JP2632680B2 - ブリ成長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミド - Google Patents
ブリ成長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミドInfo
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- JP2632680B2 JP2632680B2 JP62184083A JP18408387A JP2632680B2 JP 2632680 B2 JP2632680 B2 JP 2632680B2 JP 62184083 A JP62184083 A JP 62184083A JP 18408387 A JP18408387 A JP 18408387A JP 2632680 B2 JP2632680 B2 JP 2632680B2
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- plasmid
- yellowtail growth
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ブリ下垂体組織由来の樹立されたブリプレ
成長ホルモン構造遺伝子の塩基配列を備えたプラスミド
に関するものである。
成長ホルモン構造遺伝子の塩基配列を備えたプラスミド
に関するものである。
［従来の技術］ 哺乳類や鳥類におけると同様に、魚類においても固体
の成長には夫々種属に特有な構造をもつ成長ホルモンが
作用し、必須の働きをしている。
の成長には夫々種属に特有な構造をもつ成長ホルモンが
作用し、必須の働きをしている。
魚類において成長ホルモンのアミノ酸配列が従来判明
していたのはサケ成長ホルモンについてのみであり（特
開昭60−214798号公報）、成長ホルモンをコードする構
造遺伝子が解明されていたのもサケ成長ホルモン遺伝子
についてのみである（S.Sekineら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA.82 4306（1985））。
していたのはサケ成長ホルモンについてのみであり（特
開昭60−214798号公報）、成長ホルモンをコードする構
造遺伝子が解明されていたのもサケ成長ホルモン遺伝子
についてのみである（S.Sekineら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA.82 4306（1985））。
サケ成長ホルモンについては、サケ科の魚類に投与す
るとその成長を著しく促進する効果を有する効果が得ら
れ（特開昭60−214798号公報）、サケ・マスの養殖への
応用が考えられている。
るとその成長を著しく促進する効果を有する効果が得ら
れ（特開昭60−214798号公報）、サケ・マスの養殖への
応用が考えられている。
一方、本邦において養殖の最も盛んなブリの子ハマチ
についてであり、ブリ成長ホルモンタンパク質の構造解
析や大量生産が必要とされている。
についてであり、ブリ成長ホルモンタンパク質の構造解
析や大量生産が必要とされている。
［発明が解決しようとする課題］ ブリ成長ホルモンタンパク質の構造解析や生理作用の
解析、さらにブリ成長ホルモンタンパク質の量産が現在
解決を求められている問題点となっている。
解析、さらにブリ成長ホルモンタンパク質の量産が現在
解決を求められている問題点となっている。
この問題点の解決のためにまず必要とされることは、
ブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子の単離と増幅で
あり、ブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子増幅プラ
スミドの確立である。すなわち、ブリ成長ホルモンタン
パク質構造遺伝子について常に必要な量を確保できる体
制の確立が必要である。
ブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子の単離と増幅で
あり、ブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子増幅プラ
スミドの確立である。すなわち、ブリ成長ホルモンタン
パク質構造遺伝子について常に必要な量を確保できる体
制の確立が必要である。
次には、ブリ成長ホルモンタンパク質を暗号化してい
るブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子DNAの塩基配
列を解読することによって、ブリ成長ホルモンタンパク
質構造遺伝子の構造を明らかにすることが必要である。
るブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子DNAの塩基配
列を解読することによって、ブリ成長ホルモンタンパク
質構造遺伝子の構造を明らかにすることが必要である。
さらには、解明された構造遺伝子の構造から、ブリ成
長ホルモンタンパク質の構造を解明することも必要とな
ってくる。
長ホルモンタンパク質の構造を解明することも必要とな
ってくる。
一方で、単離されたブリ成長ホルモンタンパク質遺伝
子のホルモンタンパク質をコードしている部分を切り出
し、他の大腸菌や枯草菌等の微生物に組込んでブリ成長
ホルモンタンパク質を大量に生産させることも可能とな
ってくるものである。
子のホルモンタンパク質をコードしている部分を切り出
し、他の大腸菌や枯草菌等の微生物に組込んでブリ成長
ホルモンタンパク質を大量に生産させることも可能とな
ってくるものである。
本発明者らは、ブリ脳下垂体よりブレ成長ホルモンmR
NAを抽出・精製してその相補鎖DNAを酵素的に合成し、
これを二重鎖としたのち大腸菌プラスミドに組込むこと
により、ブリプレ成長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミ
ドを確立した。クローニングされたブリ成長ホルモンタ
ンパク質構造遺伝子DNAの塩基配列を解読してブリプレ
成長ホルモン遺伝子の構造（塩基配列）を解明し、遺伝
子の解読によ：てブリ成長ホルモンタンパク質のアミノ
酸配列を解明することによって本発明を完成した。
NAを抽出・精製してその相補鎖DNAを酵素的に合成し、
これを二重鎖としたのち大腸菌プラスミドに組込むこと
により、ブリプレ成長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミ
ドを確立した。クローニングされたブリ成長ホルモンタ
ンパク質構造遺伝子DNAの塩基配列を解読してブリプレ
成長ホルモン遺伝子の構造（塩基配列）を解明し、遺伝
子の解読によ：てブリ成長ホルモンタンパク質のアミノ
酸配列を解明することによって本発明を完成した。
［課題を解決するための手段］ 本発明の係るブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子
増幅プラスミドは、次のアミノ酸配列をコードするブリ
成長ホルモンタンパク質構造遺伝子の塩基配列を備えた
ものである。
増幅プラスミドは、次のアミノ酸配列をコードするブリ
成長ホルモンタンパク質構造遺伝子の塩基配列を備えた
ものである。
［作用および発明の効果］ 以下に本発明をさらに詳しく説明する。
本発明のブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子増幅
プラスミドは、ブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子
の塩基配列を備えたものである。このブリ成長ホルモン
タンパク質構造遺伝子は、ブリ脳下垂体組織由来の樹立
されたブリプレ成長ホルモン構造遺伝子から得られたも
のである。
プラスミドは、ブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子
の塩基配列を備えたものである。このブリ成長ホルモン
タンパク質構造遺伝子は、ブリ脳下垂体組織由来の樹立
されたブリプレ成長ホルモン構造遺伝子から得られたも
のである。
このブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子増幅プラ
スミドは、詳しくは次のようにして樹立された。
スミドは、詳しくは次のようにして樹立された。
ブリから摘出したブリ脳下垂体組織をグアニジウムチ
オシアネート溶液中で破砕し、遠心分離によりRNA画分
を集めた。得られたRNA画分をオリゴｄ（Ｔ）カラムに
通してポリ（Ａ）末尾を有するメッセンジャーRNAを濃
縮した。
オシアネート溶液中で破砕し、遠心分離によりRNA画分
を集めた。得られたRNA画分をオリゴｄ（Ｔ）カラムに
通してポリ（Ａ）末尾を有するメッセンジャーRNAを濃
縮した。
濃縮されたポリ（Ａ）RNAは、ブラスミドpSI4001（K.
Izuiら、Nucleic Acids Res.14 1615（1986））のアン
ピシリン耐性遺伝子と67個のポリｄ（Ｔ）連鎖をもつ全
長約2.5kbのクローニング用プライマーとを結合させた
後、逆転写酵素でポリ（Ａ）RNAの相補鎖DNAを合成し
た。
Izuiら、Nucleic Acids Res.14 1615（1986））のアン
ピシリン耐性遺伝子と67個のポリｄ（Ｔ）連鎖をもつ全
長約2.5kbのクローニング用プライマーとを結合させた
後、逆転写酵素でポリ（Ａ）RNAの相補鎖DNAを合成し
た。
更に、５′末端にデオキシヌクレオチド末端転移酵素
で19個のポリｄ（Ｃ）連鎖をつけ、相補鎖DNA側でない
反対側の５′末端のポリｄ（Ｃ）連鎖を含む二重鎖を制
限酵素Hind III処理で除いた。
で19個のポリｄ（Ｃ）連鎖をつけ、相補鎖DNA側でない
反対側の５′末端のポリｄ（Ｃ）連鎖を含む二重鎖を制
限酵素Hind III処理で除いた。
一方、19個のポリ（Ｇ）連鎖とHind III接着端を両端
に持ち、内部にIacプロモーター１個とSD配列および翻
訳開始コドン（ATG）のセットを３個もつ全長約390bpの
pSI4001由来のリンカーを用意しておき、前述の制限酵
素Hind III処理で除いた画分に加え、RNaseH,DNAポリメ
ラーゼ、DNAリガーゼを作用させることにより、環状化
したメッセンジャーRNAの相補DNAを持つブリ（プレ）成
長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミドを作成した。
に持ち、内部にIacプロモーター１個とSD配列および翻
訳開始コドン（ATG）のセットを３個もつ全長約390bpの
pSI4001由来のリンカーを用意しておき、前述の制限酵
素Hind III処理で除いた画分に加え、RNaseH,DNAポリメ
ラーゼ、DNAリガーゼを作用させることにより、環状化
したメッセンジャーRNAの相補DNAを持つブリ（プレ）成
長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミドを作成した。
更に、これを大腸菌宿主株DH1に導入し、寒天培地上
に育成したコロニー中のプラスミドの長さと制限酵素地
図と、塩基配列を調べることにより、ブリ成長ホルモン
タンパク質構造遺伝子を含むブリプレ成長ホルモン構造
遺伝子の塩基配列を樹立した。
に育成したコロニー中のプラスミドの長さと制限酵素地
図と、塩基配列を調べることにより、ブリ成長ホルモン
タンパク質構造遺伝子を含むブリプレ成長ホルモン構造
遺伝子の塩基配列を樹立した。
このようにして得られたブリ成長ホルモンタンパク質
構造遺伝子増幅プラスミドpyGHlは、ブリ成長ホルモン
タンパク質構造遺伝子を含むブリプレ成長ホルモンを暗
号化するブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子DNAとp
SI4001のアンピシリン耐性遺伝子を含む全長3,851塩基
対の環状二重鎖構造をもち、その全構造は添付図面第１
図および第２図に示されたごとくである。
構造遺伝子増幅プラスミドpyGHlは、ブリ成長ホルモン
タンパク質構造遺伝子を含むブリプレ成長ホルモンを暗
号化するブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子DNAとp
SI4001のアンピシリン耐性遺伝子を含む全長3,851塩基
対の環状二重鎖構造をもち、その全構造は添付図面第１
図および第２図に示されたごとくである。
上記のプラスミドを導入した大腸菌は50〜100μg/1ml
のアンピシリンを含む培養液中で成育し、前記大腸菌は
50μg/1mlのアンピシリンを含むLB培地で37℃の培養で3
0〜60分で２倍量となる。
のアンピシリンを含む培養液中で成育し、前記大腸菌は
50μg/1mlのアンピシリンを含むLB培地で37℃の培養で3
0〜60分で２倍量となる。
上記のLB倍地組成は次の通りである。
Bactotryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 5g （5N−NaClでpH7.2〜7.4に調節しH2Oを加えて全量１リ
ットルとする。） 前培養液1mlを200ml培地に加え、６〜8hr、37℃で保
温し、3.2〜4.8×108cell/1mlに達したとき170μg/mlと
なるようにクロラムフェニコール（Chloramphenicol）
を加えて更に37℃で16〜18hr振とう培養すると菌体数は
増加しないが、プラスミドは40コピー/cellから200コピ
ー/cellに増加し、200ml培地あたり150〜300μｇのプラ
スミドが得られる。
ットルとする。） 前培養液1mlを200ml培地に加え、６〜8hr、37℃で保
温し、3.2〜4.8×108cell/1mlに達したとき170μg/mlと
なるようにクロラムフェニコール（Chloramphenicol）
を加えて更に37℃で16〜18hr振とう培養すると菌体数は
増加しないが、プラスミドは40コピー/cellから200コピ
ー/cellに増加し、200ml培地あたり150〜300μｇのプラ
スミドが得られる。
本ブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子増幅プラス
ミドpyGH1は、pSI4001由来のアンピシリン耐性遺伝子
（アンピシリン分解酵素遺伝子）を含む。このため、本
プラスミドを取り込んだ大腸菌のみ抗生物質アンピシリ
ンを含む培地中で生育することが出来る。この倍地中で
大腸菌を培養することにより、ブリ成長ホルモンタンパ
ク質遺伝子を大量に増産することが可能となる。
ミドpyGH1は、pSI4001由来のアンピシリン耐性遺伝子
（アンピシリン分解酵素遺伝子）を含む。このため、本
プラスミドを取り込んだ大腸菌のみ抗生物質アンピシリ
ンを含む培地中で生育することが出来る。この倍地中で
大腸菌を培養することにより、ブリ成長ホルモンタンパ
ク質遺伝子を大量に増産することが可能となる。
本発明のブリ（プレ）成長ホルモンを暗号化している
ブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子は、詳しくは後
述する第３図及び第４図に示すアミノ酸配列をコードす
る塩基配列は、添付図面第２図のデオキシヌクレオチド
番号96から710に至るブリ成長ホルモンタンパク質構造
遺伝子DNAに含まれる。このブリ（プレ）成長ホルモン
を暗号化している構造遺伝子は、本発明によってはじめ
て明らかにされた塩基配列をもつ。
ブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝子は、詳しくは後
述する第３図及び第４図に示すアミノ酸配列をコードす
る塩基配列は、添付図面第２図のデオキシヌクレオチド
番号96から710に至るブリ成長ホルモンタンパク質構造
遺伝子DNAに含まれる。このブリ（プレ）成長ホルモン
を暗号化している構造遺伝子は、本発明によってはじめ
て明らかにされた塩基配列をもつ。
この構造遺伝子を含むブリ成長ホルモンタンパク質構
造遺伝子DNAを切り出し、大腸菌、枯草菌、酵母、動物
細胞に組込むことによって、ブリ成長ホルモンタンパク
質を大量に生産させることが可能となり、養殖漁業等へ
の応用の道を開くものである。
造遺伝子DNAを切り出し、大腸菌、枯草菌、酵母、動物
細胞に組込むことによって、ブリ成長ホルモンタンパク
質を大量に生産させることが可能となり、養殖漁業等へ
の応用の道を開くものである。
このブリプレ成長ホルモン構造遺伝子の塩基配列は、
公表されているサケのプレ成長ホルモン構造遺伝子（S.
Sekineら、Proc.Natl.Acad,Sci.USA.82 4306（1985））
と比較すると、わずか55％の部分で相同性があり、45％
もの部分で異なっているものである。本発明で明らかに
されたブリプレ成長ホルモン遺伝子の構造は魚類ではサ
ケに次いで２番目に解明されたものであるが、それらの
構造は予想外に相違するものであることが判明した。
公表されているサケのプレ成長ホルモン構造遺伝子（S.
Sekineら、Proc.Natl.Acad,Sci.USA.82 4306（1985））
と比較すると、わずか55％の部分で相同性があり、45％
もの部分で異なっているものである。本発明で明らかに
されたブリプレ成長ホルモン遺伝子の構造は魚類ではサ
ケに次いで２番目に解明されたものであるが、それらの
構造は予想外に相違するものであることが判明した。
本発明では、今回はじめてアミノ酸配列が解明された
ブリ成長ホルモンタンパク質を得ることができた。シグ
ナルペプチドが解離した成熟型のブリ成長ホルモンタン
パク質の全構造は添付図面第３図および添付図面第４図
に示されたごとくの２種類である。
ブリ成長ホルモンタンパク質を得ることができた。シグ
ナルペプチドが解離した成熟型のブリ成長ホルモンタン
パク質の全構造は添付図面第３図および添付図面第４図
に示されたごとくの２種類である。
これらの構造は従来判明していたサケの成熟型成長ホ
ルモンのアミノ酸配列（特開昭60−214798号公報;S.Sek
ineら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82 4306（1985））と
比較すると相同の部分は68％と少なく、32％もの部分が
まったく異なるアミノ酸配列を示した。
ルモンのアミノ酸配列（特開昭60−214798号公報;S.Sek
ineら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82 4306（1985））と
比較すると相同の部分は68％と少なく、32％もの部分が
まったく異なるアミノ酸配列を示した。
本発明により全一次構造が解明されたブリ成長ホルモ
ンタンパク質は、化学合成法によっても産生が可能とな
ったものであり、その量産の生理作用機構解明および養
殖漁業に対する応用への道が開かれたものである。
ンタンパク質は、化学合成法によっても産生が可能とな
ったものであり、その量産の生理作用機構解明および養
殖漁業に対する応用への道が開かれたものである。
［実施例］ ブリ下垂体940mgをグアニジウムチオシネート溶液5ml
中にてポリトロンで破砕し、12,000回転15分と29,000回
転19時間の遠心法によって得られたRNA画分をエタノー
ル沈殿法によって洗浄した。洗浄されたRNA画分を0.1％
ソジウムドデシル硫酸溶液中で90mgのオリゴｄ（Ｔ）カ
ラムを通して54.0μｇの全ポリ（Ａ）RNAが得られた。
そのうち5.8μｇのポリ（Ａ）RNAをとり、６μｇのプラ
イマーと混合し５単位の逆転写酵素と40分間反応させ
た。反応物にデオキシヌクレオチド先端転移酵素にてｄ
（Ｃ）連鎖を19個付加してHind III処理を行なった。こ
こから10分の１量を取り、リンカーを150ng加えて反応
物を環状化し、RNaseH,DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ
で共有結合させた環状二重鎖プラスミドを得た。この全
量を２×108個の宿主大腸菌DH1株にトランスフォーム
し、10万個のプラスミド導入コロニーを得た。このうち
2,800個のコロニーについてブタ成長ホルモンcDNAのSma
IおよびPvu IIで切り出した166塩基対のプローブによ
りコロニーハイブリダイゼーションを行ない６個の陽性
コロニーを得た。６個のうち５個までは同じ長さと構造
を持つfull−lengthの相補鎖DNAを含むプラスミドを有
していたが、残りの１個は部分長の相補鎖DNAを含むプ
ラスミドであった。最も長いプラスミドの１つであるpy
GH1について全塩基配列を決定した。
中にてポリトロンで破砕し、12,000回転15分と29,000回
転19時間の遠心法によって得られたRNA画分をエタノー
ル沈殿法によって洗浄した。洗浄されたRNA画分を0.1％
ソジウムドデシル硫酸溶液中で90mgのオリゴｄ（Ｔ）カ
ラムを通して54.0μｇの全ポリ（Ａ）RNAが得られた。
そのうち5.8μｇのポリ（Ａ）RNAをとり、６μｇのプラ
イマーと混合し５単位の逆転写酵素と40分間反応させ
た。反応物にデオキシヌクレオチド先端転移酵素にてｄ
（Ｃ）連鎖を19個付加してHind III処理を行なった。こ
こから10分の１量を取り、リンカーを150ng加えて反応
物を環状化し、RNaseH,DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ
で共有結合させた環状二重鎖プラスミドを得た。この全
量を２×108個の宿主大腸菌DH1株にトランスフォーム
し、10万個のプラスミド導入コロニーを得た。このうち
2,800個のコロニーについてブタ成長ホルモンcDNAのSma
IおよびPvu IIで切り出した166塩基対のプローブによ
りコロニーハイブリダイゼーションを行ない６個の陽性
コロニーを得た。６個のうち５個までは同じ長さと構造
を持つfull−lengthの相補鎖DNAを含むプラスミドを有
していたが、残りの１個は部分長の相補鎖DNAを含むプ
ラスミドであった。最も長いプラスミドの１つであるpy
GH1について全塩基配列を決定した。
第１図は本発明のブリ成長ホルモンタンパク質構造遺伝
子導入大腸菌プラスミドの構造図、 第２図（１）〜（７）は同プラスミドの全デオキシヌク
レオチド配列図、 第３図はブリ成長ホルモンタンパク質の全アミノ酸配列
図、 第４図はブリ成長ホルモンタンパク質（その２）の全ア
ミノ酸配列図である。
子導入大腸菌プラスミドの構造図、 第２図（１）〜（７）は同プラスミドの全デオキシヌク
レオチド配列図、 第３図はブリ成長ホルモンタンパク質の全アミノ酸配列
図、 第４図はブリ成長ホルモンタンパク質（その２）の全ア
ミノ酸配列図である。
Claims (3)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列をコードするブリ成長ホ
ルモン構造遺伝子の塩基配列を備えたブリ成長ホルモン
構造遺伝子増幅プラスミド。 - 【請求項２】前記プラスミドが、ブリ成長ホルモン（yG
H）を含むブリプレ成長ホルモンをコードするブリプレ
成長ホルモン構造遺伝子塩基配列を備え、大腸菌を宿主
菌としたことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
ブリ成長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミド。 - 【請求項３】前記プラスミドが、 アンピシリン耐性遺伝子を含む大腸菌プラスミドpBR322
由来のプラスミドpSI4002と前記ブリプレ成長ホルモン
構造遺伝子とからなり、 次の制限酵素地図を備えた、3,851塩基対の環状二重鎖
の構造をしたプラスミドpyGH1であることを特徴とする
特許請求の範囲第２項記載のブリ成長ホルモン構造遺伝
子増幅プラスミド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-174385 | 1986-07-24 | ||
| JP17438586 | 1986-07-24 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8336239A Division JPH09191888A (ja) | 1986-07-24 | 1996-12-03 | ブリ成長ホルモンタンパク質 |
| JP8336238A Division JP2711326B2 (ja) | 1986-07-24 | 1996-12-03 | ブリ成長ホルモン構造遺伝子ｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63152985A JPS63152985A (ja) | 1988-06-25 |
| JP2632680B2 true JP2632680B2 (ja) | 1997-07-23 |
Family
ID=15977686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62184083A Expired - Lifetime JP2632680B2 (ja) | 1986-07-24 | 1987-07-23 | ブリ成長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2632680B2 (ja) |
-
1987
- 1987-07-23 JP JP62184083A patent/JP2632680B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63152985A (ja) | 1988-06-25 |
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