JPS63164891A - 酵母によるヒト腫瘍壊死因子の生産方法 - Google Patents
酵母によるヒト腫瘍壊死因子の生産方法Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組換えＤＮＡ技術を使用してヒト腫瘍壊死因子
を生産することに関する。１つの面において、本発明は
酵母によるヒト腫瘍壊死因子の発現に関する。他の面に
おいて、本発明はヒト腫瘍壊死因子をコードする新規Ｄ
ＮＡ構築物に関する。
を生産することに関する。１つの面において、本発明は
酵母によるヒト腫瘍壊死因子の発現に関する。他の面に
おいて、本発明はヒト腫瘍壊死因子をコードする新規Ｄ
ＮＡ構築物に関する。
さらに他の面において、本発明は上記のＤＮＡ構築物で
形質転換された新規生物に関する。
形質転換された新規生物に関する。
（従来技術）
近年ＤＮＡ技術が開発されるにつれて、多種多様の有用
なポリペプチドの微生物による制御生産が可能になった
。多くの真核生物ポリペプチドはすでに微生物によって
生産されており、例えばヒト成長ホルモ／、白血球イン
ターフェロン、ヒトインシュリンおよびヒトプロインシ
ュリンのように医薬用途のために食品医薬品局によって
認可されている。すでに開発された技術を引き続き使用
することにより、将来いろいろな他の有用ポリペプチド
産物の微生物による生物が可能になると期待される。１
つのこのような有用ポリペプチド産物はヒ）Ｍ瘍壊死因
子である。
なポリペプチドの微生物による制御生産が可能になった
。多くの真核生物ポリペプチドはすでに微生物によって
生産されており、例えばヒト成長ホルモ／、白血球イン
ターフェロン、ヒトインシュリンおよびヒトプロインシ
ュリンのように医薬用途のために食品医薬品局によって
認可されている。すでに開発された技術を引き続き使用
することにより、将来いろいろな他の有用ポリペプチド
産物の微生物による生物が可能になると期待される。１
つのこのような有用ポリペプチド産物はヒ）Ｍ瘍壊死因
子である。
腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃ
ｔｏｒ。
ｔｏｒ。
ＴＮＦ）は２つの順序正しい現象において微生物産物に
より処理された動物の血清中に見出せる抗腫瘍物質であ
る。第１の現象はマクロファージの活性化および増殖を
引き起こし且つ肝臓？よび膵臓における細網内皮細胞因
子の増加と関連がある感作現象である。この感作現象の
ためには、カルメットーゲラン杆菌（Ｅａｃｉｌｌｘａ
ＣａｌｍａｔｔａＧｓｅｒｉ％、ＢＣＧ）のようなミ
コバクテリア、コリネバクテリウムロパルバム（Ｃｏｒ
ｙ％ｅｂａｃｔｅｒｉｓｍｐａｒｖｓｍ ）のようなコ
リネバクテリア吋よびザイモサン（酵母細胞壁）が効果
的である。第２の現象は血液中にＴＮＦが出現するのに
必要な誘発現象である。これはその後感作動物をリポ多
糖（ＬＰＳ−細胞内毒素または細菌性発熱物質として知
られるダラム陰性菌の細胞壁の主要構成成分）で処理す
る必要がある。これらの原理を使用して、マウス、ラッ
トおよびウサギから類似の抗膳瘍／細胞障害活性を有す
る血清を得ることが可能である。
より処理された動物の血清中に見出せる抗腫瘍物質であ
る。第１の現象はマクロファージの活性化および増殖を
引き起こし且つ肝臓？よび膵臓における細網内皮細胞因
子の増加と関連がある感作現象である。この感作現象の
ためには、カルメットーゲラン杆菌（Ｅａｃｉｌｌｘａ
ＣａｌｍａｔｔａＧｓｅｒｉ％、ＢＣＧ）のようなミ
コバクテリア、コリネバクテリウムロパルバム（Ｃｏｒ
ｙ％ｅｂａｃｔｅｒｉｓｍｐａｒｖｓｍ ）のようなコ
リネバクテリア吋よびザイモサン（酵母細胞壁）が効果
的である。第２の現象は血液中にＴＮＦが出現するのに
必要な誘発現象である。これはその後感作動物をリポ多
糖（ＬＰＳ−細胞内毒素または細菌性発熱物質として知
られるダラム陰性菌の細胞壁の主要構成成分）で処理す
る必要がある。これらの原理を使用して、マウス、ラッ
トおよびウサギから類似の抗膳瘍／細胞障害活性を有す
る血清を得ることが可能である。
ＴＮＦの細胞源はマクロファージ（モノサイト：単球）
であり、こうしてＴＮＦはモノカイン（ｒＭ％ｏｋｉｎ
ａ）とも呼ばれる。ＴＮＦはマウスに移植されたある種
の腫瘍の出血性壊死を引き起こし、時々は児全な腫瘍の
後退を生じさせる。またＴＮＦはある種の腫瘍細胞株に
対して細胞障害活性を示すが、正常細胞に対しては示さ
ない。ＴＮＦは種特異的でなく、例えばマウスＴＮＦは
ヒト癌から誘導される広範囲の細胞株に対して効果的で
ある。
であり、こうしてＴＮＦはモノカイン（ｒＭ％ｏｋｉｎ
ａ）とも呼ばれる。ＴＮＦはマウスに移植されたある種
の腫瘍の出血性壊死を引き起こし、時々は児全な腫瘍の
後退を生じさせる。またＴＮＦはある種の腫瘍細胞株に
対して細胞障害活性を示すが、正常細胞に対しては示さ
ない。ＴＮＦは種特異的でなく、例えばマウスＴＮＦは
ヒト癌から誘導される広範囲の細胞株に対して効果的で
ある。
ヒ）ＴＮＦをコードする遺伝子はすでにクローニングさ
れ、そして大腸菌により発現された。ヒトＴＮＦは単一
コピー遺伝子によりコードされると考えられる。４つの
エクソンが２３３アミノ酸の前駆産物、および異常に長
いリーダー配列を除去した後の１５７アミノ酸の成熟産
物をコードする。ヒトＴＮＦの分子量はゲルヂ過により
測定して４５０００ダルトンであり、そして５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより測定して１７０００の最小分子量を有する
。ＴＮＦは５．６の等電点な有し、Ｎ−グリコジル化部
位をもたず、Ｓ−Ｓ架橋を１つだけ有する。マウスＴＮ
Ｆも最近クローニングされ、（推定された）アミノ酸レ
ベルでヒトＴＮＦに対して約８０％の相同を示した。こ
れらの組換えＴＮＦ産物は非組換えＴＮＦの研究から予
測されたものに類似した生物学的活性を有する。
れ、そして大腸菌により発現された。ヒトＴＮＦは単一
コピー遺伝子によりコードされると考えられる。４つの
エクソンが２３３アミノ酸の前駆産物、および異常に長
いリーダー配列を除去した後の１５７アミノ酸の成熟産
物をコードする。ヒトＴＮＦの分子量はゲルヂ過により
測定して４５０００ダルトンであり、そして５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより測定して１７０００の最小分子量を有する
。ＴＮＦは５．６の等電点な有し、Ｎ−グリコジル化部
位をもたず、Ｓ−Ｓ架橋を１つだけ有する。マウスＴＮ
Ｆも最近クローニングされ、（推定された）アミノ酸レ
ベルでヒトＴＮＦに対して約８０％の相同を示した。こ
れらの組換えＴＮＦ産物は非組換えＴＮＦの研究から予
測されたものに類似した生物学的活性を有する。
ＴＮＦは類似の生物学的活性を示し且ついろいろな程度
の配列相同性をもつ１つの分子群に属することが最近明
らかになった。ＴＮＦはその細胞障害活性においてリン
フォトキシンと関係がある。
の配列相同性をもつ１つの分子群に属することが最近明
らかになった。ＴＮＦはその細胞障害活性においてリン
フォトキシンと関係がある。
これらのタンバク質は両方とも細胞障害活性を誘起する
際にインターフェロン−γとの相乗作用を示す。ＴＮＦ
はリンフォトキシンと３０％のアミノ酸相同を共有する
。これらのタンパク質をコードする単一コピー遺伝子は
いくつかの構造特性を共有しており、各遺伝子は長さが
約３ ｋｂｐであって３つのイントロンが介在している
。さらに、これらの遺伝子は近接して連結されており、
双方ともヒト染色体６にマツピングされた。生物学的活
性におけるこれらの類似性を考慮して、ＴＮＦはＴＮＦ
−αと呼ばれ、リンフォトキシンはＴＮＦ−βと呼ばれ
る。それらの生物学的活性は類似しているが、それらは
異なる細胞型から誘導されしかも区別しうる誘発機構を
有している。ＴＮＦ−αは誘発の４〜２４時間後に単球
から分泌され、一方ＴＮＦ−βは誘発の２４〜４８時間
後にＴリッツ球から分泌される。ＴＮＦ−α（分子量１
７０００）と相違して、ＴＮＦ二βはモノマーの分子値
が２５０００のグリコジル化タンパク質である。ＴＮＦ
−αおよびＴＮＦ−βは末梢血白血球（ＰＢＬ）によっ
て生産される主な細胞溶解因子であると思われる。いく
つかの研究はＴＮＦ−αがカケクチ７（ｃａｃルーｃｔ
ｉｎ： Ｌ Ｐ ｆｌの致死作用の主な媒介物質の１つ
であり、脂肪細胞培養物におけるリポタンパク質リパー
ゼの活性を抑制するその能力により検定される）と同一
であると示唆・している。
際にインターフェロン−γとの相乗作用を示す。ＴＮＦ
はリンフォトキシンと３０％のアミノ酸相同を共有する
。これらのタンパク質をコードする単一コピー遺伝子は
いくつかの構造特性を共有しており、各遺伝子は長さが
約３ ｋｂｐであって３つのイントロンが介在している
。さらに、これらの遺伝子は近接して連結されており、
双方ともヒト染色体６にマツピングされた。生物学的活
性におけるこれらの類似性を考慮して、ＴＮＦはＴＮＦ
−αと呼ばれ、リンフォトキシンはＴＮＦ−βと呼ばれ
る。それらの生物学的活性は類似しているが、それらは
異なる細胞型から誘導されしかも区別しうる誘発機構を
有している。ＴＮＦ−αは誘発の４〜２４時間後に単球
から分泌され、一方ＴＮＦ−βは誘発の２４〜４８時間
後にＴリッツ球から分泌される。ＴＮＦ−α（分子量１
７０００）と相違して、ＴＮＦ二βはモノマーの分子値
が２５０００のグリコジル化タンパク質である。ＴＮＦ
−αおよびＴＮＦ−βは末梢血白血球（ＰＢＬ）によっ
て生産される主な細胞溶解因子であると思われる。いく
つかの研究はＴＮＦ−αがカケクチ７（ｃａｃルーｃｔ
ｉｎ： Ｌ Ｐ ｆｌの致死作用の主な媒介物質の１つ
であり、脂肪細胞培養物におけるリポタンパク質リパー
ゼの活性を抑制するその能力により検定される）と同一
であると示唆・している。
商業的価値をもち得るＴＮＦのいくつかの有用な生物学
的活性を考慮すると、大腸菌による生産よりも優れた収
量および生物学的活性をもたらすヒ）ＴＮＦ−αの生産
方法が大いに望まれるだろう。
的活性を考慮すると、大腸菌による生産よりも優れた収
量および生物学的活性をもたらすヒ）ＴＮＦ−αの生産
方法が大いに望まれるだろう。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明の目的は、それ故に、酵母によるヒト腫瘍壊死因
子の生産方法を提供することである。
子の生産方法を提供することである。
本発明の他の目的は、酵母において高レベルでヒト腫瘍
壊死因子を発現し得る新規ＤＮＡ構築物を作製すること
である。
壊死因子を発現し得る新規ＤＮＡ構築物を作製すること
である。
本発明のこれらおよび他の目的は、以下の説明および特
許請求の範囲を詳細に検討することにより明らかになる
であろう。
許請求の範囲を詳細に検討することにより明らかになる
であろう。
本発明によれば、と）Ｉｌ！瘍壊死因子はその腫瘍壊死
因子のコード領域を含むＤＮＡ構築物で形質転換された
酵母細胞を酵母調節領域の支配下で培養することによっ
て、高収量で酵母から生産され得ることが見出された。
因子のコード領域を含むＤＮＡ構築物で形質転換された
酵母細胞を酵母調節領域の支配下で培養することによっ
て、高収量で酵母から生産され得ることが見出された。
本発明の生産方法の利点はとりわけその方法を腫瘍壊死
因子の大規模生産に容易に拡大しつる点にある。
因子の大規模生産に容易に拡大しつる点にある。
（問題点を解決するための手段）
本発明によれば、酵母調節領域およびポリペプチドコー
ド領域を含む新規ＤＮＡフラグメントが提供され、その
際ポリペプチドコード領域はヒト腫瘍壊死因子またはそ
の一部分をコードし、そして酵母調節領域はヒト腫瘍壊
死因子コード領域の５′末端に配置されたとぎメツセン
ジャーＲＮＡの転写を制御することができるものである
。場合により、本発明の新規ＤＮＡフラグメントはポリ
ペプチドコード領域の下流にＤＮＡの３′末端配列を含
むことができ、そ、の３′末端配列はポリペプチドコー
ド領域によりコードされるメツセンジャーＲＮＡのポリ
Ａ化および転写終止を制御することができる。調節領域
、ヒ）Ｊｉｌｔ瘍壊死因子遺伝子、および転写ターミネ
ータ−フラグメントの組合せは以後発現カセットまたは
発現単位と呼ぶことにする。
ド領域を含む新規ＤＮＡフラグメントが提供され、その
際ポリペプチドコード領域はヒト腫瘍壊死因子またはそ
の一部分をコードし、そして酵母調節領域はヒト腫瘍壊
死因子コード領域の５′末端に配置されたとぎメツセン
ジャーＲＮＡの転写を制御することができるものである
。場合により、本発明の新規ＤＮＡフラグメントはポリ
ペプチドコード領域の下流にＤＮＡの３′末端配列を含
むことができ、そ、の３′末端配列はポリペプチドコー
ド領域によりコードされるメツセンジャーＲＮＡのポリ
Ａ化および転写終止を制御することができる。調節領域
、ヒ）Ｊｉｌｔ瘍壊死因子遺伝子、および転写ターミネ
ータ−フラグメントの組合せは以後発現カセットまたは
発現単位と呼ぶことにする。
さらに本発明によれば、上記の発現カセットを含む線状
または環状の新規プラスミドが提供される。
または環状の新規プラスミドが提供される。
さらに本発明によれば、上記の線状または環状プラスミ
ドで形質転換された酵母菌株の本質的に純粋な培養物が
提供される。
ドで形質転換された酵母菌株の本質的に純粋な培養物が
提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記プラスミドで形
質転換された酵母菌株を、目的のタンパク質産物を発現
させる条件下で培養することから成るヒト腫瘍壊死因子
の生産方法が提供される。
質転換された酵母菌株を、目的のタンパク質産物を発現
させる条件下で培養することから成るヒト腫瘍壊死因子
の生産方法が提供される。
ヒト腫瘍壊死因子をコードする遺伝子は大腸菌にＲいて
すでにクローニングされ、発現された。
すでにクローニングされ、発現された。
この種のクローニングのために２つの一般的な方法が利
用された。第１の方法では、腫瘍壊死因子のａＤＮＡが
ＨＬ−６０Ｍ胞株によって生産された腫瘍壊死因子のア
ミノ酸配列に基づいて考案された合成オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いて、ＨＬ−６０細胞株由来のｍ ＲＮ
Ａから単離された。
用された。第１の方法では、腫瘍壊死因子のａＤＮＡが
ＨＬ−６０Ｍ胞株によって生産された腫瘍壊死因子のア
ミノ酸配列に基づいて考案された合成オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いて、ＨＬ−６０細胞株由来のｍ ＲＮ
Ａから単離された。
その他に使用されたクローニング方法は、ヒトゲノムラ
イブラリーのプローブとしてウサギまたはネズミの腫瘍
壊死因子ｃ Ｄ Ｎ Ｆを利用するものであった。この
ような作業の結果として、腫瘍壊死因子コード領域のヌ
クレオチド配列およびいろいろな形体のそのポリペプチ
ドのアミノ酸配列について詳細に解説する多数の刊行物
が出版された。
イブラリーのプローブとしてウサギまたはネズミの腫瘍
壊死因子ｃ Ｄ Ｎ Ｆを利用するものであった。この
ような作業の結果として、腫瘍壊死因子コード領域のヌ
クレオチド配列およびいろいろな形体のそのポリペプチ
ドのアミノ酸配列について詳細に解説する多数の刊行物
が出版された。
本明細書中で用いるとき、“腫瘍壊死因子”なる用語は
自然界に存在するＴＮＦ分子の観察された抗腫瘍特性を
保有するすべてのタンパク質（自然界に存在するものお
よび合成されたものの両方）を包含するものである。従
って、いろいろな天然源からのＴＮＦ、並びにそれらの
類似体および誘導体は本発明の範囲に含まれる。多くの
この種のＴＮＦ分子は制限地図１に記載のヌクレオチド
配列によりコードされる： 本明細書に記載の実験において使用した特定のＴＮＦコ
ードヌクレオチド配列は配列Ａとして以下に示される塩
基配列をもり６９３塩基対のＢ２−８１フラグメ／トで
ある： ５’−ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＴ ＴＣ
Ｔ ＴＣＣＣＣＴ ＧＴＡ ＧＣＣＣＡＴ Ｇ
ＴＴ ＧＴＡＧＧＧ ＣＡＧ ＣＴＣＣＡＧ
ＴＧＧ ＣＴＧＣＴＣＣＴＧ ＧＣＣＡＡＴ Ｇ
ＧＣＧＴＧＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＣＣＡ
ＴＣＡ ＧＡＧＴＣＣＣＡＧ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣ
ＡＡＧＡＣＣＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣ
ＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ ＡＣＣＧＣＣＡＴ
ＣＡＡＧ ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＧ ＧＣＴ
ＧＡＧ ＧＣＣＡＡＧ ＣＣＣＣＴＧ ＧＧＡ
ＧＧＧ ＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＧＣＴ
ＧＡＧ ＡＴＣＡＡＴＴＴＴ ＧＣＣＧＡＧ
ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧＧＣＣＣＴＧ ＴＧＡ
ＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡ
ＴＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＧＣ
ＴＴＡＧＧＧＴＣＧＧＡ ＡＣＣＣＡＡＧＣＴ
ＴＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧ ＡＡＡＣＣＴＧＧＧ
ＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＴ ＧＣＴＧＧＣＡＡＣ
ＣＣＧＴ ＡＣＣＣＣＧ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡＧ
ＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＧＡ
ＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＣＣＧＡ
Ｇ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＣＡＧＧ
ＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＧＧＣＣＡＡ
ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧ
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ＣＣＡＡＣＣＴ ＴＣＣＣＡＡＡＣＧＣＴＡＴ
ＴＡＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡ
ＧＡ ＡＴＴＧＧＧＧＧＣＴＡＧＡＡＣＴＴＴ
ＡＡ ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡ
ＴＧ ＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＣＴＡＡＧ−３
’ ヒト鹿瘍壊死因子をコードするこのＢ２−Ｒ１フラグメ
ントは次のようにしてピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａａｔｏｒｉａ）発現ベクター中に挿入された。
自然界に存在するＴＮＦ分子の観察された抗腫瘍特性を
保有するすべてのタンパク質（自然界に存在するものお
よび合成されたものの両方）を包含するものである。従
って、いろいろな天然源からのＴＮＦ、並びにそれらの
類似体および誘導体は本発明の範囲に含まれる。多くの
この種のＴＮＦ分子は制限地図１に記載のヌクレオチド
配列によりコードされる： 本明細書に記載の実験において使用した特定のＴＮＦコ
ードヌクレオチド配列は配列Ａとして以下に示される塩
基配列をもり６９３塩基対のＢ２−８１フラグメ／トで
ある： ５’−ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＴ ＴＣ
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ＴＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧ ＡＡＡＣＣＴＧＧＧ
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ＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＧＧＣＣＡＡ
ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧ
ＣＣＧＣＡＴＣＡＡＧ ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴ
ＣＴＣＡＧ ＡＧＧ ＧＡＧ ＡＣＣＣＣＡ
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ＣＣＡＡＣＣＴ ＴＣＣＣＡＡＡＣＧＣＴＡＴ
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ＧＡ ＡＴＴＧＧＧＧＧＣＴＡＧＡＡＣＴＴＴ
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’ ヒト鹿瘍壊死因子をコードするこのＢ２−Ｒ１フラグメ
ントは次のようにしてピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａａｔｏｒｉａ）発現ベクター中に挿入された。
バーネット（Ｂａｒｓ−υら、ＤＮＡ、Ｖｏｌ、５、ｐ
、８３（１９８６）に記載され且つ第１図のように誘導
された腫瘍壊死因子遺伝子を含むプラスミドｐＴＮＦ１
がこの作業のＴＮＦ遺伝子源として使用された。このプ
ラスミドｐＴＮＦ１は第２図に要約されまた以下で詳し
く説明されるように酵母を土台としたプラスミドｐ Ｔ
ＮＦ ４、ｐＴＮＦ５、ｐＴＮＦ６およびｐＴＮＦ７に
変換された。まず初めに、ｐＴＮＦｌをＢ２で消化して
２本の線状ＤＮＡフラグメントを得た。ｐＴＮＦｌから
得られた大きい方の７２グメントはＴＮＦ遺伝子とさら
にｏｒｉおよびｂｌａ機能との両方を含んでいた。この
大きいＢ２７ラグメントそれ自体を連結させてｐＴＮＦ
２と名づけだ中間体プラスミドを作った。増幅後、プラ
スミドｐＴＮＦ２をＢ２で切断し、ｐＴＮＦ２０Ｂ２
部位へＢ−Ａｖ２リンカ−のダイマー（以下に配列Ｂと
して示した塩基配列をもつ）を挿入した。
、８３（１９８６）に記載され且つ第１図のように誘導
された腫瘍壊死因子遺伝子を含むプラスミドｐＴＮＦ１
がこの作業のＴＮＦ遺伝子源として使用された。このプ
ラスミドｐＴＮＦ１は第２図に要約されまた以下で詳し
く説明されるように酵母を土台としたプラスミドｐ Ｔ
ＮＦ ４、ｐＴＮＦ５、ｐＴＮＦ６およびｐＴＮＦ７に
変換された。まず初めに、ｐＴＮＦｌをＢ２で消化して
２本の線状ＤＮＡフラグメントを得た。ｐＴＮＦｌから
得られた大きい方の７２グメントはＴＮＦ遺伝子とさら
にｏｒｉおよびｂｌａ機能との両方を含んでいた。この
大きいＢ２７ラグメントそれ自体を連結させてｐＴＮＦ
２と名づけだ中間体プラスミドを作った。増幅後、プラ
スミドｐＴＮＦ２をＢ２で切断し、ｐＴＮＦ２０Ｂ２
部位へＢ−Ａｖ２リンカ−のダイマー（以下に配列Ｂと
して示した塩基配列をもつ）を挿入した。
Ｃ←ゞ
ｃ！３Ｃ＋）
図 ト
弐
→Ｃ
上記り／カーおよびＢ２で線状化したｐＴＮＦ２は、制
限酵素ＢおよびＢ２がそれらの認識部位の中央に同一の
４個のヌクレオチド配列を有するので連結可能である。
限酵素ＢおよびＢ２がそれらの認識部位の中央に同一の
４個のヌクレオチド配列を有するので連結可能である。
配列Ｂに示したＢ−Ａｖ合成リンカ−がさらに内部Ｒ１
部位を含むという事実はその後の遺伝子操作にとって便
利である。
部位を含むという事実はその後の遺伝子操作にとって便
利である。
Ｂ２で線状化したｐＴＮＦ２と配列Ｂに示したリンカ−
とを連結することにより得られたＤＮＡは大腸菌宿主を
形質転換すべく使用した。いくつかのアンピシリン耐性
形質転換体からのプラミドＤＮＡは、どのプラスミドが
配列Ｂで表される合成リンカ−を組み込むがゆえに目的
のプラスミドｐ ＴＮＦ３として同定され得るかを調べ
るために、Ｒ１で消化することにより分析した。
とを連結することにより得られたＤＮＡは大腸菌宿主を
形質転換すべく使用した。いくつかのアンピシリン耐性
形質転換体からのプラミドＤＮＡは、どのプラスミドが
配列Ｂで表される合成リンカ−を組み込むがゆえに目的
のプラスミドｐ ＴＮＦ３として同定され得るかを調べ
るために、Ｒ１で消化することにより分析した。
プラスミドｐＴＮＦ３０Ｒ１消化の後に、ＴＮＦ遺伝子
を含む小さい方のフラグメントはゲル電気泳動それに続
く電気溶出法により単離した。次いで精製したＲ１フラ
グメントはｐＴＨＦＫ−Δ（第３図参照）、ｐＡＯＢＯ
４（第５図参照）などのピチア・パストリスに基づく発
現ベクターのＲ１部位へ挿入した。ＴＮＦ遺伝子はピチ
ア・ノくストリスに基づく発現ベクター中にどちらの方
向にでも挿入することができる。従って、例えばプラス
ミドｐＴＨＦＫ−△へのＴＮＦ遺伝子の挿入はＴＮＦコ
ード化プラスミドｐＴＮＦ４およびｐＴＮＦ５ （第６
図参照）を与え、一方プラスミドｐＡＯ８０４へのＴＮ
Ｆ遺伝子の挿入はＴＮＦコード化プラスミドｐＴＮＦ６
およびｐＴＮＦ７ （第７図参照）を与える。発現ベク
ターの調節配列に対するＴＮＦ遺伝子の向きは適当な制
限酵素分析により決定することができる。得られたＴＮ
Ｆコード化プラプラスミド半数は酵母調節配列に対して
正しい向きでＴＮＦ遺伝子を含む。
を含む小さい方のフラグメントはゲル電気泳動それに続
く電気溶出法により単離した。次いで精製したＲ１フラ
グメントはｐＴＨＦＫ−Δ（第３図参照）、ｐＡＯＢＯ
４（第５図参照）などのピチア・パストリスに基づく発
現ベクターのＲ１部位へ挿入した。ＴＮＦ遺伝子はピチ
ア・ノくストリスに基づく発現ベクター中にどちらの方
向にでも挿入することができる。従って、例えばプラス
ミドｐＴＨＦＫ−△へのＴＮＦ遺伝子の挿入はＴＮＦコ
ード化プラスミドｐＴＮＦ４およびｐＴＮＦ５ （第６
図参照）を与え、一方プラスミドｐＡＯ８０４へのＴＮ
Ｆ遺伝子の挿入はＴＮＦコード化プラスミドｐＴＮＦ６
およびｐＴＮＦ７ （第７図参照）を与える。発現ベク
ターの調節配列に対するＴＮＦ遺伝子の向きは適当な制
限酵素分析により決定することができる。得られたＴＮ
Ｆコード化プラプラスミド半数は酵母調節配列に対して
正しい向きでＴＮＦ遺伝子を含む。
酵母調節領域はどれも本発明の実施において使用するの
に適している。本明細書中で用いる“調節領域”なる用
語は制御された遺伝子発現にとって必要な徨々の機能（
例えばプロモーター領域、上流アクチベーター配列、カ
タボライト感受性領域など）を含むものである。当分野
で習熟した者は、すでに性状決定がなされ且つＴＮＦコ
ード領域と共に使用し得る多数の調節領域を知っている
だろう。
に適している。本明細書中で用いる“調節領域”なる用
語は制御された遺伝子発現にとって必要な徨々の機能（
例えばプロモーター領域、上流アクチベーター配列、カ
タボライト感受性領域など）を含むものである。当分野
で習熟した者は、すでに性状決定がなされ且つＴＮＦコ
ード領域と共に使用し得る多数の調節領域を知っている
だろう。
酵母調節領域の例にはサツカロミセス・セレビシエ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ ｃｇｒｍｖｉａｉａｇ）か
ら分離された酸ホスファターゼ、ガラクトキナーゼ、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ、チトクロムＣ１α接合因子
およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ
の調節領域；ピチア・パストリス（Ｐｉｅ屓αｐα５ｔ
ｏｒｉｓ ）から分離された第１アルコールオキシダー
ゼ（ＡＯＸｌ）、ジヒドロキシアセトンジンダーゼ（Ｄ
ＡＳｌ）＃よぴＢ４０の調節領域；ピチア・パストリス
ＨＩＳ４調節領域などが含まれる。
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ ｃｇｒｍｖｉａｉａｇ）か
ら分離された酸ホスファターゼ、ガラクトキナーゼ、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ、チトクロムＣ１α接合因子
およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ
の調節領域；ピチア・パストリス（Ｐｉｅ屓αｐα５ｔ
ｏｒｉｓ ）から分離された第１アルコールオキシダー
ゼ（ＡＯＸｌ）、ジヒドロキシアセトンジンダーゼ（Ｄ
ＡＳｌ）＃よぴＢ４０の調節領域；ピチア・パストリス
ＨＩＳ４調節領域などが含まれる。
本発明の実施において使用するのに目下適した調節領域
は、 （１） メタノール （２） 非カタボライト抑制炭素源（例えばグリセロ
ール、ガラクトース、アセテートなど）（３） カタ
ボライト抑制炭素源（例えばグルコース、エタノール、
フルクトースなど）、その後の炭素源飢餓 を含有する培地に応答するそれらの能力によって特徴づ
けられる。
は、 （１） メタノール （２） 非カタボライト抑制炭素源（例えばグリセロ
ール、ガラクトース、アセテートなど）（３） カタ
ボライト抑制炭素源（例えばグルコース、エタノール、
フルクトースなど）、その後の炭素源飢餓 を含有する培地に応答するそれらの能力によって特徴づ
けられる。
これらの目下適した調節領域の例は第８．９および１０
図の制限地図により示される。第８図に示した調節領域
はピチア・パストリスの第１ジヒドロキシアセトンジン
ダーゼ（ＤＡＳ １ ）遺伝子から誘導される。第９図
に示した調節領域はピチア・パストリスの第１アルコー
ルオキシダーゼ（ＡＯＸｌ）遺伝子から誘導される（ピ
チア・パストリスは以後ＡＯＸ１およびＡＯＸ２と呼ば
れる２種類のアルコールオキシダーゼ遺伝子を含む）。
図の制限地図により示される。第８図に示した調節領域
はピチア・パストリスの第１ジヒドロキシアセトンジン
ダーゼ（ＤＡＳ １ ）遺伝子から誘導される。第９図
に示した調節領域はピチア・パストリスの第１アルコー
ルオキシダーゼ（ＡＯＸｌ）遺伝子から誘導される（ピ
チア・パストリスは以後ＡＯＸ１およびＡＯＸ２と呼ば
れる２種類のアルコールオキシダーゼ遺伝子を含む）。
第１０図に示した調節領域はピチア・パストリスのｐ４
０遺伝子から誘導される。当分野で習熟した者は、上記
特性をもつ他の調節領域が例えばピチア・パストリスの
ようなメチロトローフ（ＣＩ化合物資化性）酵母から分
離し得ることを認めるであろう。
０遺伝子から誘導される。当分野で習熟した者は、上記
特性をもつ他の調節領域が例えばピチア・パストリスの
ようなメチロトローフ（ＣＩ化合物資化性）酵母から分
離し得ることを認めるであろう。
上記調節領域の特性と類似した調節特性をもつ別の調節
領域もまた本発明の範囲に含まれる。
領域もまた本発明の範囲に含まれる。
上記調節領域のいずれかとヒト腫瘍壊死因子遺伝子との
連結は、既知の手法を用いて当業者により容易に達成さ
れる。
連結は、既知の手法を用いて当業者により容易に達成さ
れる。
本発明の調節領域−構造遺伝子構築物はいろいろな方法
で増幅、複製および発現のために微生物に挿入される。
で増幅、複製および発現のために微生物に挿入される。
例えば、初期連結混合物は初めに増幅および選択のため
に大腸菌宿主へ形質転換することができ、またその連結
混合物は酵母宿主へ直接形質転換することもできる。
に大腸菌宿主へ形質転換することができ、またその連結
混合物は酵母宿主へ直接形質転換することもできる。
目的とするＴＮＦコード構築物を含む酵母形質転換体は
、形質転換酵母培養物の適当なスクリーニングにより選
択される。その後、選択された形質転換体がＴＮＦコー
ド配列を含むことを証明するために検定が実施される。
、形質転換酵母培養物の適当なスクリーニングにより選
択される。その後、選択された形質転換体がＴＮＦコー
ド配列を含むことを証明するために検定が実施される。
（使用した検定は笑施例■で説明する。）
酵母内での遺伝子構築物の自律複製のために、形質転換
用ＤＮＡの一部として自律複製配列（ＡＲ８）因子を使
用することが有用である。その例にはピチア・パストリ
スから誘導されるＰＡＲＥｌおよびＰＡＲ８２（それぞ
れ第１１図および第１２図参照）が含まれる。
用ＤＮＡの一部として自律複製配列（ＡＲ８）因子を使
用することが有用である。その例にはピチア・パストリ
スから誘導されるＰＡＲＥｌおよびＰＡＲ８２（それぞ
れ第１１図および第１２図参照）が含まれる。
宿主の組込み形質転換（ｉｎｔａｇｒａｔｉｖａ’ ｔ
ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ″）が望まれる場合には、
ＡＲ＆ −因子は使用されないであろう。組込み
形質転換を達成するための好適な方法は、 第１の挿入可能なＤＮＡフラグメント、ＴＮＦコード領
域、 選択可能なマーカー遺伝子、および 第２の挿入可能なＤＮＡフラグメント を連続配列状態で含む部位特異的組込みベクターを使用
することを伴う。
ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ″）が望まれる場合には、
ＡＲ＆ −因子は使用されないであろう。組込み
形質転換を達成するための好適な方法は、 第１の挿入可能なＤＮＡフラグメント、ＴＮＦコード領
域、 選択可能なマーカー遺伝子、および 第２の挿入可能なＤＮＡフラグメント を連続配列状態で含む部位特異的組込みベクターを使用
することを伴う。
第１および第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントはそれ
ぞれ少なくとも約２００ヌクレオチドの鎖長であり、セ
してピチア属菌種のゲノムＤＮＡの一部に相同なヌクレ
オチド配列を有する。組込みベクターの各種成分は、発
現カセットと選択可能なマーカー遺伝子とが第１の挿入
可能なＤＮＡフラグメントの３′末端と第２の挿入可能
ＴＬ Ｄ Ｎ Ａフラグメントの５′末端の間に位置づ
けられるように連続して配置され、ＤＮＡの線状フラグ
メントを形成する。第１および第２の挿入可能なＤＮＡ
フラグメントは、それらがピチア・パストリスのゲノム
内での方向と同じになるように、その連紐配置された線
状７ラグメ／ト内で互に対して方向づけられる。
ぞれ少なくとも約２００ヌクレオチドの鎖長であり、セ
してピチア属菌種のゲノムＤＮＡの一部に相同なヌクレ
オチド配列を有する。組込みベクターの各種成分は、発
現カセットと選択可能なマーカー遺伝子とが第１の挿入
可能なＤＮＡフラグメントの３′末端と第２の挿入可能
ＴＬ Ｄ Ｎ Ａフラグメントの５′末端の間に位置づ
けられるように連続して配置され、ＤＮＡの線状フラグ
メントを形成する。第１および第２の挿入可能なＤＮＡ
フラグメントは、それらがピチア・パストリスのゲノム
内での方向と同じになるように、その連紐配置された線
状７ラグメ／ト内で互に対して方向づけられる。
宿主菌株を形質転換するために使用されるＤＮＡは、少
なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を含むことが
必要である。これは形質転換用ＤＮＡを組み込んだ微生
物の選択および分離を容易にする。マーカー遺伝子は宿
主が持っていなかった表現型特性（例えば非形質転換宿
主菌株が特定アミノ酸の生合成経路に欠損を有する場合
に、その特定アミノ酸を生産する能力の回復）を形質転
換微生物に付与する。
なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を含むことが
必要である。これは形質転換用ＤＮＡを組み込んだ微生
物の選択および分離を容易にする。マーカー遺伝子は宿
主が持っていなかった表現型特性（例えば非形質転換宿
主菌株が特定アミノ酸の生合成経路に欠損を有する場合
に、その特定アミノ酸を生産する能力の回復）を形質転
換微生物に付与する。
このような組込みＤＮＡ形質転換においては、一般に酵
母の細胞壁を酵素により除去してスフェロプラストを形
成する。そのスフェロプラストを例えばポリエチレング
リコールのようなポリアルコールの存在下で組込み用Ｄ
ＮＡと接触させる。
母の細胞壁を酵素により除去してスフェロプラストを形
成する。そのスフェロプラストを例えばポリエチレング
リコールのようなポリアルコールの存在下で組込み用Ｄ
ＮＡと接触させる。
その後スフェロプラストの細胞壁を再生させ、そして選
択マーカー遺伝子の発現を必要とする条件にさらすこと
により形質転換酵母細胞を選択する。
択マーカー遺伝子の発現を必要とする条件にさらすこと
により形質転換酵母細胞を選択する。
当分野で習熟した者は、別のＤＮＡ配列もまた本発明の
実施において使用されるベクター（例えば細菌プラスミ
ドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡなど）に挿入され
得ることを認めるであろう。このような配列は細菌宿主
中でのこれらのベクターの増幅および維持を可能にする
。
実施において使用されるベクター（例えば細菌プラスミ
ドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡなど）に挿入され
得ることを認めるであろう。このような配列は細菌宿主
中でのこれらのベクターの増幅および維持を可能にする
。
本発明の上記プラスミドは酵母菌株を形質転換するのに
有用である。本発明の新規ＤＮＡ構築物を用いる酵母に
よるＴＮＦ発現の調節は、適当な誘導条件下または非誘
導条件下で形質転換菌株を生育させることにより達成さ
れる。例えば、第８．９および１０図に示した目下のと
ころ好適な調節領域を使用する遺伝子発現は、形質転換
微生物を炭素源飢餓に付すことにより達成される。種々
のカタボライト抑制および非カタボライト抑制炭素源上
で増殖させた後の炭素源飢餓は、本発明の目下好適な調
節領域の支配下に維持された遺伝子産物の発現を誘導す
る。形質転換された適当な酵母菌種による遺伝子産物の
発現を達成する別の方法は、形質転換酵母をメタノール
上で生育させることである。目的の遺伝子産物の発現を
誘導するさらに別の方法は、形質転換酵母を非カタボラ
イト抑制炭素源を含む培地上で生育させることである。
有用である。本発明の新規ＤＮＡ構築物を用いる酵母に
よるＴＮＦ発現の調節は、適当な誘導条件下または非誘
導条件下で形質転換菌株を生育させることにより達成さ
れる。例えば、第８．９および１０図に示した目下のと
ころ好適な調節領域を使用する遺伝子発現は、形質転換
微生物を炭素源飢餓に付すことにより達成される。種々
のカタボライト抑制および非カタボライト抑制炭素源上
で増殖させた後の炭素源飢餓は、本発明の目下好適な調
節領域の支配下に維持された遺伝子産物の発現を誘導す
る。形質転換された適当な酵母菌種による遺伝子産物の
発現を達成する別の方法は、形質転換酵母をメタノール
上で生育させることである。目的の遺伝子産物の発現を
誘導するさらに別の方法は、形質転換酵母を非カタボラ
イト抑制炭素源を含む培地上で生育させることである。
本発明の目下好適な調節領域は、これらの調節領域がい
ろいろな条件下で機能することがわかったので、全ての
酵母菌株によるＴＮＦ発現のために使用しうる。従って
、メタノールまたは非カタボライト抑制炭素源上で増殖
しうる酵母は直接ＴＮＦを生育させることができ、一方
力タボライド抑制炭素源上で増殖しうる酵母は、このよ
うにして増殖させた酵母細胞を炭素源欠乏の条件に付す
ことによりＴＮＦを生産させることができる。
ろいろな条件下で機能することがわかったので、全ての
酵母菌株によるＴＮＦ発現のために使用しうる。従って
、メタノールまたは非カタボライト抑制炭素源上で増殖
しうる酵母は直接ＴＮＦを生育させることができ、一方
力タボライド抑制炭素源上で増殖しうる酵母は、このよ
うにして増殖させた酵母細胞を炭素源欠乏の条件に付す
ことによりＴＮＦを生産させることができる。
種々の調節領域−コード配列構築物を使用する本発明方
法で利用するのに適した形質転換酵母菌株には以下の属
： カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ） クロエケラ（ＫｌｏｍｃｋｍｒｃＬ） サツカロミセス（Ｓａｅｅｈａｒｏｍｙｃｇｔｔ）シゾ
サツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏａａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ）ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）ハンセヌ
ラ（Ｈａｎｓｇｎｕｌａ） トルロプシス（Ｔｏｒｒｂｌｏｐｓｉｓ）ピチア（Ｐｉ
ｃｈｉａ） クルイベロミセス（ＩＣｌｕｙｖｍｒｏｒｎｙｃｅｓ）
の菌種が含まれる。これらの属に含まれる酵母はそれら
の取扱い上の安全性、増殖条件などがすでに確立されて
いて当業者によく知られているので好適である。
法で利用するのに適した形質転換酵母菌株には以下の属
： カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ） クロエケラ（ＫｌｏｍｃｋｍｒｃＬ） サツカロミセス（Ｓａｅｅｈａｒｏｍｙｃｇｔｔ）シゾ
サツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏａａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ）ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）ハンセヌ
ラ（Ｈａｎｓｇｎｕｌａ） トルロプシス（Ｔｏｒｒｂｌｏｐｓｉｓ）ピチア（Ｐｉ
ｃｈｉａ） クルイベロミセス（ＩＣｌｕｙｖｍｒｏｒｎｙｃｅｓ）
の菌種が含まれる。これらの属に含まれる酵母はそれら
の取扱い上の安全性、増殖条件などがすでに確立されて
いて当業者によく知られているので好適である。
本発明の１つの実施態様においてＴＮＦの生産のために
使用される特に好適な酵母菌株は、炭素／エネルギー源
としてのメタノール上で生育しうる酵母菌株である。な
ぜならこの種の宿主は上記の目下好適なメタノール応答
性調節領域を十分に利用することができるからである。
使用される特に好適な酵母菌株は、炭素／エネルギー源
としてのメタノール上で生育しうる酵母菌株である。な
ぜならこの種の宿主は上記の目下好適なメタノール応答
性調節領域を十分に利用することができるからである。
メタノール上で生育しうろことが知られている酵母には
以下の属： カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ） クロエケラ（Ｉｒｌｏｇｅｋａｒａ ）サツカロミセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｇａ）ロドトルラ（Ｒｈｏｄ
ｏｔｏｒｕｌａ ）ハンセヌラ（ＨａｆＬｓｇ％罰α） トルロプシス（Ｔｏｒｘｌｏｐｓｉａ ）ピチア（Ｐｉ
ｃｈｉａ ） の菌種が含まれる。
以下の属： カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ） クロエケラ（Ｉｒｌｏｇｅｋａｒａ ）サツカロミセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｇａ）ロドトルラ（Ｒｈｏｄ
ｏｔｏｒｕｌａ ）ハンセヌラ（ＨａｆＬｓｇ％罰α） トルロプシス（Ｔｏｒｘｌｏｐｓｉａ ）ピチア（Ｐｉ
ｃｈｉａ ） の菌種が含まれる。
本発明の目下好適な調節領域はまた非カタボライト抑制
炭素源上での増殖ならびに炭素源欠乏の条件により誘導
されるので、 グルコース アセテート グリセロール エタノール ラクトース ガラクトース フルクトース シュークロース のような非メタノール基質上で生育しうる酵母菌株もま
た不発明の実施において有用である。宿主微生物を適当
な非カタボライト抑制、非メタノール基質上源（例えば
グリセロールやガラクトース）上で生育させるか、また
は宿主微生物を適当なカタボライト抑制炭素源（例えば
エタノール、グルコースおよびフルクトース）上で生育
させたのちにその微生物を炭素源欠乏条件に付すことに
より、本発明の目下好適な調節領域の支配下でＴＮＦの
発現を達成することができる。
炭素源上での増殖ならびに炭素源欠乏の条件により誘導
されるので、 グルコース アセテート グリセロール エタノール ラクトース ガラクトース フルクトース シュークロース のような非メタノール基質上で生育しうる酵母菌株もま
た不発明の実施において有用である。宿主微生物を適当
な非カタボライト抑制、非メタノール基質上源（例えば
グリセロールやガラクトース）上で生育させるか、また
は宿主微生物を適当なカタボライト抑制炭素源（例えば
エタノール、グルコースおよびフルクトース）上で生育
させたのちにその微生物を炭素源欠乏条件に付すことに
より、本発明の目下好適な調節領域の支配下でＴＮＦの
発現を達成することができる。
特に好適な宿主酵母菌株はヒスチジンの生産能力を欠損
した突然変異株ピチア・パストリスＧＴｓ１１５である
。ＧＴＳ １１５はヒスチジノールデヒドロゲナーゼコ
ード遺伝子に影響を及ぼすヒスチジン経路の欠損の結果
として、突然変異遺伝子型ｈｉｓ ４をもつと指定され
た。ＧＴＳｌ １５はピチア・パストリスＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３０から誘導され、イリノイ州ビオーリアの
米国農務省、ノザン・リージョナル・リサーチ・センタ
ー（ｔｈｅＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｇｇｉｏｎａｌ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ （ｇｎｉａｒ）に受託番号ＮＲＲＬ
Ｙ−１５８５１として寄託された。
した突然変異株ピチア・パストリスＧＴｓ１１５である
。ＧＴＳ １１５はヒスチジノールデヒドロゲナーゼコ
ード遺伝子に影響を及ぼすヒスチジン経路の欠損の結果
として、突然変異遺伝子型ｈｉｓ ４をもつと指定され
た。ＧＴＳｌ １５はピチア・パストリスＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３０から誘導され、イリノイ州ビオーリアの
米国農務省、ノザン・リージョナル・リサーチ・センタ
ー（ｔｈｅＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｇｇｉｏｎａｌ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ （ｇｎｉａｒ）に受託番号ＮＲＲＬ
Ｙ−１５８５１として寄託された。
この特定宿主はヒスチジン合成経路が欠損した栄養要求
変異株であるので有用である。この宿主を、もちろん他
のＤＮＡ配列も含むがとりわけＨＩ：Ｅ４遺伝子機能を
コードする配列を含むベクターで形質転換すると、容易
に形質転換宿主を選択することができる。
変異株であるので有用である。この宿主を、もちろん他
のＤＮＡ配列も含むがとりわけＨＩ：Ｅ４遺伝子機能を
コードする配列を含むベクターで形質転換すると、容易
に形質転換宿主を選択することができる。
本発明の実施において有用な他の好適な酵母菌株は突然
変異ピチア・パストリスＧ５１９０であり、この菌株は
アルギニノコハク酸リアーゼコード遺伝子に影響を及ぼ
すアルギニン合成経路が欠損した突然変異株である。Ｇ
５１９０はピチア・パストリスＮＲＲＬ １’−１１
４３０から誘導され、イリノイ州ビオーリアの米国農務
省、ノザン・リーショナル・リサーチ・センターに受託
番号ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４として寄託された。
変異ピチア・パストリスＧ５１９０であり、この菌株は
アルギニノコハク酸リアーゼコード遺伝子に影響を及ぼ
すアルギニン合成経路が欠損した突然変異株である。Ｇ
５１９０はピチア・パストリスＮＲＲＬ １’−１１
４３０から誘導され、イリノイ州ビオーリアの米国農務
省、ノザン・リーショナル・リサーチ・センターに受託
番号ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４として寄託された。
さらに別の好適な宿主酵母菌株は、ヒスチジンとアルギ
ニンの両方の合成経路が欠損した２重栄養要求変異株Ｐ
ＰＦ１である。ＰＰＰｌはヒスチジノールデヒドロゲナ
ーゼコード遺伝子に影響するヒスチジン経路と、アルギ
ニノコハク酸リアーゼコード遺伝子に影響するアルギニ
ノ経路の両方が欠損している。ＰＰＦｌはイリノイ州ビ
オーリアの米国農務省、ノザン・リージョナル・リサー
チ・センターに受託番号ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７と
して寄託された。
ニンの両方の合成経路が欠損した２重栄養要求変異株Ｐ
ＰＦ１である。ＰＰＰｌはヒスチジノールデヒドロゲナ
ーゼコード遺伝子に影響するヒスチジン経路と、アルギ
ニノコハク酸リアーゼコード遺伝子に影響するアルギニ
ノ経路の両方が欠損している。ＰＰＦｌはイリノイ州ビ
オーリアの米国農務省、ノザン・リージョナル・リサー
チ・センターに受託番号ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７と
して寄託された。
大腸菌（Ｅｓｃｈａｒｉｃ／ｌａ ｃｏｌｉ）もまた本
発明プラスミドの増幅のために適した宿主である。当分
野で習熟した者は、大腸菌の多くの菌株が容易に入手で
きしかも適当な宿主であることを認めるであろう。
発明プラスミドの増幅のために適した宿主である。当分
野で習熟した者は、大腸菌の多くの菌株が容易に入手で
きしかも適当な宿主であることを認めるであろう。
ピチア・パストリスの形質転換法
ピチア・パストリスを形質転換するための実験的手法は
以前に開示されており、以下（実施例Ｉ）でより詳しく
説明する。
以前に開示されており、以下（実施例Ｉ）でより詳しく
説明する。
ピチア・パストリスは、細胞壁の酵素消化によりスフェ
ロプラストを得、そのスフェロプラストを形質転換用Ｄ
ＮＡと混合してカルシウムイオン８よびポリエチレング
リコールの存在下にインキュベーションし、その後宿主
菌株が生育し得ない遺伝子産物を欠いた選択増殖培地で
そのスフェロプラストを再生することにより形質転換さ
れる。
ロプラストを得、そのスフェロプラストを形質転換用Ｄ
ＮＡと混合してカルシウムイオン８よびポリエチレング
リコールの存在下にインキュベーションし、その後宿主
菌株が生育し得ない遺伝子産物を欠いた選択増殖培地で
そのスフェロプラストを再生することにより形質転換さ
れる。
形質転換用ＤＮＡは宿主菌株には存在しない遺伝子産物
をコードする遺伝子を含み、それ故に形質転換された細
胞のみが使用した選択増殖培地上で生き残る。
をコードする遺伝子を含み、それ故に形質転換された細
胞のみが使用した選択増殖培地上で生き残る。
目的生産物のヒ）＆瘍壊死因子は、調節領域がＴＮＦを
コードするポリペプチドコード領域の発現を誘導する条
件下で、形質転換細胞を増殖させることにより生産され
る。当分野で習熟した者は過度の実験を行うことなくこ
のような適当な培養条件を容易に決定し得るであろう。
コードするポリペプチドコード領域の発現を誘導する条
件下で、形質転換細胞を増殖させることにより生産され
る。当分野で習熟した者は過度の実験を行うことなくこ
のような適当な培養条件を容易に決定し得るであろう。
ひとたび細胞の増殖およびＴＮＦの発現が許容レベルま
で達すると、生産物は当業者に知られたいろいろなタン
パク質回収手段を用いて回収される。例えば、回収方法
はガラスピーズとの激しい混合により細胞を破壊し、そ
の後遠心して可溶性タンパク質抽出物を得ることを包含
する。
で達すると、生産物は当業者に知られたいろいろなタン
パク質回収手段を用いて回収される。例えば、回収方法
はガラスピーズとの激しい混合により細胞を破壊し、そ
の後遠心して可溶性タンパク質抽出物を得ることを包含
する。
分離したタンパク質含有画分は、例えば細胞タンパク質
のポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＮＦ抗体との免
疫反応、生物学的活性などの種々の方法で検定される。
のポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＮＦ抗体との免
疫反応、生物学的活性などの種々の方法で検定される。
これらの検定のいくつがは実施例でより詳細に説明する
。
。
本発明は今や以下の非限定的実施例に関してより詳しく
説明されるであろう。
説明されるであろう。
（実施例）
実施例全体に関係がある一般情報：
菌株
ピチア・パストリスＧＴ！； １１５ （ｈｉｓ４ ）
（、Ｍ７？ＲＬ Ｙ−１５８５１〕はこれらの実施
例で使用した宿主酵母菌株であった。
（、Ｍ７？ＲＬ Ｙ−１５８５１〕はこれらの実施
例で使用した宿主酵母菌株であった。
大腸菌に一１２株Ｃ３Ｈ７（ｌａｃ Ｙ ｒｐａ Ｌｔ
ｈｉ ）はヒ）ＴＮＦの大腫菌発現のために使用し、
′大腸菌ＤＧ ７５’ （ｈｓｄｌ、１１−６．１
５ＬｃＹ、 ｔｈｒ−１，５ｘｐＥ４４、ｔｏｎＡ２１
ラムダ〔−〕）はプラスミドの構築並びにプラスミドＤ
ＮＡの増幅のために使用した。
ｈｉ ）はヒ）ＴＮＦの大腫菌発現のために使用し、
′大腸菌ＤＧ ７５’ （ｈｓｄｌ、１１−６．１
５ＬｃＹ、 ｔｈｒ−１，５ｘｐＥ４４、ｔｏｎＡ２１
ラムダ〔−〕）はプラスミドの構築並びにプラスミドＤ
ＮＡの増幅のために使用した。
プラスミド
プラスミドｐ ＴＮＦ Ｉ、ｐＴＨＦＫ−△、ｐ ＢＳ
ＡＧＩ５１％ｐＡｏ ８０４、ｐＴＮＦ４／ ｐＴＮＦ
５、およびｐＴＮＦ６／ｐＴＮＦ７はそれぞれ第１．
３．４．５．６Ｓよび７図に例示される。
ＡＧＩ５１％ｐＡｏ ８０４、ｐＴＮＦ４／ ｐＴＮＦ
５、およびｐＴＮＦ６／ｐＴＮＦ７はそれぞれ第１．
３．４．５．６Ｓよび７図に例示される。
以下の実施例で使用した緩衝液および溶液は次の組成を
有する： １Ｍトリス緩衝液： １１２０８００ｍｌ中のトリス塩
基１２１．１ｔ；濃（３５％）ＨＣ１水溶液を加 えて所望のｐＨ値に調整；最終的な ｐＨ調整前に溶液を室温まで冷却さ せ、最終容量１ｔに希釈。
有する： １Ｍトリス緩衝液： １１２０８００ｍｌ中のトリス塩
基１２１．１ｔ；濃（３５％）ＨＣ１水溶液を加 えて所望のｐＨ値に調整；最終的な ｐＨ調整前に溶液を室温まで冷却さ せ、最終容量１ｔに希釈。
ＴＥ緩衝液： ０．０１Ｍ（ｐＨ７，４） ）リス
緩衝液中の１．０倶Ｍ ＥＤＴＡ ＳＤＳゲル泳効用 緩衝液：６２，５ｍＭ ）リス−ＨｃｔｃｐＨ６，８
）２％ ５ＤＳ １０％ グリセロール １００ｍＭ ジチオトレイトール ０．００１％ ブロモフェノールブルーＳＥＤ：
１Ｍソルビトール２５惰Ｍ ＥＤＴＡ ５０ｍＭ ＤＴＴ ・・・ｐＨ８に調整 ＳＣＥ緩衝液 １Ｍソルビトール １０ｆｒＬＡ／ クエン酸ナトリウム１倶Ｍ ＥＤ
ＴＡ ・・・ＨＣｌでｐＨ５，８に調整 Ｃａｂ： ＩＭ ソルビトール１０ｔ
ｎＭ ＣａＣＬｚ １０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）・・・濾過滅菌 ＰＥＧ溶ｇ： ２０％ポリエチレングリコール−３
３５０１０ｍＭ ＣａＣＬｚ １ＯｒｒＬＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）・・・濾
過滅菌 ５Ｏ８＝ ＩＭ ソルビトール０．３Ｘ Ｙ
ＰＤ培地 １０ ｍＡｆ ＣａＣＬｚ 培地 大腸菌の形質転換体は１００μ２／祷アンピシリンを含
むＬＢ培地中で増殖させた。
緩衝液中の１．０倶Ｍ ＥＤＴＡ ＳＤＳゲル泳効用 緩衝液：６２，５ｍＭ ）リス−ＨｃｔｃｐＨ６，８
）２％ ５ＤＳ １０％ グリセロール １００ｍＭ ジチオトレイトール ０．００１％ ブロモフェノールブルーＳＥＤ：
１Ｍソルビトール２５惰Ｍ ＥＤＴＡ ５０ｍＭ ＤＴＴ ・・・ｐＨ８に調整 ＳＣＥ緩衝液 １Ｍソルビトール １０ｆｒＬＡ／ クエン酸ナトリウム１倶Ｍ ＥＤ
ＴＡ ・・・ＨＣｌでｐＨ５，８に調整 Ｃａｂ： ＩＭ ソルビトール１０ｔ
ｎＭ ＣａＣＬｚ １０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）・・・濾過滅菌 ＰＥＧ溶ｇ： ２０％ポリエチレングリコール−３
３５０１０ｍＭ ＣａＣＬｚ １ＯｒｒＬＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）・・・濾
過滅菌 ５Ｏ８＝ ＩＭ ソルビトール０．３Ｘ Ｙ
ＰＤ培地 １０ ｍＡｆ ＣａＣＬｚ 培地 大腸菌の形質転換体は１００μ２／祷アンピシリンを含
むＬＢ培地中で増殖させた。
ピチア・バストリスの振盪フラスコ培養物はＭＤ、ＭＧ
ＹまたはＭｕ培地中で増殖させ、発酵槽培養物はＹＴＭ
−４微量ミネラルを含む１Ｍ３培地中で増殖させた。炭
素源は２．０％グルコース、１．０％グリセロールまた
は０．５％メタノールであった。
ＹまたはＭｕ培地中で増殖させ、発酵槽培養物はＹＴＭ
−４微量ミネラルを含む１Ｍ３培地中で増殖させた。炭
素源は２．０％グルコース、１．０％グリセロールまた
は０．５％メタノールであった。
次の培地の処方はすべて培地１を当たりの量として表さ
れる： ２ＸＹＴ−酵母エキス（１０グ）、トリプトン（１６ｆ
）、ＮａＣｔ（５？ ） Ｙ Ｐ Ｄ −酵母：ｘ、キ、ｘ、 （１０ｆ’ ）、
ペプト／（２０グ）およびデキストロース（１０ｒ） ＬＢ□酵母エキス（５２）、トリプトン（１（１７）、
ＮａＣＬ（１０ＳＦ ）そしてＮａＯＨでｐＨ７，５に
調整 ＬＢＡｐ−ＬＢ＋１００■ア／ピシリンＭＤ□醇母窒素
塩基（ＹＮＢ、 １３．４１ ）、ビオチン（４００μ
？）およびデキストロース（１（１） ＭＤ （Ｚ、） −ＹＮＢ （１３，４１）、ビオチン
（４００μ？）およびデキストロース（１，（１）ＭＤ
Ｉ−ＭＤ＋ヒスチジン（４００ｍｇ）ＭＧＹ −ＹＮＢ
（１３，４Ｆ ）、ビオチン（４００μ７）８よびグ
リセロール（１０ｄ） Ｍｕ −Ｙ Ｎ Ｂ （１３，４ｆ ）、ビオチン（４
００μ？）８よびＭｇＱＨ（５祷） ＫＤＲ−ＹＮＢ （１３，４ｒ ）、ビオチン（４０〇
−ス（１０５’）、寒天（１（１）、ヒスチジン検定混
合物（２ｖ）およびア ミノ酸混合物（次のアミンｒＲ：グルタミン、メチオニ
ン、リシン、ロイン／ およびインロイシンそれぞれ５０■） ＫＤＨＲ−ＫＤＲ＋ヒスチジン（４００ｍｇ）ＦＭ−２
１塩培地： Ｈ３Ｐ０４（８５％）３．５成 ＣａＳＯ４・２Ｈ２００，１５Ｆ ＫｚＳＯ４２，３８ｔ Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・７Ｈ２０１，９５ｆ！ＫＯＨ０，６
５ｆｔ ＦＣ８０４・７Ｈ２００，０６５ｆ ＣｗＳＯ４・５Ｈ２００，００６ｒ Ｚ ｎ Ｓ ０４・７Ｈ２００，０２０りＭｎＳｉＯ３
・ＨｚＯＯ，ＯＯ３？ ビオチン ０．００００４１グ１を水 １Ｍ３塩培地： ＫＨ２ＰＯ４１５，０？ ＫｚＨＰ Ｏ４１，０９ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５０？ ＣａＳＯ４’ ２１ｈＯＯ，０４Ｓ’ （ＮＨ４）２Ｓ０４ ３．０ Ｏ
ｆ！ビオチン ０．００００５ ｒ
ｐＨ５，４に調整 １を水ＹＴＭ−４微
量ミネラル濃縮液： Ｆ ａＳｏ４” ７Ｈ２０６５，０？ Ｃｕ５Ｏａ・５Ｈ２０６，０？ Ｚ ｎＳＯ＜ ” ７１ｈＯ２０，ＯｆＭ ？ｌ Ｓ
０４ ・Ｈ２Ｏ３，ＯＳ’１を水 培地１を当たり２’５０μを添加 実施例１゜ 形質転換法 ■、ピチア・パストリス Ａ、細胞増殖 １、 ピチア・パストリスＧＴＳ １１５ （ＮＲＲＬ
）’−１５８５１）のコロニーをＹＰＤ培地約１０成に
接種し、３０℃で１２〜２０時間振盪培養する。
れる： ２ＸＹＴ−酵母エキス（１０グ）、トリプトン（１６ｆ
）、ＮａＣｔ（５？ ） Ｙ Ｐ Ｄ −酵母：ｘ、キ、ｘ、 （１０ｆ’ ）、
ペプト／（２０グ）およびデキストロース（１０ｒ） ＬＢ□酵母エキス（５２）、トリプトン（１（１７）、
ＮａＣＬ（１０ＳＦ ）そしてＮａＯＨでｐＨ７，５に
調整 ＬＢＡｐ−ＬＢ＋１００■ア／ピシリンＭＤ□醇母窒素
塩基（ＹＮＢ、 １３．４１ ）、ビオチン（４００μ
？）およびデキストロース（１（１） ＭＤ （Ｚ、） −ＹＮＢ （１３，４１）、ビオチン
（４００μ？）およびデキストロース（１，（１）ＭＤ
Ｉ−ＭＤ＋ヒスチジン（４００ｍｇ）ＭＧＹ −ＹＮＢ
（１３，４Ｆ ）、ビオチン（４００μ７）８よびグ
リセロール（１０ｄ） Ｍｕ −Ｙ Ｎ Ｂ （１３，４ｆ ）、ビオチン（４
００μ？）８よびＭｇＱＨ（５祷） ＫＤＲ−ＹＮＢ （１３，４ｒ ）、ビオチン（４０〇
−ス（１０５’）、寒天（１（１）、ヒスチジン検定混
合物（２ｖ）およびア ミノ酸混合物（次のアミンｒＲ：グルタミン、メチオニ
ン、リシン、ロイン／ およびインロイシンそれぞれ５０■） ＫＤＨＲ−ＫＤＲ＋ヒスチジン（４００ｍｇ）ＦＭ−２
１塩培地： Ｈ３Ｐ０４（８５％）３．５成 ＣａＳＯ４・２Ｈ２００，１５Ｆ ＫｚＳＯ４２，３８ｔ Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・７Ｈ２０１，９５ｆ！ＫＯＨ０，６
５ｆｔ ＦＣ８０４・７Ｈ２００，０６５ｆ ＣｗＳＯ４・５Ｈ２００，００６ｒ Ｚ ｎ Ｓ ０４・７Ｈ２００，０２０りＭｎＳｉＯ３
・ＨｚＯＯ，ＯＯ３？ ビオチン ０．００００４１グ１を水 １Ｍ３塩培地： ＫＨ２ＰＯ４１５，０？ ＫｚＨＰ Ｏ４１，０９ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５０？ ＣａＳＯ４’ ２１ｈＯＯ，０４Ｓ’ （ＮＨ４）２Ｓ０４ ３．０ Ｏ
ｆ！ビオチン ０．００００５ ｒ
ｐＨ５，４に調整 １を水ＹＴＭ−４微
量ミネラル濃縮液： Ｆ ａＳｏ４” ７Ｈ２０６５，０？ Ｃｕ５Ｏａ・５Ｈ２０６，０？ Ｚ ｎＳＯ＜ ” ７１ｈＯ２０，ＯｆＭ ？ｌ Ｓ
０４ ・Ｈ２Ｏ３，ＯＳ’１を水 培地１を当たり２’５０μを添加 実施例１゜ 形質転換法 ■、ピチア・パストリス Ａ、細胞増殖 １、 ピチア・パストリスＧＴＳ １１５ （ＮＲＲＬ
）’−１５８５１）のコロニーをＹＰＤ培地約１０成に
接種し、３０℃で１２〜２０時間振盪培養する。
２、ＹＰＤ培地１００１に種培養物を接種して約０．０
０１の０Ｄ６０ｏを得る。３０℃で約１２〜２０時間振
盪する。
０１の０Ｄ６０ｏを得る。３０℃で約１２〜２０時間振
盪する。
３、 ０Ｄ６ＤＯが約０．２〜０．３になったとぎ（イ
）１６２０時間後） １５００Ｘｒ で５分遠心する
ことにより培養物を回収する。
）１６２０時間後） １５００Ｘｒ で５分遠心する
ことにより培養物を回収する。
Ｂ、スフェロプラストの調製
１、細胞を滅菌水１０成で１回洗う。（工程１〜５の遠
心はすべて１５００Ｘｆで５分行う。）２、細胞を新た
に調製したＳＢＤｌｏｍｌで１回洗う。
心はすべて１５００Ｘｆで５分行う。）２、細胞を新た
に調製したＳＢＤｌｏｍｌで１回洗う。
３、細胞を滅菌ＩＭンルビトールｌＱｍＪで１回洗う。
４、細胞をＳＣＥ緩衝緩衝液１０中Δ中濁する。
５、 ３ｍｇ／ｍＡチモリアーゼｌＯα０００（？イル
ス・ラボラトリーズ製）７．５μｔを加える。細胞を３
０℃で約１０分間インキュベーションする。
ス・ラボラトリーズ製）７．５μｔを加える。細胞を３
０℃で約１０分間インキュベーションする。
６、 １０００Ｘｒで５〜ｌＯ分遠心することによりス
フェロプラストを滅菌１Ｍソルビトール１０廐で１回洗
う。（遠心時間および速度は変化しうる；スフェロプラ
ストを沈殿させるのに十分であるが、遠心力によりそれ
らを破壊しない程度に遠心する。） ７、細胞を滅菌Ｃａ５１０ｍ１で１回洗９゜８、細胞を
合計１．ＱｍｌのＣａＳ 中に懸濁する。
フェロプラストを滅菌１Ｍソルビトール１０廐で１回洗
う。（遠心時間および速度は変化しうる；スフェロプラ
ストを沈殿させるのに十分であるが、遠心力によりそれ
らを破壊しない程度に遠心する。） ７、細胞を滅菌Ｃａ５１０ｍ１で１回洗９゜８、細胞を
合計１．ＱｍｌのＣａＳ 中に懸濁する。
Ｃ０形質転換
１、ＤＮＡ試料（２０μを容量まで）を１２×７５闘の
滅菌ポリプロピレン管に加える。
滅菌ポリプロピレン管に加える。
（ＤＮＡはＴＥ緩衝液のような適当な緩衝液中に含まれ
るべきである；少量のＤＮＡで最大の形質転換頻度を得
るために、各試料に５■／ ｍｌ超音波処理大腸菌ＤＮ
Ａ約１μｔを加えることが有利である。） ２、スフェロプラスト１００μｔを各ＤＮＡ試料に加え
、室温で約２０分間インキュベーションする。
るべきである；少量のＤＮＡで最大の形質転換頻度を得
るために、各試料に５■／ ｍｌ超音波処理大腸菌ＤＮ
Ａ約１μｔを加えることが有利である。） ２、スフェロプラスト１００μｔを各ＤＮＡ試料に加え
、室温で約２０分間インキュベーションする。
３、ＰＥＧ溶液１−を各試料に加え、室温で約１５分間
インキュベーションする。
インキュベーションする。
Ｄ、スフェロプラストの再生
１、形質転換試料を用意する少なくとも３０分前に、プ
レート当たり再生寒天１０ｍ１の底部寒天層を注ぐ。形
質転換試料がＳＯ８中にある間に４５〜５０℃の浴中の
管に再生寒天ＫＤＲまたはＫＤＨＲのｌＱｍＡ’アリコ
ートを分配する。４５〜５０℃に保持した溶融再生寒天
の１０幅アリコートに形質転換試料の５０．２５０また
は７００μｔアリコートを加え、再生寒天の固体１０ｒ
ｎｌ底部寒天層を含むプレート上にそれぞれを注入する
。
レート当たり再生寒天１０ｍ１の底部寒天層を注ぐ。形
質転換試料がＳＯ８中にある間に４５〜５０℃の浴中の
管に再生寒天ＫＤＲまたはＫＤＨＲのｌＱｍＡ’アリコ
ートを分配する。４５〜５０℃に保持した溶融再生寒天
の１０幅アリコートに形質転換試料の５０．２５０また
は７００μｔアリコートを加え、再生寒天の固体１０ｒ
ｎｌ底部寒天層を含むプレート上にそれぞれを注入する
。
２、３０℃で３〜５日間インキュベーションする。
■、大腸菌
ダジャー） （Ｄａｇｅｒｔ）およびエールリッヒ（Ｅ
ｈｒｌｉ、ｈ） （Ｇａｎｇ ６ 、２３ （１９７９
）コの方法を用いて全ての大腸菌株を形質転換した。
ｈｒｌｉ、ｈ） （Ｇａｎｇ ６ 、２３ （１９７９
）コの方法を用いて全ての大腸菌株を形質転換した。
実施例■
ＴＮＦ遺伝子はｐＴＮＦｌのＢ２−Ｒ１フラグメント上
に存在する。そのＴＮＦ遺伝子をピチア・パストリス発
現ベクターｐＴＨＦＫ−Δ（第３図）またはｐＡＯ８０
４ｃ第４図）のＲ，部位へ挿入するためにｓ Ｂ２部位
は８１部位へ変換しなければならなかった。乞れは第２
図に概略的に示した戦略（ｓｔｒａｔｅｇｙ ）を使用
することにより達成された。
に存在する。そのＴＮＦ遺伝子をピチア・パストリス発
現ベクターｐＴＨＦＫ−Δ（第３図）またはｐＡＯ８０
４ｃ第４図）のＲ，部位へ挿入するためにｓ Ｂ２部位
は８１部位へ変換しなければならなかった。乞れは第２
図に概略的に示した戦略（ｓｔｒａｔｅｇｙ ）を使用
することにより達成された。
ｐＴＮＦｌをＢ２で消化して２本のフラグメントを得た
。大きい方の７ラグメントはＴＮＦ遺伝子と６ｒｉ２よ
びｂｌａ機能を含む。その大きい方のＢ２フラグメント
をそれ自体に連結させた。この中間プラスミドはｐＴＮ
Ｆ２と命名した。
。大きい方の７ラグメントはＴＮＦ遺伝子と６ｒｉ２よ
びｂｌａ機能を含む。その大きい方のＢ２フラグメント
をそれ自体に連結させた。この中間プラスミドはｐＴＮ
Ｆ２と命名した。
ｐＴＮＦ２をＢ２で切断し、そのＢ２部位に内部Ｒ，を
含むＥ −ＡｔＰ２リンカ−のダイマーを連結させてｐ
ＴＮＦ３を得た。この種の連結は、Ｂ−１６よびＢ２が
それらの認識部位の中央に同一の４つのヌクレオチド配
列を共有するので可能であった。自己連結実験に？いて
、Ｅ−Ａν２オリゴマーの／ｌｖ２末端は１りの誤対合
塩基対にもかかわらず別のリンカ・−分子のＡｖ２末端
と連結可能であることが知られていた。
含むＥ −ＡｔＰ２リンカ−のダイマーを連結させてｐ
ＴＮＦ３を得た。この種の連結は、Ｂ−１６よびＢ２が
それらの認識部位の中央に同一の４つのヌクレオチド配
列を共有するので可能であった。自己連結実験に？いて
、Ｅ−Ａν２オリゴマーの／ｌｖ２末端は１りの誤対合
塩基対にもかかわらず別のリンカ・−分子のＡｖ２末端
と連結可能であることが知られていた。
次いでプラスミドｐＴＮＦ３をＲ１で消化し、ＴＮＦ遺
伝子を含む小さい方の８１フラグメントを、アガロース
ゲルでのそのフラグメントの電気泳動分画化それに続く
電気溶出法により分離した。精製したＲ１フラグメント
はベクターｐＴＨＦＫ−△およびｐＡｏ ８０４のそれ
ぞれのＲ，部位へ挿入した。
伝子を含む小さい方の８１フラグメントを、アガロース
ゲルでのそのフラグメントの電気泳動分画化それに続く
電気溶出法により分離した。精製したＲ１フラグメント
はベクターｐＴＨＦＫ−△およびｐＡｏ ８０４のそれ
ぞれのＲ，部位へ挿入した。
第３図に示したプラスミドｐＴＨＦＫ−Δまプラスミド
ｐＴＨＢＳ３Ｖから次のようにして作製した。
ｐＴＨＢＳ３Ｖから次のようにして作製した。
プラスミドｐＴＨＢ！Ｆ；３ＶはプラスミドｐｓＡＯＨ
５（イリノイ州ビオーリアの米国農務省、ノザ／・リー
ジョナル・リサーチ・センターに受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−１５８６２として寄託された大腸菌宿主より入手可
能）から得られるピチア・パストリスｔ７） ＨＩ Ｓ
４、ＰＡＲＥＩＮよび５’−Ａ ＯＸ １配列、並び
にプラスミドｐＰＧ４．０（Ｉｆ；ＤＡにＮＲＲＬＢ−
１５８６８として寄託された大腸菌宿主より入手可能）
から得られるピチア・パストリスの３′−ＡＱＺＩ配列
を含む。ｐＴＨＢｓ３Ｖの３．６ｋｂｐＮｒ−Ｐｓ
ｐＢＲ３２２部分を、毒素配列（すなわちｐＢＲ３２２
のヌクレオチド１１００と２４８５の間の配列）を欠い
たｐＢＲ３２２系プラスミドから誘導された１、 ５
ｋｂｐ Ｎｒ−Ｐｐフラグメントと置き換えて、プラス
ミドｐＴＨＢｓ−３ＶＦＫを作製した。このプラスミド
を制限酵素Ｎαで消化した後自己連結させて、プラスミ
ドｐＴＨＦＫ−△を作った。従ってｐＴＨＦＫ−Δでは
大腸菌の毒素配列とｐＢＲ３２２からのＳ部位の両方が
欠失された。
５（イリノイ州ビオーリアの米国農務省、ノザ／・リー
ジョナル・リサーチ・センターに受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−１５８６２として寄託された大腸菌宿主より入手可
能）から得られるピチア・パストリスｔ７） ＨＩ Ｓ
４、ＰＡＲＥＩＮよび５’−Ａ ＯＸ １配列、並び
にプラスミドｐＰＧ４．０（Ｉｆ；ＤＡにＮＲＲＬＢ−
１５８６８として寄託された大腸菌宿主より入手可能）
から得られるピチア・パストリスの３′−ＡＱＺＩ配列
を含む。ｐＴＨＢｓ３Ｖの３．６ｋｂｐＮｒ−Ｐｓ
ｐＢＲ３２２部分を、毒素配列（すなわちｐＢＲ３２２
のヌクレオチド１１００と２４８５の間の配列）を欠い
たｐＢＲ３２２系プラスミドから誘導された１、 ５
ｋｂｐ Ｎｒ−Ｐｐフラグメントと置き換えて、プラス
ミドｐＴＨＢｓ−３ＶＦＫを作製した。このプラスミド
を制限酵素Ｎαで消化した後自己連結させて、プラスミ
ドｐＴＨＦＫ−△を作った。従ってｐＴＨＦＫ−Δでは
大腸菌の毒素配列とｐＢＲ３２２からのＳ部位の両方が
欠失された。
プラスミドｐＡＯ８０４はプラスミドｐＢ：５ＡＧＩ５
Ｉ（第４図参照；イリノイ州ビオーリアの米国農務省、
ノザン・リージョナル・リサーチ・センターにＮＲＲＬ
Ｂ−１８０２１として寄託された大腸菌宿主より入
手可能）、ｐＹＪ８ （イリノイ州ビオーリアの米国
農務省、ノザン・リージョナル・リサーチ・センターに
ＮＲＲＬ Ｂ−１５８８９として寄託された大腸菌宿
主より入手可能）およびｐＢＲ３２２から次のようにし
て作製した。まず初めに、ｐＢＲ３２２をＲｒで切断ｆ
ることｖＣｘｖｐＢＲ３２２の唯一のＲ１部位を除き、
その食い違い末端をＤＮＡポリメラーゼのＫ１ｇｔｓｏ
ｗフラグメントで修復し、その後再連結させた。このプ
ラスミドはｐＢＲ３２２（Ｒｔ−）と命名した。
Ｉ（第４図参照；イリノイ州ビオーリアの米国農務省、
ノザン・リージョナル・リサーチ・センターにＮＲＲＬ
Ｂ−１８０２１として寄託された大腸菌宿主より入
手可能）、ｐＹＪ８ （イリノイ州ビオーリアの米国
農務省、ノザン・リージョナル・リサーチ・センターに
ＮＲＲＬ Ｂ−１５８８９として寄託された大腸菌宿
主より入手可能）およびｐＢＲ３２２から次のようにし
て作製した。まず初めに、ｐＢＲ３２２をＲｒで切断ｆ
ることｖＣｘｖｐＢＲ３２２の唯一のＲ１部位を除き、
その食い違い末端をＤＮＡポリメラーゼのＫ１ｇｔｓｏ
ｗフラグメントで修復し、その後再連結させた。このプ
ラスミドはｐＢＲ３２２（Ｒｔ−）と命名した。
次に、プラスミドｐＢＲ３２２ｃＲ１−）をＰυ２で切
断したあとＢ２認識配列をもつ合成オリゴヌクレオチド
アダプターと連結させることにより、プラスミドｐＢＲ
３２２（Ａ’＋−）の唯一のＰτ２部位をＢ２部位に変
換した。このプラスミドはｐＢＲ３２２，（Ｒ１−Ｐｖ
２’″：Ｂ２）と命名した。
断したあとＢ２認識配列をもつ合成オリゴヌクレオチド
アダプターと連結させることにより、プラスミドｐＢＲ
３２２（Ａ’＋−）の唯一のＰτ２部位をＢ２部位に変
換した。このプラスミドはｐＢＲ３２２，（Ｒ１−Ｐｖ
２’″：Ｂ２）と命名した。
得られたプラスミドｐＢＲ３２２（Ｒｘ−、Ｐτ２−：
Ｂ２）はＢで開環し、そしてピチア・パストリスＨＩＳ
４遺伝子を含むｐＹＪ８出米のＢ２フラグメントと再連
結させた。このプラスミドはｐＢＲ３２２（Ｒ１−＋
Ｆ ｙ２− ： Ｂ２ ＨＩＳ ４ ）と命名した。
Ｂ２）はＢで開環し、そしてピチア・パストリスＨＩＳ
４遺伝子を含むｐＹＪ８出米のＢ２フラグメントと再連
結させた。このプラスミドはｐＢＲ３２２（Ｒ１−＋
Ｆ ｙ２− ： Ｂ２ ＨＩＳ ４ ）と命名した。
その後プラスミドｐＢＲ３２２（Ｒ，−、Ｐτ「：Ｂ２
ＨＩＳ４）はＣで開環シ、そこＩＫｐＥＳＡＧＩ５１（
第４図参照）から得られた２不のＣフラグメントのうち
小さい方を挿入した。そのＣフラグメントはピチア・パ
ストリスからの５’−ＡＯＸｌ および３’−ＡＯＸ１
調節配列、並びにＢ型肝炎表面抗原（ＨＢａＡｙ）コー
ド配列を含んでいる。このプラスミ ドはｐＢＲ３２２
（Ｒ１−Ｐν；：Ｂ２ ｇｚｓ４ ＡｏｘＨＥｓＡｇ）
と命名した。
ＨＩＳ４）はＣで開環シ、そこＩＫｐＥＳＡＧＩ５１（
第４図参照）から得られた２不のＣフラグメントのうち
小さい方を挿入した。そのＣフラグメントはピチア・パ
ストリスからの５’−ＡＯＸｌ および３’−ＡＯＸ１
調節配列、並びにＢ型肝炎表面抗原（ＨＢａＡｙ）コー
ド配列を含んでいる。このプラスミ ドはｐＢＲ３２２
（Ｒ１−Ｐν；：Ｂ２ ｇｚｓ４ ＡｏｘＨＥｓＡｇ）
と命名した。
後者のプラスミドはその後ｐＢｓＡＧＩ５１由米のＣフ
ラグメント内の唯−Ｓｔ部位をＲ１部位へ変換すべく処
理した。これはそのプラスミドをＳｔで切断したあと、
Ｒ１認識配列をもつ合成オリゴヌクレオチドアダプター
と連結させることにより達成された。このプラスミドは
ｐＢＲ３２２ＣＲｔ 。
ラグメント内の唯−Ｓｔ部位をＲ１部位へ変換すべく処
理した。これはそのプラスミドをＳｔで切断したあと、
Ｒ１認識配列をもつ合成オリゴヌクレオチドアダプター
と連結させることにより達成された。このプラスミドは
ｐＢＲ３２２ＣＲｔ 。
Ｐｖｚ ：Ｉｈ ＨＩ Ｓ ４ ＡＯＸ ＨＢｓＡｇ
：Ｓｔ−、Ｒ１”）と命名した。
：Ｓｔ−、Ｒ１”）と命名した。
最後に、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｒ１−、Ｐｖｚ：Ｂ
２ ＨｆＢ２ ＡＯＸ ＨＢｓＡｇ：Ｓｔ−、Ｒ１
＋）からＲ１フラグメント（ＨＢｓＡｇコード配列を含
む）を欠失させることにより所望のプラスミドｐＡＯ８
０４を得た。これは単に上記プラスミドを制限酵素Ｒ１
で消化したあと再連結することにより達成された。
２ ＨｆＢ２ ＡＯＸ ＨＢｓＡｇ：Ｓｔ−、Ｒ１
＋）からＲ１フラグメント（ＨＢｓＡｇコード配列を含
む）を欠失させることにより所望のプラスミドｐＡＯ８
０４を得た。これは単に上記プラスミドを制限酵素Ｒ１
で消化したあと再連結することにより達成された。
ＴＮＦ遺伝子はベクターｐＴＨＦＫ−ΔおよびｐＡ。
８０４甲のいずれかの方向で挿入された。ＡＯＸ１プロ
モーターに対するＴＮＦ遺伝子の方向はＲ８−Ａｖ
消化により決定した。こうして、プラスミドｐＴＮＦ４
およびｐＴＮＦ６ではその遺伝子が正しい方向にあって
、ＡＯＸ１プロモーターを読み取ることができる。大腸
菌宿主中に保有されたプラスミドｐＴＮＦ４およびｐＴ
ＮＦ６は、本出願が特許として発布された際に一般の人
々が利用し得るように、イリノイ州ビオーリアのノザン
・リージョナル・リサーチ・センターに寄託された。寄
託菌株はそれぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｅ−１８１１５
およびＮＲＲＬ Ｂ−１８１１４を指定された。ｐ
ＴＮＦ ５およびｐＴＮＦ７ではその遺伝子が反対の方
向にある。
モーターに対するＴＮＦ遺伝子の方向はＲ８−Ａｖ
消化により決定した。こうして、プラスミドｐＴＮＦ４
およびｐＴＮＦ６ではその遺伝子が正しい方向にあって
、ＡＯＸ１プロモーターを読み取ることができる。大腸
菌宿主中に保有されたプラスミドｐＴＮＦ４およびｐＴ
ＮＦ６は、本出願が特許として発布された際に一般の人
々が利用し得るように、イリノイ州ビオーリアのノザン
・リージョナル・リサーチ・センターに寄託された。寄
託菌株はそれぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｅ−１８１１５
およびＮＲＲＬ Ｂ−１８１１４を指定された。ｐ
ＴＮＦ ５およびｐＴＮＦ７ではその遺伝子が反対の方
向にある。
大腸菌株Ｃ３Ｈ７／ｐＴＮＦＩはＬＢＡｐ中で飽和状態
になるまで３０℃にて増殖させた。これらの条件下で、
λｐＬプロモーターは抑制されている。
になるまで３０℃にて増殖させた。これらの条件下で、
λｐＬプロモーターは抑制されている。
ＴＮＦ発現を誘導するために、上記の飽和培養物を２Ｘ
、ＹＴ培地申７６００＝約２．０に希釈し、４２℃で１
．５〜４時間インキュベーションした。４時間後にＡ６
０Ｇは約５．０となった。
、ＹＴ培地申７６００＝約２．０に希釈し、４２℃で１
．５〜４時間インキュベーションした。４時間後にＡ６
０Ｇは約５．０となった。
大腸菌溶菌液の調製
ＳＤＳ溶菌：大腸菌細胞は泳動用色素混合液（１％ＳＤ
Ｓ、５％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロー
ル％ １０惰Ｍ ＥＤＴＡ、 ０．０２５チブロモフ
エノールブルー）中にＡ６Ｇｏ＝約５０で懸濁し、沸騰
水浴中で５分間インキュベーションした。澄明な溶菌液
の約５〜１０ｐｔアリコートは５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
、これはＴＮＦ発現のために誘導された細胞中のＴＮＦ
に対する顕著なタンパク質バンドを示した。
Ｓ、５％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロー
ル％ １０惰Ｍ ＥＤＴＡ、 ０．０２５チブロモフ
エノールブルー）中にＡ６Ｇｏ＝約５０で懸濁し、沸騰
水浴中で５分間インキュベーションした。澄明な溶菌液
の約５〜１０ｐｔアリコートは５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
、これはＴＮＦ発現のために誘導された細胞中のＴＮＦ
に対する顕著なタンパク質バンドを示した。
リソチーム溶菌：大腸菌細胞はリソチーム溶菌媒体（５
ｏ ｍＭトリス、３０ｍＷ ＮａＣＬ、１ｍ９７ｍ１リ
ソチームおよび１ｍＭ弗化フェニルメチルスルホニル（
ＰＭＳＦ））中にａａｏｏ−約５０で懸濁し、４℃で３
０分間インキュベーションした。リソチーム処理後、試
料を３回の凍結−解凍サイクルに通し、そして小遠心機
で１０分または５Ｍ２４あるいは５Ａ６００ローターを
備えたノルパル（Ｆｌｏｒｖａｌ ｌ ）を使って１５
０００ ｒｐｍで１０分遠心した。澄明な上清を沈殿物
から分離して一２０℃で貯蔵した。１０〜２０μｔのア
リコートを５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
ｏ ｍＭトリス、３０ｍＷ ＮａＣＬ、１ｍ９７ｍ１リ
ソチームおよび１ｍＭ弗化フェニルメチルスルホニル（
ＰＭＳＦ））中にａａｏｏ−約５０で懸濁し、４℃で３
０分間インキュベーションした。リソチーム処理後、試
料を３回の凍結−解凍サイクルに通し、そして小遠心機
で１０分または５Ｍ２４あるいは５Ａ６００ローターを
備えたノルパル（Ｆｌｏｒｖａｌ ｌ ）を使って１５
０００ ｒｐｍで１０分遠心した。澄明な上清を沈殿物
から分離して一２０℃で貯蔵した。１０〜２０μｔのア
リコートを５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
ピチア・パストリスＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ４−１形質
転換体は１０−のＭＤまたはＭＧＹ培地中３０℃で飽和
状態になるまで増殖させた。ＴＮＦ合成の誘導のために
、細胞は１０ｒｎｌのＭ Ｍ １１＋：１Ａ６００ ＝
約０．１に希釈し、４日間増殖させた。この時点でＡ６
ＧＧは約８．０となった。ＡＯＸ１破壊ピチア・パスト
リス形質転換体の場合、ＭＧＹから細胞を回収し、Ｍｕ
で１回洗い、ＭＷ甲Ａｓｏｏ＝ （／Ｌ６００＝ ２〜
４）に再懸濁し、そして３０℃で４日間インキュベーシ
ョンした。この期間中、種々の試料のＡ６ｏＱは約２〜
８の範囲であった。
転換体は１０−のＭＤまたはＭＧＹ培地中３０℃で飽和
状態になるまで増殖させた。ＴＮＦ合成の誘導のために
、細胞は１０ｒｎｌのＭ Ｍ １１＋：１Ａ６００ ＝
約０．１に希釈し、４日間増殖させた。この時点でＡ６
ＧＧは約８．０となった。ＡＯＸ１破壊ピチア・パスト
リス形質転換体の場合、ＭＧＹから細胞を回収し、Ｍｕ
で１回洗い、ＭＷ甲Ａｓｏｏ＝ （／Ｌ６００＝ ２〜
４）に再懸濁し、そして３０℃で４日間インキュベーシ
ョンした。この期間中、種々の試料のＡ６ｏＱは約２〜
８の範囲であった。
ＴＮＦの生産は２回の連続培養実験および２回のバッチ
型発酵実験により調べた。各実験はｐＨ。
型発酵実験により調べた。各実験はｐＨ。
溶存酸素（ＤＯ）、撹拌速度、温度、空気流量および酸
素流量のための監視／制御装置を備えた５リツトルのニ
ュー・プルンスウイツク・サイエンティフィック発酵槽
（Ｎｅｗ ＢｒｓｆＬｓｗｉｃｋ ５ｅｉｅｎｔｉ−ｆ
ｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ ）を使って行った。温度は
３０℃に保った。細胞の収量は洗浄細胞の乾燥重量から
求めた。
素流量のための監視／制御装置を備えた５リツトルのニ
ュー・プルンスウイツク・サイエンティフィック発酵槽
（Ｎｅｗ ＢｒｓｆＬｓｗｉｃｋ ５ｅｉｅｎｔｉ−ｆ
ｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ ）を使って行った。温度は
３０℃に保った。細胞の収量は洗浄細胞の乾燥重量から
求めた。
発酵槽実験用の接種物は唯一の炭素／エネルギー源とし
て１％＜２）グリセロールを含むＭＧＹ１００ｍ／！を
入れた２５０ＷＬｌエルレンマイヤーフラスコ甲で増殖
させた。発酵槽培養物は２％（ｗ／ｖ）グリセロール−
ＩＭ−３培地を用いて利用可能なグリセロールが消耗さ
れるまでバンチ式で増殖させた。連続培養物は１０％（
”／、）グリセロール−１Ｍ２１塩培地または２０％（
ｗ／ｖ）グリセロール−１Ｍ２１塩培地を用いて定常状
態が達成されるまで増殖させた。ひとたびベースライン
基準試料が得られたら、メタノール上で生育しうる培養
物に対しては１５％（Ｖｌ）メタノール−塩培地として
、混合基質上での連続実験に対しては５％（２）グリセ
ロール−１％（ｔ／、、）メタノール−１Ｍ２１塩培地
として、またはメタノール上で生育しない培養物に対し
てはメタノールの不連続添加として培養物にメタノール
を加えた。
て１％＜２）グリセロールを含むＭＧＹ１００ｍ／！を
入れた２５０ＷＬｌエルレンマイヤーフラスコ甲で増殖
させた。発酵槽培養物は２％（ｗ／ｖ）グリセロール−
ＩＭ−３培地を用いて利用可能なグリセロールが消耗さ
れるまでバンチ式で増殖させた。連続培養物は１０％（
”／、）グリセロール−１Ｍ２１塩培地または２０％（
ｗ／ｖ）グリセロール−１Ｍ２１塩培地を用いて定常状
態が達成されるまで増殖させた。ひとたびベースライン
基準試料が得られたら、メタノール上で生育しうる培養
物に対しては１５％（Ｖｌ）メタノール−塩培地として
、混合基質上での連続実験に対しては５％（２）グリセ
ロール−１％（ｔ／、、）メタノール−１Ｍ２１塩培地
として、またはメタノール上で生育しない培養物に対し
てはメタノールの不連続添加として培養物にメタノール
を加えた。
ピチア・バストリス細胞は破壊用緩衝液（５０ｍＭ
リン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，５％グリセロール、１
ｍｕ ＰＭＳＦ）中で１回洗い、新たな破壊用緩衝液を
用いてＡｓｏｏ−５０〜１００ （２５〜５０ｔｉｔの
乾燥細胞重量）に懸濁した。酸洗浄したガラスピーズ（
４５０〜５００μ）を等容量加えた。この混合物を合計
４分間（各回３０秒、その後氷上に３０秒）ポルテック
ス混合した。その径小遠心機で１０分間、または５Ｍ２
４あるいは５Ａ６００ローターを備えたンルバル（Ｓｏ
ｒτα１１）でｌ Ｑ ０００ ｒｐｍ、１０分間遠心
した。澄明な上清を新しい管に移して一２０℃で貯蔵し
た。別法として、５０〜１００ ｔ／ｌの乾燥細胞Ｘ波
（Ａａｏｏ＝ １００〜２００ ）のピｆ７−バストリ
ス細胞を等容量のガラスピーズと直接混合し、そして細
胞不含抽出物を前のようにして調製した。いずれの方法
を用いても、得られた細胞不含溶菌液はロー＋） −（
Ｌｏｗｒｔｔ ）らの方法で測定したとき約５〜２０ｍ
１；／／ｍｌのタンパク質を含んでいた。ＴＮＦを発現
する細胞では、約５〜１０μｔの細胞不含溶菌液が！５
ＤＳ−ＰＡＧＥによりＴＮＦに対応する顕著なタンパク
質バンドを調べるのに十分な量であった。
リン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，５％グリセロール、１
ｍｕ ＰＭＳＦ）中で１回洗い、新たな破壊用緩衝液を
用いてＡｓｏｏ−５０〜１００ （２５〜５０ｔｉｔの
乾燥細胞重量）に懸濁した。酸洗浄したガラスピーズ（
４５０〜５００μ）を等容量加えた。この混合物を合計
４分間（各回３０秒、その後氷上に３０秒）ポルテック
ス混合した。その径小遠心機で１０分間、または５Ｍ２
４あるいは５Ａ６００ローターを備えたンルバル（Ｓｏ
ｒτα１１）でｌ Ｑ ０００ ｒｐｍ、１０分間遠心
した。澄明な上清を新しい管に移して一２０℃で貯蔵し
た。別法として、５０〜１００ ｔ／ｌの乾燥細胞Ｘ波
（Ａａｏｏ＝ １００〜２００ ）のピｆ７−バストリ
ス細胞を等容量のガラスピーズと直接混合し、そして細
胞不含抽出物を前のようにして調製した。いずれの方法
を用いても、得られた細胞不含溶菌液はロー＋） −（
Ｌｏｗｒｔｔ ）らの方法で測定したとき約５〜２０ｍ
１；／／ｍｌのタンパク質を含んでいた。ＴＮＦを発現
する細胞では、約５〜１０μｔの細胞不含溶菌液が！５
ＤＳ−ＰＡＧＥによりＴＮＦに対応する顕著なタンパク
質バンドを調べるのに十分な量であった。
細胞抽出物中のＴＮＦの定量化
有意前のＴＮＦ（分子量１７０００の顕著なバンドとし
て見ることができる）を含む細胞抽出物に？いて、存在
するＴＮＦのパーセントは５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した
クーマシー染色タンパク質のデンシトメーター（Ｊｏｙ
ｃ−εＬｏ ａ ｂ ｌマイクロデンシトメーター）測
定により求めた。細胞抽出物中のＴＮＦの生物学的活性
はテキサス州ダラス、ワドレー分子医学研究所（Ｗａｄ
ｌｇｙ Ｉ％ａｔｉｔｗｔｅｓｏｆ Ｍｏｌｇｅｕｌｔ
ｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で調べた。
て見ることができる）を含む細胞抽出物に？いて、存在
するＴＮＦのパーセントは５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した
クーマシー染色タンパク質のデンシトメーター（Ｊｏｙ
ｃ−εＬｏ ａ ｂ ｌマイクロデンシトメーター）測
定により求めた。細胞抽出物中のＴＮＦの生物学的活性
はテキサス州ダラス、ワドレー分子医学研究所（Ｗａｄ
ｌｇｙ Ｉ％ａｔｉｔｗｔｅｓｏｆ Ｍｏｌｇｅｕｌｔ
ｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で調べた。
プラスミドｐＴＮＦ４で形質転換した６１８１１５株、
Ｓよび陰性対照としてのｐＴＮＦ５で形質転換したＧＴ
Ｓ １１５株はＭｕまたはＭＤの１０は培地中で増殖さ
せた。２つの独立した形質転換体をそれぞれの場合に試
験した。ＡＯＸＩプロモーターはＭｕ上では抑制解除Ｉ
Ｍ導されるが、一方ＭＤでは抑制される。ｐＴＮＦ４お
よびｐＴＮＦ５形質転換体のＭＤおよびＭｕ上での増殖
速度はＧＴＳ１１５／ｐＴＨＦＫ−△と類似していた。
Ｓよび陰性対照としてのｐＴＮＦ５で形質転換したＧＴ
Ｓ １１５株はＭｕまたはＭＤの１０は培地中で増殖さ
せた。２つの独立した形質転換体をそれぞれの場合に試
験した。ＡＯＸＩプロモーターはＭｕ上では抑制解除Ｉ
Ｍ導されるが、一方ＭＤでは抑制される。ｐＴＮＦ４お
よびｐＴＮＦ５形質転換体のＭＤおよびＭｕ上での増殖
速度はＧＴＳ１１５／ｐＴＨＦＫ−△と類似していた。
種々の形質転換体から調製した細胞不含抽出物は、ＴＮ
Ｆの存在についてＳｒ）；−ＰＡＧＥにより分析した。
Ｆの存在についてＳｒ）；−ＰＡＧＥにより分析した。
ＴＮＦバンドはＭｕ上で生育させたＧＴＳ１１５／ｐＴ
ＮＦ４−１およびＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ４−２からの
抽出物中にのみ検出された。これらの条件（１？／を乾
燥細胞重量をＭＷ上で６６時間生育させる）下で生産さ
れたＴＮＦの量は約１１ｎ９／Ｌであった。ＴＮＦ産生
形質転換体の１つであるＧＴＳｌｌ ５／ｐＴＮＦ４−
１は、５リツトルのケモスタット中で４６ ？／ｌの細
胞密度まで増殖した。
ＮＦ４−１およびＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ４−２からの
抽出物中にのみ検出された。これらの条件（１？／を乾
燥細胞重量をＭＷ上で６６時間生育させる）下で生産さ
れたＴＮＦの量は約１１ｎ９／Ｌであった。ＴＮＦ産生
形質転換体の１つであるＧＴＳｌｌ ５／ｐＴＮＦ４−
１は、５リツトルのケモスタット中で４６ ？／ｌの細
胞密度まで増殖した。
この形質転換体は唯一の炭素／エネルギー源としてグリ
セロールまたはメタノールを使用することにより、野生
型の増殖特性を十分に示した。４６ｆ／ｌの洗浄細胞の
乾燥重量が得られたのは１０％（Ｗ／）グリセロール上
での増殖期間中であった。
セロールまたはメタノールを使用することにより、野生
型の増殖特性を十分に示した。４６ｆ／ｌの洗浄細胞の
乾燥重量が得られたのは１０％（Ｗ／）グリセロール上
での増殖期間中であった。
ν
１０％グリセロールから１５％（η）メタノール−ＦＭ
２１塩への栄養培地の交換は飢餓期間を介在させること
なく行った。ひとたびメタノール上での定常状態増殖が
安定化されたら、連続実験の終了時までＱ、 Ｑ ６７
ｈデ１の希釈率（１５時間の保持時間）を維持した。
２１塩への栄養培地の交換は飢餓期間を介在させること
なく行った。ひとたびメタノール上での定常状態増殖が
安定化されたら、連続実験の終了時までＱ、 Ｑ ６７
ｈデ１の希釈率（１５時間の保持時間）を維持した。
増殖基質としてメタノールを用いた場合の収率は４０％
であり、この値は類似の増殖条件下で野生型ピチア・パ
ストリス株を用いたときの値と同一であった。試料はい
ろいろな時間間隔で抜き取り、ＥＤＳ−ＰＡＧＥにより
ＴＮＦ生産について、および活性について分析した（表
■参照）。
であり、この値は類似の増殖条件下で野生型ピチア・パ
ストリス株を用いたときの値と同一であった。試料はい
ろいろな時間間隔で抜き取り、ＥＤＳ−ＰＡＧＥにより
ＴＮＦ生産について、および活性について分析した（表
■参照）。
５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果および麦Ｉに要約した結果
に基づくと、ＴＮＦ生産はメタノールに交換した時点で
速やかに誘導され、少なくとも１６８時間かなり安定し
て進行すると結論づけることができる。ピチア・パスト
リスにより生産されたＴＮＦは、大腸菌ＴＮＦと少なく
とも同程度の又はそれより高い生物学的比活性を有する
。染色強度の肉眼による比較で概算したＴＮＦ量に基づ
くと、この実験でピチア・パストリスにより生産された
ＴＮＦのパーセントは全可溶性タンパク質の約０．５〜
１％であった。また、振盪フラスコ培養（１？／ｌ ）
において生産されたＴＮＦ量（全可溶性タンパク質のパ
ーセント）は、高細胞密度ケモスタット（４６ｆ／ｌ
）において生産されたＴＮＦ量と同程度であり、このこ
とは大規模ＴＮＦ生産の効率が低下しないことを示唆し
ている。発酵槽試料から分離したＤＮＡの電気泳動分析
は、自律的なプラスミドｐＴＮＦ４がグリセロール増殖
細胞中に存在することを示した。メタノール増殖細胞か
らの全ＤＮＡ中には遊離のプラスミドＤＮＡがエチジウ
ムプロミド染色により全く検出されなかった。このこと
はメタノール上での増殖中にプラスミドの組込みが起こ
ったことを示している。
に基づくと、ＴＮＦ生産はメタノールに交換した時点で
速やかに誘導され、少なくとも１６８時間かなり安定し
て進行すると結論づけることができる。ピチア・パスト
リスにより生産されたＴＮＦは、大腸菌ＴＮＦと少なく
とも同程度の又はそれより高い生物学的比活性を有する
。染色強度の肉眼による比較で概算したＴＮＦ量に基づ
くと、この実験でピチア・パストリスにより生産された
ＴＮＦのパーセントは全可溶性タンパク質の約０．５〜
１％であった。また、振盪フラスコ培養（１？／ｌ ）
において生産されたＴＮＦ量（全可溶性タンパク質のパ
ーセント）は、高細胞密度ケモスタット（４６ｆ／ｌ
）において生産されたＴＮＦ量と同程度であり、このこ
とは大規模ＴＮＦ生産の効率が低下しないことを示唆し
ている。発酵槽試料から分離したＤＮＡの電気泳動分析
は、自律的なプラスミドｐＴＮＦ４がグリセロール増殖
細胞中に存在することを示した。メタノール増殖細胞か
らの全ＤＮＡ中には遊離のプラスミドＤＮＡがエチジウ
ムプロミド染色により全く検出されなかった。このこと
はメタノール上での増殖中にプラスミドの組込みが起こ
ったことを示している。
以下の表■に示すように、Ｈｉｓ＋マーカーの安定度パ
ーセントの値は、プラスミドｐＴＮＦ４ （このプラス
ミドの少なくともＨＩＳ４マーカー）がメタノール増殖
細胞中に安定して組み込まれるという推測を支持してい
る。ＴＮＦ発現プラスミドｐＴＮＦ４中には５′ＡＯＸ
１と３’ＡＯＸ１ の両方が存在するので、細胞中のプ
ラスミドの組込みはＡＯＸ１遺伝子の破壊をもたらす可
能性があった。
ーセントの値は、プラスミドｐＴＮＦ４ （このプラス
ミドの少なくともＨＩＳ４マーカー）がメタノール増殖
細胞中に安定して組み込まれるという推測を支持してい
る。ＴＮＦ発現プラスミドｐＴＮＦ４中には５′ＡＯＸ
１と３’ＡＯＸ１ の両方が存在するので、細胞中のプ
ラスミドの組込みはＡＯＸ１遺伝子の破壊をもたらす可
能性があった。
この可能性は２５０［ｉｌのＨｔｔｔ＋コロニーをメタ
ノール上での増殖についてスクリーニングすることによ
り試験した（表■参照）。Ｈｉｓ＋コロニーはどれもＭ
ｕ上でよく増殖し、このことはこれらのコロニーにおい
てプラスミドの組込みが内生ＡＯＸ１の破壊を起こさな
かったことを示唆している。
ノール上での増殖についてスクリーニングすることによ
り試験した（表■参照）。Ｈｉｓ＋コロニーはどれもＭ
ｕ上でよく増殖し、このことはこれらのコロニーにおい
てプラスミドの組込みが内生ＡＯＸ１の破壊を起こさな
かったことを示唆している。
Ｂ、 Ｈｉｓ＋−メタノール遅延形質転換体によるＴ
ＮＦの発現 ピチア・パストリスの先の実験は、ピチア・パストリス
の内生ＡＯＸ１の破壊が異種タンパク質の高レベル発現
をもたらすことを示唆した。それ故に、ＡＯＸ１破壊Ｇ
ＴＳ １１５によるＡＯＸｌ：ＴＮＦ発現カセットの発
現は次のようにして試験した。
ＮＦの発現 ピチア・パストリスの先の実験は、ピチア・パストリス
の内生ＡＯＸ１の破壊が異種タンパク質の高レベル発現
をもたらすことを示唆した。それ故に、ＡＯＸ１破壊Ｇ
ＴＳ １１５によるＡＯＸｌ：ＴＮＦ発現カセットの発
現は次のようにして試験した。
Ｇｒ、Ｓ’ｌ１５はＢ、消化ｐＴＮＦ６（大きい方のＢ
。
。
ＤＮＡフラグメントはＡＯＸ１置換力七ットを含む）で
形質転換した。この形質転換は多数のＨ４ｓ十形質転換
体を形成させた。比較のために、Ｂ、切断ｐＡＯ８０４
およびｐＢｓＡＧＩ５１ もまた形質転換のために使
用した。形質転換の結果は表■および■に要約する。
形質転換した。この形質転換は多数のＨ４ｓ十形質転換
体を形成させた。比較のために、Ｂ、切断ｐＡＯ８０４
およびｐＢｓＡＧＩ５１ もまた形質転換のために使
用した。形質転換の結果は表■および■に要約する。
表■に示すように、ｐＴＮＦ６はｐＡＱ８０４ また
はｐＢＳＡＧＩ５１と比較してＨｉｓ十形質転換体の頻
度がかなり低かった。メタノール上で遅く増殖するピチ
ア・パストリスをスクリーニングするために、ＭＤＬ上
のコロニーはＭＭ上でレプリカ培養した。約５〜８゛％
のＨｉｓ十形質転換体がメタノール上で遅く増殖した。
はｐＢＳＡＧＩ５１と比較してＨｉｓ十形質転換体の頻
度がかなり低かった。メタノール上で遅く増殖するピチ
ア・パストリスをスクリーニングするために、ＭＤＬ上
のコロニーはＭＭ上でレプリカ培養した。約５〜８゛％
のＨｉｓ十形質転換体がメタノール上で遅く増殖した。
メタノール遅延表現型は形質転換用ＤＮＡによるＡＯＸ
１破壊を表している。１組の無作為に選ばれたメタノー
ル遅延クローンはその表現型を確かめるべく再スクリー
ニングした。表ＩＶに示すように、初期スクリーニング
からのコロニーはその大部分が第２回目′のスクリーニ
ングでメタノール遅延として評価された。しかしながら
、メタノール遅延コロニーの中で２つの区別しうる表現
型が観察された：すなわちメタノール遅延（Ｓ）と呼ば
れるＭＭ上で増殖しないクローン、およびメタノール遅
延（１）と呼ばれる３０℃で４日間インキュベーション
後に中程度の増殖を示すクローン。プラスミドｐＥｓＡ
ＧＩ５１はｐＡＯ８０４またはｐＴＮＦ６と比較してよ
り高いパーセントのメタノール遅延（Ｓ）を与えた。後
者の２つのプラスミドの場合には、中程度のメタノール
遅延（Ｉ）が比較的優勢である。い（つかのコロニーは
メタノール正常およびメタノール遅延形質転換体の混合
集団の存在ゆえに、メタノール正常（Ｎ）とメタノール
遅延（ＩまたはＳ）細胞の混合物であった。
１破壊を表している。１組の無作為に選ばれたメタノー
ル遅延クローンはその表現型を確かめるべく再スクリー
ニングした。表ＩＶに示すように、初期スクリーニング
からのコロニーはその大部分が第２回目′のスクリーニ
ングでメタノール遅延として評価された。しかしながら
、メタノール遅延コロニーの中で２つの区別しうる表現
型が観察された：すなわちメタノール遅延（Ｓ）と呼ば
れるＭＭ上で増殖しないクローン、およびメタノール遅
延（１）と呼ばれる３０℃で４日間インキュベーション
後に中程度の増殖を示すクローン。プラスミドｐＥｓＡ
ＧＩ５１はｐＡＯ８０４またはｐＴＮＦ６と比較してよ
り高いパーセントのメタノール遅延（Ｓ）を与えた。後
者の２つのプラスミドの場合には、中程度のメタノール
遅延（Ｉ）が比較的優勢である。い（つかのコロニーは
メタノール正常およびメタノール遅延形質転換体の混合
集団の存在ゆえに、メタノール正常（Ｎ）とメタノール
遅延（ＩまたはＳ）細胞の混合物であった。
ＴＮＦの発現
６個のメタノール遅延ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６単離物
は振盪フラスコ中の１０ｍ１ＭＧＹでＡ ６０［＋＝約
３〜５（約１ ｆ／を乾燥細胞重量）へ増殖させ、その
後Ｍｕに変えてＴＮＦ生産を誘導した。ＭＭ上で１００
時間後、細胞を回収し、溶菌し、細胞不含抽出物は５Ｄ
ＦＩ−ＰＡＧＥでＴＮＦの存在について分析した。比較
のために、同様に処理したＧＴＳ１１５／ｐＡＧ）８０
４およびＧＴＳ １１５／ｐＢＳＡＧＩ５１からの抽出
物も分析した。これらの形質転換体のそれぞれのＴＮＦ
発現レベルを表Ｖに示す。
は振盪フラスコ中の１０ｍ１ＭＧＹでＡ ６０［＋＝約
３〜５（約１ ｆ／を乾燥細胞重量）へ増殖させ、その
後Ｍｕに変えてＴＮＦ生産を誘導した。ＭＭ上で１００
時間後、細胞を回収し、溶菌し、細胞不含抽出物は５Ｄ
ＦＩ−ＰＡＧＥでＴＮＦの存在について分析した。比較
のために、同様に処理したＧＴＳ１１５／ｐＡＧ）８０
４およびＧＴＳ １１５／ｐＢＳＡＧＩ５１からの抽出
物も分析した。これらの形質転換体のそれぞれのＴＮＦ
発現レベルを表Ｖに示す。
試験した全ての形質転換体（但しＧＴＳ１１５／ｐＴＮ
Ｆ６−２を除く）において、細胞はＭｕ上で１００時間
増殖させる間におおよそ２倍になった。
Ｆ６−２を除く）において、細胞はＭｕ上で１００時間
増殖させる間におおよそ２倍になった。
５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したＧ ＴＳ １１５／ｐ Ｔ
ＮＦ６−（１〜６）の細胞不含抽出物のうち、クローン
２および５は最も多量のＴＮＦを含んでいた。これらの
クローンの１つであるＧ’Ｚ’ＳＩ １５／ｐＴＮＦ６
−５は本出願が特許として発布された際に一般の人々が
利用できるように、イリノイ州ビオーリアのノザ／・リ
ージョナル・リサーチ・七ンターに寄託され、受託番号
ＮＲＲＬ Ｙ−１８１１６を指定すした。クローンｌ
および４は非常に低いレベルを有し、そしてクローン３
および６は中程度のＴＮＦレベルを有していた（表Ｖ参
照）。デンシトメーター測定結果に基づくと、クローン
２および５により生産されたＴＮＦ量は可溶性タンパク
質の約３０％であると概算された。これら２つの高ＴＮ
Ｆ産生菌は発酵槽でのＴＮＦ生産について試験された（
以下参照）。予想されたように、ＴＮＦに対応するタン
パク質バンドはＧＴＳ １１５／ｐＡＱ８０４−１およ
びＧＴＳｌｌ ５／ｐＢｓＡＧＩ５１細胞抽出物に存在
しなかった。
ＮＦ６−（１〜６）の細胞不含抽出物のうち、クローン
２および５は最も多量のＴＮＦを含んでいた。これらの
クローンの１つであるＧ’Ｚ’ＳＩ １５／ｐＴＮＦ６
−５は本出願が特許として発布された際に一般の人々が
利用できるように、イリノイ州ビオーリアのノザ／・リ
ージョナル・リサーチ・七ンターに寄託され、受託番号
ＮＲＲＬ Ｙ−１８１１６を指定すした。クローンｌ
および４は非常に低いレベルを有し、そしてクローン３
および６は中程度のＴＮＦレベルを有していた（表Ｖ参
照）。デンシトメーター測定結果に基づくと、クローン
２および５により生産されたＴＮＦ量は可溶性タンパク
質の約３０％であると概算された。これら２つの高ＴＮ
Ｆ産生菌は発酵槽でのＴＮＦ生産について試験された（
以下参照）。予想されたように、ＴＮＦに対応するタン
パク質バンドはＧＴＳ １１５／ｐＡＱ８０４−１およ
びＧＴＳｌｌ ５／ｐＢｓＡＧＩ５１細胞抽出物に存在
しなかった。
ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ ６−２はグリセロール上でよ
く増殖したが、予期されるようにメタノール上では増殖
しないであろう。ケモスタットにおける１０％（ｗ／、
）グリセロール上での定常状態増殖は、５７ ｔ／ｌの
洗浄乾燥細胞重量をもたらした。
く増殖したが、予期されるようにメタノール上では増殖
しないであろう。ケモスタットにおける１０％（ｗ／、
）グリセロール上での定常状態増殖は、５７ ｔ／ｌの
洗浄乾燥細胞重量をもたらした。
栄養供給の停止はＤｏレベルを速やかに上昇させた。３
０分の炭素飢餓期間後、メタノール１０ｄを培養物２０
００−に対して加えた。ＤｏおよびｐＨの速やかな低下
が見られ、このことは細胞が添加メタノールを酸化する
能力をもっことを示している。合計１００ｍ（７９Ｐ）
のメタノールを１４３時間にわたって培養物に加えた。
０分の炭素飢餓期間後、メタノール１０ｄを培養物２０
００−に対して加えた。ＤｏおよびｐＨの速やかな低下
が見られ、このことは細胞が添加メタノールを酸化する
能力をもっことを示している。合計１００ｍ（７９Ｐ）
のメタノールを１４３時間にわたって培養物に加えた。
メタノールを酸化する培養物の能力は初めの２４時間が
最も高く、その後徐々に酸化速度が低下した。添加メタ
ノールのほとんど全てが消費されても、培養物はまった
く増殖を示さなかった。試料はメタノ−ルの添加前およ
びメタノールの添加後いろいろな時間間隔で発酵槽から
抜き取った。発酵槽細胞からの細胞不含抽出物は５ＤＳ
−ＰＡＧＥで分析した。表■に示すように、ピチア細胞
抽出物中のｒｎｐＨはグリセロール上での約２％程度の
低い量から、メタノール添加後３時間以内に１３％まで
急速に上昇し、その後４８時間以内で約２５％の飽和に
達し、本実験の間中（１４２時間）そのレベルを維持し
続けた。
最も高く、その後徐々に酸化速度が低下した。添加メタ
ノールのほとんど全てが消費されても、培養物はまった
く増殖を示さなかった。試料はメタノ−ルの添加前およ
びメタノールの添加後いろいろな時間間隔で発酵槽から
抜き取った。発酵槽細胞からの細胞不含抽出物は５ＤＳ
−ＰＡＧＥで分析した。表■に示すように、ピチア細胞
抽出物中のｒｎｐＨはグリセロール上での約２％程度の
低い量から、メタノール添加後３時間以内に１３％まで
急速に上昇し、その後４８時間以内で約２５％の飽和に
達し、本実験の間中（１４２時間）そのレベルを維持し
続けた。
４、バッチ発酵槽におけるＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６−
ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ ６−５は１０８り／ｌの乾燥
細胞重量の定常状態増殖収量が得られるまで２０％（ｗ
／υ）グリセロール上で増殖させた。
ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ ６−５は１０８り／ｌの乾燥
細胞重量の定常状態増殖収量が得られるまで２０％（ｗ
／υ）グリセロール上で増殖させた。
３０分の飢餓期間後、メタノール２０ｍ１を培養物２０
００ゴに対して加えた。ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６−２
の場合と同様に、ＤｏおよびｐＨの速やかな低下が見ら
れた。合計２７５ｍ（２１７Ｐ）のメタノールを１８９
時間にわたって培養物に加えた。この期間中に１９回の
メタノール添加が必要であった。メタノールはほとんど
全てが酸化された。ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６−５は振
盪フラスコ中１９／ｌの細胞密度においてメタノール上
で若干の構部を示したが、発酵槽中の高細胞密度増殖の
条件下ではメタノール上での増殖が全（観察されなかっ
た。表■に示すように、ＧＴ：Ｅ １１５／ｐＴＮＦ６
−５細胞によるＴＮＦの生産はメタノールに交換俊速や
かに誘導され、４８時間以内で飽和値に達し、そしてそ
のＴＮＦレベルは本実験の終了時（１８９時間）まで変
わらなかった。
００ゴに対して加えた。ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６−２
の場合と同様に、ＤｏおよびｐＨの速やかな低下が見ら
れた。合計２７５ｍ（２１７Ｐ）のメタノールを１８９
時間にわたって培養物に加えた。この期間中に１９回の
メタノール添加が必要であった。メタノールはほとんど
全てが酸化された。ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６−５は振
盪フラスコ中１９／ｌの細胞密度においてメタノール上
で若干の構部を示したが、発酵槽中の高細胞密度増殖の
条件下ではメタノール上での増殖が全（観察されなかっ
た。表■に示すように、ＧＴ：Ｅ １１５／ｐＴＮＦ６
−５細胞によるＴＮＦの生産はメタノールに交換俊速や
かに誘導され、４８時間以内で飽和値に達し、そしてそ
のＴＮＦレベルは本実験の終了時（１８９時間）まで変
わらなかった。
ＧＴＳＩＬ５／ｐＴＮＦ６−５打グリセロール上で増殖
させたとき、グリセロール上で増殖させたＧＴＳ１１５
／ｐＴＮＦ６−２ （２％ＴＮＦ）に比べて、有意に高
い量（９％）のＴＮＦを生産した。
させたとき、グリセロール上で増殖させたＧＴＳ１１５
／ｐＴＮＦ６−２ （２％ＴＮＦ）に比べて、有意に高
い量（９％）のＴＮＦを生産した。
メタノール上で生育させたときのＧ７’５’ｌ１５／ｐ
ＴＮＦ６−５によるＴＮＦの発現レベルは約３２％であ
った。この値はメタノール上で生育させたＧＴＳＩＬ５
／ｐＴＮＦ６−２の場合よりもわずかに高かった。
ＴＮＦ６−５によるＴＮＦの発現レベルは約３２％であ
った。この値はメタノール上で生育させたＧＴＳＩＬ５
／ｐＴＮＦ６−２の場合よりもわずかに高かった。
の生産
ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ ６−５は定常状態になるまで
５％（、／τ）グリセロール−１Ｍ２１塩培地上で増殖
させた。培地をグリセロールから５％（卿４）グリセロ
ール＋１％（、／ｖ）メタノールを含む混合培地に、飢
餓期間を介在させることな（変えた。
５％（、／τ）グリセロール−１Ｍ２１塩培地上で増殖
させた。培地をグリセロールから５％（卿４）グリセロ
ール＋１％（、／ｖ）メタノールを含む混合培地に、飢
餓期間を介在させることな（変えた。
連続培養はグリセロール／メタノール混合物上で７３時
時間待した。ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６−５は唯一（Ｄ
炭素／−＋−Ｊルギー源としてのメタノール上で増殖す
ることができなかったが、それはグリセロール上で増殖
し且つ０．０５ ｈｒ−”の希釈率においてケモスタッ
ト中で付随的にメタノールを酸化するであろう。表■に
示すように、発酵槽中のメタノール濃度は実験の間中１
％（ｖ／ｖ）以下のｆ″！保たれた。
時間待した。ＧＴＳ１１５／ｐＴＮＦ６−５は唯一（Ｄ
炭素／−＋−Ｊルギー源としてのメタノール上で増殖す
ることができなかったが、それはグリセロール上で増殖
し且つ０．０５ ｈｒ−”の希釈率においてケモスタッ
ト中で付随的にメタノールを酸化するであろう。表■に
示すように、発酵槽中のメタノール濃度は実験の間中１
％（ｖ／ｖ）以下のｆ″！保たれた。
表■に示すように、ピチア・パストリス細胞抽出物中の
ＴＮＦ量はグリセロール／メタノール混合物に交換俊速
やかに上昇し、本実験の間中（７３時間）そのまま維持
された。グリセロール／メタノール混合物上で増殖させ
た発酵槽細胞中のＴＮＦ量は可溶性タンパク質の約１７
％であった（表■参照）。
ＴＮＦ量はグリセロール／メタノール混合物に交換俊速
やかに上昇し、本実験の間中（７３時間）そのまま維持
された。グリセロール／メタノール混合物上で増殖させ
た発酵槽細胞中のＴＮＦ量は可溶性タンパク質の約１７
％であった（表■参照）。
上記の実施例は本発明の実施を例示するためにのみ提供
されたものであり、本発明の範囲または特許請求の範囲
を制限するものと解釈されるべきでない。本発明の本質
および精神から逸脱しない理にかなった変更および修飾
は、希望し且つ要求する特許請求の範囲に含まれるもの
である。
されたものであり、本発明の範囲または特許請求の範囲
を制限するものと解釈されるべきでない。本発明の本質
および精神から逸脱しない理にかなった変更および修飾
は、希望し且つ要求する特許請求の範囲に含まれるもの
である。
【図面の簡単な説明】
第１図は主要制限部位の位置を含み且つまたｐＵＣ９−
ＰＬ８５およびｐＥＲ３２２−ＴＮＦｌからのｐＴＮＦ
ｌの作製に関する細部を含む、プラスミドｐＴＮＦ１の
重要な構成成分を表す模式図である。 第２図はプラスミドｐ ＴＮ Ｆ ４ ／ ｐ ＴＮ
Ｆ ５およびｐＴＮＦ６／ｐＴＮＦ７を作製するのに使
用する工程の概略図である。 第３図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＴＨＦ
Ｋ−Δの重要構成成分を表す模式図である。 第４図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＢｓＡ
ＧＩ５１ の重要構成成分を表す模式図である。 第５図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＡＱ８
０４の重要構成成分を表す模式図である。 第６図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＴＮＦ
４／ｐＴＮＦ５の重要構成成分を表す模式図である。 第７図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＴＮＦ
６／ｐＴＮＦ７の重要構成成分を表す模式図である。 第８図は第１ビチア・バストリスジヒドロキシアセトン
シンターゼ（ＤＡＳｌ）遺伝子の調節領域の制限地図で
ある。 第９図は第１ピチア・パストリスアルコールオキシダー
ゼ（ＡＱ、￥１）遺伝子の調節領域の制限地図である。 第１０図はピチア・パス） ＩＪスｐ４０遺伝子の調節
領域の制限地図である。 第１１図はピチア・パストリス自律複製配列（ＰＡＲ８
１）の制限地図である。 第１２図は別のピチア・パストリス自律複製配列（ＰＡ
Ｒ８２）の制限地図である。 制限酵素は本明細書および図面において以下の略号で表
される： 略 号 制限酵素 Ａ −Ａａｕｆｉ ＣＡｃｃｌ Ａｈ ＡｈａｍＡυ
、 ＡτｃＬＩ Ａυ２Ａフα■ Ｂ Ｂａ倶ＨＩ Ｂ、 ＢＱｌｒ Ｂ、 ＢＱＬｎ Ｂｃ ＢｃｌＩ Ｂｔ Ｂａ１ｌ Ｂｎ Ｂａｎ ＩＥｔｔ
ＢｓｔＥ■ＣＣ１ａ Ｉ Ｆ ＦｏｋＩ ＨＨαａ（Ｉ Ｈ２Ｈｉｎｃｒｌ Ｈｓ Ｈｉルｄ■Ｈｈ
ＨｈαＩＨｐ
Ｈｐ ａ ［［Ｋ Ｋｐｎ■ Ｍｂ Ｍｂｏ■Ｎα
Ｎａｒｌ Ｎ ｃ Ｎｃ ｉ ＩＮｄ＋
ＮｄｇｌＮｒ 、
Ｎｒｕ ＩＰｇ
Ｐｓｔ■ＰダＩ Ｐν
５ｌ Ｐｖｔ ＰｖｒｂｆＪＲ＋
ＥｃｏＲＩＲ５ＥｃｏＲＶ Ｓ ３αｌ■Ｓｓ
５ｓｔＩＳ ｔ
５ｔｔ４１Ｔ Ｔａｑｌ （外４名） （ｐＴＮＦ６／ｐＴＮＦ７ ） ＦＩＧ、 ３ ＮｏヒＩ ＦＩＧ、 ６ ）１ａｅｌ Ｈ） Ｈ
２Ｒ息 Ｈ２Ｈ２ＸｈＦＩｏ、８ 一匹ｊ日 ＦＩＧ、 ９ ＦＩＧ、 ＩＱ
ＰＬ８５およびｐＥＲ３２２−ＴＮＦｌからのｐＴＮＦ
ｌの作製に関する細部を含む、プラスミドｐＴＮＦ１の
重要な構成成分を表す模式図である。 第２図はプラスミドｐ ＴＮ Ｆ ４ ／ ｐ ＴＮ
Ｆ ５およびｐＴＮＦ６／ｐＴＮＦ７を作製するのに使
用する工程の概略図である。 第３図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＴＨＦ
Ｋ−Δの重要構成成分を表す模式図である。 第４図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＢｓＡ
ＧＩ５１ の重要構成成分を表す模式図である。 第５図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＡＱ８
０４の重要構成成分を表す模式図である。 第６図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＴＮＦ
４／ｐＴＮＦ５の重要構成成分を表す模式図である。 第７図は主要制限部位の位置を含むプラスミドｐＴＮＦ
６／ｐＴＮＦ７の重要構成成分を表す模式図である。 第８図は第１ビチア・バストリスジヒドロキシアセトン
シンターゼ（ＤＡＳｌ）遺伝子の調節領域の制限地図で
ある。 第９図は第１ピチア・パストリスアルコールオキシダー
ゼ（ＡＱ、￥１）遺伝子の調節領域の制限地図である。 第１０図はピチア・パス） ＩＪスｐ４０遺伝子の調節
領域の制限地図である。 第１１図はピチア・パストリス自律複製配列（ＰＡＲ８
１）の制限地図である。 第１２図は別のピチア・パストリス自律複製配列（ＰＡ
Ｒ８２）の制限地図である。 制限酵素は本明細書および図面において以下の略号で表
される： 略 号 制限酵素 Ａ −Ａａｕｆｉ ＣＡｃｃｌ Ａｈ ＡｈａｍＡυ
、 ＡτｃＬＩ Ａυ２Ａフα■ Ｂ Ｂａ倶ＨＩ Ｂ、 ＢＱｌｒ Ｂ、 ＢＱＬｎ Ｂｃ ＢｃｌＩ Ｂｔ Ｂａ１ｌ Ｂｎ Ｂａｎ ＩＥｔｔ
ＢｓｔＥ■ＣＣ１ａ Ｉ Ｆ ＦｏｋＩ ＨＨαａ（Ｉ Ｈ２Ｈｉｎｃｒｌ Ｈｓ Ｈｉルｄ■Ｈｈ
ＨｈαＩＨｐ
Ｈｐ ａ ［［Ｋ Ｋｐｎ■ Ｍｂ Ｍｂｏ■Ｎα
Ｎａｒｌ Ｎ ｃ Ｎｃ ｉ ＩＮｄ＋
ＮｄｇｌＮｒ 、
Ｎｒｕ ＩＰｇ
Ｐｓｔ■ＰダＩ Ｐν
５ｌ Ｐｖｔ ＰｖｒｂｆＪＲ＋
ＥｃｏＲＩＲ５ＥｃｏＲＶ Ｓ ３αｌ■Ｓｓ
５ｓｔＩＳ ｔ
５ｔｔ４１Ｔ Ｔａｑｌ （外４名） （ｐＴＮＦ６／ｐＴＮＦ７ ） ＦＩＧ、 ３ ＮｏヒＩ ＦＩＧ、 ６ ）１ａｅｌ Ｈ） Ｈ
２Ｒ息 Ｈ２Ｈ２ＸｈＦＩｏ、８ 一匹ｊ日 ＦＩＧ、 ９ ＦＩＧ、 ＩＱ
Claims (19)
- （１）（ａ）ポリペプチドコード領域の５′末端に配置
されたとき、酵母内でメッセンジャーＲＮＡの転写を制
御しうる酵母調節領域、および （ｂ）ヒト腫瘍壊死因子、その類似体またはその機能的
部分をコードするポリペプチドコード領域 を含むＤＮＡフラグメント。 - （２）酵母調節領域は ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
）ＡＯＸ１調節領域； ピチア・パストリスＤＡＳ１調節領域； ピチア・パストリスグリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ調節領域； サツカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ−
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酸ホスファターゼ調節
領域； サツカロミセス・セレビシエα接合因子調節領域； サツカロミセス・セレビシエグリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ調節領域；サツカロミセス・セ
レビシエガラクトキナーゼ調節領域； サツカロミセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナー
ゼ調節領域； サツカロミセス・セレビシエチトクロムＣ調節領域；お
よび ピチア・パストリスｐ４０調節領域 より成る群から選ばれる、特許請求の範囲第１項記載の
ＤＮＡフラグメント。 - （３）ヒト腫瘍壊死因子をコードする領域は約６９３塩
基対の鎖長であり、地図１に示される制限地図により特
徴づけられる、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡフラ
グメント。 地図１ ▲数式、化学式、表等があります▼ - （４）ヒト腫瘍壊死因子をコードする領域は以下のヌク
レオチド配列を有するＢ＿２−Ｒ＿１フラグメントに含
まれる、特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡフラグメン
ト。 【ヌクレオチド配列があります】 - （５）前記調節領域は （ｉ）前記ＤＮＡフラグメントを含む宿主微生物が接触
する培地中にメタノールが存在する こと； （ｉｉ）前記ＤＮＡフラグメントを含む宿主微生物が接
触する培地中にメタノール以外の非カ タボライト抑制炭素源が存在すること； （ｉｉｉ）前記ＤＮＡフラグメントを含む宿主微生物が
カタボライト抑制炭素／エネルギー源上 で増殖した後、該宿主微生物が接触する培 地中の炭素源が欠乏すること； より成る群から選ばれた条件の少なくとも１つに応答す
る、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡフラグメント。 - （６）前記調節領域は第９図に示す制限地図により特徴
づけられる、特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡフラグ
メント。 - （７）ポリペプチドコード領域の下流にＤＮＡの３′配
列をさらに含み、該ＤＮＡの３′配列は前記ポリペプチ
ドコード領域によりコードされるメッセンジャーＲＮＡ
のポリＡ化および転写終止を制御することができる、特
許請求の範囲第１項記載のＤＮＡフラグメント。 - （８）前記ＤＮＡフラグメントは 細菌プラスミドＤＮＡ、 バクテリオフアージＤＮＡ、 酵母プラスミドＤＮＡ、および 酵母染色体ＤＮＡ より成る群から誘導される１つまたはそれ以上の追加Ｄ
ＮＡ配列をさらに含む、特許請求の範囲第１項記載のＤ
ＮＡフラグメント。 - （９）酵母染色体ＤＮＡは自律的に複製するＤＮＡ配列
とマーカー遺伝子を含む、特許請求の範囲第８項記載の
ＤＮＡフラグメント。 - （１０）前記ＤＮＡフラグメントは 細菌プラスミドＤＮＡ、 バクテリオフアージＤＮＡ、 酵母プラスミドＤＮＡ、および 酵母染色体ＤＮＡ より成る群から誘導される１つまたはそれ以上の追加Ｄ
ＮＡ配列をさらに含む、特許請求の範囲第３項記載のＤ
ＮＡフラグメント。 - （１１）酵母染色体ＤＮＡは自律的に複製するＤＮＡ配
列とマーカー遺伝子を含む、特許請求の範囲第１０項記
載のＤＮＡフラグメント。 - （１２）第１の挿入可能なＤＮＡフラグメント、選択可
能なマーカー遺伝子、および 第２の挿入可能なＤＮＡフラグメント から成る連続配置ＤＮＡをさらに含み、その際第１およ
び第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントはそれぞれ少な
くとも約２００ヌクレオチドの鎖長であり且つピチア属
菌種のゲノムＤＮＡの一部と相同性のヌクレオチド配列
を有し；前記ＤＮＡフラグメント、前記マーカー遺伝子
および特許請求の範囲第１項記載の前記ＤＮＡフラグメ
ントは第１の挿入可能なＤＮＡフラグメントの３′末端
と第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントの５′末端の間
に配置され；そして第１および第２の挿入可能なＤＮＡ
フラグメントはそれらがピチア・パストリスのゲノム内
で方向づけられているように互いに対して方向づけられ
る、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡフラグメント。 - （１３）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡフラグメン
ト、 細菌プラスミドＤＮＡ、 選択可能な酵母マーカー遺伝子、および 酵母自律複製配列 を含むプラスミド。 - （１４）プラスミドｐＴＮＦ４およびｐＴＮＦ６より成
る群から選ばれる、特許請求の範囲第１３項記載のプラ
スミド。 - （１５）特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡフラグメン
トで形質転換されたピチア属菌株の本質的に純粋な培養
物。 - （１６）特許請求の範囲第１０項記載のＤＮＡフラグメ
ントで形質転換されたピチア属菌株の本質的に純粋な培
養物。 - （１７）プラスミドｐＴＮＦ４およびｐＴＮＦ６より成
る群から選ばれるプラスミドで形質転換されたピチア属
菌株の本質的に純粋な培養物。 - （１８）特許請求の範囲第１３項記載のプラスミドで形
質転換された酵母菌株を、調節領域がヒト腫瘍壊死因子
をコードするポリペプチドコード領域の発現を誘導する
条件下で培養することから成る、ヒト腫瘍壊死因子の生
産方法。 - （１９）前記ヒト腫瘍壊死因子を分離精製することをさ
らに含む、特許請求の範囲第１８項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US909528 | 1986-09-22 | ||
| US06/909,528 US5002876A (en) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | Yeast production of human tumor necrosis factor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63164891A true JPS63164891A (ja) | 1988-07-08 |
Family
ID=25427386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62238617A Pending JPS63164891A (ja) | 1986-09-22 | 1987-09-22 | 酵母によるヒト腫瘍壊死因子の生産方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5002876A (ja) |
| EP (1) | EP0263311A3 (ja) |
| JP (1) | JPS63164891A (ja) |
| AU (1) | AU601768B2 (ja) |
| DK (1) | DK494287A (ja) |
| IE (1) | IE872368L (ja) |
| IL (1) | IL83899A0 (ja) |
| NO (1) | NO873927L (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6359854B1 (en) | 1993-11-01 | 2002-03-19 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Disk reproducing apparatus |
Families Citing this family (48)
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