KR900004942B1 - 펩티드(peptide)의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

펩티드(peptide)의 제조방법

본 발명은 발효법에 따른 베타-인터페론(이하 β-IFN으로 약기한다) 등의 진핵세포성 생리활성 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.

근래에, 급속히 발전한 유전자 조작기술의 이용에 따라 β-IFN 등의 진핵세포성 유용 생리활성 펩티드를 코드(code)화 하는 유전자를 클로닝 (cloning)하고, 또한 그것을 미생물성 프로모터 (promoter)와 연결시켜, 미생물내에서 목적하는 생리활성 펩티드를 효율적으로 생산할 수 있게 되어있다[참조 : 티 다니구찌 등 ; Proc.Ja p.J.Acad.Ser B, 55권 464-469(1979), 일본국 특허원 소 제 56-89725호 (일본 특허 공개소 제57-89725호), 일본 특허원 소 제56-213193호 (일본 특허 공개 소 제58-110600호)]. 이와같이 하여 얻어진 재조합 플라스미드(plasmid)를 함유하는 미생물을 그의 성질에 따라 효과적으로 배양하고, 목적하는 생리활성 펩티드를 높은 수율로 발효 생산하는 기술은 극히 중요하다.

통상 균체에서 생성되는 단백질, 즉 효소의 적합한 생성조건은 반드시 균자체의 적합한 생육조건과 동일한 것은 아니고, 배양온도, pH, 통기교반(通氣攪拌)의 배양조건, 배지 (培地) 조건에 따라서 크게 변동한다. 또한 목적하는 단백질 효소가 유도형인가, 구성형인가에 따라서 그 생산방법은 상당히 다르며, 예를들면 유도형의 경우, 유도물질의 첨가조건 등에 따라, 생산량은 크게 변동한다. 또한 목적하는 단백질 효소가 불안정할 경우, 그의 안정한 생산방법에 대하여 검토할 필요가 있다.

본 발명자들은 β-IFN 등을 생산하는 재조합 플라스미드를 함유하는 미생물을 사용하여, 목적하는 생리 활성 펩티드를 높은 수율로 발효생산키 위해서, 상술한 바와 같은 여러 종류의 배양조건에 대하여 검토하여 극히 효율이 좋은 β-IFN 등의 생리활성 펩티드를 생산할 수 있는 조건을 밝혀내는데 성공하였으며, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

발명은, 진핵세포성 펩티드의 코드화 유전자, 벡터(vector) 및 프로모터로 이루어진 재조합 DNA를 함유하고 또한 그 펩티드의 생산능력을 갖춘 미생물을 배지에 배양하여 배양물중에 이 펩티드를 축적시키고, 이 배양물로부터 그 펩티드를 채취할 경우에 미생물의 최적 생육온도보다 10 내지 25℃ 낮은 온도에서 배양시키는 것을 특징으로 하는 펩티드의 제조방법을 제공한다.

현재까지 많은 생리활성 펩티드가 미생물중에서 발현되고 있지만, 그 대개의 경우, 미생물로는 대장균이 사용되고 있다. 대장균의 경우 통상 쓰이는 배양온도로서는 37℃가 대부분이고, 또한 실제로 이의 생리활성 펩티드를 생산할 경우도 37℃에서 행하고 있는 경우가 많다. 본 발명 방법에 의하면, 이의 통상 배양온도보다 10 내지 25℃ 낮은 온도, 보다 바람직하게는 15 내지 20℃ 낮은 온도에서 배양하여, 펩티드를 효율 좋게 생산할 수가 있다. 예를들면 대장균의 경우, 15 내지 30℃, 보다 바람직하게는 20 내지 25℃에서 배양하는 것이 보다 좋은 결과가 얻어진다.

본 발명의 진핵세포성 펩티드로서는 인슐린, 인터페론, 성장호르몬 등, 바람직한 예를들면 인체의 β-인터페론의 펩티드가 있다. 벡터로서는 대장균성 벡터, 고산균(枯算菌) 유래의 벡터, 효모 유래의 벡터가 사용되고 있으나 바람직하게는 대장균성 P^BR322, P^BR313, P^MB9 등이 사용된다. 프로모터로서는 lac-프로모터, pho A-프로모터, trp-프로모터 등, 바람직하게는 try-프로모터가 사용된다.

본 발명 방법의 배지로서는 숙주(宿主) 미생물의 배양에 통상 사용되는 배지가 사용된다. 일반적으로 균의 생육을 좋게 하기 위해서는 부유(富裕)배지가 좋으나, 예를 들면 프로모터로서 trp-프로모터를 사용할 경우에는 펩톤계의 배지는 바람직하지 않다.

trp-프로모터에 의해 펩티드의 발현이 제어되고 있는 경우에는, 유도물질로서 IAA를 첨가하는 것은 알려져 있다.

본 발명은 또한, 이 IAA 첨가효과를 비약적으로 향상시키는 방법을 제공한다. 즉, 미생물의 배양중 대수증식기(對數增殖期)의 후반부터 최고 증식을 나타낼 때까지, 대장균을 사용할 경우는 건조균체 농도 3 내지 30㎎/㎖의 범위에서 미생물이 증식할때, 배지에 IAA를 첨가함으로써 이 펩티드의 생산을 향상시킬 수 있다. 첨가하는 IAA는 10 내지 200㎎/ℓ의 범위에서 사용된다. 또한 펩티드의 생산을 향상시키기 위해서는 상기 IAA의 첨가후, 추가로 IAA를 연속적 혹은 간헐적으로 첨가한다. 연속적으로 첨가할때는 총량이 200㎎/ℓ을 넘지않는 농도로 첨가하고, 간헐적으로 첨가할 때는 3 내지 10회, 매회에 5 내지 50㎎/ℓ의 범위에서 첨가함이 바람직하다.

상기와 같이 배양법의 개량 즉, 저온배양, IAA의 첨가시기의 선택, IAA의 추가보충에 의한 펩티드 생산의 향상은, 일반적인 미생물에 의한 생산은 물론, DNA 재조합법을 사용하는 펩티드 생산에 있어서도 알려져 있지 않으며, 본 발명자들에 의해 처음으로 밝혀질 것이다.

다음에 본 발명의 실시예를 설명한다.

[실시예 1]

인체의 β-IFN 유전자를 trp-프로모터 (이하 ptrp로 약기한다)의 하류(下流)에 조합하고, 조성된 재조합체 플라스미드 prv-1을 함유하는 대장균 K-12주(株) HB101 즉, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)ILV-1 ATCC 39025 (일본 특허원(소) 제56-213193호, 일본 특허 공개 소 제 58-110600호)을 사용하고, 다음에 서술하는 방법으로 배양하여 인체 β-IFN의 생산성을 조사한다.

상기 균체를 LG 배지(트립톤 10g, 효모 엑기스 5g, NaCl 5g, 글루코오스 2g을 물 1ℓ에 용해시키고 NaOH로 pH를 7.0으로 만든다)에서 30℃하에, 17시간 배양한다. 이 배양액 50m1을 1ℓ의 MGC 배지 (Na₂HPO₄, 0.6%, KH₂PO₄, 0.3%, NaCl 0.5%, NH₄Cl 0.1%, 글루코오스 0.5%, 카사미노산(Casaminoiaacid) 0.5%, MgSO₄, 1mM 사이아민, 4㎎/l)을 함유하는 2ℓ용 소형 발효용기에 접종하여 배양을 한다. 또한 배양액에는 50㎎/ℓ의 농도로 암피실린(ampicillin)을 첨가한다. 750rpm 1vvm의 통기 교반조건하에서 pH를 6.5로 제어하고 15 내지 37℃의 여러 종류의 온도에서 배양을 한다. 글루코오스 농도는 글루코오스 분석기로 조사하면서 0 내지 1.0%의 범위가 되도록 공급 조절한다. 또한 카사미노산도 글코오스와 동량 공급한다.

건조균체 농도로 3㎎/㎖의 균이 생육하는 시점에서 20㎎/ℓ의 IAA(와코오 준야구샤제)를 첨가하고, 다시 12 내지 72시간 배양을 계속한다.

β-IFN을 균체로부터 추출하는 것은 다음과 같이 실시한다. 배양액 1㎖을 8,000rpm, 10분간 원심분리하여 균을 모으고, 30mM NaCl, 30mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액으로 세척한다. 세척균체를 상기 완충액으로 현탁하고, 100㎍의 리소자임 (lysozyme) 및 0.25 MEDTA 25㎕을 가하여 1㎖ 현탁액으로 만들고, 30분간 0℃에서 방치한 후, 냉동, 용해를 3회 반복하여 균체를 파괴한다. 이것을 15,000rpm 30분간 원심분리하여 상등액을 얻고, 상등액중의 β-IFN의 양을 암스트롱 방법에 의해 정량한다[암스트롱 : Appl.Microbiol, 21권, 723-725(1971)][단, 바이러스(Virus)인 경우, Vesicular Stomatitis Virus, 동물 세포인 경우 인체 양막 세포 유래의 Wish cell을 사용한다].

결과를 표 1에 표시한다.

[표 1]

표 1에서 분명한 바와같이, β-IFN 생산성은 배양온도에 따라 현저히 다르고, 20℃ 부근의 온도에서 배양함에 따라 극히 높은, β-IFN 생산성이 얻어진다

[실시예 2]

균주(菌株) ILV-1을 사용하고, 배양온도는 20℃에 고정시켜, IAA를 표 2에 표시된 시기에 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 배양조건에서 배양하여, IAA의 첨가시기에 대하여 검토한다. 첨가한 IAA 농도는 20㎎/ℓ이다. 결과를 표 2에 표시한다.

[표 2]

표 2에서 분명한 바와 같이, β-IFN 생산성은 IAA를 첨가하는 시기의 균체농도에 따라서 현저히 다르고, 대수생육기 후반부터 생육이 최고가 되는 시점에서 첨가함에 따라 극히 높은 β-IFN 생산성이 얻어진다.

[실시예 3]

균주 ILV-1을 사용하고, 배양온도 20℃에서, 건조균체 농도 3㎎/㎖의 시기에 IAA 20㎎/ℓ을 첨가하고, 일부는 그대로, 일부는 매 12시간마다 총 5회, 각 20㎎/ℓ의 농도에서 IAA를 추가 첨가하여 배양하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 배양하여, β-IFN의 생산성을 조사한다. 결과를 표 3에 표시한다.

[표 3]

Claims (5)

1. 진핵세포성 펩티드를 코드화하는 유전자, 벡터(Vector) 및 프로모터 (promotor)로 이루어진 재조합체 DNA를 함유하며, 상기 언급한 펩티드의 생산 능력을 갖는 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하여, 배양물중에 상기 펩티드를 축적시키고, 배양물로 부터 펩티드를 채취하여 상기 언급한 펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 미생물의 배양을 미생물의 최적 생육온도보다 10 내지 25℃ 낮은 온도에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 프로모터가 트립토판 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물의 배양주기중 대수증식기의 후반부터 최고증식을 나타낼 때까지 배지에 3-인돌 아크릴산(3-indole acrylic acid)(이하 IAA로 약기한다)을 첨가함을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, IAA 첨가후, 다시 IAA를 연속적 또는 간헐적으로 첨가함을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 펩티드가 인체 β형 인터페론의 펩티드임을 특징으로 하는 방법.