
するデオキシニユクレオチド配列は、４個のデオキシニ
ユクレオシドトリホスフエートの存在でリバーストラン
スクリプターゼまたはDNAポリメラーゼを用いる第２の
反応中でインキユベートする。生成物は、一方の端にお
いて一重鎖ドループにより相互に結合されている相補鎖
を有する二重cDNA構造である。この生成物は一重鎖に特
異的なニユクレアーゼで処理して一重鎖ループを切断す
る。生ずる二重鎖cDNAを、両端において制限酵素認識サ
イト配列を含有するひとつの特異的DNAへ付加すること
により長さを延長する。この付加はDNAリガーゼ酵素で
触媒する。延長されたcDNAはついで制限エンドニユクレ
アーゼで処理して、二重構造をなしているストランドの
それぞれについて、５′末端に自己相補性の一重鎖末端
を生成させる。
同じ制限エンドニユクレアーゼに対する認識サイトを有
するプラスミドDNAはその酵素で処理してポリニユクレ
オチド鎖を切断し、５′末端において自己相補性の一重
鎖ニユクレオチド配列とする。一重鎖末端上の５′末端
リン酸塩基を除いて、プラスミドが宿主細胞を変換しう
る環構造を形成するのを防止するようにする。このよう
に調製したcDNAおよびプラミドDNAを相互に、DNAリガー
ゼの存在でインキユベートする。このような反応条件
で、生きた閉環状のプラスミドDNAは、cDNAフラグメン
トが含まれる場合にのみ生じうる。このcDNA配列を含有
するプラスミドは、ついで適当な宿主の細胞に導入す
る。生きたプラスミドを受けとつた細胞は、そのプラス
ミドにより与えられた遺伝的性質たとへば薬剤抵抗性の
あるコロニーが出現することで検出される。導入された
cDNA配列を有するリコンビナイトプラスミドを含有する
純細菌株を培養し、リコンビナントプラスミドをふたた
び分離する。このようにして大量のリコンビナントプラ
スミドDNAが調製され、その特定のcDNA配列は、適当な
制限酵素を用いるエンドニユクレアーゼ開裂によりそれ
より再分離される。
本発明の基本的プロセスは、ヒトを含めた高等生物より
得られるいかなる望むニユクレオチド配列の分離および
宿主微生物へ導入に応用しうる。この方法は、医学的ま
たは産業的に価値のある特定の蛋白質に対する遺伝子コ
ードの導入およびそのような蛋白質の微生物的合成に有
用である。本発明の例示として、インシユリンに対する
ニユクレオチド配列をラツトより分離し、細菌に導入
し、そのなかで複製させた。同様にラツトの成長ホルモ
ンに対するニユクレオチド配列を分離し、細菌に導入し
複製させた。この方法は、ヒトのインシユリンおよび成
長ホルモンならびに他のポリペプチドホルモンを含めた
ヒトに由来するニユクレオチドの導入に応用しうる。
本発明の詳説 本発明は、特定のニユクレオチド配列を有するDNA分子
の分離およびそれら微生物への導入のための方法を包含
する。ここで、DNAの本来のニユクレオチド配列は、導
入された細菌中に複製されて見出されるのである。
さらに詳細には、本発明は大腸菌(Escherichia coli)宿
主細胞で複製可能であり、かつ宿主細胞に対して相同の
ＤＮＡおよび異種ＤＮＡを含む組換えＤＮＡプラスミド
であつて、この異種ＤＮＡがインシユリンおよび成長ホ
ルモンから選択されるタンパク質ホルモンをコードする
ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ
プラスミドおよびその製造方法ならびにこれらの組換え
ＤＮＡプラスミドで形質転換した大腸菌に関するもので
ある。
本発明方法を包含する段階の順序は、一般的につぎのよ
うに４つのカテゴリーに分類される。
１．高等生物よりの望む細胞集団の分離 特定の蛋白質に対する遺伝的配列の材料としてはつぎの
２つが可能である。由来する高等生物のDNAおよびDNAの
RNA転写物。アメリカ合衆国のNational Institutes of
Healthで現行の安全基準は、いかなる種類のヒトの遺伝
子であれ、非常に注意して精製したあとではじめてまた
は特別のハイ−リスク（P4）施設においてのみ、リンコ
ンビナントDNA中に添加しうると規定している。たとえ
ばFederal Register,４１巻、１３１号、７月７日、１
９６７年、２７９０２−２７９４３頁をみよ。それゆえ
に、本発明方法のように、ヒト蛋白質の生産のための潜
在的用途を有するいかなる方法でも、有利なアプローチ
は、望む蛋白質をコードするニユクレオチド配列を有す
る特定のmRNAの分離である。この戦略の採用は、細胞よ
り抽出されたDNAにくらべて、mRNAがより容易に精製し
うることである。特に、高度に分化した生物たとへば哺
乳動物では、生物体の特定の部位にある特定の細胞集団
を見定めることが可能で、それらの機能は問題とする蛋
白質の生産に第１次的に関与しているのである。別様に
は、このような集団は、生物の遷移的な分化の段階のあ
いだに存在しうる。このような細胞集団では、細胞より
分離されたmRNAの大部分は望むニユクレオチド配列を有
する。それゆえに分離さるべき細胞集団の選択および用
いられる分離方法は、それより分離されるmRNAの最初か
らもつ純度の点で有利である。
大部分の組織、腺および器官において、細胞は、結合織
の一般的に繊維性のあみ目構造により相互に結合されて
いる。組織は主としてコラーゲンより成立つが、組織に
よつては他の構造蛋白質、多糖類および無機沈降物を含
有しうる。所与の組織よりの細胞の分離は必然的に、結
合織マトリツクスより細胞を遊離さす技術の使用を必要
とする。特定の分化した型の細胞の分離および精製は２
つの主要な段階を具体的に実施する。結合織マトリツク
スよりの細胞の分離および組織に見出されるすべての他
の型の細胞よりの望む型の細胞の分離である。本発明に
固有の記載される操作の原則は、種々の組織原よりの種
々の型の細胞の分離に応用しうる。たとへば、すい臓よ
りのランゲルハンス島は、インシユリンのmRNAの分離に
適当なので、それについて記載してみる。
インシユリン生産細胞は、他の原料たとへば牛胎児すい
臓またはランゲルハンス島腫瘍の培養細胞に由来しう
る。このような純島細胞の分離はそのような場合はるか
に簡単で、特に純細胞培養物を用いる場合にそうであ
る。上記に論議した島細胞分離の方法は、純細胞培養物
使用の場合には不要であろうが、一般的に応用されうる
ゆえに有利である。
しばしば環境刺激に対する細胞の反応を利用して望むmR
NAの割合を増加させうることが分つた。たとへば、ホル
モンを用いる処理で望むmRNAの生産を増加させうる。他
の技術では、特定の温度で発育および特定の培地または
他の化学物質にさらすことを包含する。ラツトの生長ホ
ルモンのmRNAの分離に際しては、培養されたラツトの脳
下垂体細胞を、副賢ホルモンおよびクルココルチコイド
で処理すると、生長ホルモンのmRNAの割合を著しく増加
させる。
２．mRNAの抽出 本発明の重要な特徴は、細胞抽出物中のRNase活性の本
質的に完全な除去である。抽出されるmRNAは一重鎖のポ
リニユクレオチドで、相補鎖とは対をなしていない。そ
れで、配列中の一重ホスホジエステルを水解で切断する
と、完全な状態の遺伝的配列を微生物に導入する目的
に、全体の分子が役立たなくなる。上記のように、酵素
RNaseは広く分布しており、活性を有し、例外的に安定
である。それは皮膚上に見出され、ふつうのガラス器具
洗浄でも生き残り、時として有機化合物が汚染する。す
い臓細胞の抽出物を用いる際には、特に顕著な困難をと
もなうが、それは、すい臓が消化酵素の生産原で、RNas
eが豊富であるゆえである。しかし、RNaseの混入はすべ
ての組織において存在し、本明細書に記載のRNase活性
を除去する方法はすべての組織に応用しうる。本発明方
法の類を見ない効果は、本発明において、分離された島
細胞よりの完全なmRNAの分離の成功により示される。
本発明では、細胞の破壊のあいだおよび蛋白質を本質的
に含有しないＲＮＡを分離するに必要なすべての操作の
あいだカオトロープ(chaotropic)陰イオン、カオトロー
プ陽イオンおよびジスルフアイド結合の切断剤を組合わ
せて使用する。上記した試剤の組合わされた作用の効果
は、分離されたラツトすい臓のランゲルハンス島より好
収量で本質的に分解されていないmRNAを分離するのにそ
れらを用いることにより証明された。
適当なカオトロープイオンは、それらの水性媒体中への
溶解性および入手しやすさにより選択する。適当な陽イ
オンには、グアニジウム、カルバモイルグアニジウム、
グアニルグアニジウム、リチウムおよび類似のものがあ
る。適当なカオトロープ陰イオンには、ヨーダイド、パ
ークロレート、チオシアネート、ジヨードサリチレート
および類似のものがある。このような陽イオンおよび陰
イオンを組合わせて生ずる塩の相対的効果は、部分的に
は、それらの溶解性で決まる。たとへば、リチウムジヨ
ードサリチレートは、グアニジウムチオシアネートより
より強力な変性剤である。しかし、わずか０．１Ｍの溶
解性を有し、やはり比較的に高価である。グアニジウム
チオシアネートは、入手容易であり水性媒体中に約５Ｍ
まで溶解するので高度に溶解性を有する。
チオール化合物たとへばβ−メルカプトエタノールは、
チオール−ジスルフアイド交換反応により、蛋白質中の
分子内ジスルフアイド結合を切断することが知られてい
る。多くの適当なチオール化合物が有効であると知られ
ており、β−メルカプトエタノールに他に、ジチオスレ
イトール、システイン、プロパノール、ジメルカプタン
および類似のものがある。交換反応を本質的に完結さす
に至らすためには、チオール化合物は分子内ジスルフア
イドに対して大過剰に存在せねばならぬので、水溶性は
必要な性質である。適切な価格で入手容易であるので、
β−メルカプトエタノールが有利である。
細胞または組織よりＲＮＡを抽出するあいだRNaseを阻
害する目的では、所与のカオトロープ塩の効果は、その
溶度に直接的に関係する。それゆえ、有利な濃度は、使
用しうる最高濃度が実際的となる。抽出中にmRNAを完全
のままに保つのに本発明が成功しているのは、変性の程
度に加えてRNaseが変性される速度によると考えられ
る。このことは、たとへば、塩酸塩が変性剤としてほん
の僅かに活性が劣る程度にかかわらず、グアニジウムチ
オシアネートが塩酸塩にすぐれていることを説明すると
考えられる。変性剤の効果は、蛋白質の完全な変性を達
成するに必要ないき値として定義されている。他方、多
くの蛋白質の変性の速度は、いき値に対する変性剤濃度
の割合の５乗から１０乗になる。Tanford,C.A.,Adv.Pro
t Chem.23,121(1968)をみよ。定性的には、この関係
は、グアニジウム塩酸塩よりほんの僅かに強力な変性剤
は、同じ濃度でなん倍にもすみやかに蛋白質を変性する
ことになる。RNase変性の速度論と細胞よりmRNAを抽出
する際のmRNAの保存との関係は、本発明以前には、認識
されていないし、開発もされていないと考えられる。以
上の解析が正しいならば、有利な変性剤は、高い水溶性
にあわせて低い変性濃度のいき値を有するものである。
この理由から、グアニジウムチオシアネートはリチウム
ジヨードサリチレートより有利である。これは、後者の
方がより強力な変性剤であるが、グアニジウムチオシア
ネートの溶解度が大で、それゆえによりすみやかなRN
ase不活化を可能とする濃度で用いうるからである。上
記の解析は、グアニジウムチオシアネートが同程度の溶
解性を有する塩酸塩に比して有利な理由も説明する。つ
まり前者の方がやや強力な変性剤であるからである。
変性剤と組合わせてジスルフアイド切断剤を使用する
と、RNase分子を完全に巻きほぐすことにより、前者の
効果を強力とする。チオール化合物は、分子内ジスルフ
アイド結合が完全のままに保たれる時におこりうるすみ
やかな変性の逆戻りを防止することにより、変性の方向
への速度を高くすると考えられる。さらに、mRNA調製物
中にRNaseが混入することがあつても、それは、変性剤
およびチオールの存在しない状態でも実質的に不活性に
留まる。チオール基を有するジスルフアイド結合切断剤
は、いずれの濃度でもある程度は有効である。しかし、
一般的にいつて、分子内ジスルフアイド結合に対して大
過剰のチオール基が、該交換反応を分子内ジスルフアイ
ドの切断の方向に進めるのに有利である。他方、多くの
チオール化合物は悪臭を有し高濃度を扱うのは不快であ
る。それで実際上濃度の上限が存在する。β−メルカプ
トエタノールを用いると、ラツトすい臓よりＲＮＡを分
解しないで分離するのに０．０５Ｍから１．０Ｍまでの
濃度が効果的であつたことが分つた。そして、０．２Ｍ
が至適濃度である。
細胞よりのmRNAの抽出中の培地の濃度はpH５．０から
８．０の範囲とする。
細胞の崩壊の段階のあとで、細胞蛋白質およびＤＮＡの
全体よりＲＮＡを分離する。種々の方法がこの目的で開
発され、この方面の技術で知られているいずれも適当で
ある。従来法で用いられているふつうの方法は、ＲＮＡ
を選択的に沈殿さすエタノール沈澱法である。本発明の
有利な技術は、沈殿段階をとばし、遠心管中で５．７Ｍ
塩化セシウム溶液上に直接に重層しついで、Glisin,V.,
Crkvenjakov,R.,およびByus,C.,Biochemistry 13,2633
(1974)記載のように管を遠心に処する。この方法は、RN
aseに不利な環境がそのまま保たれ、そしてＤＮＡおよ
び蛋白質不含のＲＮＡが高収量で得られるからである。
上記の操作で、細胞ホモジネートより全ＲＮＡが精製さ
れる。しかし、このようなＲＮＡのほんの１部が望むmR
NAにずぎない。望むmRNAをさらに精製するには、高等生
物の細胞中では、転写後のmRNAは、ポリアデニル酸を付
着さすことによりさらに処理しうることを利用する。ポ
リＡ配列を付着含有するそのようなmRNAは、Aviv,H.お
よびLeder,P.,の上記引用の論文に記載のように、オリ
ゴーチミジレートを付着させたセルロースカラム上のク
ロマトグラフイーで選択的に分離しうる。上記の操作
は、本質的に純粋で、完全なままの、翻訳されうるmRNA
を、RNaseに富む材料よりうることを可能とする。mRNA
の精製およびそれにつづきイン ビトローの操作は、由
来生物によらずmRNAのいずれでも本質的に同じ方法で実
施しうる。
ある条件では、たとへば組織培養細胞をmRNAの原料とし
て使用する時には、RAaseの混入は、上記のRNase阻害法
を不要とするほどに十分に低くありうる。そのような場
合、RNase活性を減少さすための従来法で十分でありう
る。
３．cDNAの形成 方法の残りの段階を模式的に第１図に示す。この方法の
第１段階は、精製mRNAに相補的なDNA配列の形成であ
る。この方法に用いて有利な酵素はリバーストランスク
リプターゼである。原則的には、mRNAを鋳型に用いて確
実に相補的なDNA鎖を形成しうる酵素ならいずれでもよ
い。反応は、mRNAを鋳型に用いDNA鎖のための前駆体で
ある４種のデオキシニユクレオシドトリホスフエートの
混合物を用い、従来法に記載の条件で実施しうる。デオ
キシニユクレオシドトリホスフエートのうちのひとつの
アルフアー位を32Pでラベルしておき、反応の進行をモ
ニターし、クロマトグラフイーおよび電気泳動のような
分離操作のあとで生成物を採取する際の目印とし、収量
を定量的に評価しうるようにする。たとへば、上記引用
のEfstratiadfs.A.,等の上記引用の文献をみよ。
図に示すように、リバーストランスクリプターゼ反応の
生成物は二重鎖ヘアピン構造で、ＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖と
のあいだに、非共有結合性の連結を有する。
リバーストランスクリプターゼ反応の生成物は、この方
面の技術で知られている標準法で反応混合物より取り出
す。フエノール抽出、セフアデツクスG100（商品名、Ph
armacia Inc.,Uppsala,Sweden）およびエタノール沈殿
の組合わせを用いるのが有利であると分つた。
cDNAが酵素的に合成されたら、ＲＮＡ鋳型は除きうる。
ＤＮＡの存在でのＲＮＡの選択的分解については、種々
の従来法が知られている。有利な方法はアルカリ水解
で、これは高等に選択的でpHの調整で容易に調節しう
る。
アルカリ水解しついで中和してから、望むならば32Pラ
ベルＤＮＡをエタノール沈殿で濃縮しうる。
二重鎖ヘアピンcDNAの合成は、適当な酵素たとへばＤＮ
Ａポリメラーゼまたはリバーストランスクリプターゼの
ような適当な酵素を用いて実施しうる。前記したような
反応条件を用い、α−32Pラベルニユクレオシドトリホ
スフエートを使用する。リバーストランスクリプターゼ
は種々の由来のものを使用しうる。便利なのは鳥のミエ
ロブラストジス（myeloblastosis）ウイルスである。ウ
イルスは、Dr.D.J.Beard,Life Sciences Incorporated,
St.Petersburg,Floridaより入手しうる。氏は、Nationa
l Institute of Healthとの接触下にウイルスを生成し
ている。
cDNAヘアピンの形成についで、反応混合物よりＤＮＡを
精製するのが有利である。前記のように、フエノール抽
出、セフアデツクスＧ−１００上のクロマトグラフイー
およびエタノール沈殿を行ない、混入蛋白質不含のＤＮ
Ａ生成物とする。
ヘアピン構造は、相補的な鎖の末端をつなぐ一重鎖ルー
プを除いて、従来からの二重鎖ＤＮＡ構造となしうる。
ＤＮＡの一重鎖部分を特異的に水解切断しうる種々の酵
素をこの目的で入手しうる。この目的で便利なのは、As
pergillus oryzaeより分離されたＳ１ニユクレアーゼで
ある。酵素はMiles Researeh Products,Elkhart,Indian
aより購入しうる。ヘアピンＤＮＡ構造をＳ１ニユクレ
アーゼで処理すると、塩基対を末端とするcDNA分子を高
収量で生ずる。抽出後、クロマトグラフイーおよびエタ
ノール沈殿する。mRNAの二重鎖cDNA転写の合成において
リバーストランスクリプターゼおよびＳ１ニユクリアー
ゼを使用することはEfstratiadis等の上記引用の文献に
記載されている。
場合により、４種のデオキシニユクレオシドトリホスフ
エートの存在でE.coli DNAポリメラーゼＩで処理してブ
ラント末端を有するcDNA分子の割合を最大となしうる。
エキソニユレアーゼおよびポリメラーゼ活性を組合わせ
て、突きでている３′末端があればそれを除去し５′末
端の突きでている方をみたしうる。つぎのリゲーシヨン
反応にcDNA分子が関与するのを最大にすることがこれに
より確実となる。
この方法のつぎの段階としては、cDNA生成物の両端を処
理してそれぞれに制限エンドニユクレアーゼ認識サイト
を含有する適当な配列を与える。末端に付着させようと
するＤＮＡフラグメントの選択は、操作に便宜なように
選択する。末端に付着させる配列は、選択する特定の制
限エンドニユクレアーゼを基礎として選択する。そし
て、この選択はついでcDNAを再結合させようとするDNA
ベクターの選択に応じて変化する。選択するプラスミド
は、少なくともひとつのサイドが制限エンドニユクレア
ーゼ切断を受けやすいものであるべきである。たとへ
ば、プラスミドpMB9は、酵素Hind IIIに対するひとつの
制限サイトを含有する。Hind IIIは、Smith.H.O.,およ
びWilcox,K.W.,J.Mol.Biol,51,379(1970)の方法で、Hem
ophilus influenzaeより分離は精製される。酵素Hae II
Iは、Hemophilus aegyptiousより、Middleton,J.H.,Edg
ell,M.H.およびHutchison III,C.A.,J.Virol.10,42(197
2)の方法で精製される。Hemophilus suis よりの酵素はHsuＩと称し、Hind IIIと
同じ認識部位において同じサイト特異的水解を触媒す
る。これらの２つの酵素は、機能的に相互交換しうると
考えられる。
cDNAジユプレツクスの末端に付着さす目的では、Hind I
IIに対する認識配列を含有する化学的に合成された二重
鎖デカニユクレオチドを用いるのが便宜である。二重鎖
デカニユクレオチドは、第１図に示す配列を有する。He
yneker,H.L.,等およびScheller,R.H.等の上記引用の文
献をみよ。この方面の技術者は、このような合成制限サ
イト配列の種々のものがうることができるので、広範囲
に種々の制限エンドニユクレアーゼのいずれかに対して
感受性であるように、ジユプレツクスＤＮＡの末端を調
製しうる。
cDNAの末端への制限サイト配列の付着は、この方面の技
術で知られている任意の段階で達成しうる。有利な方法
は、Panet,A.,等Biochemistry 12,5045(1973)の方法で
精製されたＤＮＡリガーゼにより触媒される、ブラント
エンドリゲーシヨンと称せられる反応である。ブラント
エンドリゲーシヨン反応は、Sagramella,V.,等の上記引
用の文献に記載されている。ブラントエンドcDNAとHind
IIIエンドニユクレアーゼ制限サイトを含有する二重鎖
デカニユクレオチドの大モル過剰量とのあいだのブラン
トエンドリゲーシヨン反応生成物は、それぞれの末端に
Hind III制限サイト配列を有するcDNAである。反応生成
物をHind IIIエンドニユクレアーゼで処理すると、制限
サイトで切断され、一重鎖５′−自己相補的末端を生ず
る。これは第１図に示す。
４．リコンビナントＤＮＡ導入ベクターの生成 原則として、広範囲に及ぶウイルスおよびプラスミドＤ
ＮＡを、上記のように調製したcDNAとのリコンビナント
の形成に使用しうる。主な必要条件は、ＤＮＡ導入ベク
ターが宿主細胞に入り、宿主細胞中で複製を行ない、そ
して、さらには、ベクターを受入れた宿主細胞を選び出
すことを可能とする遺伝的デターミナントを有すべきで
ある。しかし、公衆に安全なために、上記のNIAの指示
に従い、用いる実験の型に適当と思われる導入ベクター
種に限定すべきである。許可されているＤＮＡ導入ベク
ターのリストは、新しいベクターが開発されＮＩＨ Re
combinant DNA Safety Committeeにより認可され、絶え
ず拡大されているけれども、本発明が、ＮＩＨの許可が
あとで得られるであろうものを含めて、上記の能力を有
するウイルスおよびプラスミドＤＮＡのいずれについて
も、使用することを考慮していることを理解さるべきで
ある。現在使用の許可されている適当な導入ベクターに
は、種々のバクテリオフアージラムダの種々の誘導体
（たとへば、Blattner.F.R.,Williams,B.G.,Blechl,A.
E.,Denniston-Thompson,K.,Faber,H.E.,Furlong,L.A.,G
runwaid,D.J.,Kiefer,D.O.,Moore,D.D.,Shumm,J.W.,She
ldon,E.L.,およびSmithies,O.,Science 196,161(1977)
をみよ）およびプラスミドcol El（たとへばAcademic P
ress NY,1976年刊、D.P.Nierlich,W.J.Rutter,C.F.Fox,
編．The control of Gene Expression,471から477頁、R
odriguez,R.L.,Bolivar,S.,Goodman,H.M.,Boyer,H.W.,
およびBetlach,M.N.,ICN-UCLA Symposium on Molecular
Mechanismsをみよ）がある。col Elに由来するプラス
ミドは、比較的小型で、数百万程度の分子量を有し、宿
主細胞当たりに存在するプラスミドＤＮＡのコプーの数
は、ふつうの状態での２０から４０より、クロラムフエ
ニコールで宿主細胞を処理することにより１０００また
はそれ以上に増加させうるという性質を有する。宿主細
胞中の遺伝子量を増加させうる能力は、研究者の制御下
に適当な条件下に、宿主細胞がプラスミドの担つている
遺伝子よりコードされる蛋白質を主として生産するよう
になしうる。それゆえにcol Elのこのような誘導体は、
本発明方法においては有利な導入ベクターである。col
Elの適当な誘導体には、テトラサイクリン抵抗性を担う
プラスミド pMB-9、およびテトラサイクリン抵抗性遺
伝子に加えてアンプリシリン（amplicillin）抵抗性の
遺伝子を担う。pBR-313、pBR-315、pBR-316、pBR-317、
およびpBR-322がある。薬剤抵抗遺伝子の存在は、プラ
スミドにより首尾よく感染された細胞を選択する便宜な
方法を提供する。つまり、このような細胞は、薬剤の存
在で発育し、他方、プラスミドを受取らなかつた細胞は
発育しないしコロニーも形成しない。具体的例として記
載する実験では上記の薬剤抵抗マーカーに加えて、ひと
つのHind IIIサイトを含有するcol El由来のプラスミド
を一貫して使用する。
プラスミドの選択と同様に、適当な宿主の選択は、原則
としてきわめて広範であるが、大衆の安全の目的には、
せまく限定されている。Ｘ−1776と称するE,coliの１株
が開発されたが、これは、Ｐ２設備を用いることで、上
記の型の方法に対してＮＩＨの認可を受けているCurtis
s,III,R.,Ann.Rev.Microbiol.,30.507(1976)をみよ。Ｐ
３設備が用いうるならばE.coli RR-1（ポリバール他、
ジーン（Bolivar et al.Gene）、第２巻７５頁（１９７
７年）参照）が適当である。プラスミドと同様にして、
本発明が、選ばれたベクターの導入を受け入れる側とし
て作用しうる能力を有する宿主細胞ならばいずれも考慮
に入れていることを理解さるべきである。それらに細菌
以外の原生生物たとへば酵母など、ＮＩＨの指示により
使用の認可されているものはいずれも使用しうる。
リコンビナントプラスミドは、制限エンドニユクレアー
ゼ処理プラスミドＤＮＡを同様に処理した未端基を含有
するcDNAと混合して生成される。cDNAのフラグメント同
志が相互に結合するチヤンスを最小におさえるために、
プラスミドＤＮＡはcDNAに対して過剰モル量加える。こ
れまでの方法では、大部分のプラスミドは、挿入された
cDNAフラグメントなしに成環してしまうことがおこつ
た。それで、ついで変換された細胞は、主としてプラス
ミドを含有し、cDNAリコンビナントプラスミドは含有し
ないことになつた。その結果、選び出すプロセスは非常
に面倒で時間がかかつた。この問題への従来の解決法
は、リコンビナントの挿入が遺伝子がコードされた構能
の損失をおこすように、適当なマーカー遺伝子の中央に
制限エンドニユクレアーゼサイトを有するＤＮＡベクタ
ーを創出すことであつた。
リコンビナントプラスミドを求めてスクリーニングする
コロニーの数を減少なすための方法を用いるのが有利で
ある。この方法では、制限エンドニユクレアーゼで切断
されたプラスミドＤＮＡをアルカリホスフアターゼで処
理する。この酵素は、Worthington Biochemical Corpor
ation,Freehold,New Jerseyのような、いくつか会社か
ら市販品として入手しうる酵素である。アルカリホスフ
アターゼは、プラスミドのエンドニユクレアーゼで生成
した端より５′−末端ホスフエートを除き、プラスミド
ＤＮＡの自身がリゲーシヨンしてしまうのを防ぐ。その
結果、５′−リン酸化末端を含有するＤＮＡフラグメン
トを挿入することによつて、環形成、つまりは変換がお
こる。この方法は、リコンビネーシヨンのない変換の相
対的割合を１対１０4以下に減少させる。
本発明は、５′−ホスフエートＤＮＡ末端基と３′−ヒ
ドロキシルＤＮＡ末端基とのあいだにＤＮＡリガーゼ触
媒反応がおこる事実を基礎としている。末端５′−ホス
フエートを除くと、結合反応はまつたくおこらない。二
重鎖ＤＮＡを結合しようとする場合には、表Ｉに示すよ
うに３つの場合が可能である。
表１で、二重鎖ＤＮＡは模式的に平行する実線で示して
ある。それらのそれぞれの５′および３′末端基は、ヒ
ドロキシル(OH)またはホスフエート(OPO3H2)で示してあ
る。ケースＩでは、５′ホスホフエートが両方の反応剤
の末端に存在して、両方の未端が共有的に結合される。
ケースIIでは、結合される鎖の一方のみが末端５′−ホ
スフエートを有し、共有結合による一重鎖結合を生じ、
他方には不連続の一重鎖の切断点を残す。共有的に結合
されない鎖は、結合された鎖と、この方面でよく知られ
ているように、相対する鎖上の相補的塩基対のあいだで
の水素結合により、相伴なつた状態に留まる。IIIの場
合には、反応剤はいずれも５′−ホスフエート末端を有
しないで、結合反応は生じない。
それで、結合させまいとする反応剤末端を処理してより
５′−ホスフエート基を除くことで、望まない結合反応
を防ぎうる。他の部分ではＤＮＡを損なうことのない、
５′−ホスフエート基を除くに適当な方法を用いうる。
アルカリホスフアターゼ酵素で触媒される水餌が有利で
ある。
この方法はまた、典型的には制限エンドニユクレアーゼ
酵素を用いて、直線状ＤＮＡ分子を２個のサブフラグメ
ントとし、ついでもとの配列に再構成する場合にも有用
である。サブフラグメントは別々に精製し、サブフラグ
メントを結合させることにより望む配列を再構成しう
る。ＤＮＡフラグメントの末端−末端結合を触媒する酵
素であるＤＮＡリガーゼはこの目的に使用しうる。
Sgaramella,V.,Van de Sande,J.H.,およびKhorana,H.
G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA67,1468(1970)をみよ。得よ
うとする配列がブラント−エンドでない場合には、E.co
liより得られる酵素を用いうる。Modrich,P.,およびLeh
man,I.R.,J.Biol.Chem.245,3626(1970)をみよ。
制限エンドニユクレアーゼ処理により生じたサブフラグ
メントよりもとの配列を再構成する効率は、不適当な配
列へ再構成を防止する方法を用いて強化される。この望
ましからぬ結果を防ぐには、均質なcDNAを制限エンドニ
ユクレアーゼで切断するより前にcDNA上の５′−末端ホ
スフエート基を除きうる試剤で、望む配列の、均質な長
さのcDNAフラグメントを処理することが防ぎうる。酵素
としてアルカリホスフアターゼが有利である。５−末端
ホスフエートは切断されたサブフラグメントを再構成す
るに用いるＤＮＡリガーゼによるひきつづく結合作用の
ための構造上の必要条件となる。それゆえに５′−末端
ホスフエートを欠如する末端には共有的に結合されえな
い。ＤＮＡサブフラグメントは、分離されたＤＮＡフラ
グメントに対する制限エンドニユクレアーゼ切断により
生ずる、５′−ホスフエート含有末端においてのみ結合
される。
上記のプロセスは、もつとも重大な望ましからぬ結合反
応、つまり、２個のフラグメントが、前部対後部でな
く、後部対前部の逆の順序で結合するのを防止する。他
の可能性のある副反応、つまり２量体の形成および成環
は防止されない。つまり、これらは、上記表１の型IIの
反応で生じうるのである。しかし、このような副反応
は、物理的に分離同定しうる生成物を与えるので面倒で
ない。しかし、逆の順序でのリコンビネーションではそ
うはいかぬのである。
上記の操作を説明するために、ラツトインシユリンのcD
NAコードを分離し、プラスミドと結合さす場合を示す。
このＤＮＡ分子を用いてE.coliX-1776を変換する。変換
体はテトラサイクリン含有培地上に発育させて選び出
す。変換された細胞より得られたリコンビナントプラス
ミドDNAは、約４１０ニユクレオチド長の挿入されたDNA
フラグメントを含有することが分つた。同様な操作で分
離される他のリコンビナントもまた得られる分析され
た、挿入されたフラグメントは、Hind IIIまたはHSUIエ
ンドニユクレアーゼで消化されて遊離されMaxam,A.M,お
よびGilbert.W.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,560(1977)
の方法でその配列が分析された。挿入されたDNAフラグ
メントのニユクレオチド配列は、重複しており、ラツト
プロインシユリンＩに対するコード全体にあわせてその
ペプチド配列の２３個のアミノ酸のうちの１３個に対す
るコードをも有していた。この領域のニユクレオチド配
列は、あとに示すように構成されている。
同様にして、ラツト成長ホルモンに対するcDNAコードを
分離し、プラスミドとリコンビナイトとし、E.coli中に
導入した。E.coli中で十分に複製させたあとで、約８０
０ニユクレオチド長のニユクレオチド配列を再分離し
た。RGHに対する全コード配列ならびにプリカーサーペ
プチドの部分に対するコードおよび５′の翻訳されない
部分を含有することが分つた。
以上に記載の方法は、ヒトの遺伝子を含めた高等生物よ
りの遺伝子の分離および精製およびそれの微生物への導
入および複製に一般的に応用しうる。分離された遺伝子
のすべてまたは部分を含有する新規リコンビナントプラ
スミドを記載する。高等生物よりの遺伝子を遺伝的構成
の１部に有するこれまで知られていない性質の新規微生
物を記載する。ラツトインシユリン遺伝子を分離し、精
製しそしてE.coliに導入するに用いられる方法の各段階
を詳細に示す具体例をつぎに記載して、本発明の特徴お
よび用途をより明確に示そうとする。つぎの実施例はラ
ツトインシユリン遺伝子、ラツト生長ホルモン遺伝子、
ヒトインシユリン遺伝子およびヒト生長ホルモン遺伝子
を含むリコンビナントフラスミドおよびそれら遺伝子を
含有する新規微生物を特徴づける。
ラツトインシユリン遺伝子を含む新規株、エシエリチア
コリ(E.Coli)RR-1,PRI-1のATCC寄託番号は３１３９２で
あり、かつラツトインシユリン遺伝子を担うプラスミ
ド、プラスミドRRI-1のATCC寄託番号は４０００３であ
る。
例１ ここに記記載する方法は、ラツトインシユリンmRNAの抽
出および分離、それに相補的DNAの合成および相補的DNA
の特徴付けを示す。精製されたラツト島細胞を調製する
には、麻酔させたラツトのすい臓に、すい管中に背後か
ら注入する方法でハンクス塩溶液を注入する。ハンクス
塩溶液は、この方面の技術で知られる標準塩溶液で、た
とえばGrand Island Biological Supply Company,Grand
Island New Yorkのような、いくつかの会社から入手し
うる。すい臓を取り出し、０度Ｃでハンクス溶液中で摩
砕し、コラゲナーゼおよび大豆トリプシンインヒビター
で消化する。特に規定しない限りすべての操作は０から
４度Ｃで実施する。消化操作の条件は、きわめて厳密で
ある。８cc全容量のリンクス培体中での２個の摩砕され
たラツトすい臓を３０ccのガラス管中におく。すべて管
は、シリコンで予備処理しておく。たとえび、これは、
Silicladの商品名で、Clay-Adams Division,Becton-Dic
inson社、Parsippany,New Jerseyより販売されている。
このインキユベーシヨン混合物は、Mandl,I.,Mackenan
n,J.D.およびHowes,E.L.,J.Clin.Invest.32、１３２３
（１９４３）の方法に本質的に準じて得られた、Clostr
idium histolyticumより精製の、Worthington Biochemi
cal Corporationより入手しうる型CLS IVの酵素である
コラゲナーゼの１２mgおよびSigma,Chemical Company,S
t.Louis,Missouriより得られる大豆トリプシンインヒビ
ターの１mgを含有する。毎分９０ストロークで振とうし
３７度Ｃで２５分インキユベートする。インキユベーシ
ヨンが短かすぎると、島細胞の遊離が不完全で、インキ
ユベーシヨンが長すぎると島細胞の融解が始まる。イン
キユベーシヨンのあと、管は２００XGで１分間遠心す
る、上清をけいしやし、カ粒をハンクス溶液で洗う。こ
の操作は５回反復する。最後の遠心のあとで、カ粒は１
５ccのFicoll（商品名、Pharmacia Chemical Company.U
ppsala,Swedenより販売、密度１．０８５）に懸濁させ
る。１．０８０の密度のFicollの８ccの層を加える。つ
いで密度１．０６０のFicoll 5ccの層を加える。スウイ
ンギング バケツト ローター（Swinging bucket roto
r）中で５００×Ｇで５分間遠心し、ついで２０００×
Ｇで５分間遠心する。上記方法の結果として、アシナー
（acinar）細胞は管の底部に留まり、島細胞は勾配中に
上昇し、頂部の２つの層のあいだにバンドを形成する。
この島細胞のバンドには、ギヤングリオン細胞、淋巴節
および結合織が混入している。混入する大きなフラグメ
ントは、バンド中の材料より除かれる。調製物の残りの
分は解剖顕微鏡下において、ミクロピペツトで肉眼に見
える混入物を手で除く。細胞調製物はハンクス溶液中で
希釈して遠心する。上清はけいしやし細胞カ粒は液体窒
素中に凍結保存する。
２００頭のラツトよりプールされた島細胞は、４Ｍグア
ニジウムチオシアネート（Tridomの商品名、Fluka AG C
hemische Fabrik,Buchs,Switzerland）中でホモジナイ
ズする。なお、この溶液は、pH５．０に緩衝されてお
り、１Ｍのβ−メルカプトエタノールを含有し、４度Ｃ
で使用する。このホモジネートは１００mMのEDTAを含有
する５．７ＭCsCl 1.2cc上に重層しBeckman Ultracentr
ifuge(Beckman Instrument Company,Fullerton,Califor
nia）のSW５０．１ローター中で３７，０００rpmで１８
時間遠心する。RNAは管の底部に移行する。
Aviv,H.,およびLeder,P.,の上記引用の操作に準じて、
オリゴ（dT）−セルローズ上で全RNA調製物をクロマト
グラフイーして、ポリアデニル化RNAを分離する。
D.J.Beard,Life Science Inc.,St.Petersburg,Florida
より提供されている鳥ミエロブラスト−ジスウイルスリ
バーストランスクリプターゼを用いて、ラツトランゲル
ハンス島よりの全ポリアデニル化RNAをcDNAに転写す
る。反応は、５０ｍＭトリス−HCl,pH８．３、９ｍＭMg
Cl2３０ｍＭNaCl、２０ｍＭベーター−メルカプトエタ
ノール、各１ｍＭの３種の非放射性デオキシリボニユク
レオシドトリホスフエート、２５０μＭの、モル当たり
５０から２００キユーリーの比活性を有するα−32Pラ
ベルの第４のデオキシニユクレオシドトリホスフエー
ト、２０μｇ／ccのオリゴ−dT12-18（Collaborative R
esearch,Waltham,Massachusetts）、１００μｇ／ccの
ポリアデニル化RNAおよび２００単位／ccのリバースト
ランスクリプターゼ中で行なう。混合物は４５度Ｃで１
５分インキユベートする。EDTA-NA2を２５ｍＭまで添加
したあとで、溶液は等容量の水飽和フエノールで抽出
し、ついで直径０．３cm高さ１０cmのSephadexＧ−３０
０カラム上で水相をクロマトグラフイーする。このもの
は１０ｍＭTris-HCl、pH９．０、１００ｍＭNaCl、２ｍ
ＭEDTAで展開する。空隙容量分の溶液で溶出された核酸
にpH６．０酢酸アンモニウムを０．２５Ｍまで加えたあ
とでエタノールで沈殿させる。沈殿は遠心して集め、カ
粒は新しく調製された０．１ＭNaOHの５０μｌに溶解
し、７０度Ｃで２０分インキユベートしRNAを水解させ
る。混合物は、pH４．５の１Ｍ酢酸ナトリウムを加えて
中和し、32P−cDNA生成物をエタノールで沈殿させ、水
に再溶解する。一重鎖cDNAの分を生のままのポリアクリ
ルアミドゲルで、Dingman,C.W.,およびPeacock,A.C.,Bi
ochemistry 7、659(1968)の方法で分析する。ゲルは乾燥
し、32PDNAをKodak No.-Screen NS-2T（商品名、Eastma
n Kodak社、Rochester,New York）によるオートラジオ
グラフイーで検出する。cDNAは、電気泳動のパターンか
らみて、ヘテロジスパーズである。既知の標品と比較し
て、約４５０ニユクレオチドの、少なくとも１個の顕著
なcDNA種を含有している。
例２ ラツトインシユリン配列を含有する二重鎖cDNAの合成を
特徴付けを記載する。例１の一重鎖cDNA生成物をリバー
ストランスクリプターゼで処理して相補鎖を合成する。
反応混合物は、５０ｍＭトリス−HCl,pH８．３、９ｍMg
Cl2、１０ｍＭジチオスレイトール、各５０ｍＭの３種
の末ラベルデオキシニユクレオシドトリホスフエート、
１ｍＭのアルフアー０32P−ラベルニユクレオシドトリ
ホスフエート（比活性は１−１０キユーリー／ミリモ
ル）、５０μｇ／ccのcDNAおよび２２０単位／ccのリバ
ーストランスクリプターゼを含有する。反応混合物は４
５度Ｃで１２０分インキユベートする。EDTA-Na2を２５
ｍＭまで加えて反応を停止させ、フエノールで抽出し、
セフアデツクスＧ−１００でクロマトグラフし、エタノ
ール沈殿する。５００cpmから１，０００cpmまでを有す
る反応生成物の１部を、例１記載のようにゲル電気泳動
で分析する。約４５０ニユクレオチドの長さのまわりに
集まるヘテロジスパーズバンドを、標準試料と比較して
観察する。例１および例２のDNA反応生成物の１部宛を
別々に過剰の制限エンドニユレアーゼHae IIIの過剰で
消化し、ゲル電気泳動で同様に分析する。両方の生成物
共にエンドニユクレアーゼで切断されるので、放射能を
有する２個のバンドをゲル電気泳動で認める。二重鎖cD
NAの切断で生ずるバンドは一重鎖cDNAの切断で生ずるバ
ンドと同じ長さの切断生成物である。
例３ 例２のラツト島二重鎖cDNAに対するデカニユクレオチド
リンカーのHind IIIブラント−エンドリゲーシヨンを記
載する。２から５μｇ／ccの例２の二重鎖反応生成物
を、０．０３Ｍ酢酸ナトリウム、pH４．６、０．３Ｍ塩
化ナトリウム、４．５ｍＭZnCl2中、Miles Laboratorie
s,Elkhart,Indianaより得られる１２００単位／ccの活
性を有するSlニユクレアーゼ３０単位で処理する。２２
度Ｃで３０分インキユベートしてから、１０度Ｃで１５
分さらにインキユベートする。Tris塩基を最終濃度０．
１Ｍまで、EDTAを２５ｍＭまで、そしてS.P.Colowickお
よびN.O.Kaplan編、Methods in Enzymology１２Ａ巻、
５８８頁（１９６７）にron Ehrensteinの記載した方法
で調製したE.col：tRNAを４０μｇ／ccまで加えて反応
を停止させる。反応混合物をフエノール抽出し、セフア
デツクスＧ−１００クロマトグラフイーし、空隙容量分
の展開液で溶出される32P−cDNAをエタノールで沈殿さ
せる。この処理で、化学的に合成されるデカニユクレオ
チドに対しブラント−エンドリゲーシヨンに必要な塩基
対末端を有するcDNA分子は高収量で生ずる。Hind IIIデ
カマーは、Scheller,R.H.,Dickerson,R.E.,Boyer,H.W.,
Riggs,A.D.およびItakura,K.,Science196、177(1977)の
方法で調製する。Hind IIIデカマーをcDNAに結合するに
は、６６ｍＭTris-HCl,pH７．６、６．６ｍＭMgCl2,1mM
ATP,１０ｍＭジチオスレイトール、３０ｍＭMind IIIデ
カマー（１０5cpm/ｐモルおよびＴ４DNAリガーゼ（約５
００単位／cc）中で１４度Ｃで１時間インキユベートす
る。ついで反応混合物は、６５度Ｃで５分間加熱して、
リガーゼを不活化する。KClを５０ｍＭ最終濃度まで、
ベーター−メルカプトエタノール１ｍＭ最終濃度までそ
してEDTAを０．１ｍＭ最終濃度まで加えてから、１５０
単位／ccのHsu IまたはHind IIIエンドニユクレアーゼ
で３７度Ｃで２時間消化する。Hind IIIおよびHae III
エンドニユクレアーゼは、NeW England Bio-Labs,Bever
ly,Massachusettsより市販している。反応生成物は例１
のようにゲル電気泳動で分析し約４５０個ニユクレオチ
ドの配列に相当するピークを、切断されたHind IIIデカ
マーのフラグメントにあわせて観察する。
例４ リコンビナントプラスミドの生成および複製後の特徴を
記載する。D.P.Wierlich,W.J.RutterおよびC.F.Fox編、
ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biolo
gy,４７１から４７７頁にRodriguez,R.L.,Boliver,F.,G
oodman,H.M.,Boyer,H.W.,およびBetlach,M.,が記載した
方法でプラスミドpMB-9 DNAを調製し、Hsu Iエンドニユ
レアーゼを用いHind III制限サイトで切断する。ついで
アルカリホスフアターゼ（タイプBAPF,Worthington,Bio
chemical Corporation,Freehold,New Jersey）で処理す
る。酵素は、反応混合物中に、０．１単位／ミクログラ
ムDNAの割合で存在させ、反応混合物は、２５ｍＭトリ
ス−HCl中、pH８で３０分６５度Ｃでインキユベートす
る。ついでフエノール抽出してフオスフアターゼを除去
する。エタノール沈殿のあと、ホスフアターゼ処理プラ
スミドDNAを、Hind III結合性末端を有するcDNAに、プ
ラスミド３モル対はcDNA１モルの割合で添加する。混合
物は、６６ｍＭトリス、pH７．６、６．６ｍＭMgCl2、
１０ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭATP中で、５
０単位／ccのＴ４DNAリガーゼの存在で１４度Ｃ１時間
インキユベートする。
このリゲーシヨン混合物は、つぎのようにして、変換の
ために調製したE.coliＸ−１７７６細胞の懸濁液に直接
に添加する。つまり、細胞を、Trypton１０ｇ／１、酵
母エキス５ｇ／１、NaCl１０ｇ／１、NaOH２ｍＭ、ジア
ミノピメリン酸１００μｇ／ccおよびチミン４０μｇ／
ccを含有する培地５０cc中で３７度Ｃでインキユベート
し、約２×１０6個細胞／ccの細胞密度とする。細胞
は、５度Ｃで５，０００×Ｇで５分間遠心して採取し、
２０ccの冷NaCl１０ｍＭに再懸濁させ、７５ｍＭのCaCl
2、１４０ｍＭのNaClおよび１０ｍＭのTris pH７．５を
含有する２０ccの変換培地中に再懸濁させる。そして氷
中５分間保つ。細胞は遠心し０．５ccの変換緩衝液中に
再懸濁させる。細胞懸濁液１００μｌをリコンビナント
DNA（１μｇ／cc）５０μｌと混合して変換を行なう。
混合物は、０度Ｃで１５分インキユベートし、２５度Ｃ
で４分インキユベートし、ついで０度Ｃで３０分インキ
ユベートする。細胞は寒天プレートに移し、選び出す条
件に処する。
Hind IIIサイトへの変換に対しては、５マイクログラム
／ccのテトラサイクリンを用いて、リコンビナントプラ
スミドをスクリーニングする。pAU−１と称する選択さ
れたリコンビナントを分離する。pAU−１より分離した
２μｇから５μｇのDNAの粗プラスミド調製物を過剰のH
su１エンドニユクレアーゼで消化する。最終濃度で１０
ｍＭのEDTA-Na2および１０％重量／容量のスクロースを
加え、混合物を８％ポリアクリルアミドゲルで分割す
る。長さ約４１０塩基対相等する位置にDNAを見出だ
す。同様な実験でプラスミドpBR−３２２をトランスフ
アーベクターとして使用する。すべての条件は記載した
ようであるが、リコンビナントクローンの最終的選択
は、２０μｇ／ccのアンピシリンを含有するプレート上
で実施する。
例５ 例４の記載のようなpAU−１よりのDNAを６％ポリアクリ
ルアミドゲル上の電気泳動でさらに精製する。ゲルより
溶出したDNAはγ−32P−ATPおよびポリニユクレオチド
キナーゼ酵素とMaxamおよびGilbertの上記引用の条件で
インキユベートしてラベルする。この酵素は、γ−32P
−ATPより放射性リン酸基をDNAの５′−末端に移すこと
を触媒する。酵素は、Panet,A.,等、Biochemistry 12、
５０４５（１９７３）の方法によりE.coliより得られ
る。このようなラベルされたDNAは、例２記載のようなH
ae IIIエンドニユクレアーゼで切断し、約２６５個およ
び１３５個の塩基対を有する２個のラベルされたフラグ
メントを、例１記載の条件でポリアクリルアミドゲル上
で分ける。分離されたフラグメントは、上記引用のMaxa
mおよびGilbertの方法により、特異的切断反応に処して
配列を分析する。表１に示す配列は、この１連の実験の
知見およびcol E1たとえばpMB−９およびpBR−３２２よ
り由来するプラスミドベクターを用いる同様に１連のcD
NAについての実験の知見を組合わせて得られたものであ
る。５′末端での配列において、５０から１２０個のニ
ユクレオチド鎖と推定される配列は未定で、３′−末端
でのポリdA断片は種々の長さを有する。この配列は、現
在入手しうる最良の情報を示すとされるが、もちろん、
研究の進行により、さらに詳細が追加されうるし、同じ
部分でもやや訂正を要することもありうることはもちろ
んである。ラツトプロインシユリンの相当するアミノ酸
配列は、１で示したトリプレツト位置に始まり、８６で
示したトリプレツト位置に終る。点線で示した配列には
若干の不確実さが残る。
例６ 例１から４までの記載に本質的に準じて、分離され、精
製されたヒトインシユリンのニユクレオチド配列をプラ
スミドに導入する。提供されたすい臓、または新鮮な死
体、ヒトのインシユリノーマより分離されたヒトのすい
臓組織を用いる。例４に本質的に準じて微生物を生産す
る。これは、ヒトインシユリンＡ鎖およびＢ鎖をコード
するニユクレオチド配列を有する。ヒトインシユリンＡ
鎖の既知のアミノ酸配列をつぎに示す。
ヒトインシユリン鎖Ｂの既知のアミノ酸配列をつぎに示
す アミノ酸配列は、遊離アミノ基を有する末端から番号を
付してある。Smith,L.F.,Diabetes21(suppl.２）、４５
８（１９７２）をみよ。
例７ RGHに対する全構造遺伝子配列を有するDNAの分離および
精製を示す。あわせて、RGHに対する全構造遺伝子を含
有する導入ベクターの合成および遺伝子構成の１部RGH
の遺伝子を含有している微生物の構成を示す。
ヒトに由来しない遺伝子の場合には、Ｕ．Ｓ．Federal
安全規制は、ヒトcDNAにおけるような高度の純度を有す
るcDNAの分離は要求していない。それゆえに、RGHの既
知のアミノ酸鎖長よりして、約８００個の塩基対を有す
る、期待された長さの、電気泳動的に分かれるDNAを分
離することにより、全RGH構造遺伝子を含有するcDNAを
分離することが可能であつた。American Type Culture
Collectionより入手しうる、セルラインGH−１のサブ−
クローンである培養ラツト脳下垂体細胞を、RGHｍRNAの
原料として使用する。Tashjian.A.H.等、Endochrinolog
y 82、３４２（１９６８）をみよ。このような細胞中で
は、ふつうの条件で培養する場合、生長ホルモンmRNA
は、全ポリ−Ａ含有RNAのわづか１から３％の低いパー
セントを占めるのみである。しかし、生長ホルモンmRNA
のレベルは、他の種類の細胞性mRNAレベルよりも、甲状
腺ホルモンおよびグルココルチコイドの協力作用で上昇
する。懸濁培養の状態で発育した５×１０8個の細胞よ
りRNAをうる。細胞は集める前に、１ｍＭのデクサメサ
ゾン(dexamethasone)および１０ｎＭのＬ−トリヨード
チロニンを加えて生長ホルモンの生産を誘導しておく。
別に記載したようにして、原形質膜分画よりポリアデニ
ル化RNAを分離する。Martial,J.A.,Baxter,J.D.,Goodma
n,H.M.およびSeeburg,P.H.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 7
4、１８１６（１９７７）およびBancroft,F.C.,Wu,G.お
よびZubay,G.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 70、３６４６
（１９７３）をみよ。mRNAはさらに精製し、上記例１、
２および３の記載に本質的に準じて二重鎖cDNAに転写す
る。ゲル電気泳動で分画して、約８００塩基対の長さの
DNAに相当する、うすいが明確なバンドを観察する。Hha Iエンドニユクレアーゼを用いて培養脳下垂体細胞mR
NAより転写されたcDNAを処理すると、２個の主要なDNA
フラグメントを与える。電気泳動で分離すると、３２０
ニユクレオチド（フラグメントＡ）および２４０ニユク
レオチド（フラグメントＢ）に相当する。例５のように
フラグメントＡおよびＢのニユクレオシド配列を解析す
ると、公表されているRGHアミノ酸配列データにもとづ
き、他の既知の生長ホルモン配列と比較して、これらの
フラグメントが実際、RGHに対するコード領域の部分で
あることが分る。Wallis,M.およびDavies,R.V.N.,Growt
h Hormone and Related Peptides(Copecile,A.およびMu
ller,E.E.編）、１から４頁（Elsevier,New York,１９
７６）およびDayhoff,M.O.,Atlas of Protein Sequence
and Structure,5,Suppl.２，１２０から１２１頁（Nat
ional Biomedical Research Foundation,Washington,D.
C.,１９７６）をみよ。上記のように電気泳動的に分離
された８００個の塩基対を有する二重鎖cDNAを同様にHa
lIエンドニユクレアーゼに処すると、長さでフラグメン
トＡおよびＢに相当する２個のフラグメントを主要な切
断生成物のうちに見出だす。
約８００個の塩基対のRGH-cDNAは制限エンドニユクレア
ーゼ処理により精製されないので、対をなさない一重鎖
未端がある場合それを除くのにDNAを処理する必要があ
つた。実際にそのような対をなさない末端を除去する処
理を、電気泳動による分離に先立つて、２５μｌの６０
ｍＭのトリス−HCl，pH７．５、８ｍＭMgCl2、１０ｍＭ
β−メルカプトエタノール、１ｍＭATPおよび各２００
μＭのdATP，dTTP，dGTPおよびdCTPで実施する。混合物
は１単位のE.coliDNAポリメラーゼＩと１０度Ｃで１０
分間インキユベートして、３′の突き出している末端が
あればそれをエキソニユクレオリテイツクに除き、５′
の突きでている末端があればそれをみたす。DNAポリメ
ラーゼＩはBoehringer-Mannheim Biochemicals,Indiana
polis Indianaより市販品として入手しうる。
約８００塩基対のRGH-cDNAを、例３記載のように、化学
的に合成されたHindIIIリンカーを加えて処理する。ア
ンピシリン抵抗性遺伝子を有しそしてテトラサイクリン
抵抗性遺伝子中に存在するひとつのHindIIIサイトを有
するプラスミドpBR−３２２を、例４記載のようにHindI
IIエンドニユクレアーゼおよびアルカリホスフアターゼ
で予備処理する。処理されたプラスミドは例３記載のよ
うに、DNAリガーゼ反応混合物中で８００塩基対のRGH-c
DNAと結合させる。リガーゼ反応混合物を用いて、例３
に前記したように処理した、E.coliＸ−１７７６細胞の
懸濁液を変換する。リコンビナントコロニーはアンピリ
シリン含有ニユトリエントプレート上の発育し２０μg/
ccのテトラサイクリンでの発育不能で、そのようなコロ
ニー１０個をうるが、すべて、HindIII切断により遊離
された約８００塩基対の挿入を有するプラスミドを担つ
ている。
８００塩基対のRGH-DNAをリコンビナントクローンpRGH
−１よりある程度の量になるように分離し、例５のよう
にニユクレオチド配列を定める。この例でも、ニユクレ
オチド配列は、RGHの５′の翻訳されない部分ならびに
分泌前の生長ホルモンプリカーサー蛋白質に見出だされ
る２６個のアミノ酸配列を含有する。遺伝子配列より推
定されるmRNAのメツセンジヤーの配列を表２に示す。示
されたアミノ酸配列は、位置１および８を除いては、上
記引用のWallisおよびDaviesの文献記載のラツト生長ホ
ルモンの部分的アミノ酸配列（これはアミノ酸残基１−
４３、６５−６９、１０８−１１３、１３３−１４３お
よび１５０−１９０からなる）とよく一致する。
例８ HGHに対する全遺伝配列コードの分離および精製、あわ
せてHGHに対する全構造遺伝子含有リコンビナントプラ
スミドの合成およびHGHに対する全構造遺伝子を遺伝構
成の１部として有する微生物の製造を記載する。
上記プラスミドは１９７８年４月３日にアメリカンタイ
プカルチヤーコレクシヨンにＡＴＣＣ番号４０，０００
でプラスミドｐＨＧＨ−１として寄託された。このプラ
スミドはまた、ＡＴＣＣ番号３１３８９（ブタペスト条
約による国際寄託に基づく受託番号３１３８９）として
寄託されているE.coliＨＧＨＸ−１７７６株に含まれて
いる。
HGHmRNAの分離は例７記載と本質的に同様であるが生物
原料はヒト脳下垂体腫瘍組織である。５個の良性脳下垂
体腫瘍を外科的に切除してすぐに液体窒素中で急速に凍
結する。各０．４ｇから１．５ｇである。pH５．０に緩
衝させた、１Ｍメルカプトエタノール含有４Ｍグアニジ
ウムチオシアネート中で４度Ｃで融解させホモジナイズ
する。ホモジネートは、１００ｍＭのEDTAを含有する
５．７ＭCaCl１．２cc上に重層する。Beckman超遠心機
（Beckman Instrument Company,Fullerton,Californi
a）のＳＷ５０．１ローター中で１５度Ｃで３７，００
０rpmで１８時間遠心する。RNAは管の底に沈降する。ol
igo-dTカラムおよびスクローズ勾配沈降を用いて、例
１、２および３に記載のようにして、さらに精製する。
このように分離されたRNAの１０％が生長ホルモンをコ
ードしていることが、小麦麦芽に由来する、細胞不含翻
訳システム中での抗生長ホルモン沈殿物質中への放射性
アミノ酸プリカーサーの取り込みより判断して分る。Ro
berts,B.E.およびPatterson,B.M.,Proc.Nat.Acad.Sci.U
SA70、２３３０（１９７３）をみよ。HGH-cDNAの製造
は、本質的に例７の記載に準ずる。HGH-cDNAはゲル電気
泳動で分画し、長さが約８００ニユクレオチドに相当す
る位置に移動する物質を選択してクローン化に用いる。
選択された分画は例７記載のようにDNAポリ メラーゼ
Ｉで処理しついでHindIIIリンカーを末端に付着させ
る。cDNAについでDNAリガーゼを使用し、アルカリホス
フアターゼ処理プラスミドpBR−３２２とリコンビネー
シヨンさせる。このリコンビナントDNAでE.coliＸ−１
７７６を変換しHGH-DNAを含有する株を選択する。この
株は１９７８年４月３日にE.coliＨＧＨ Ｘ−１７７６
としてＡＴＣＣ番号３１３８９でアメリカンタイプカル
チヤーコレクシヨンに寄託されている。これはまたブタ
ペスト条約による国際寄託に基づく受託番号３１３８９
で寄託されている。HGH-DNA含有株をある程度の量まで
発育させ、HGH-DNAをそれより分離し、それのニユクレ
オチド配列を決定する。クローン化されたHGH-DNAは、H
GHの全アミノ酸配列のニユレオチドコードを含有してい
る。最初の２３個のHGHのアミノ酸は、H2N-Phe-Pro-Thr
-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-▲Ｐ10 he▼e-Asp-Asn-Ala-M
et-Leu-Arg-Ala-His-Arg-▲Ｌ20 eu▼u-His-Gln-Leu-で
残りは表３に示す。
一般的結論 本発明により高等生物たとえば哺乳動物よりの特定の調
節蛋白質に対するニユクレオチド配列コードの分離およ
びそれに含有される遺伝情報をそれが複製されうる微生
物に導入することが可能となつた。記載された方法は、
ヒトインシユリン遺伝子の分離および精製、およびそれ
の微生物への導入に応用されうる。同様に、ヒト成長ホ
ルモン遺伝子および蛋白質に対する遺伝子も、分離さ
れ、微生物に導入されて複製されうる。いくつかの新規
リコンビナントプラスミドが記載されたが、これらは、
それぞれに、それのニユクレオチド配列内に、高等生物
の遺伝子の構造を有しそれより転写されたニユクレオチ
ド亜配列を含有する。それぞれに、高等生物の遺伝子の
構造を有しそれより転写されたニユクレオチド配列を含
有するように変型されたいくつかの新規微生物が記載さ
れている。本発明の実施は、プロインシユリンに対する
ラツト遺伝子のEscherichia coliの株への導入および生
長ホルモンのラツト遺伝子をE.coli株への導入を示すこ
とで説明してある。導入された遺伝子の主要部分の配列
はそれぞれの場合について決定され、すべての生命形態
に共通である既知の遺伝コードを参照して決められた、
ラツトプロインシユリンＩまたはラツト生長ホルモンの
全アミノ酸配列をコードしていることが見出だされた。
本発明は、それの特殊な具体例を参照して記載された
が、さらに別の変型も可能で、本発明の応用には、本発
明の原則を一般的に従い、そして、本発明が関係してい
る技術において、既知であるかまたは習慣的となつてい
るような、または、この方面の技術の専門家にとつて自
明であるような、本発明の記載にしてない。包含してい
る、変法、用途または適用をも包含されているものとす
る。かかる理解をもつて、本発明は、特許請求の範囲の
要求する範囲によつてのみ限定さるべきものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の実施段階を模式的に示したものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ８９７７１０ (32)優先日 1978年４月19日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ８９８８８７ (32)優先日 1978年４月21日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ８９９００２ (32)優先日 1978年４月26日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ８９９００３ (32)優先日 1978年４月26日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ−３１３８９ 審判番号 昭62−15713 (72)発明者 アクセル・ウルリツチ アメリカ合衆国カリフオルニア州サン・フ ランシスコ・フレデリツク・ストリ−ト 281 (72)発明者 ジヨン・シヤイン オ−ストラリア国カ−チン・エイ・シ−・ テイ−・ギリエス・ストリ−ト７ (72)発明者 ジヨン・ミツチエル・チヤ−グウイン アメリカ合衆国カリフオルニア州サン・フ ランシスコ・リバテイ・ストリ−ト307 (72)発明者 レイモンド・ルイス・ピクテツト アメリカ合衆国カリフオルニア州サン・フ ランシスコ・ウイラ−ド・ストリ−ト1524 (72)発明者 ピ−タ−・ホ−スト・シ−バ−グ アメリカ合衆国カリフオルニア州サン・フ ランシスコ・シツクスス・アベニユ−1208 (56)参考文献 特開 昭51−125782（ＪＰ，Ａ) Ｃｅｌｌ，８（1976−６）Ｐ．163〜182 Ｎａｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｃｓｅ ａｒｃｈ，３〔８〕（1976−８）Ｐ．1961 〜1971 Ｒｒｏｃ，Ｎａｔｈ Ａｃａｄ Ｓｃ ｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．73〔９〕（1976−９) Ｐ．3146〜3150 Ｃｅｌｌ，６（1975−10）Ｐ．231〜244

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】大腸菌(Escherichia coli)宿主細胞で複製
    可能であり、かつ宿主細胞に対して相同のＤＮＡおよび
    異種ＤＮＡを含む組換えＤＮＡプラスミドであって、こ
    の異種ＤＮＡがインシュリンおよび成長ホルモンから選
    択されるタンパク質ホルモンをコードするヌクレオチド
    配列を含むことを特徴とする組換えＤＮＡプラスミド。
  2. 【請求項２】タンパク質ホルモンがインシュリンである
    特許請求の範囲第１項のプラスミド。
  3. 【請求項３】タンパク質ホルモンが成長ホルモンである
    特許請求の範囲第１項のプラスミド。
  4. 【請求項４】大腸菌(Escherichia cloi)宿主細胞で複製
    可能であり、かつ宿主細胞に対して相同のＤＮＡおよび
    異種ＤＮＡを含む組換えＤＮＡプラスミドであって、こ
    の異種ＤＮＡがインシュリンおよび成長ホルモンから選
    択されるタンパク質ホルモンをコードするヌクレオチド
    配列を含む組換えＤＮＡプラスミドで形質転換した大腸
    菌。
  5. 【請求項５】大腸菌宿主細胞で複製可能であり、かつイ
    ンシュリンをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡプラ
    スミドの製造方法であって、 (a)膵臓からインシュリンをコードするｍＲＮＡを含有
    する島細胞を単離し、この単離は (i)島細胞および他の細胞を含有する膵臓組織を加水分
    解酵素およびトリプシン阻害剤で処理して島細胞を他の
    細胞から分離し、次いで (ii)処理された組織を分画して、他の細胞および細胞残
    査を実質的に含有していない島細胞を得る、 ことにより行ない、 (b)pH５．０〜８．０で、たとえば４Ｍグアニジニウム
    チオシアネートおよび０．０５〜１．０Ｍβ−メルカプ
    トエタノールの組成のＲＮａｓｅ阻害剤を存在させてｍ
    ＲＮＡのＲＮａｓｅ分解を防止して、島細胞からｍＲＮ
    Ａを抽出し、 (c)得られたｍＲＮＡからインシュリンをコードするヌ
    クレオチドｍＲＮＡ配列を有するｃＤＮＡを、それ自体
    既知の方法で逆転写酵素により製造し、次いでこのｃＤ
    ＮＡを二重鎖にし、 (d)得られた二重鎖ｃＤＮＡの末端に工程(e)と同一の制
    限エンドヌクレアーゼの識別部位配列を結合させ、 (e)その後で、ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで開
    裂させて付着末端を生成させ、 (f)細菌プラスミドを制限エンドヌクレアーゼ、たとえ
    ばＨｉｎｄIIIまたはＨｓｕＩで開裂して、付着末端を
    有する開裂されたプラスミドをつくり、 (g)工程(f)のプラスミドの５′−ホスフエート末端基を
    アルカリホスファターゼにより、たとえばpH８．０およ
    び６５℃で３０分間処理することにより加水分解し、か
    くして工程(f)に記載の付着末端が一緒に結合しないよ
    うにし、次いで (h)工程(g)に従い処理されたプラスミドを工程(d)のｃ
    ＤＮＡと、ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰの存在下に、た
    とえばpH７．６および１４℃で１時間、プラスミドをモ
    ル過剰に使用してインキュベートすることにより結合さ
    せて、インシュリンをコードするヌクレオチド配列を有
    するプラスミドを製造する、 ことを特徴とする前記プラスミドの製造方法。
  6. 【請求項６】大腸菌宿主細胞で複製可能であり、かつ成
    長ホルモンをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡプラ
    スミドの製造方法であって、 (a)下垂体細胞を、pH５．０〜８．０で４Ｍグアニジニ
    ウムチオシアネートおよび０．０５〜１．０Ｍβ−メル
    カプトエタノールの組成のＲＮａｓｅ阻害剤を存在させ
    てｍＲＮＡのＲＮａｓｅ分解を防止してホモゲナイズす
    ることにより下垂体細胞からｍＲＮＡを単離し、 (b)得られたｍＲＮＡから、それ自体既知の方法で逆転
    写酵素を用いて成長ホルモンをコードするヌクレオチド
    ｍＲＮＡ配列を有するｃＤＮＡを製造し、次いでこのｃ
    ＤＮＡを二重鎖にし、 (c)得られた二重鎖ｃＤＮＡの末端に、工程(d)と同一の
    制限エンドヌクレアーゼの識別部位配列を結合させ、そ
    の後で、ｃＤＮＡをこの制限エンドヌクレアーゼで開裂
    させて付着末端を生成させ、 (d)細菌プラスミドベクターを制限エンドヌクレアー
    ゼ、たとえばＨｉｎｄIIIまたはＨｓｕＩで開裂して、
    付着末端を有する開裂されたプラスミドベクターを製造
    し、 (e)工程(d)のプラスミドベクターの５′−ホスフエート
    末端基をアルカリホスファターゼにより、たとえばpH
    ８．０および６５℃で３０分間処理することにより加水
    分解し、かくして工程(d)に記載の付着末端が一緒に結
    合できないようにし、次いで (f)工程(e)に従い処理されたプラスミドベクターを工程
    (c)のｃＤＮＡと、ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰの存在
    下に、たとえばpH７．６および１４℃で１時間、プラス
    ミドベクターをモル過剰に使用してインキュベートする
    ことにより結合させて、成長ホルモンをコードするヌク
    レオチド配列を有するプラスミドを製造する、 ことを特徴とする前記プラスミドの製造方法。
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