JP2646085B2 - 異種遺伝子の発現用ベクター - Google Patents
異種遺伝子の発現用ベクターInfo
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- JP2646085B2 JP2646085B2 JP62073948A JP7394887A JP2646085B2 JP 2646085 B2 JP2646085 B2 JP 2646085B2 JP 62073948 A JP62073948 A JP 62073948A JP 7394887 A JP7394887 A JP 7394887A JP 2646085 B2 JP2646085 B2 JP 2646085B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は酵母において異種遺伝子のクローニングおよ
び発現用ベクター、ならびにこのベクターにより形質転
換した酵母に関する。
び発現用ベクター、ならびにこのベクターにより形質転
換した酵母に関する。
更に詳述すると、本発明は酵母の形質転換用ベクター
に関し、このベクターにはKluyveromyces drosophilaru
mのpkD1プラスミドの全ヌクレオチド配列又はその一部
が存在する。更に、本発明はこのベクターにより形質転
換されたKluyveromyces属の酵母に関する。
に関し、このベクターにはKluyveromyces drosophilaru
mのpkD1プラスミドの全ヌクレオチド配列又はその一部
が存在する。更に、本発明はこのベクターにより形質転
換されたKluyveromyces属の酵母に関する。
周知のように、現在まで酵母の形質転換はある種に限
られていた。形質転換ベクターの構築に必要な酵母プラ
スミドの入手性に乏しかつたからである（Gunge,N.,An
n.Rev.Microbiol.37,253−276.1983;Toh−e,A.,Tada,S.
およびOshima.Y.,J.Bacteriol.151,1380−1390,1982;To
h−e,A.,Araki,H.,Utatsu.I.およびOshima,Y.,Gen.Micr
obiol.130,2527−2534,1984）。
られていた。形質転換ベクターの構築に必要な酵母プラ
スミドの入手性に乏しかつたからである（Gunge,N.,An
n.Rev.Microbiol.37,253−276.1983;Toh−e,A.,Tada,S.
およびOshima.Y.,J.Bacteriol.151,1380−1390,1982;To
h−e,A.,Araki,H.,Utatsu.I.およびOshima,Y.,Gen.Micr
obiol.130,2527−2534,1984）。
Saccharomyces cerevisiaeから単離した２μプラスミ
ドは現在までS.cerevisiaeの形質転換に成功裡に使われ
た唯一のプラスミドであつた。しかし、２μプラスミド
由来のベクターは形質転換効率が低くあるいはSaccharo
myces cerevisiae以外の酵母にて安定して複製する能力
に制限があつた。
ドは現在までS.cerevisiaeの形質転換に成功裡に使われ
た唯一のプラスミドであつた。しかし、２μプラスミド
由来のベクターは形質転換効率が低くあるいはSaccharo
myces cerevisiae以外の酵母にて安定して複製する能力
に制限があつた。
したがつて、他の酵母の形質転換に適するベクターの
構築用プラスミドが必要であり、特に例えばKluyveromy
ces属に属するものを含めて、工業上重要な酵母につい
て然りである。
構築用プラスミドが必要であり、特に例えばKluyveromy
ces属に属するものを含めて、工業上重要な酵母につい
て然りである。
しかし、この必要性を現在まで満足するすべての試み
は有効でなかつた。
は有効でなかつた。
更に具体的に言えば、２つのベクターがKluyveromyce
s lactisの形質転換に使われてきた。１つはK.lactisの
染色体DNA断片を含有し（Das,S.およびHollenberg,C.
P.,Current Genetics 6,123−128,1982）および他はK.l
actisから単離した直線プラスミドpGK1から誘導した
（L.da Louvencourt,H.Fukuhara,H.Heslot,M.Wesolowsk
i,,ELF Biorecheceheのフランス特許出願第8209564号;
L.de Louvencour等,J.Bacteriol,154,737−742,198
2）。
s lactisの形質転換に使われてきた。１つはK.lactisの
染色体DNA断片を含有し（Das,S.およびHollenberg,C.
P.,Current Genetics 6,123−128,1982）および他はK.l
actisから単離した直線プラスミドpGK1から誘導した
（L.da Louvencourt,H.Fukuhara,H.Heslot,M.Wesolowsk
i,,ELF Biorecheceheのフランス特許出願第8209564号;
L.de Louvencour等,J.Bacteriol,154,737−742,198
2）。
上記両ベクターはこの酵母にて複製を可能とするK.la
ctisのヌクレオチド配列を含むが、形質転換クローンを
得る効率および／又は安定性は全く低いことを指摘する
のは重要である。
ctisのヌクレオチド配列を含むが、形質転換クローンを
得る効率および／又は安定性は全く低いことを指摘する
のは重要である。
したがつて、本発明の目的は酵母特にKluyveromyces
属用クローニングと発現ベクターの調製である。その酵
母はすぐれた形質転換効率を有しかつ形質転換細胞にお
いて高い安定性を示す。
属用クローニングと発現ベクターの調製である。その酵
母はすぐれた形質転換効率を有しかつ形質転換細胞にお
いて高い安定性を示す。
本発明によれば、この目的はC.Falconea L.Frontali
およびH.Fukuhara（発明者）により行なわれた新規プラ
スミドに関する研究過程において、形質転換ベクターの
本質部分としてKluyveromyces drosophilarum株にて発
見されたプラスミドを使うことにより達成できることが
分つた。
およびH.Fukuhara（発明者）により行なわれた新規プラ
スミドに関する研究過程において、形質転換ベクターの
本質部分としてKluyveromyces drosophilarum株にて発
見されたプラスミドを使うことにより達成できることが
分つた。
ここで扱うプラスミドは円周1.6ミクロンの環状二重D
NA分子から成り、これはUCD51−130Kluyveromyces dros
ophilarum株（U.C.D.コレクシヨン、加州大、Davis,CA9
5616）にて発見された。
NA分子から成り、これはUCD51−130Kluyveromyces dros
ophilarum株（U.C.D.コレクシヨン、加州大、Davis,CA9
5616）にて発見された。
pkD1と呼ぶこのプラスミドは高コピー数（フロー100/
細胞）の細胞に存在し、標準法を使つて染色体DNAから
容易に分離できる。
細胞）の細胞に存在し、標準法を使つて染色体DNAから
容易に分離できる。
pkD1の完全ヌクレオチド配列を測定し、プラスミドの
正確な大きさ（4757塩基対）が知られている。更に、こ
の配列の分析により、このプラスミドと２μおよびpGK1
プラスミド間の第１構造上の実質的差異についてDNA−D
NAハイブリド法により前に得たデータを確認した。
正確な大きさ（4757塩基対）が知られている。更に、こ
の配列の分析により、このプラスミドと２μおよびpGK1
プラスミド間の第１構造上の実質的差異についてDNA−D
NAハイブリド法により前に得たデータを確認した。
このプラスミドは、等量存在しかつ2.15キロベースの
中心断片の方向により互いに異なるＡとＢと呼ぶ２つの
相互変換可能な分子形の同一細胞内に存在し、第１図で
は２つの垂直の点線間から成る。第１図は多くの制限酵
素の部位の位置を示し（このような位置は直線分子とし
て描く場合はpkD1のＡ形とＢ形と呼ぶ）、これらの酵素
は図の左欄に示す。平行方向に示すスケールはプラスミ
ドに対するこれらの部位間の距離（kb）を示す。＊印は
その位置関係がはつきりしない断片を示す。
中心断片の方向により互いに異なるＡとＢと呼ぶ２つの
相互変換可能な分子形の同一細胞内に存在し、第１図で
は２つの垂直の点線間から成る。第１図は多くの制限酵
素の部位の位置を示し（このような位置は直線分子とし
て描く場合はpkD1のＡ形とＢ形と呼ぶ）、これらの酵素
は図の左欄に示す。平行方向に示すスケールはプラスミ
ドに対するこれらの部位間の距離（kb）を示す。＊印は
その位置関係がはつきりしない断片を示す。
この配列の分析の結果、2136ヌクレオチドの距離で、
配列上同一であるが逆方向をもつことが再度分つた346
塩基対のDNA断片の存在をこのプラスミドにみた。
配列上同一であるが逆方向をもつことが再度分つた346
塩基対のDNA断片の存在をこのプラスミドにみた。
この逆方向塩基配列（TR）は、S.cerevisiaeの２μプ
ラスミドで観察されたものと類似して、Ａ形とＢ形間の
相互転換の機構上基本的なもののようである。
ラスミドで観察されたものと類似して、Ａ形とＢ形間の
相互転換の機構上基本的なもののようである。
プラスミドpkD1のヌクレオチド配列から、Ａ、Ｂおよ
びＣと呼ぶ３つの可能な遺伝子の存在を推定した（1 34
1.1245および636ヌクレオチドに関し）。配列ホモロジ
イおよびその機能に関する予備研究に基づくこれらの遺
伝子は２μプラスミドに存在するFLP.Rep1およびRep2遺
伝子に夫々類似する様である（Broack,J.R.,Cell 28,20
3−204,1982）。
びＣと呼ぶ３つの可能な遺伝子の存在を推定した（1 34
1.1245および636ヌクレオチドに関し）。配列ホモロジ
イおよびその機能に関する予備研究に基づくこれらの遺
伝子は２μプラスミドに存在するFLP.Rep1およびRep2遺
伝子に夫々類似する様である（Broack,J.R.,Cell 28,20
3−204,1982）。
pkD1プラスミドは酵母のクローニングおよび発現ベク
ターの構築に有利に使うことができる。主にその環状形
が簡単な操作を可能とするからである。更に、このプラ
スミドはEcoR1、Cla IおよびPst Iの如き制限酵素に対
して多くのユニークな部位を含み、この特長は異種遺伝
子の挿入および組換えベクターの構築に対し特に有利で
ある。
ターの構築に有利に使うことができる。主にその環状形
が簡単な操作を可能とするからである。更に、このプラ
スミドはEcoR1、Cla IおよびPst Iの如き制限酵素に対
して多くのユニークな部位を含み、この特長は異種遺伝
子の挿入および組換えベクターの構築に対し特に有利で
ある。
pkD1プラスミドの存在および高コピー数の細胞中同じ
ものから誘導したベクターの存在は更に有利である。挿
入した異種遺伝子の増幅を可能にするからである。
ものから誘導したベクターの存在は更に有利である。挿
入した異種遺伝子の増幅を可能にするからである。
更に、pkD1プラスミドの配列の完全性と連続性は本発
明に係るベクターの構築に必要としないことも有利であ
る。実際、このようにpkD1配列を中断するユニークな制
限部位の１つにクローンすべき遺伝子を挿入することあ
るいは本発明の目的に対しこのプラスミドの複製オリジ
ンを含有する断片を使用することが可能である。
明に係るベクターの構築に必要としないことも有利であ
る。実際、このようにpkD1配列を中断するユニークな制
限部位の１つにクローンすべき遺伝子を挿入することあ
るいは本発明の目的に対しこのプラスミドの複製オリジ
ンを含有する断片を使用することが可能である。
本発明の特定の目的は酵母において異種遺伝子のクロ
ーニングおよび発現ベクターを構築するこであり、この
ベクターには少なくともpkD1プラスミド（Kluyveromyce
s drosophilarumから単離）のDNAの全部又は一部および
この遺伝子を発現させる配列を含めて、任意の異種遺伝
子を有するDNA断片を含有する。
ーニングおよび発現ベクターを構築するこであり、この
ベクターには少なくともpkD1プラスミド（Kluyveromyce
s drosophilarumから単離）のDNAの全部又は一部および
この遺伝子を発現させる配列を含めて、任意の異種遺伝
子を有するDNA断片を含有する。
pkD1プラスミドの全DNAを使う場合、クローンすべき
遺伝子をユニーク制限部位の一つ、特にPst I部位に挿
入することが望ましい。
遺伝子をユニーク制限部位の一つ、特にPst I部位に挿
入することが望ましい。
クローニングに最も望ましい遺伝子の内、S.cerevisi
aeのURA3遺伝子は大腸菌のpBR322プラスミドの配列およ
び更にこのURA3遺伝子の配列から成るYIP5プラスミドの
一部として特に考慮する価値がある。
aeのURA3遺伝子は大腸菌のpBR322プラスミドの配列およ
び更にこのURA3遺伝子の配列から成るYIP5プラスミドの
一部として特に考慮する価値がある。
本発明の別の望ましい態様において、ベクターはYIP5
プラスミドのユニークBamH I部位に挿入される酵素BamH
Iにより得たpkD1プラスミドのDNAの1.7kb断片を含有す
る。
プラスミドのユニークBamH I部位に挿入される酵素BamH
Iにより得たpkD1プラスミドのDNAの1.7kb断片を含有す
る。
本発明はまた上記ベクターにより形質転換された酵母
に関し、特に限定するものではないが、Kluyveromyces
属の株、更に言えばKluyveromyces lactisに関する。
に関し、特に限定するものではないが、Kluyveromyces
属の株、更に言えばKluyveromyces lactisに関する。
本発明により形質転換した酵母はベクターにより挿入
された異種遺伝子によりコードされるタン白の製造に有
利に利用できることは興味ある。このような酵母は例え
ば食品分野（アミラーゼ、レンニン、ペクチナーゼ等の
製造）又は医薬分野（インスリン、インターフエロン
等）に特に重要なものとなりうる。
された異種遺伝子によりコードされるタン白の製造に有
利に利用できることは興味ある。このような酵母は例え
ば食品分野（アミラーゼ、レンニン、ペクチナーゼ等の
製造）又は医薬分野（インスリン、インターフエロン
等）に特に重要なものとなりうる。
更に、このような形質転換酵母は動物又は家畜飼料の
成分足りうる。
成分足りうる。
制限するものではなく説明上、Kluyveromyces lactis
のura A株にてSaccharomyces cerevisiaeのURA3遺伝子
をクローニングおよび発現させるために本発明の使用が
考えられる。ura A株は通常ウラシルを含まない培地に
は生育できない。pkD1プラスミドから誘導したベクター
に存在するURA3遺伝子は宿主細胞に発現されることが分
りまたその細胞はウラシルを含まない培地に生育しうる
ことも分つた。このことは、S.cerevisiaeのURA3遺伝子
によりコードされるオロチジン−モノリン酸塩脱カルボ
キシレードタン白はK.lactisにより有効に合成されるこ
とを示す。
のura A株にてSaccharomyces cerevisiaeのURA3遺伝子
をクローニングおよび発現させるために本発明の使用が
考えられる。ura A株は通常ウラシルを含まない培地に
は生育できない。pkD1プラスミドから誘導したベクター
に存在するURA3遺伝子は宿主細胞に発現されることが分
りまたその細胞はウラシルを含まない培地に生育しうる
ことも分つた。このことは、S.cerevisiaeのURA3遺伝子
によりコードされるオロチジン−モノリン酸塩脱カルボ
キシレードタン白はK.lactisにより有効に合成されるこ
とを示す。
URA3遺伝子を含むpkD1プラスミドから誘導したベクター
の構築 pkDプラスミドの単離と精製 プラスミドDNAはK.drosophilarumの培養物２から得
たプロトプラストにより調整した。このプロトプラスト
の溶解後に得た該酸を50mM Tris−HCl、5mM EDTA、pH8
含有溶液40mlに再懸濁させた。CsCl40gおよび臭化エチ
ジウム4ml（50mM Trsi−HCl中10mg/ml、pH8.5）をDNA含
有溶液に加え、ついでベツクマン50Tiロータにて15℃、
40時間38,000rpmで遠心した。DNAはU.V.光線で観察し、
プラスミドDNAに相当する低バントグライエントより回
収しそして上記操作により２度精製した。
の構築 pkDプラスミドの単離と精製 プラスミドDNAはK.drosophilarumの培養物２から得
たプロトプラストにより調整した。このプロトプラスト
の溶解後に得た該酸を50mM Tris−HCl、5mM EDTA、pH8
含有溶液40mlに再懸濁させた。CsCl40gおよび臭化エチ
ジウム4ml（50mM Trsi−HCl中10mg/ml、pH8.5）をDNA含
有溶液に加え、ついでベツクマン50Tiロータにて15℃、
40時間38,000rpmで遠心した。DNAはU.V.光線で観察し、
プラスミドDNAに相当する低バントグライエントより回
収しそして上記操作により２度精製した。
pkD1誘導ベクター pkD1が互いに逆方向反復塩基（TR）配列対を持つ閉還
形で示してある第２図に言及する。黒く示したゾーンは
プラスミドに存在する主遺伝子の位置を示す。更に、プ
ラスミドのクローニングおよび操作にとつて最も重要な
制限部位の位置が示してある。
形で示してある第２図に言及する。黒く示したゾーンは
プラスミドに存在する主遺伝子の位置を示す。更に、プ
ラスミドのクローニングおよび操作にとつて最も重要な
制限部位の位置が示してある。
この図では、プラスミドのＢ形が示されている。記述
した様に、遺伝子Ｂが位置されている環の方向によつ
て、形はＢ形と異なつている。
した様に、遺伝子Ｂが位置されている環の方向によつ
て、形はＢ形と異なつている。
組換えプラスミドの構築に対し、pkD1を先ずユニーク
Pst I部位で直線化した。同時に、S.cerevisiaeのURA3
遺伝子配列およびバクテリアのプラスミドpBR322の配列
を含む組換えプラスミドであるYIP5もPst I部位で直線
化した。YIP5の構造は第2b図に示す。S.cerevisiaeのUR
A3遺伝子配列は黒で示してあり、バクテリアのプラスミ
ドpBR322の配列は白で示してあり、その遺伝子はアンピ
シリン（Amp）耐性とテトラサイクリン（Tet）耐性であ
る。更に、クローニングに使うあるユニーク制限部位の
位置が示されている。
Pst I部位で直線化した。同時に、S.cerevisiaeのURA3
遺伝子配列およびバクテリアのプラスミドpBR322の配列
を含む組換えプラスミドであるYIP5もPst I部位で直線
化した。YIP5の構造は第2b図に示す。S.cerevisiaeのUR
A3遺伝子配列は黒で示してあり、バクテリアのプラスミ
ドpBR322の配列は白で示してあり、その遺伝子はアンピ
シリン（Amp）耐性とテトラサイクリン（Tet）耐性であ
る。更に、クローニングに使うあるユニーク制限部位の
位置が示されている。
２つの直線化分子は公知標準法のDNAリガーゼにより
共通のPst I部位で結合した。
共通のPst I部位で結合した。
したがつて、この連結により得たプラスミドは全体の
pkD1配列、URA3遺伝子およびpBR322配列を有する。後者
の配列は大腸菌にて構築ベクターを増幅するために導入
した。
pkD1配列、URA3遺伝子およびpBR322配列を有する。後者
の配列は大腸菌にて構築ベクターを増幅するために導入
した。
連結反応混合物は塩化カルシウムで処理した後形質転
換に適合させたRR1株の大腸菌細胞のサスペンジヨンに
直接加えた。
換に適合させたRR1株の大腸菌細胞のサスペンジヨンに
直接加えた。
この細胞サスペンジヨンはテトラサイクリン含有完全
固形培地に平板培養させた。得られた多くのコロニー
（テトラサイクリン耐性）の内、アンピシリン含有培地
で生育できない多くのコロニーを選択した。約10％のフ
ランクシヨンを示すこれらのコロニー（テトラサイクリ
ン耐性、アンピシリン感受性）をそれらが含むプラスミ
ドの性質について別々に試験した。
固形培地に平板培養させた。得られた多くのコロニー
（テトラサイクリン耐性）の内、アンピシリン含有培地
で生育できない多くのコロニーを選択した。約10％のフ
ランクシヨンを示すこれらのコロニー（テトラサイクリ
ン耐性、アンピシリン感受性）をそれらが含むプラスミ
ドの性質について別々に試験した。
PIベクターで示す、第2c図のように、このようなコロ
ニーの約半分は目的の構造を有する組換えプラスミドを
含有した。使用した記号は第2a図と2b図で使つたものと
同一である。
ニーの約半分は目的の構造を有する組換えプラスミドを
含有した。使用した記号は第2a図と2b図で使つたものと
同一である。
この操作により、P3と呼ぶ別のベクターも構築した
が、pkD1のＡ形を含む点でP1と異なる。
が、pkD1のＡ形を含む点でP1と異なる。
A15プラスミドはpkD1から誘導されたその他の組換え
分子である。後者はBamH Iによる制限酵素で消化し、17
00塩基対の断片を単離した。ついでこの断片をそのユニ
ークBamH I部位で切断したYIP5の直線化分子と混合し
た。連結しかつ大腸菌にて増幅後（上記したように）、
アンピシリン耐性およびテトラサイクリン感受性を示す
クローンを選択した。組換えプラスミドをこのクローン
から単離し、予期したように、このプラスミドはpkD1の
BamH I断片、URA3遺伝子およびpBR322の配列を含有し
た。
分子である。後者はBamH Iによる制限酵素で消化し、17
00塩基対の断片を単離した。ついでこの断片をそのユニ
ークBamH I部位で切断したYIP5の直線化分子と混合し
た。連結しかつ大腸菌にて増幅後（上記したように）、
アンピシリン耐性およびテトラサイクリン感受性を示す
クローンを選択した。組換えプラスミドをこのクローン
から単離し、予期したように、このプラスミドはpkD1の
BamH I断片、URA3遺伝子およびpBR322の配列を含有し
た。
A15ベクターの構築に関する第３図では、YIP5プラス
ミドにおけるpkD1の1.7KbBamH I断片（黒色）の挿入点
が示してある。使用した記号は上記図面と同じである。
ミドにおけるpkD1の1.7KbBamH I断片（黒色）の挿入点
が示してある。使用した記号は上記図面と同じである。
上記したpkD1を使つて構築したベクター、URA3遺伝子
および大腸菌にて複製できる。pBR322の配列は上記した
大腸菌のクローンから精製しついでKluyveromyces lact
isのura A株の形質転換に使つた。
および大腸菌にて複製できる。pBR322の配列は上記した
大腸菌のクローンから精製しついでKluyveromyces lact
isのura A株の形質転換に使つた。
Kluyveromyces lactisの形質転換 K.lactisのura A変異はS.cerevisiaeのURA3遺伝子に
より補完されうることを上記研究は証明した（L.de Lou
vencourt等J.Bactehiol.154,737−742,1982）したがつ
て、この変異を含むK.lactis株は、pkD1配列とURA3遺伝
子から成るハイブリツドプラスミドによる形質転換を確
信するのに使つた。
より補完されうることを上記研究は証明した（L.de Lou
vencourt等J.Bactehiol.154,737−742,1982）したがつ
て、この変異を含むK.lactis株は、pkD1配列とURA3遺伝
子から成るハイブリツドプラスミドによる形質転換を確
信するのに使つた。
K.lactisのCBS2359株からOrsay研究所にて単離した株
MW98−8C（ａ、ura A,arg,lys,K+,R+）を２％グルコー
ス、１％酵母エキスおよび１％バクトペプトン含有液体
培地にし振盪浴中28℃,18時間生育させた。
MW98−8C（ａ、ura A,arg,lys,K+,R+）を２％グルコー
ス、１％酵母エキスおよび１％バクトペプトン含有液体
培地にし振盪浴中28℃,18時間生育させた。
対数生育段階の細胞は標準法によりプロトプラストに
転換した。
転換した。
このプロトプラストは約109/mlの濃度でSTCバツフア
ー（1Mソルビトール、10mMCacl2、10mM Tris−Hcl、pH
7.5）に再懸濁させた。通常0.1mlのこのサスペンジヨン
試料は本発明にて記述したp1、p3およびA15と対照プラ
スミド0.2−0.5μｇと混合した。
ー（1Mソルビトール、10mMCacl2、10mM Tris−Hcl、pH
7.5）に再懸濁させた。通常0.1mlのこのサスペンジヨン
試料は本発明にて記述したp1、p3およびA15と対照プラ
スミド0.2−0.5μｇと混合した。
10分後、サスペンジヨンを42℃、２分間加熱し、１容
のポリエチレングリコール4000と混合した。更に室温で
10分後、サスペンジヨンを遠心分離し、スフエロプラス
トを洗いそしてSOSバツフアー（この100mlは50mlの2Mソ
ルビトール、33.5mlのYEP培地、0.65mlの1MCacl2、135
μの１％ウラシルおよび15mlの水を含有する）に再懸
濁させた。
のポリエチレングリコール4000と混合した。更に室温で
10分後、サスペンジヨンを遠心分離し、スフエロプラス
トを洗いそしてSOSバツフアー（この100mlは50mlの2Mソ
ルビトール、33.5mlのYEP培地、0.65mlの1MCacl2、135
μの１％ウラシルおよび15mlの水を含有する）に再懸
濁させた。
スフエロプラストサスペンジヨン試料0.1mlを4mlのＷ
培地（これは45℃で液体に保ち、ウラシル以外の栄養要
求性を補完した補給物を含有）4mlに加え、固形Ｗに培
地含有ペトリ皿に注いだ。
培地（これは45℃で液体に保ち、ウラシル以外の栄養要
求性を補完した補給物を含有）4mlに加え、固形Ｗに培
地含有ペトリ皿に注いだ。
コロニーの生育は28℃で３−４日培養後に観察した。
第１表はpkD1プラスミドから誘導したベクターにより
Kluyveromyces lactis MW98−8C株の形質転換実験の数
および安定性を示す。
Kluyveromyces lactis MW98−8C株の形質転換実験の数
および安定性を示す。
pkD1配列含有プラスミドを添加したプロトプラストの
みがura+であるコロニーを生成した。どのpkD1配合を含
有しないYIP5の場合に、生育培地にウラシルを添加した
時だけコロニーを観察した。
みがura+であるコロニーを生成した。どのpkD1配合を含
有しないYIP5の場合に、生育培地にウラシルを添加した
時だけコロニーを観察した。
DNAはpkD1−誘導ベクターで形質転換したいくつかの
コロニーから抽出した制限地図が形質転換に使つたプラ
スミドの地図に同じであるプラスミドが存在することが
分つた。
コロニーから抽出した制限地図が形質転換に使つたプラ
スミドの地図に同じであるプラスミドが存在することが
分つた。
表に示すように、A15に含まれるpkD1DNA断片は組換え
ベクターの複製を促進するのにそれ自身十分である。こ
のpkD1領域を含まない他のベクターはKluyveromyces la
ctisを形質転換できない。しかし、A15ベクターの形質
転換効率および生成形質転換体の安定性は他のベクター
でみられたより低い。このことは、A15ベクターがプラ
スミド保持に重要な役割をもつあるpkD1配列を欠いてい
ることを示唆している。
ベクターの複製を促進するのにそれ自身十分である。こ
のpkD1領域を含まない他のベクターはKluyveromyces la
ctisを形質転換できない。しかし、A15ベクターの形質
転換効率および生成形質転換体の安定性は他のベクター
でみられたより低い。このことは、A15ベクターがプラ
スミド保持に重要な役割をもつあるpkD1配列を欠いてい
ることを示唆している。
全pkD1プラスミドを含むP1とP3で得た形質転換体の安
定性はKluyveromycesの形質転換でこれまで観察された
ものの最高である。
定性はKluyveromycesの形質転換でこれまで観察された
ものの最高である。
これらのベクターにより形質転換された酵母を含めて
これは工業利用上非常に有利である。
これは工業利用上非常に有利である。
第１図は多くの制限酵素の部位の位置を示す。 第2a図はpkD1プラスミドのＢ形の構造を示す。 第2b図はYIP5プラスミドを示す。 第2c図は本発明によるP1ベクターを示す。 第３図は本発明の別の態様によるA15ベクターを示す。
フロントページの続き (73)特許権者 999999999 サントル ナショナル ドゥ ラ ルシ エルシュ シアンティフィック フランス国 パリ，ケ アナトール フ ランス 15 (72)発明者 クラウディオ ファルコネ イタリア国 ローマ，ビアーレ ブルノ ブオジィ，ナンバー 107 (72)発明者 ヒロシ フクハラ フランス国 ジフ スル イベット，ア ブニュ ドウ ジェネラル ルクルルク 160，バティマン ７ (72)発明者 ラウラ フロンタリ イタリア国 ローマ，ビア アディゲ, ナンバー 30
Claims (9)
- 【請求項１】酵母における異種遺伝子の発現のためのク
ローニングベクターであって、 酵母中で複製することができ、 自律複製配列、シス作用安定化配列及び逆方向反復塩基
配列からなる群より選ばれた少なくとも一つのpKD1プラ
スミド由来の配列、及び 異種遺伝子を有し、該遺伝子の発現を確立する配列を含
むDNA断片からなり、 該pKD1プラスミドは以下の制限地図 を有することを特徴とする上記ベクター。 - 【請求項２】異種遺伝子をpKD1プラスミドのユニーク制
限部位の一つに挿入する特許請求の範囲第１項記載のベ
クター。 - 【請求項３】ユニーク制限部位はPst I部位である特許
請求の範囲第２項記載のベクター。 - 【請求項４】異種遺伝子はSaccharomyces cerevisiaeの
URA3遺伝子である特許請求の範囲第１項から第３項まで
のいずれか１項に記載のベクター。 - 【請求項５】URA3遺伝子を有するDNA断片はYIP5プラス
ミドのDNAである特許請求の範囲第４項記載のベクタ
ー。 - 【請求項６】pKD1プラスミドの1.7キロベース長のDNA断
片を含有し、この断片は酵素BamH Iにより得られ、YIP5
プラスミドのユニークBamH I部位に挿入する特許請求の
範囲第５項記載のベクター。 - 【請求項７】酵母における異種遺伝子の発現のためのク
ローニングベクターであって、 酵母中で複製することができ、 自律複製配列、シス作用安定化配列及び逆方向反復塩基
配列からなる群より選ばれた少なくとも一つのpKD1プラ
スミド由来の配列、及び 異種遺伝子を有し、該遺伝子の発現を確立する配列を含
むDNA断片からなり、 該pKD1プラスミドは以下の制限地図 を有する上記ベクターにより形質転換されたことを特徴
とする酵母。 - 【請求項８】Kluyveromyces属に属する特許請求の範囲
第７項記載の酵母。 - 【請求項９】Kluyveromyces lactisに属する特許請求の
範囲第８項記載の酵母。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT47830/86A IT1203758B (it) | 1986-03-27 | 1986-03-27 | Vettori di clonazione e di espressione di geni eterologhi in lieviti e lieviti trasformati con tali vettori |
| IT47830A/86 | 1986-03-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63290A JPS63290A (ja) | 1988-01-05 |
| JP2646085B2 true JP2646085B2 (ja) | 1997-08-25 |
Family
ID=11262795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62073948A Expired - Lifetime JP2646085B2 (ja) | 1986-03-27 | 1987-03-27 | 異種遺伝子の発現用ベクター |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0241435B1 (ja) |
| JP (1) | JP2646085B2 (ja) |
| AT (1) | ATE83009T1 (ja) |
| DE (2) | DE241435T1 (ja) |
| ES (1) | ES2053586T3 (ja) |
| GR (1) | GR3007153T3 (ja) |
| IT (1) | IT1203758B (ja) |
Families Citing this family (16)
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|---|---|---|---|---|
| US4943529A (en) | 1982-05-19 | 1990-07-24 | Gist-Brocades Nv | Kluyveromyces as a host strain |
| ATE97446T1 (de) * | 1987-07-28 | 1993-12-15 | Gist Brocades Nv | Kluyveromyces als wirtsstamm. |
| FR2649991B2 (fr) | 1988-08-05 | 1994-03-04 | Rhone Poulenc Sante | Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces |
| JPH0486191A (ja) * | 1990-07-30 | 1992-03-18 | Aiphone Co Ltd | テレビドアホン方式 |
| FR2678636A1 (fr) * | 1991-07-02 | 1993-01-08 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production de proteines recombinantes et cellules hote utilisees. |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| DE4244915C2 (de) * | 1992-08-14 | 1998-12-03 | Widmar Prof Dr Tanner | DNA-Moleküle codierend Proteine, die an der O-Glykosylierung von Proteinen beteiligt sind |
| GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| US6358705B1 (en) | 1998-07-16 | 2002-03-19 | Novo Nordisk A/S | Method of making proteins in transformed yeast cells |
| AU2001266557A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-23 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP2305311A3 (en) | 2001-10-10 | 2011-07-20 | BioGeneriX AG | Glycoconjugation of peptides |
| ES2516041T3 (es) | 2001-10-10 | 2014-10-30 | Ratiopharm Gmbh | Remodelación y glicoconjugación de la hormona del crecimiento humano (hGH) |
| WO2003059934A2 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP2261250B1 (en) | 2001-12-21 | 2015-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | GCSF-Albumin fusion proteins |
| MXPA05010773A (es) | 2003-04-09 | 2005-12-12 | Neose Technologies Inc | Metodos de glicopegilacion y proteinas/peptidos producidos por los metodos. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US4657857A (en) * | 1982-05-19 | 1987-04-14 | Internationale Octrooi Maatschappij "Octropa" B.V. | Yeast of the genus kluyveromyces modified for the expression of preprothaumatin or its various allelic and modified forms or their maturation forms, and the proteins obtained by that expression |
| FR2532656B2 (fr) * | 1982-06-02 | 1985-10-18 | Elf Bio Rech | Nouveau vecteur de clonage et d'expression, levure et bacterie transformees par ce vecteur |
-
1986
- 1986-03-27 IT IT47830/86A patent/IT1203758B/it active
-
1987
- 1987-03-25 AT AT87830114T patent/ATE83009T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-25 DE DE198787830114T patent/DE241435T1/de active Pending
- 1987-03-25 DE DE8787830114T patent/DE3782844T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-25 EP EP87830114A patent/EP0241435B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-25 ES ES87830114T patent/ES2053586T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-27 JP JP62073948A patent/JP2646085B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-02-25 GR GR930400389T patent/GR3007153T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0241435B1 (en) | 1992-12-02 |
| IT1203758B (it) | 1989-02-23 |
| DE241435T1 (de) | 1989-03-09 |
| ATE83009T1 (de) | 1992-12-15 |
| GR3007153T3 (ja) | 1993-07-30 |
| EP0241435A2 (en) | 1987-10-14 |
| DE3782844D1 (de) | 1993-01-14 |
| JPS63290A (ja) | 1988-01-05 |
| DE3782844T2 (de) | 1993-06-17 |
| EP0241435A3 (en) | 1988-09-14 |
| ES2053586T3 (es) | 1994-08-01 |
| IT8647830A0 (it) | 1986-03-27 |
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