KR101128055B1

KR101128055B1 - 고 수준의 인터페론 베타를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR101128055B1
Application number: KR1020077016241A
Authority: KR
Inventors: 산제에브 케이. 멘디라타; 비브호르 사라스와트; 다르메드라 추다사마
Original assignee: 카딜라 핼쓰캐어 리미티드
Priority date: 2004-12-20
Filing date: 2005-12-19
Publication date: 2012-03-29
Also published as: US7923220B2; KR20070091334A; ATE501168T1; JP4705113B2; CA2591235A1; NZ555979A; EP1828242A2; EA200701105A1; WO2006067804A3; DE602005026854D1; DK1828242T3; EP1828242B1; AU2005317574B2; BRPI0518491A2; CA2591235C; EA013263B1; WO2006067804A2; JP2008523801A; ZA200704732B; US20090215121A1

Abstract

본 발명은 발효에 의해 개선된 수율로 인터페론-베타를 생산하는 신규한 방법에 관한 것이다.

인터페론-베타(INF-β), 티아민, 복합질소원.

Description

고 수준의 인터페론 베타를 제조하는 방법{Process for preparing high levels of interferon beta}

인간에서 세 가지 주요한 유형의 인터페론이 확인되었다: 알파-, 베타- 및 감마-인터페론. 이들은 바이러스, 유사분열물질(mitogen), 폴리뉴클레오티드 등에 노출 시 다양한 세포들에 의해 생산된다. 그들은 항-바이러스성, 항-증식성 및 면역조절(immunomodulatory) 특성을 갖는다. 인터페론-베타(IFN-β)는 다발성 경화증[Corboy JR et al., Current Treatment Options in Neurology, 5, 35-54 (2003)], B형 간염 및 C형 간염의 효과적인 치료제로 이용된다.

세린이 17번 위치의 시스테인을 치환하도록 유전적으로 조작된 인간 IFN-β의 유사체인 베타세론(Betaseron)은 IFN-β 1b(US 4588585)로 알려져 있다. 이 분자는 하나의 디술피드 결합을 갖는, 165개의 아미노산으로 구성된 소형 폴리펩티드이고 비-당화된(non-glycosylated) 단백질로 생산된다. IFN-β 1a로 알려진, IFN-β의 당화된 변이체는 80번 위치에 탄수화물 사슬을 가지며 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 발현된다[Conradt et al., J. Biol. Chem., 262, 14600-5 (1987); Kagawa et al., J. Biol. Chem., 263, 17508-15 (1988); Oh et. al., Biotechnol Prog., 21, 1154-64 (2005); US 5795779 (McCormik et al); US 5554513 (Revel et al)].

IFN-β는 초기에 백혈구를 바이러스로 처리하여 유도하는 것에 의해 생산되었다. 그러나, 이 방식으로 생산된 인터페론-β의 치료적 용도는 그와 같은 제제 내에 다양한 오염물(예를 들면, 바이러스)이 존재할 수 있는 높은 가능성 때문에 의문시된다. 재조합 기술은 바이러스 오염을 포함하지 않는 IFN-β를 생산하는 것을 가능하게 하였다. 원형의(native) IFN-β는 당단백질(glycoprotein)이고, 그 생산은 각각 Mantei et al., Nature 297: 128 (1982); Ohno et al., Nucl Acid. Res. 10: 967 (1982); 및 Smith et al., MoL Cell. Biol. 3: 2156 (1983)에 기재된 바와 같이 포유동물, 곤충 및 효모 세포에서 보고되었다.

US 5795779 (McCormick et al.)는 재조합 CHO 세포로부터 고수준의 IFN-β 생산을 개시한다. US 5554513 (Revel et al.)은 두 가지 서브타입의 IFN-β를 개시하고 CHO 세포에서 이를 생산하는 방법을 기재한다. 그러나, 모든 상용화된 동물 세포 배양 방법은 보다 긴 공정 시간, 엄격한 배양 조건 유지의 요구, 고 비용의 배양 배지 등과 같은 기술적 어려움과 연관된다.

또한, 당화는 단백질의 생물학적 활성에서 역할을 수행하지 않는 것으로 입증되었고[Taniguchi, et al., Gene 10, 11-15 (1980); E. Knight Jr., Proc. Natl. Acad. ScL , 73, 520 (1976); E. Knight Jr. and D. Fahey, J. Interferon Res. 2(3), 421 (1982)], 이에 의해 통상적으로 이용되는 숙주인 대장균에서 생산을 수 행하는 것의 장점이 강조되었다[Saraswat et al. FEMS Microbiology Lett., 179, 367-73 (1999); Holowachuk & Ruhoff, Protein Expr. Purif. 6, 588-96 (1995); Kim et. al, Biotechnol. & Bioeng., 69, (2000); Kim et al., Bioprocess and Biosystems Engineering, 24 (2001); Saraswat et. al. Biotechnol. Lett., 22, 261-5 (2000); Lee et. al, FEMS Microbiology Lett., 195, 127-132 (2001); Saraswat et. al. Biochemistry, 41, 15566-77 (2002); Wang et al., Chin. J. Biotechnol. 11, 45-81 (1995)].

IFN-β는 대장균에서 클로닝되고 발현되었다(Taniguchi, et al., Gene 10, 11-15 (1980).

EP 0048970(Goeddel et al.)은 성숙한 인간 섬유아세포 인터페론의 미생물에 의한 생산을 기재한다.

임의의 치료용 단백질의 경우와 같이, 상업적 목적을 위해 고수준의 인터페론-β를 수득하는 것이 바람직하다. EP 0036776(Kield et al.)은 세균에서 이종기원(heterologous) 단백질의 효율적인 생산을 위한 트립토판 프로모터-오퍼레이터 시스템에 기반한 신규한 벡터를 개시한다. US 4686191(Itoh et al.)은 단백질 합성의 효율성을 증가시키기 위해, trp 프로모터를 갖는 개선된 벡터를 이용하는 것에 의한 대장균에서 인터페론-β의 효율적인 발현을 수득하는 방법을 개시한다. US 4499188(Konrad et al.)은 trp 프로모터가 인터페론-β 생산을 위해 이용되는 경우, 배양 동안 억제자(repressor) 수준을 모니터링하는 것의 문제를 해결하는 것으로 주장한다. US 4746608에서 Mizukami 등은 고 수율의 인터페론-β를 수득하기 위 해, 최적의 성장 온도보다 10 내지 25℃ 낮은 온도에서 재조합 미생물을 배양하는 방법을 제안한다. US 4656132에서 Ben-Bassat 등은 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 수용성 알칸올 및/또는 배양의 말기 동안 세균 성장을 지원하는 아미노산 혼합물의 유효량의 첨가에 의해 인터페론-β의 낮은 수율의 문제를 해결하는 것으로 주장한다. US 5866362에서 Cousens 등은 유효량의 Cu⁺⁺를 포함하는 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것에 의해 인터페론-β를 단백질 집합체(protein aggregates)로 생산하여 그들이 숙주 세포 내에서 봉입체(inclusion body)를 형성하고 이로부터 단백질이 분리되고 정제될 수 있게 하는 방법을 제안했다. 그러나, 이 방법들 중 어느 것도 인터페론-β의 만족스러운 수준을 달성할 수 없었다. 인터페론-β의 소수성 때문에, 합성된 단백질은 세포 성장을 방해하고 따라서 인터페론-β의 생산이 상당히 높은 수준으로 달성되지 않는다.

US 5814485에서 Dorin 등은 형질전환된 숙주 세포에서 인터페론-β 같은 소수성 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 특정한 조건을 개시한다. 상기 발명(US 5814485)의 중요한 조건은 단백질 생산의 유도 동안 120 mM 이하의 포타슘 농도 및/또는 40 mM 이하의 소디움 이온 농도 및/또는 4.8 내지 6.8의 pH이다.

본 발명은 생산 배지에서 낮은 수준의 포타슘 및 소디움 이온 농도를 유지하는 것에 의존하지 않는, 조건에서 단백질 생산을 유도하는 것에 의해 US 5814485에 개시된 바와 같은 보다 높은 수준의 인터페론-β의 생산에 유사한 방법을 개시한다. 이는 생산기 전 또는 생산기 동안 질소원 및 기타 영양소/첨가제의 세심한 선택에 의해 달성된다.

발명의 요약

일 양태에서, 본 발명은 선택적 배양 조건을 이용하여 높은 수준으로 재조합 인터페론-β를 생산하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 생산 및/또는 전-생산(pre-production) 배지에서 종래 기술에 기재된 것보다 높은 K+ 및 Na+ 이온 농도 수준에서도, 질소원 및 기타 영양소의 세심한 선택에 의해 고 수준의 인터페론-β를 제공한다.

그의 양태들 중 하나에서, 본 발명은 고 수율의 인터페론 베타를 수득하는 종래 기술에 기재된 것보다 높은 pH에서도 고 수준의 인터페론-베타를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 배양 조건이 종래 기술의 방법들보다 더 비용 효율적인 발효 방법을 이용하여 상당히 높은 수준의 IFN-β를 수득한다.

발명의 설명

본 발명은 높은 발현 수준으로 인터페론-β를 생산하는 신규한 발효 방법에 관한 것이다. 형질전환된 대장균(Escherichia coli)을 이용한 인터페론-β 단백질의 고 수준 생산에 대한 다양한 배양 조건들이 연구되어 이의 생산을 위한 대안적이고 고도로 효율적인 방법에 도달하였다. 본 발명은 개선된 생산 수율을 위한 배양 조건을 개시한다. 본 발명은 하기에서 상세하게 기재된다:

임의의 인터페론-β(본 명세서에서 'IFN-β'로도 지칭됨) 폴리펩티드가 이용될 수 있다. 용어 "인터페론-β(interferone-β)" 또는 "IFN-β"는 원형의 IFN-β의 60% 이상의 생물학적 활성 또는 수용체 결합 활성을 보이거나, 또는 서열번호 1(인간 IFN-β의 아미노산 서열)과 약 80% 이상의 아미노산 동일성(identity)을 보유하는 원형의 IFN-β, 그의 돌연변이체, 단편, 융합체(fusion), 유사체(analog) 및 유도체를 의미한다.

본 발명에서 이용된 IFN-β 유전자는 US 4588585에 따라 17번째 아미노산인 세린이 시스테인을 치환하도록 유전적으로 조작된 원형 유전자의 돌연변이형이다. 인간 IFN-β의 이 돌연변이 유사체는 IFN-β 1b로 알려져 있다. 본 발명에서 이용된 원형의 IFN 베타 유전자의 출처는 NCCS, Pune, INDIA의 인간 폐 섬유아세포주 (human lung fibroblast cell line), MRC 5이다. 전술된 돌연변이는 종래 기술에서보고된 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 이 유전자로 도입되었다.

적합한 숙주 세포, 바람직하게는 대장균을 본 발명이 속한 기술 분야에서 알려진 형질전환 기법을 이용하여 다른 벡터 성분들과 함께 t7, tac, 및 유사한 프로모터로부터 선택된 적합한 프로모터 및 IFN-β의 코딩 서열을 포함하는 적합한 발현 벡터로 형질전환시킨다. 본 발명의 대장균 균주는 대장균 BL21(DE3) 및 그 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 숙주는 ATCC 기탁번호 ATCC 47095로 ATCC에 기탁된 대장균 BL21(DE3)이다. 본 발명에서 사용된 대장균 BL21(DE3)의 출처는 Stratagene, USA이다.

형질전환된 숙주 세포를 먼저 회분식(batch) 발효로 증식을 위한 조건 하에서 배양하였다. 본 발명의 방법에서 사용된 배양 배지는 글루코오스, 글리세롤, 프럭토오스, 말토오스, 갈락토오스 및 그 등가물 또는 그 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 및 에너지원, 효모 추출물, 트립톤, 펩톤, 카세인 효소 가수분해물, 대두 카세인 가수분해물, 젤라틴, 및 그 등가물 또는 그 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 질소원, 시트르산, 염화 칼륨, 염화 나트륨, 황산 마그네슘, 디-암모늄 히드로겐 포스페이트, 포타슘 디히드로겐 포스페이트, 소디움 부티레이트, 티아민, 글리신, 및 염화 아연으로 구성된 군으로 선택된 적합한 염/영양소를 포함한다. pH는 약 5-8에서 유지된다. 온도는 약 30-40℃에서 유지된다. 통기(aeration) 및 교반(agitation), 접종원, 접종시간과 같은 다른 발효 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 편리하게 선택된다.

기질 제한적인 유가식(substrate limiting fed-batch mode) 발효는 배양 배지 내의 기질 농도가 약 0.5 g/L 이하로 유지되면 개시된다. 1-30 g/L 세포 건량의 세포 농도 및 0.5 g/L 미만의 글루코오스 농도에 도달하면, 전-생산 배지의 첨가를 수행하였다. 전-생산 배지는 트립톤, 카세인 효소 가수분해물(CEH), 대두 카세인 가수분해물, 젤라틴 소화물(gelatin digest), 및 그 등가물, 그들의 조합 및 그들과 효모 추출물의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 질소원, 시트르산, 염화 칼륨, 염화 나트륨, 황산 마그네슘, 디-암모늄 히드로겐 포스페이트, 포타슘 디히드로겐 포스페이트, 소디움 부티레이트, 티아민, 글리신, 및 염화 아연으로 구성된 군으로 선택된 적합한 염/영양소, 필요한 경우 선택되는, 암피실린, 카나마이신 등과 같은 적합한 항생제를 포함한다. pH는 약 6.3-8, 바람직하게는 pH 6.5-7.0에서 유지되고, 온도는 약 25-40℃, 바람직하게는 약 37℃에서 유지된다. 배양 배지의 총 K⁺ 농도는 12OmM을 초과하고 Na⁺ 농도는 4OmM을 초과하며, 바람직하게는 60-80 mM의 범위이다. 탄소원은 전-생산 배지에 첨가되지 않을 수 있다. 단백질 생산의 유도는 전-생산 배지의 첨가 후에 수행된다. 적합한 유도원(incuder)은 일회, 복수회, 또는 연속적인 방식으로 첨가될 수 있다. 생산 배지의 연속적인 공급(feed)(유가식)은 유도원의 첨가 직후에 개시된다. 생산 배지는 전-생산 배지의 성분들 외에 탄소원을 포함한다. 적합한 탄소원은 글리세롤, 글루코오스, 프럭토오스, 말토오스, 갈락토오스 및 그 등가물 또는 그 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 탄소원은 글루코오스이다. 배지의 pH는 약 6.3-8, 바람직하게는 6.5-7.0으로 유지되고, 온도는 약 25-40℃, 바람직하게는 약 37℃로 유지된다. 배양의 다른 모든 조건들은 종래 기술에서 공지된 바와 같이 선택된다. 발효의 생산기 동안, 배양 배지의 총 K⁺ 농도는 12OmM을 초과하고 Na⁺ 농도는 4OmM을 초과한다. 5 내지 24시간 후에, 배양 배지를 제거하고 본 발명이 속한 기술 분야에서 기술된 기법에 따라 다운스트림 공정(downstream processing)을 수행하였다. 본 발명의 방법은 SDS-PAGE 방법으로 수득된 단백질 밴드를 이용하여 밀도계로 추정된 바와 같이 IFN-β와 같은 소수성 단백질의 고수율(전체 세포 단백질의 4-28% 범위의 발현 수준) 생산을 가져온다.

도 1은 다양한 질소원의 IFN-β 발현 수준에 대한 효과를 도시한다. 실험은 진탕-플라스크(shake-flask)에서 수행하였다. 회색 막대는 복합 및 무기 질소원, 즉, 아세트산 암모늄, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 카세인 효소 가수분해물, 젤라틴 소화물, 트립톤, 및 우레아(유도원(inducer))의 첨가 시점에 10 g/L)로 수득되는 발현 수준을 나타내고, 흑색 막대는 대응되는 시점에서의 광학 밀도(600 nm)를 나타낸다. 모든 값들은 유도 후 8시간 경과(8-h post-induction) 시료들로부터 수득하였다.

도 2는 선택된 질소원의 다양한 농도의 IFN-β 발현 수준에 대한 효과를 도시한다. 실험은 진탕-플라스크에서 수행하였다. 상이한 농도(IPTG의 첨가 시점에서 10, 20 및 30 g/L)의 복합 질소원에 따른 발현 수준이 도시된다: 카세인 효소 가수분해물(진회색 막대), 젤라틴 소화물(연회색 막대), 및 트립톤(흑색 막대).

도 3은 다양한 질소원 및 포타슘과 조합된 티아민의 IFN-β 발현 수준에 대한 효과를 도시한다. 실험은 진탕-플라스크에서 수행하였다. 티아민과 조합된 경우(회색 막대) 및 티아민과 조합되지 않는 경우(흑색 막대)의 트립톤, 젤라틴 소화물, 및 카세인 효소 가수분해물(유도원의 첨가 시점에서 6-7 g/L) 간의 발현 수준의 비교가 도시된다.

도 4는 티아민 및 고 농도의 소디움 양이온과 트립톤의 조합의 IFN-β 발현 수준에 대한 효과를 도시한다. 실험은 발효기(fermentor)에서 수행하였다. 티아민과 고 농도의 소디움 양이온(60 mM)을 포함하는 배지(●)와 티아민 및 높은 농도의 소디움 양이온을 포함하지 않는 배지(△) 간의 발현 수준의 비교가 도시된다.

도 5는 IFN-β의 아미노산 서열(서열번호 1)을 도시한다.

하기의 실시예들은 본 발명을 더 설명한다. 이 실시예들은 예시를 위해 제공 되며 어떤 방식으로도 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1

카세인 효소 가수분해물 , 소디움 및 티아민을 포함하는 베지에서 IFN 베타의 발현

IFN-베타 유전자로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포의 배양을 암피실린(100 mg/L)을 포함하는 루리아-베르티니(Luria-Bertini) 배지(pH 7.0)로 진탕 배양기(incubator shaker)에서 37℃ 및 200 rpm으로 14시간 동안 배양하였다. 뒤이어, 바이오매스(biomass)를 20℃에서 7135xg로 15분간 원심분리에 의해 무균적으로 제거하고 무균적으로 생산 배지에 재-현탁시켰다. IFN-β의 생산을 위해 이용된 배지의 조성은 하기와 같았다:

성분 유도 시점의 농도

글루코오스 5 g/L

카세인 효소 가수분해물 20 g/L

소디움 양이온 60 mM

포타슘 양이온 90 mM

티아민 7 g/L

암피실린 100 mg/L

뒤이어 37℃에서 여과-멸균된(filter-sterilized) IPTG(2 mM)의 첨가에 의해 IFN-β 유전자를 유도하였다. 생산기 동안의 온도는 37℃에서 유지하였고 pH는 5.3-7.2의 범위에 있었다. 2시간 마다 시료를 취하고 pH를 약 7.0으로 조절하였다. 유도 후 8시간 경과 시료에서 IFN-베타 발현 수준은 SDS-PAGE로 수득된 단백질 밴드를 이용한 밀도계 측정에 따르면 10.49%였다.

실시예 2

트립톤 , 소디움 및 티아민을 포함하는 베지에서 IFN 베타의 발현

실험은 하기의 조성을 갖는 생산 배지에서 질소원으로 트립톤을 이용한 것 외에는 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방식으로 수행하였다:

성분 유도 시점의 농도

글루코오스 5 g/L

트립톤 20 g/L

소디움 양이온 60 mM

포타슘 양이온 90 mM

티아민 7 g/L

암피실린 100 mg/L

뒤이어 37℃에서 여과-멸균된 IPTG(2 mM)의 첨가에 의해 IFN-β 유전자를 유도하였다. 생산기 동안의 온도는 37℃에서 유지하였고 pH는 5.3-7.2의 범위에 있었다. 2시간 마다 시료를 취하고 pH를 ～7.0으로 조절하였다. 유도 후 8시간 경과 시료에서 IFN-베타 발현 수준은 7.15%였다.

실시예 3

다양한 질소원의 진탕 플라스크 수준의 발현 수준에 대한 효과

IFN-베타 유전자로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포의 배양을 암피실린(100 mg/L)을 포함하는 루리아-베르티니 배지(pH 7.0)로 진탕 배양기에서 37℃ 및 200 rpm으로 14시간 동안 배양하였다. 뒤이어, 바이오매스를 20℃에서 7135xg로 15분간 원심분리에 의해 무균적으로 제거하고 무균적으로 생산 배지에 재-현탁시켰다. IFN-β의 생산을 위해 이용된 배지의 조성은 하기와 같았다:

성분 유도 시점의 농도

글루코오스 5 g/L

질소원 20 g/L

포타슘 양이온 90 mM

암피실린 100 mg/L

본 실험에서 이용된 질소원은 아세트산 암모늄, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 카세인 효소 가수분해물, 젤라틴 소화물, 트립톤 및 우레아였다. 뒤이어 37℃에서 여과-멸균된 IPTG(2 mM)의 첨가에 의해 IFN-β 유전자를 유도하였다. 생산기 동안의 온도는 37℃에서 유지하였고 pH는 5.3-7.2의 범위에 있었다. 2시간 마다 시료를 취하고 pH를 ～7.0으로 조절하였다. 유도 후 8시간 경과 시료에서 IFN-베타 발현 수준은 도 1에 도시된다.

실시예 4

발현수준에 대한 질소원 농도 의존성

인터페론 베타 생산에 대한 다양한 농도의 질소원의 효과를 테스트하였다(도 2). 본 실시예에서 테스트되지 않은 Na⁺와 티아민 농도를 제외한, 모든 다른 파라미터는 실시예 1에서 사용된 것과 동일했다.

INF-β의 생산을 위해 사용된 배지의 조성은 하기와 같았다:

성분 유도 시점의 농도

글루코오스 5 g/L

질소원 10-30 g/L

소디움 양이온 60 mM

포타슘 양이온 90 mM

티아민 7 g/L

암피실린 100 mg/L

뒤이어 37℃에서 여과-멸균된 IPTG(2 mM)의 첨가에 의해 IFN-β 유전자를 유도하였다. 생산기 동안의 온도는 37℃에서 유지하였고 pH는 5.3-7.2의 범위에 있었다. 2시간 마다 시료를 취하고 pH를 약 7.0으로 조절하였다.

유도 후 8시간 경과 시료에서 IFN-베타 발현 수준의 결과가 표 1에 요약된다.

표 1

실시예 5

트립톤의 IFN 베타 발현 수준에 대한 효과

IFN-베타 유전자로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포의 종 배양(seed culture)을 하기 조성을 갖는 배양 배지에 접종하였다.

성분 접종 전 농도

KH₂PO₄ 13.3 g/L

(NH₄)₂HPO₄ 4.0 g/L

효모 추출물 1.0 g/L

글루코오스 10.0 g/L

시트르산 1.7 g/L

MgSO₄.7H₂O 1.2 g/L

미량원소 용액 20.0 mL/L

암피실린 100 mg/L

미량 금속 용액:

성분 농도

FeCl₃.6H₂O 0.162g/L

ZnCl₂.4H₂O 0.0144g/L

CoCl₂.6H₂O 0.12g/L

Na₂Mo04.2H₂0 0.012g/L

CaCl₂.2H₂O 0.006g/L

CuCl₂ 1.9g/L

H₃BO₃ 0.5g/L

하기의 배지를 기질 제한적인 유가식(substrate limited fed-batch mode)으로 첨가하는 것은 바이오매스의 현저한 증가를 가져왔다:

성분 농도

글루코오스 700g/L

MgSO₄.7H₂O 2 g/L

미량원소 용액 20 mL/L

암피실린 1.5 g/L

성장기에, 수산화암모늄을 pH를 6.8 내지 7.0의 범위에서 유지하기 위한 pH 조절제로 이용하였다. 온도는 37℃에서 유지하였다. 약 50 AU(600 nm)의 광학적 밀도를 달성한 후, 전-생산 배지를 첨가하여 배양액 내에서 다음과 같은 상기 배지의 개별적인 성분의 농도를 얻었다:

성분 농도

트립톤 10 g/L

포타슘 양이온 90 mM

IFN 베타 유전자의 발현은 배양액에 여과-멸균된 IPTG 용액(2 mM)을 무균적으로 첨가하는 것에 의해 유도하였다. 뒤이어 IFN-베타의 발현 수준을 증가시키기 위해 하기의 생산 배지를 첨가하였다:

성분 농도

글루코오스 270 g/L

MgSO₄.7H₂O 1 g/L

트립톤 20 g/L

포타슘 양이온 90 mM

암피실린 l g/L

생산기에, pH 7.0을 유지하기 위해 pH 조절제로서 수산화암모늄을 이용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다. SDS-PAGE에 의해 결정된 IFN-베타의 발현 수준은 유도 후 12시간 경과(12-h post-induction) 시료에서 15.24%였다.

실시예 6

카세인 효소 가수분해물의 IFN 베타 발현 수준에 대한 효과

실시예 6에서 트립톤 대신에 카세인 효소 가수분해물을 주요한 질소원으로 이용한 것을 제외하고는 실시예 5와 유사한 방식으로 실험을 수행하였다. 전-유도 (pre-induction) 배지 및 생산 배지에서 카세인 효소 가수분해물의 최종 농도는 각각 10 g/L 및 20 g/L였다. SDS-PAGE에 의해 결정된 IFN-베타의 발현 수준은 유도 후 12시간 경과 시료에서 24.76%였다.

실시예 7

트립톤과 효모 추출물의 조합의 IFN 베타 발현 수준에 대한 효과

실시예 7에서 카세인 효소 가수분해물을 사용하는 대신, 트립톤과 효모 추출물의 조합을 주요한 질소원으로 이용한 것을 제외하고는 실시예 5와 유사한 방식으로 실험을 수행하였다. 전-유도 배지의 첨가 후 배양액에서 트립톤과 효모 추출물의 최종 농도는 각각 10 g/L 및 5 g/L였다. 생산 배지에서 트립톤과 효모 추출물의 농도는 각각 10 g/L 및 5 g/L였다. SDS-PAGE에 의해 결정된 IFN-베타의 발현 수준은 유도 후 12.5시간 경과 시료에서 7.82%였다.

실시예 8

다양한 티아민 농도의 발현 수준에 대한 효과

IFN-베타 유전자로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포의 배양을 암피실린(100 mg/L)을 포함하는 루리아-베르티니 배지(pH 7.0)로 진탕 배양기에서 37℃ 및 200 rpm으로 14시간 동안 배양하였다. 뒤이어, 바이오매스를 원심분리에 의해 무균적으로 제거하고 무균적으로 생산 배지에 재-현탁시켰다. 생산 배지의 조성은 하기와 같았다:

성분 유도 시점의 농도

글루코오스 5 g/L

젤라틴 소화물 20 g/L

티아민 0-12 g/L

포타슘 양이온 90 mM

암피실린 100 mg/L

뒤이어 37℃에서 여과-멸균된 IPTG(2 mM)의 첨가에 의해 IFN-β 유전자를 유도하였다. 생산기 동안의 온도는 37℃에서 유지하였다. 2시간 마다 시료를 취하고 pH를 ~ 7.0으로 조절하였다. 유도 후 8시간 경과 시료에서 IFN-베타 발현 수준이 하기의 표 2에 요약된다.

표 2

실시예 9

티아민과 다양한 질소원의 조합의 발현 수준에 대한 효과

성분 유도 시점의 농도

글루코오스 5 g/L

질소원 20 g/L

티아민 6-7 g/L

포타슘 양이온 90 mM

암피실린 100 mg/L

3종의 질소원, 즉, 젤라틴 소화물, 카세인 효소 가수분해물 및 트립톤에 대해 티아민의 효과를 모니터링하였다. 뒤이어 37℃에서 여과-멸균된 IPTG(2 mM)의 첨가에 의해 IFN-β 유전자를 유도하였다. 생산기 동안의 온도는 37℃에서 유지하였다. 2시간 마다 시료를 취하고 pH를 ~ 7.0으로 조절하였다. 유도 후 8시간 경과 시료에서 IFN-베타 발현 수준(도 3)이 하기의 표 3에 요약된다.

표 3

실시예 10

소디움 양이온의 발현 수준에 대한 효과

IFN-베타 유전자로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 세포의 배양을 암피실린(100 mg/L)을 포함하는 루리아-베르티니 배지(pH 7.0)로 진탕 배양기에서 37℃ 및 200 rpm으로 14시간 동안 배양하였다. 뒤이어, 바이오매스를 20℃에서 7135xg로 15분간 원심분리에 의해 무균적으로 제거하고 무균적으로 생산 배지에 재-현탁시켰다. IFN-β의 생산을 위해 사용된 배지의 조성은 하기와 같았다:

성분 유도 시점의 농도

글루코오스 5 g/L

트립톤 20 g/L

티아민 7 g/L

포타슘 양이온 100 mM

소디움 양이온 60 mM, 또는 <40 mM

암피실린 100 mg/L

뒤이어 37℃에서 여과-멸균된 IPTG(2 mM)의 첨가에 의해 IFN-β 유전자를 유도하였다. 생산기 동안의 온도는 37℃에서 유지하였고 pH는 6.62-1.52의 범위에 있었다. 2시간 마다 시료를 취하고 pH를 ~ 7.0으로 조절하였다. 유도 후 8시간 경과 시료에서 SDS-PAGE로 수득된 단백질 밴드를 이용한 밀도계로 측정된 IFN-베타 발현 수준은 표 4에 표시된다.

표 4

소디움 양이온 농도	IFN 베타 발현 수준(%)
60 mM 소디움을 포함하는 배지	7.15%
40 mM 미만의 소디움을 포함하는 배지	6.02%

실시예 11

티아민, 고 농도의 소디움 양이온 및 트립톤의 조합의 발현 수준에 대한 효과

IFN-베타 유전자로 형질전환된 대장균 BL21 (DE3) 세포들의 종 배양을 하기 조성의 성장 배지에 접종하였다.

성분 접종 전 농도

KH₂PO₄ 13.3 g/L

(NH₄)₂HPO₄ 4.0 g/L

효모 추출물 1.0 g/L

글루코오스 10.0 g/L

시트르산 1.7 g/L

MgSO₄.7H₂O 1.2 g/L

미량원소 용액 20.0 mL/L

암피실린 100 mg/L

미량 금속 용액:

성분 농도

FeCl₃.6H₂O 0.162g/L

ZnCl₂.4H₂O 0.0144g/L

CoCl₂.6H₂O 0.12g/L

Na₂Mo0₄.2H₂0 0.012g/L

CaCl₂.2H₂O 0.006g/L

CuCl₂ 1.9g/L

H₃BO₃ 0.5g/L

하기의 배지를 기질 제한적인 유가식으로 첨가하는 것은 바이오매스의 현저한 증가를 가져왔다:

성분 농도

글루코오스 700g/L

MgSO₄.7H₂O 20g/L

미량원소 용액 20 mL/L

암피실린 1.0 g/L

성장기에, 수산화암모늄을 pH를 6.8 내지 7.0의 범위에서 유지하기 위한 pH 조절제로 이용하였다. 온도는 37℃에서 유지하였다. 약 50 AU(600 nm)의 최적의 광학적 밀도를 달성한 후, 전-생산 배지를 첨가하였다.

배지 A: 고 농도의 소디움 양이온 및 티아민 불포함 배지에서의 생산

전-생산 배지:

성분 배양액의 농도

트립톤 10 g/L

티아민 1 g/L

포타슘 90 mM:배양액의 최종 농도

소디움 소디움 염 무첨가

IFN-베타 유전자의 발현은 배양액에 여과-멸균된 IPTG 용액(2 mM)을 무균적으로 첨가하는 것에 의해 유도하였다.

생산 피드 배지(production feed media):

성분 배양액의 농도

글루코오스 270 g/L

트립톤 20 g/L

티아민 7 g/L

MgSO₄.7H₂O 1 g/L

포타슘 90 mM

소디움 소디움 염 무첨가

암피실린 1 g/L

생산기에, pH 7.0을 유지하기 위해 pH 조절제로서 수산화암모늄을 이용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다.

배지 B: 고 농도의 소디움 양이온 및 티아민 함유 배지에서의 생산

전-생산 배지:

성분 농도

트립톤 10 g/L

티아민 1 g/L

포타슘 90 mM:배양액의 최종 농도

소디움 60 mM:배양액의 최종 농도

생산 피드 배지:

성분 농도

글루코오스 270 g/L

트립톤 20 g/L

티아민 7 g/L

MgSO₄.7H₂O 1 g/L

포타슘 90 mM

소디움 60 mM

암피실린 1 g/L

생산기에, pH 7.0을 유지하기 위해 pH 조절제로서 수산화암모늄을 이용하였다. 온도는 37℃로 유지하였다. 생산기 동안, 세포-불포함(cell-free) 배지에서 소디움 및 포타슘 양이온의 총 농도는 각각 109-101 ± 10.9-10.1 mM 및 163-118 ± 16.3-11.8 mM이었다. 세포-불포함 배양액에서 포타슘 및 소디움 양이온의 측정은 원자 흡수 스펙트럼(atomic absorption spectra)을 이용하여 수행하였다.

시간에 따른 발현 수준의 증가 과정은 도 4에 도시된다. 배지 A 및 B에서 수득된 IFN 베타 발현 수준은 SDS-PAGE로 수득된 단백질 밴드를 이용한 밀도계 측정에 따르면, 각각 15.24% 및 27.32%였다. 배지 B에서 IFN 베타 수율은 약 2 g/L였다.

본 방법의 장점:

1. 본 발명의 방법은 종래 기술의 방법보다 높은 IFN-베타 발현 수준을 제공한다.

2. 본 발명의 방법은 배지 내에서 소디움 또는 포타슘 농도를 매우 낮은 수 준으로 유지하기 위해 엄격하게 그 농도를 모니터링할 필요가 없기 때문에 상업적으로 보다 유리하다.

3. 본 발명의 방법은 종래 기술의 방법보다 수행하기가 더 용이하다.

4. 본 발명의 전체적인 방법은 매우 비용 효율적이다.

<110> CADILA HEALTHCARE LIMITED <120> PROCESS FOR PREPARING HIGH LEVELS OF INTERFERON BETA <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Leu Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His His Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165

Claims

대장균 숙주 세포에서 인터페론 베타를 생산하는 방법으로서:

a) 상기 인터페론 베타를 생산할 수 있는 상기 숙주 세포를 제공하는 단계; 및

b) 젤라틴 소화물, 카세인 효소 가수분해물, 및 트립톤으로부터 선택된 복합 질소원을 단독으로 포함하거나 또는 이들의 조합을 포함하는 배양 배지에서 또는 효모 추출물과 조합된 상기 배양 배지에서 상기 인터페론 베타의 생산을 유도하기에 유효한 조건 하에 pH 6.5 내지 7.0 및 37℃의 온도에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하고,

c) 상기 배양 배지는 3g/l 내지 12 g/l의 농도의 티아민을 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합 질소원의 농도는 10 내지 30 g/L인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 복합 질소원은 젤라틴 소화물인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 복합 질소원은 트립톤인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 복합 질소원은 카세인 효소 가수분해물인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 티아민을 상기 배지 중에 3 내지 12 g/L의 농도로 유지하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 티아민을 상기 배지 중에 7 g/L의 농도로 유지하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지는 글루코오스, 프럭토오스, 말토오스, 글리세롤, 갈락토오스 및 그들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 탄소원을 더 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 탄소원은 글루코오스 또는 글리세롤로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지는 50-100 mM 소디움 양이온 농도를 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인터페론 베타(IFN-β)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 생산의 종료 시에 상기 인터페론-베타의 수준은 상기 배지 중 총 단백질의 15% 이상인 것인 방법.
인터페론 베타 생산용 조성물로서,

a. 상기 인터페론 베타를 생산할 수 있는 대장균 세포,

b. 트립톤, 카세인 효소 가수분해물 및 젤라틴 소화물로 구성된 군으로부터 선택된 복합 질소원, 글루코오스 및 글리세롤로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소원, 3 내지 12 g/L의 농도의 티아민 및 60-80 mM 범위의 소디움 양이온을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것인 조성물.