EA013263B1

EA013263B1 - Способ получения интерферона-бета

Info

Publication number: EA013263B1
Application number: EA200701105A
Authority: EA
Inventors: Санджеев К. Мендиратта; Вибхор Сарасват; Дхармедра Чудасама
Original assignee: Кадила Хелзкэр Лимитед
Priority date: 2004-12-20
Filing date: 2005-12-19
Publication date: 2010-04-30
Also published as: KR20070091334A; EP1828242B1; ZA200704732B; BRPI0518491A2; DK1828242T3; US20090215121A1; WO2006067804A3; EP1828242A2; CA2591235C; CA2591235A1; AU2005317574B2; ATE501168T1; EA200701105A1; JP2008523801A; US7923220B2; AU2005317574A1; WO2006067804A2; KR101128055B1; DE602005026854D1; NZ555979A

Abstract

Настоящее изобретение относится к новому способу получения интерферона-бета с повышенным выходом путем ферментации.

Description

Настоящее изобретение относится к новому способу получения интерферона-бета с улучшенным выходом ферментации.

Описание предшествующего уровня техники

У людей были идентифицированы 3 основных типа интерферонов: альфа-, бета- и гаммаинтерфероны. Они продуцируются разнообразными клетками после воздействия вирусов, митогенов, полинуклеотидов и т.д. Они обладают противовирусными, антипролиферативными и иммуномодулирующими свойствами. ΙΡΝ-β используется в качестве эффективного лечения по поводу рассеянного склероза [СогЬоу ΙΚ е! а1., Сипси! ТгеаИпеШ Орйопк ίη №иго1оду, 5, 35-54 (2003)], гепатита В и гепатита С.

Бетасерон, аналог человеческого ΙΡΝ-β, где серин методами генной инженерии был замещен цистеином в положении 17, известен как ΙΡΝ-β 1Ь (патент США № 4588585). Молекула представляет собой небольшой полипептид из 165 аминокислот с одной дисульфидной связью и продуцируется в виде не гликозилированного белка. Гликозилированный вариант ΙΡΝ-β, известный как ΙΡΝ-β 1а, имеет углеводородную цепь в положении 80 и экспрессирован в клетках яичников китайских хомячков (СНО) |Сопгаб1 е! а1., 1. Бю1. Сйет., 262, 14600-5 (1987); Кауаиа е! а1., 1. Бю1. Сйет., 263, 17508-15 (1988); Ой е!. а1., Бю!есйпо1. Рго§., 21, 1154-64 (2005); И8 5795779 (МсСогтк е! а1.); И8 5554513 (Веуе1 е! а1.)].

ΙΡΝ-β первоначально получали индукцией лейкоцитов обработкой их вирусами. Но терапевтическое применение интерферона-β, полученного таким образом, сомнительно ввиду высокой вероятности присутствия в таких препаратах различных загрязняющих материалов (например, вирусов). Рекомбинантная технология сделала возможным получение ΙΡΝ-β, который лишен вирусного загрязнения. Нативный ΙΡΝ-β представляет собой гликопротеид, и о его получении в клетках млекопитающих, насекомых и дрожжей было сообщено соответственно в публикациях Мап!е1 е! а1., №1Шге 297: 128 (1982); Ойпо е! а1., Νι.κ1 Ааб. Век. 10: 967 (1982); и 8тйй е! а1., Мо1. Се11. Бю1. 3: 2156 (1983).

В патенте США № 5795779 (МсСогтюк е! а1.) раскрыто крупномасштабное получение ΙΡΝ-β из рекомбинантных клеток СНО. В патенте США № 5554513 (Кеуе1 е! а1.) раскрыты 2 подтипа ΙΡΝ-β и описаны способы получения его в клетках СНО. Но все промышленные способы культивирования клеток животных связаны с техническими трудностями, подобными более длительному времени осуществления способа, потребности в поддержании жестких условий культивирования, высокой стоимости культуральных сред и т. д.

Также было показано, что гликозилирование не играет роли в биологической активности белка [ТашдисЫ, е! а1., Оепе 10, 11-15 (1980); Е. Кшдй! 1т., Ргос. №!1. Асаб. 8ск, 73, 520 (1976); Е. Кшдй! 1т. и Ό. Гайеу, 1. БИегГегоп Век. 2 (3), 421 (1982)], ввиду этого снижая преимущество проведения получения у обычно используемого хозяина, Е.сой. Этой технологией были получены различные рекомбинантные белки у Е.со11 [8атакиа! е! а1. ГЕМ8 М1стоЬю1оду Бей., 179, 367-73 (1999); Но1оиасйик&Вийокк, Рто!ет Ехрг. Рипк. 6, 588-96 (1995); К1т е!. а1., Бю!есйпо1.&Бюепд., 69, (2000); К1т е! а1., Бюргосекк апб Бюкук!етк Епдтееппд, 24 (2001); 8агакиа! е!. а1. Бю!есйпо1. Бей., 22, 261-5 (2000); Бее е!. а1., ГЕМ8 М1стоЬю1оду Бей., 195, 127-132 (2001); 8атакиа! е!. а1. Бюсйет1к!гу, 41, 15566-77 (2002); \7апд е! а1., СЫп. 1. Бю!есйпо1. 11, 45-81 (1995)]. ΙΡΝ-β был клонирован и экспрессирован в Е.сой (Ташдисй1, е! а1., Оепе 10, 11-15 (1980).

В ЕР 0048970 (Ооеббе1 е! а1.) описана микробная продукция интерферона зрелых человеческих фибробластов.

Как и для любого терапевтического белка, желательно получать высокие уровни интерферона-β в коммерческих целях. В ЕР 0036776 (К1е1б е! а1.) раскрыты новые векторы на основе системы промотера-оператора триптофана для эффективного получения гетерологичного белка в бактериях. В патенте США № 4686191 (йой е! а1.) раскрыты способы получения эффективной экспрессии интерферона-β в Е.сой путем использования улучшенных векторов с промотером ίτρ для увеличения эффективности синтеза белка. В патенте США № 4499188 (Копгаб е! а1.) раскрыто решение проблемы мониторинга уровней репрессора во время культивирования, когда промотор !гр используется для получения интерферона-β. М|/икат1 е! а1. в патенте США № 4746608 предлагают способ культивирования рекомбинантного микроорганизма при температуре на 10-25°С ниже, чем оптимальная температура роста, для получения высокого выхода интерферона-β. Беп-Бакка! е! а1. в патенте США № 4656132 раскрывают решение проблемы более низких выходов интерферона-β добавлением эффективного количества растворимого в воде алканола с 1-4 атомами углерода и/или смеси аминокислот, которая поддерживает бактериальный рост во время поздней фазы культивирования. Соикепк е! а1. в патенте США № 5866362 предложили получение интерферона-β в виде белковых агрегатов выращиванием клеток-хозяев в среде, включающей эффективное количество Си⁺⁺, так, что они образуют тельца включений в клетке-хозяине, из которой выделяется и очищается белок. Но ни один из способов не мог достичь удовлетворительных уровней интерферона-β. Ввиду гидрофобной природы интерферона-β синтезированный белок препятствует клеточному росту и, таким образом, получение интерферона-β на значимо высоких уровнях не достигается.

- 1 013263

Όοτίη с1 а1. в патенте США № 5814485 раскрывают определенные условия, которые увеличивают экспрессию гидрофобного полипептида, подобного интерферону-β, в трансформированных клеткаххозяевах Решающими условиями изобретения (патент США № 5814485) являются концентрация ионов калия не более чем 120 мМ, и/или концентрация ионов натрия не более чем 40 мМ, и/или рН от 4,8 до 6,8 во время индукции продукции белка.

Настоящее изобретение раскрывает уровень продукции интерферона-β, аналогичный более высокому уровню продукции интерферона-β, раскрытый в патенте США № 5814485, индукцией продукции белка в условиях, которые зависят от поддержания низких уровней концентраций ионов калия и натрия в продуктивной среде. Это достигается тщательным выбором источника азота и других питательных веществ/добавок перед фазой продукции или во время нее.

Краткое описание сущности изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения рекомбинантного интерферона-β в больших количествах, используя селективные условия культивирования.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет высокие уровни интерферона-β при уровнях концентрации ионов К⁺ и Να', которые выше, чем уровни, рекомендовавшиеся в предшествующем уровне техники, тщательным выбором источника азота и других питательных веществ в продукционной и/или в предпродукционной среде.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение предоставляет высокие уровни интерферона-β при рН, более высоком, чем рекомендовано в предшествующем уровне техники, для получения высокого выхода интерферона-β.

В еще одном аспекте настоящее изобретение получает значимо высокие уровни ΙΡΝ-β с использованием способа ферментации, при котором условия культивирования более эффективны по затратам, чем способы предшествующего уровня техники.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан эффект различных источников азота на уровень экспрессии ΙΡΝ-β. Эксперименты проводили во встряхиваемых колбах, где серые столбики указывают на уровни экспрессии, полученные комплексными и неорганическими источниками азота, а именно ацетатом аммония, хлоридом аммония, сульфатом аммония, ферментным гидролизатом казеина, переваром желатина, триптоном и мочевиной (10 г/л во время добавления индуктора), а черные столбики указывают на оптическую плотность (при 600 нм) в соответствующей точке времени. Все величины получены из образцов через 8 ч после индукции.

На фиг. 2 показан эффект различных концентраций выбранных источников азота на уровень экспрессии ΙΡΝ-β. Эксперименты проводили во встряхиваемых колбах, где уровни экспрессии показаны при различных концентрациях (10, 20 и 30 г/л, во время добавления ΙΡΤΟ (изопропилтиогалактозида)) комплексных источников азота: ферментного гидролизата казеина (темно-серые столбики), перевара желатина (светло-серые столбики) и триптона (черные столбики).

На фиг. 3 показан эффект тиамина с различными источниками азота и калия на уровень экспрессии ΙΡΝ-β. Эксперименты проводили во встряхиваемых колбах, где сравнение уровня экспрессии показано между триптоном, переваром желатина и ферментным гидролизатом казеина с тиамином (серые столбики) и без тиамина (черные столбики) (6-7 г/л во время добавления индуктора).

На фиг. 4 показан эффект комбинации триптона с тиамином и высокой концентрации катиона натрия на уровень экспрессии ΙΡΝ-β. Эксперименты проводили в ферментерах, где сравнение уровней экспрессии было показано между культуральной средой, включающей тиамин и высокий уровень катиона натрия (60 мМ) (·), и культуральной средой без тиамина и высоким уровнем катиона натрия (Δ).

На фиг. 5 показана аминокислотная последовательность ΙΡΝ-β (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1).

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новому способу ферментации для получения интерферона-β при высоких уровнях экспрессии. Были изучены различные условия культивирования для высокого уровня продукции белка интерферона-β с использованием трансформированных ЕксйепсЫа сой, ведущие к альтернативному, высокоэффективному способу получения. Настоящее изобретение раскрывает условия культивирования для повышенного выхода продукта. Настоящее изобретение описано в деталях ниже.

Можно использовать любой полипептид интерферона-β (также именуемый здесь «ΙΡΝ-β»). Термин «интерферон-β» и «ΙΡΝ-β» относится к нативному ΙΡΝ-β, его мутеинам, фрагментам, гибридам, аналогам и производным, проявляющим биологическую активность или активность связывания с рецепторами, составляющую по меньшей мере 60% нативного ΙΡΝ-β, или сохраняющим по меньшей мере 80% идентичность аминокислот с 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 (аминокислотной последовательностью человеческого ΙΡΝ-β).

Ген ΙΡΝ-β, используемый в настоящем изобретении, представляет собой мутированную форму нативного гена, где 17-я аминокислота, серин, была замещена на цистеин методами генной инженерии в соответствии с патентом США № 4588585. Этот мутированный аналог человеческого ΙΡΝ-β известен как

- 2 013263

ΙΕΝ-β 1Ь. Источник гена нативного ΙΕΝ-β, используемого в настоящем изобретении, представляет собой линию клеток легочных фибробластов человека, МКС 5, от N008, Рипе, Ιηάία. Описанная выше мутация была внесена в этот ген с использованием стандартных методик молекулярной биологии, описанных в предшествующем уровне техники.

Подходящие клетки-хозяева, предпочтительно ЕксйепсШа со11, трансформируются подходящим вектором экспрессии, включающим кодирующую последовательность ΙΕΝ-β и подходящий промотор, выбранный из 17, 1ас и аналогичных промоторов, наряду с другими компонентами вектора, используя методики трансформации, хорошо известные в данной области. Штамм ЕксйепсЫа со11 для настоящего изобретения выбран из группы, включающей ЕксйепсШа со11 ВЬ21 (ΌΕ3) и ее производные. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой ЕксйепсШа сой ВЬ21 (ΌΕ3), которая депонирована в АТСС под номером АТСС 47092. Источник ЕксйепсШа со11 ВЬ21 (ОЕ3), используемого в настоящем изобретении, является 81га1адепе, И8А.

Трансформированные клетки-хозяева первоначально культивировали в условиях для роста при циклической ферментации. Культуральные среды, используемые в способе по настоящему изобретению, включают источники углерода и энергии, выбранные из группы, включающей глюкозу, глицерин, фруктозу, мальтозу, галактозу и им подобные или их смеси, источник азота, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, триптона, пепетона, ферментного гидролизата казеина, гидролизата казеина соевых бобов, желатина и им подобных, подходящие соли/питательные вещества, выбранные из группы, состоящей из лимонной кислоты, хлорида калия, хлорида натрия, сульфата магния, диаммонийгидрофосфата, дигидрофосфата калия, бутирата натрия, тиамина, глицина и хлорида цинка. рН поддерживается на уровне примерно 5-8. Температура поддерживается на уровне примерно 30-40°С. Другие условия ферментации, подобные аэрации и перемешиванию, инокуляции, времени инокуляции и т.д., выбираются как обычно специалистом в данной области.

Ограничиваемая субстратом циклическая ферментация (однозагрузочная для производства партии) начинается, как только концентрация субстрата в культуральной среде окажется на уровне примерно 0,5 г/л или менее. После достижения плотности клеток 1-30 г/л сухой клеточной массы и концентрации глюкозы менее чем 0,5 г/л проводили добавление предпродукционной среды. Предпродукционная среда включает источник азота, выбранный из группы, содержащей комплексные источники азота, такие как триптон, ферментный гидролизат казеина (СЕН), гидролизат казеина соевых бобов, перевар желатина и им подобных, их комбинации друг с другом и их комбинации с дрожжевым экстрактом, подходящие соли/питательные вещества, выбранные из группы, состоящей из лимонной кислоты, хлорида калия, хлорида натрия, сульфата магния, диаммонийгидрофосфата, дигидрофосфата калия, бутирата натрия, тиамина, глицина и хлорида цинка, подходящие антибиотики, подобные ампициллину, канамицину и т.д., которые выбираются в соответствии с требованиями способа. рН поддерживается на уровне примерно 6,3-8, предпочтительно на уровне рН 6,5-7,0, и температура поддерживается на уровне примерно 2540°С, предпочтительно на уровне примерно 37°С. Общая концентрация К⁺ в культуральной среде больше чем 120 мМ, и концентрация №1' больше чем 40 мМ, предпочтительно в диапазоне 60-80 мМ. Источник углерода можно не добавлять к предпродукционной среде. Индукция продукции белка осуществляется после добавления предпродукционной среды. Подходящий индуктор можно добавить в виде одной загрузки, множества загрузок или непрерывным образом. Непрерывную подачу продукционной среды (в режиме подачи для производства партии) начинают сразу после добавления индуктора. Продукционная среда включает источник углерода в дополнение к ингредиентам предпродукционной среды. Подходящий источник углерода можно выбрать из группы, состоящей из глицерина, глюкозы, фруктозы, мальтозы, галактозы и им подобных или их смесей. Предпочтительным источником углерода по настоящему изобретению является глюкоза. рН поддерживается на уровне примерно 6,3-8,0, предпочтительно на уровне рН 6,5-7,0, и температура поддерживается на уровне примерно 25-40°С, предпочтительно на уровне примерно 37°С. Все другие условия ферментации выбираются в соответствии с принципами, известными в предшествующем уровне техники. В течение продукционной фазы ферментации общая концентрация К⁺ в культуральной среде больше чем 120 мМ и концентрация Να' больше чем 40 мМ. Через 5-24 ч культуральную среду удаляют и подвергают переработке ниже по потоку в соответствии с методиками, описанными в данной области. Способ по настоящему изобретению приводит к получению гидрофобных белков, подобных ΙΕΝ-β с большим выходом (уровень экспрессии в диапазоне от 4 до 28% общего клеточного белка), по данным денситометрической оценки с использованием полос белка, полученных способом 808-РАСЕ (электрофорезом на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия).

Приведенные ниже примеры дополнительно описывают изобретение. Эти примеры представлены в качестве иллюстраций и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение.

Пример 1. Экспрессия ΙΕΝ-β в средах, включающих ферментный гидролизат казеина, натрий и тиамин.

Культуру клеток Е.со11 ВЬ21 (ЭЕ3), трансформированных геном ΙΕΝ-β, выращивали в среде Ешта-Вегйш (рН 7,0) с ампициллином (100 мг/л) в течение 14 ч при 37°С и 200 об/мин в инкубаторе с перемешиванием. Затем биомассу в асептических условиях удаляли центрифугированием при 7135/д в течение 15 мин при 20°С и в асептических условиях повторно суспендировали в продукционной среде.

- 3 013263

Состав среды, использованной для получения ΙΡΝ-β, был следующий.

Концентрация во время Компонент индукции

Глюкоза	5 г/л
Ферментный гидролизат казеина	20 г/л
Катион натрия	60 мМ
Катион калия	90 мМ
Тиамин	7 г/л
Ампициллин	100 г/л

Ген ΙΡΝ-β в последующем индуцировали добавлением стерилизованного через фильтр ΙΡΤΟ (2 мМ) при 37°С. Температуру во время продукционной фазы поддерживали на уровне 37°С и рН был в диапазоне от 5,3 до 7,2. Через каждые 2 ч брали образцы и рН доводили до примерно 7,0. Уровень экспрессии ΙΡΝ-β в образце через 8 ч после инкубации составлял 10,49%, по данным денситометрического измерения с использованием полос белка, полученных при помощи δΌδ-ΡΛΟΕ.

Пример 2. Экспрессия ΙΡΝ-β в средах, включающих триптон, натрий и тиамин.

Эксперимент выполняли таким же образом, как в примере 1, за исключением наличия триптона в качестве источника азота при получении среды, имеющей следующий состав.

Концентрация во время Компонент индукции

Глюкоза	5 г/л
Триптон	20 г/л
Катион натрия	60 мМ
Катион калия	90 мМ
Тиамин	7 г/л
Ампициллин	100 г/л

Ген ΙΡΝ-β в последующем индуцировали добавлением стерилизованного через фильтр ΙΡΤΟ (2 мМ) при 37°С. Температуру во время продукционной фазы поддерживали на уровне 37°С и рН был в диапазоне от 5,3 до 7,2. Через каждые 2 ч брали образцы и рН доводили до ~7,0. Уровень экспрессии ΙΡΝ-β в образце через 8 ч после инкубации составлял 7,15%.

Пример 3. Влияние различных источников азота на уровень экспрессии на уровне встряхиваемой колбы.

Культуру клеток Е.сой ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированных геном ΙΡΝ-β, выращивали в среде Ешта-ВетНт (рН 7,0) с ампициллином (100 мг/л) в течение 14 ч при 37°С и 200 об/мин в инкубаторе с перемешиванием. Затем биомассу в асептических условиях удаляли центрифугированием при 7135/д в течение 15 мин при 20°С и в асептических условиях повторно суспендировали в продукционной среде. Состав среды, использованной для получения ΙΡΝ-β, был следующий.

Концентрация во время

Компонент индукции

Глюкоза	5 г/л
Источник азота	10 г/л
Катион калия	90 мМ
Ампициллин	100 г/л.

Использованными источниками азота в эксперименте были ацетат аммония, хлорид аммония, сульфат аммония, ферментный гидролизат казеина, перевар желатина, триптон и мочевина. Ген ΙΡΝ-β в последующем индуцировали добавлением стерилизованного через фильтр ΙΡΤΟ (2 мМ) при 37°С. Температуру во время продукционной фазы поддерживали на уровне 37°С и рН был в диапазоне от 5,3 до 7,2. Через каждые 2 ч брали образцы и рН доводили до ~7,0. Уровни экспрессии ΙΡΝ-β в образцах через 8 ч после инкубации показаны на фиг. 1.

- 4 013263

Пример 4. Зависимость уровня экспрессии от концентрации источников азота.

Испытывали влияние различной концентрации источников азота на продукцию интерферона-β (фиг. 2). Все другие параметры были такими же, как параметры, использованные для примера 1, за исключением концентраций Να' и тиамина, которые здесь не испытывались. Состав среды, использованной для получения ΙΡΝ-β, был следующий.

Компонент

Глюкоза

Источник азота

Катион натрия

Катион калия

Тиамин

Ампициллин

Концентрация во время индукции г/л

10-30 г/л мМ мМ г/л

100 г/л.

Ген ΙΡΝ-β в последующем индуцировали добавлением стерилизованного через фильтр ΙΡΤΟ (2 мМ) при 37°С. Температуру во время продукционной фазы поддерживали на уровне 37°С, и рН был в диапазоне от 5,3 до 7,2. Через каждые 2 ч брали образцы и рН доводили до ~7,0.

Результаты уровня экспрессии ΙΡΝ-β в образцах через 8 ч после индукции приведены в табл. 1. Таблица 1

Источник азота	Концентрация (г/л)	Уровень экспрессии ΙΓΝ-бета (%)
Перевар желатина	10	4,83
20	5, 96
30	5,81
Триптон	10	3,07
20	3,32
30	3,25
Ферментный гидролизат казеина	10	3,25
20	5,02
30	8,10

Пример 5. Влияние триптона на уровень экспрессии ΙΡΝ-β.

Посевную культуру клеток Е.еой ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированных геном ΙΡΝ-β, инокулировали в ростовую среду следующего состава.

Концентрация перед

Компонент инокуляцией

КН₂РО₄	13,3	г/л
(ЫН₄) ₂НРО₄	4,0	г/л
Дрожжевой экстракт	1,0	г/л
Глюкоза	10,0	г/л
Лимонная кислота	1,7	г/л
Мд8О₄.7Н₂О	1,2	г/л
Раствор микроэлементов	20, 0	мл/л
Ампициллин	100	мг/л

- 5 013263

Раствор микроэлементов.

Компонент

РеС1₃. 6Н₂О

2пС1₃.4Н_гО

СоС1₂.6Н₂О

Ыа₂Мо0₄. 2Н₂О

СаС1₂.2Н₂О

СиС1₂

Н₃ВО₃

Концентрация

0,162 г/л

0,0144 г/л

0,12 г/л

0,012 г/л

0,006 г/л

1,9 г/л

0,5 г/л

Добавление следующей среды при ограничиваемом субстратом однозагрузочном режиме привело к большому увеличению биомассы.

Компонент

Глюкоза

МдЗО₄.7Н₂О

Раствор микроэлементов

Ампициллин

Концентрация

700,0 г/л 20 г/л мл/л

1,5 г/л

В фазе роста использовали гидроксид аммония в качестве регулятора рН для поддержания рН в диапазоне от 6,8 до 7,0. Температуру поддерживали на уровне 37°С. После достижения оптической плотности примерно 50 ЛИ (произвольных единиц) (при 600 нм) добавляли предпродукционную среду для получения следующих концентраций отдельных компонентов указанной среды в культуральном бульоне.

Компонент Концентрация

Триптон 10 г/л

Катион калия 90 мМ

Экспрессию гена ΙΕΝ-β индуцировали добавлением стерилизованного через фильтр раствора 1РТС (2 мМ) в культуральный бульон. Следующую продукционную среду в последующем добавляли для увеличения уровня экспрессии ΙΕΝ-β.

Компонент

Глюкоза

МдЗО₄.7Н_аО

Триптон

Катион калия

Ампициллин

Концентрация

270, 0' г/л ” г/л г/л мМ г/л

В продукционной фазе использовали гидроксид аммония в качестве регулятора рН для поддержания рН 7,0. Температуру поддерживали на уровне 37°С. По данным определения 8Ό8-ΡΑΟΕ, уровень экспрессии ΙΕΝ-β в образце через 12 ч после индукции составил 15,24%.

Пример 6. Влияние ферментного гидролизата казеина на уровень экспрессии ΙΕΝ-β.

Эксперимент выполняли таким же образом, как в примере 5, за исключением того, что в примере 6 вместо применения триптона в качестве главного источника азота использовали ферментный гидролизат казеина. Конечные концентрации ферментного гидролизата казеина были 10 и 20 г/л соответственно в прединдукционной и продукционной средах. По данным определения при помощи 8Ό8-ΡΑΟΕ уровень экспрессии ΙΕΝ-β в образце через 12 ч после индукции составил 24,76%.

Пример 7. Влияние комбинации трипсина и дрожжевого экстракта на уровень экспрессии ΙΕΝ-β.

Эксперимент выполняли таким же образом, как в примере 5, за исключением того, что в примере 7 вместо применения дрожжевого гидролизата казеина в качестве главного источника азота использовали комбинацию триптона и дрожжевого экстракта. Конечные концентрации триптона и дрожжевого экстракта в культуральном бульоне после добавления прединдукционной среды были соответственно 10 и 5 г/л. Концентрации триптона и дрожжевого экстракта в продукционной среде также составляли соответственно 10 и 5 г/л. По данным определения 8Ό8-ΡΑΟΕ уровень экспрессии ΙΕΝ-β в образце через

- 6 013263

12,5 ч после индукции составил 7,82%.

Пример 8. Влияние различных концентраций тиамина на уровень экспрессии.

Культуру клеток Е.соН ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированных геном ΙΕΝ-β, выращивали в среде Бипа-ВсгЩи (рН 7,0) с ампициллином (100 мг/л) в течение 14 ч при 37°С и 200 об/мин в инкубаторе с перемешиванием. Затем биомассу в асептических условиях удаляли центрифугированием и повторно суспендировали в продукционной среде. Состав продукционной среды был следующим.

Компонент

Глюкоза

Перевар желатина

Тиамин

Катион калия

Ампициллин

Концентрация во время индукции г/л г/л

0-12 г/л мМ

100 г/л.

Ген ΙΕΝ-β в последующем индуцировали добавлением стерилизованного через фильтр ΙΡΤΟ (2 мМ) при 37°С. Температуру во время продукционной фазы поддерживали на уровне 37°С. Через каждые 2 ч брали образцы и рН доводили до ~7,0. Уровни экспрессии ΙΕΝ-β в образцах через 8 ч после инкубации (фиг. 2) показаны в табл. 2.

Таблица 2

Пример 9. Влияние комбинации тиамина с различными источниками азота на уровень экспрессии.

Культуру клеток Е.соН ВЬ21 (ΌΕ3), трансформированных геном ΙΕΝ-β, выращивали в среде Бипа-ВсгШи (рН 7,0) с ампициллином (100 мг/л) в течение 14 ч при 37°С и 200 об/мин в инкубаторе с перемешиванием. Затем биомассу в асептических условиях удаляли центрифугированием и повторно суспендировали в продукционной среде. Состав продукционной среды был следующим.

Концентрация во время

Компонент индукции

Глюкоза	5 г/л
Источник азота	20 г/л
Тиамин	6-7 г/л
Катион калия	90 мМ
Ампициллин	100 г/л.

Влияние тиамина контролировали для трех источников азота, т. е. перевара желатина, ферментного гидролизата казеина и триптона. Ген ΙΕΝ-β в последующем индуцировали добавлением стерилизованного через фильтр ΙΡΤΟ (2 мМ) при 37°С. Температуру во время продукционной фазы поддерживали на уровне 37°С. Через каждые 2 ч брали образцы и рН доводили до ~7,0. Уровни экспрессии ΙΕΝ-β в образцах через 8 ч после инкубации (фиг. 3) показаны в табл. 3.

- 7 013263

Таблица 3

Источник азота	Концентрация тиамина (г/л)	Уровень экспрессии ΙΕΝ-бета (%)
Перевар желатина	0	5,96
6	8,33
Ферментный гидролизат казеина	0	5,02
7	10,49
Триптон	0	3,32
7	5,52

Пример 10. Влияние катиона натрия на уровень экспрессии.

Культуру клеток Е.еой ВЬ21 (ΌΕ3). трансформированных геном ΙΕΝ-β, выращивали в среде Ьшта-Ветш (рН 7.0) с ампициллином (100 мг/л) в течение 14 ч при 37°С и 200 об/мин в инкубаторе с перемешиванием. Затем биомассу в асептических условиях удаляли центрифугированием при 7135хд в течение 15 мин при 20°С и в асептических условиях повторно суспендировали в продукционной среде. Состав среды. использованной для получения ΙΕΝ-β. был следующий.

Компонент

Глюкоза

Триптон

Тиамин

Катион калия

Катион натрия

Ампициллин

Концентрация во время индукции г/л г/л г/л

100 мМ мМ, ИЛИ <40 ММ

100 г/л.

Ген ΙΕΝ-β в последующем индуцировали добавлением стерилизованного через фильтр 1РТС (2 мМ) при 37°С.

Температуру во время продукционной фазы поддерживали на уровне 37°С и рН - в диапазоне от 6.62 до 7.52. Через каждые 2 ч брали образцы и рН доводили до ~7.0. По данным определения при помощи δΌδ-ΡΛΟΕ уровни экспрессии ΙΕΝ-β в образцах через 8 ч после индукции показаны в табл. 4.

Таблица 4 Концентрация катионов Уровень экспрессии ΙΓΝнатрия Оета (%)

Среда, содержащая 60 мМ

7,15% натрия

Среда, содержащая менее

6,02% чем 40 мМ натрия

Пример 11. Влияние комбинации тиамина. высокой концентрации катиона натрия и триптона на уровень экспрессии.

Посевную культуру клеток Е.еоН ВЬ21 (ΌΕ3). трансформированных геном ΙΕΝ-β. инокулировали в ростовую среду следующего состава.

Компонент Концентрация перед инокуляциеи

КН₂Р0₄	13,3	г/л
(ЫН₄)₂НРО₄	4,0	г/л
Дрожжевой экстракт	1,0	г/л
Глюкоза	10,0	г/л
Лимонная кислота	1,7	г/л
МдЗО₄.7Н₂О	1,2	г/л
Раствор микроэлементов	20,0	мл/л
Ампициллин	100	мг/л

- 8 013263

Раствор микроэлементов.

Компонент

РеС1₃.6Н_гО

2пС1₃.4Н₂О

СоС1₂.6Н₂О

Ыа₂Мо0₄. 2Н₂О

СаС1₂.2Н₂О

СиС1₂

Н₃ВОз

Концентрация ~ 0,162 г/л

0,0144 г/л

0,12 г/л

0,012 г/л

0,006 г/л

1,9 г/л

0,5 г/л

Компонент

Глюкоза

Мд5О₄.7Н₂О

Раствор микроэлементов

Ампициллин

Концентрация 700,0 г/л г/л мл/л

1,5 г/л

В фазе роста использовали гидроксид аммония в качестве регулятора рН для поддержания рН в диапазоне от 6,8 до 7,0. Температуру поддерживали на уровне 37°С. После достижения оптической плотности примерно 50 ЛИ (при 600 нм) добавляли предпродукционную среду.

Среда А. Получение без высокого содержания катиона натрия и тиамина.

Предпродукционная среда.

Компонент

Триптон

Тиамин

Калий

Натрий

Концентрация в культуральном бульоне г/л г/л

Конечная концентрация в бульоне 90 мМ

Без добавления натриевой соли

Экспрессию гена ΙΡΝ-β индуцировали добавлением в асептических условиях стерилизованного через фильтр ΙΡΤΟ (2 мМ).

Продукционная питающая среда.

Компонент Концентрация

Глюкоза	270,0 г/л
Триптон	20 г/л
Тиамин	7 г/л
МдеО₄.7Н₂О	1 г/л
Калий	90 мМ
Натрий	Без добавления натриевой соли
Ампициллин	1 г/л

В продукционной фазе использовали гидроксид аммония в качестве регулятора рН для поддержания рН 7,0. Температуру поддерживали на уровне 37°С.

- 9 013263

Среда В. Получение с высоким содержанием катиона натрия и тиамина. Предпродукционная среда.

Компонент Концентрация в культуральном бульоне

Триптон 10 г/л

Тиамин 1 г/л

Калий Конечная концентрация в бульоне 90 мМ

Натрий Конечная концентрация в бульоне 60 мМ

Продукционная питающая среда.

Компонент Концентрация

Глюкоза	270,0 г/л
Триптон	20 г/л
Тиамин	7 г/л
МдЗО₄.7Н₂О	1 г/л
Калий	90 мМ
Натрий	60 мМ
Ампициллин	1 г/л

В продукционной фазе гидроксид аммония использовали в качестве регулятора рН для поддержания рН 7,0. Температуру поддерживали на уровне 37°С. Общая концентрация катионов натрия и калия в бесклеточных средах во время продукционной фазы была соответственно 109-101+10,9-10,1 мМ и 163-118+16,3-11,8 мМ. Измерения содержания катионов калия и натрия в бесклеточном культуральном бульоне производили, используя спектры атомного поглощения.

Динамика увеличения уровней экспрессии показана на фиг. 4. Уровни экспрессии ΙΡΝ-β, полученные в средах А и В, составили соответственно 15,24 и 27,32% по данным денситометрического измерения с использованием полос белка, полученных при помощи δΌδ-ΡΛΟΕ. Выход ΙΡΝ-β в среде В составил 2 г/л.

Преимущества способа.

1. Способ по настоящему изобретению дает более высокую экспрессию ΙΡΝ-β, чем способы предшествующего уровня техники.

2. Способ по настоящему изобретению коммерчески более жизнеспособен, поскольку нет необходимости жесткого контроля концентрации натрия или калия в среде для поддержания ее на очень низком уровне.

3. Способ по настоящему изобретению легче выполнять, чем способы предшествующего уровня техники.

4. Весь способ по настоящему изобретению очень эффективен по затратам.

- 10 013263

Список последовательностей <110 > САОТЬА НЕАЬТНСАР.Е ЫМ1ТЕР

МепсНгаСОа, Зап]ееу Китаг ЗагазмаЬ, УгЬЬог СНиЦазата, РЪагтепйга

<120>	СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКИХ УРОВНЕЙ ИНТЕРФЕРОНА-БЕТА
<130>	2КС-ВТ-004
<160>	1
<170>	РаЬепЫп νβΐΈίοη 3.3

<210> 1 <211> 166 <212 > РЕТ <213> ЕзсЬег1сЫа соМ <400> 1

МеЬ 1

£ег

Туг

Азп

Ьеи 5

Ьеи

С1у

РЬе 10

Ьеи

С1п

Агд

Зег

Азп

РЬе 15

С1п

Суз

С1п

Ьуз

Ьеи 20

Ьеи

Тгр

51п

Ьеи

Азп 25

61у

Агд

Ьеи

131и

Туг 30

Суз

Ьеи

Ьуз

Азр

Агд 35

меь

Азп

РЬе

Азр

11е 40

Рго

С1и

<31и

11е

Ьуз 45

<31п

Ьеи

С1п

О1п

РЬе 50

С1п У

Ьуз

С1и

Азр

А1а 55

А1а

Ьеи

ТЬг

11е

Туг 60

С1и

меь

Ьеи

О1п

АЗП 65

11е

РЬе

А1а

Ьеи РЬе 70

Агд

О1п

Азр

Зег Зег 75

Зег

ТЬг

01у

Тгр Азп 80

С1и

ТЬг

11е

Уа1

61и 85

Азп

Ьеи

А1а

Азп 90

Уа1

Туг

Н1з

С1п

11е 95

Азп

ΗΪ3

Ьеи

Ьуз

ТЬг 100

Уа1

Ьеи

О1и

С1и

Ьуз 105

Ьеи

<51и

ьуз

С1и

Азр 110

РЬе

ТЬг

Агд

<31у

Ьуз 115

Ьеи

МеЬ

Зег

Ьеи 120

Н13

ΗΪ3

Ьуз

Агд

Туг 125

Туг

О1у

Агд

11е

Ьеи 130

Н1з

Туг

Ьеи

Ьуз

А1а 135

Ьуз

О1и

Туг

Зег

Ηίε 140

Суз

А1а

Тгр

ТЬг

Не Уа1 Агд Уа1 С1и 11е Ьеи Агд Азп РЬе Туг РЬе 11е Азп Агд Ьеи 145 150 155 160

ТЬг О1у Туг Ьеи Агд Азп

165

- 11 013263

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения интерферона-бета (ΙΕΝ-β) в клетке-хозяине Е^сНспсЫа сой. включающий:

a) обеспечение клетки-хозяина Е.соН. которая способна продуцировать указанный белок; и

b) культивирование клетки в условиях. эффективных для индукции продукции указанного белка в среде. включающей комплексный источник азота. выбранный из группы. содержащей ферментативный гидролизат желатина. ферментативный гидролизат казеина и триптон или их комбинации. такие как ферментативный гидролизат желатина и ферментативный гидролизат казеина. или ферментативный гидролизат желатина и триптон. или ферментативный гидролизат казеина и триптон. или ферментативный гидролизат желатина. ферментативный гидролизат казеина и триптон. или любые из указанных отдельных источников азота или из указанных комбинаций в сочетании с дрожжевым экстрактом. где способ осуществляется при рН примерно от 6.5 до 7.0 и при температуре примерно 37°С. причем культуральная среда включает тиамин в концентрации по меньшей мере от 3 до 12 г/л.
2. Способ по п.1. где концентрация комплексного источника азота составляет от примерно 10 до примерно 30 г/л.
3. Способ по п.1 или 2. где комплексный источник азота представляет собой ферментативный гидролизат желатина.
4. Способ по любому из пп.1 или 2. где комплексный источник азота представляет собой триптон.
5. Способ по любому из пп.1 или 2. где комплексный источник азота представляет собой ферментативный гидролизат казеина.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов. где концентрация тиамина в культуральной среде составляет предпочтительно 7 г/л.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов. где среда дополнительно включает источник углерода. выбранный из группы. содержащей глюкозу. фруктозу. мальтозу. глицерин. галактозу и их комбинации.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов. где источник углерода выбран из глюкозы или глицерина.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов. где среда включает катионы натрия в концентрации примерно 50-100 мМ.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов. где ΙΕΝ-β имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов. где уровень экспрессии ΙΕΝ-β на конечной стадии осуществления способа составляет по меньшей мере 15% от общего белка.
12. Композиция для получения ΙΕΝ-β в клетке-хозяине Е.соН. включающая:

a) клетку-хозяин Е.сой. способную продуцировать указанный белок;

b) культуральную среду. содержащую комплексный источник азота. выбранный из группы. включающей ферментативный гидролизат желатина. ферментативный гидролизат казеина и триптон или их комбинации. такие как ферментативный гидролизат желатина и ферментативный гидролизат казеина. или ферментативный гидролизат желатина и триптон. или ферментативный гидролизат желатина. ферментативный гидролизат казеина и триптон. или любые из указанных отдельных источников азота или из указанных комбинаций. в сочетании с дрожжевым экстрактом; источник углерода. выбранный из группы. включающей глюкозу и глицерин. тиамин в концентрации по меньшей мере от 3 до 12 г/л и катионы натрия в концентрации от 60 до 80 мМ.