JPH02303497A - サケ成長ホルモンのピキア属メチロトローフ酵母での発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジーの分野に関す
る。１つの観点では、本発明はサケの成長ホルモン（ｓ
ＧＨ）を呈上ヱ（Ｐｔｃｈｉａ）属のメチロトローフ酵
母で発現させる方法に関する。他の観点では、本発明は
サケの成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列を包含する
新規のベクターで形質転換された新規の酵母株に関する
。

（従来技術） サケの成長ホルモン（ｓＧＩｌ）はセキネ（Ｓｅｋｉｎ
ｅ）らハエｌ、　Ａｃａ止Ｊｄ」−１録、　４３０６−
４３１０（１９８５）　）によって単離され１．大ＪＭ
Ｊ［遷−東」ｌ　　にクローン化されている。大■Ｉが
生産するｓＧＨには、ニジマスの成長を刺激する生物活
性があることが証明されている。

二のホルモンを水性の養殖用商品として魚類の飼料（ｆ
ｅｅｄ）および餌（ｂａｉｔｓ）として利用するにはほ
ど遠い、サケおよびマスのような商業上重要な数種類の
魚はこのホルモンに反応し、かつ５Ｇｔｌを投与すると
その成長が増加するであろう。

残念な事に、太吸１はｓＧＨの生産に不適当な宿主であ
ることが証明されている０例えば、環１直は生産された
ｓＧＨに混入し易いエンドトキシンを生産する。これら
のエンドトキシンは望ましくない汚染物質であり、高価
な精製手段を用いて除去する必要がある。さらに大腸菌
で主に生産される２５ｋＤ蛋白質は不活性形であり、こ
の不活性蛋白質を活性型にするためにはこれを溶解し、
変性処理し、さらに変性蛋白質を元の形に戻す必要があ
る。

また、太且１は不活性な２５ｋＤのｓＤＨ蛋白質をもっ
ばら生産する代わりとして、僅かの量のより望ましい生
物活性をもつ２２ｋＤのｓＤＨ蛋白質を生産するだけで
ある。

また、欧、州特許出願第８７１０４３２１．２号に開示
され、現在では欧州特許公告第２３９０７５号（協和発
酵工業株式会社）として公表されたように、５ＧＩｌを
５カロミセス・セレビシアエＣ３ａｃｃｈａｒＯｓＣｅ
ｓ　ｃａｒ−７で生産する試みもなされている。しかし
ながら、発現した蛋白質の形は唯一、不活性な２５ｋＯ
のｓＤＨ蛋白質のみであった。このように、２５ｋＤの
５ＧＩＩ蛋白質のさらなるプロセシングの必要性を未然
に除去する、２２ｋＤ形のｓＧＨの生産を増加させるた
めの方法および宿主株を提供することは、この技術分野
への重要な貢献となるであろう。

（発明が解決しようとする課題） 故に、本発明の目的はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメチ
ロトローフ酵母株で２２ｋＤの５ＧＩｌの生産を増加さ
せる方法を提供することである。

本発明の他の目的はｓＧＨをコートするＤＮＡ配列を含
む新規ベクターを提供することである。

本発明の他の目的は５ＧＩＩをコードするＤＮＡ配列を
包含する新規の線状組込み部位特異的ベクターを提供す
ることである。

本発明のさらなる目的は、２２ｋＯのｓＧＨの生産を増
強させる能力をもつ１つのベクターあるいはべフター頻
で形質転換した、商業的発酵に適切な新規のピキア（Ｐ
ｉｃｈｉａ）属のメチロトローフ酵母株を提供すること
である。

本発明の他の目的、態様およびさらなる利点は、本明細
書に含まれる開示、特許請求の範囲、および図面より明
らかになるであろう。

（課題を解決するための手段） 本発明に従って、我々は風土ヱ（Ｐｉｃｈｉａ）属のメ
チロトローフ酵母を発現カセット内に包含された５ＧＩ
Ｉの構造遺伝子を含む適合性ベクターで形質転換するこ
とからなる、２２ｋＤの５ＧＩＩ蛋白質の改良された生
産方法を発明した。

ここで図面について説明する。

第１図Ａ４！ｐＵｃ１８の概要ならびにＥｃｏＲＩおよ
び１１ｉｎｄｌｌｌで消化しｐＡＯ８０４のＥｃｏＲＩ
　サイトに挿入するために調製した汎用クローニングサ
イトを提供する。

第１図Ｂはｐ＾０８０４の概要を提供し、このｐＡＯ８
０４はに吐■で消化されさらにそこにｐＵ０１８からの
ポリリンカーフラグメントが挿入されることになるであ
ろう。

第１図ＣはｐＡＯ８０４の皿ＩサイトへｐＵｃ１８ポリ
リンカーフラグメントを挿入して出来た生成物であるｐ
ＨＩＬ２０１の概要を提供しているが、ｋ吐Ｉフラグメ
ント上の制限サイトのすべてを図示してはいない。

第２図Ａはｔｌｉｎｄ［ｎで消化されるであろうρ５Ｇ
ＩＩＩＢ２の概要を提供する。

第２図ＢはｐＨＩＬ２０１の概要を提供し、このｐＨｌ
［。

２０１はｓＧＩ！構造遺伝子を含む１ＩｉｎｄｌＩＩフ
ラグメントを挿入するためにＳｍａ　ｌサイトで切断さ
れることになるであろう、また、ＥｃｏＲＩ　フラグメ
ントの制限サイトのすべてを図示してはいない。

第２図ＣはｐＨＩＬ２０１にシ１１サイト挿入の５ＧＩ
Ｉ構造遺伝子を挿入した生産物であるｐ旧シ５１の概要
を提供する。このプラスミドは後にｌＩｌでこのプラス
ミドを部分消化することによって線状ベクターとして使
用されるであろう。

本発明に従って、ピキア（■堕ｎ）属のメチロトローフ
酵母株内で２２ｋＤ−ｓＧＨの改良された生産力ン去が
提イ共される。

さらに、本発明に従って、ｓＧＨをコードするＤＮＡ配
列を包含する新規ベクターが提供される。

さらにまた、本発明はｓＧＨをコードするＤＮＡ配列を
包含する新規の線状組込み部位特異的ベクターをも提供
する。

また、本発明は、２２ｋＤ−ｓＧＨの生産を増加させる
能力をもつ１つのベクターまたはベクター類で形質転換
された、商業的発酵に適した新規呈上ヱ北江…旦属のメ
チロトローフ酵母株を提供する。

５ＧＩＩをコードする遺伝子は、セキネ（Ｓｅｋｉｎｅ
）ら、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、　ＦＪＩ、　４３０６−
４３１０．１９８５年７月、によって用いられた技術に
従って、サケより直接回収され得る。ヌクレオチド配列
の人工構築のようなｍ換えｆｌｌｌＡｌｌｌ用いた他の
戦略もまた、この遺伝子を単離するために用いることが
できた。しかしながら、本発明を実施するためには、１
９８４年６月２３日に寄託されたプラスミドｐｓＧ１１
１　、太Ｕ（Ｌ並旦）ＥＳＧＨＩ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５
５１）　　；　１９Ｂ４年９月２０日に寄託されたｐｓ
Ｇ１１１４、大腸＠ＥｓＧ１１−１４（Ｆ［！ＲＭ　Ｂ
Ｐ６１１）；１９８４年９月２０日に寄託されたｐｓＧ
ＩＩ＋８２　、大腸菌ＥＳＧｌｌＩ８２（ＦＥＲＭＢＰ
−６１２）　　ｉ　１９８５年２月８日に寄託されたｐ
ｓＧ１１１１８９、大腸菌εＳＧＩＩＩＩ８９（ＰＥＲ
Ｍ　［１Ｐ−７０７）　　；および１９８５年２月８日
に寄託されたρ５ＧＩＩＩＩＣ２、大腸菌ＥＳＧＩ（Ｉ
ＩＣ２（ＦＥＲＮ　ＢＰ−７０８）と名付けられた米国
特許第４，６８９，４０２号に関連して寄託されたプラ
スミドよりｓＧＩ＋遺伝子を単離することが望ましい。

すべての寄託はＦＲＩで作られた。

上記のプラスミドからの５ＧＩＩ遺伝子の単離は任意の
適切な技術または技術の組合わせによってなし遂げられ
得る０例えば、ｐｓＧＩＩＩＩｃ２を含む大腸菌株を培
養後、プラスミドＤＮＡはピルムポイン（Ｄｉｒ＋ｗｂ
ｏｉｎ）およびドビイ（Ｄｏｂｙ）の方法、又久２不・
・り・アシ・　′・ｉ　−チ（損匹１．４劇１」値」−
１ｈ１５１３−１５２３（１９７９）を、用いることに
よって回収され得た０次いでプラスミドはＣｓＣ１−Ｅ
ｔＢｒ密度遠心分離を用いて精製できた。さらに最終的
には、遺転子は■ｎｄｌｌｌおよび独１」でのエンドヌ
クレアーゼ消化、ゲル電気泳動、およびｓＧＨ遺伝子を
包含する小さい方の１ｌｉｎｄ　ｍ　−Ｘｂａ　Ｉフラ
グメントの電気溶出によって回収され得た。

上に列挙した環１面株の培養は任意の適切な手段によっ
て成し遂げられるであろう、太ＩＪＪｉを培養するため
の一般的技術はこの技術分野では既知であり、ｓＧＨ遺
伝子を含む株に特異的な必要性に対応してこれらの方法
を任意に修正することも当業者の能力の範囲内で十分対
応できる。

太■回からのプラスミドＤＮＡの回収は、コンパクトサ
イズおよび閉鎖用らせん形によって、いろいろな技術に
よって成し遂げられ得る０例えば、集菌後、宿主細胞を
遠心分離によってベレット状にし、その後再懸濁して溶
菌する。溶菌液は遠心分離して細胞砕片を取去し、ＤＮ
Ａを含む上澄液を残す０次いでフェノール抽出を行ない
他の汚染物質のほとんどをＤＮＡから除去する。そうし
た後、フェノール抽出したＤＮＡはさらに密度勾配遠心
分離またはゲル濾過技術を用いて処理し、プラスミドＤ
ＮＡを細菌性ＤＮＡから分離する。上述のような分離を
成し遂げるための技術はこの技術分野では熟知されてお
り、これらの技術を実行するための数多くの方法が知ら
れている。

ｓＧＨ遺伝子を包含するプラスミドのヌクレアーゼ消化
は、完全なｓＧＨ遺伝子の回収を容易にするような手段
として選ばれたプラスミドを切断するのに適切なエンド
ヌクレアーゼを選ぶことによって成し遂げられるであろ
う、使用されるエンドヌクレアーゼは５（ｄｉ　Ｊｉ伝
転子副出されるはずの起源に依存するであろう０例えば
、プラスミドｐｓＧＩＩＩＩｃ２に含まれる５ＧＩＩ遺
伝子は…ｎｄｌ［−Ｘｂａ　Ｉフラグメントとして回収
され得た。ゲル電気泳動またはその他の適切な技術が５
ＧＩＩ遺伝子を含むフラグメントを存在する他のフラグ
メントから分離するために必要とされるであろう。

ＤＮＡのゲル電気泳動は数多くの技術を用いて成し遂げ
られるであろう、セアリ（Ｐ、Ｇ、５ｅａｌｙ）および
サザン（［！、Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ）、″核酸のゲル
電気泳動−実用的研究法（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ−Ａ　
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）’　（リック
ウッド（Ｄ、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）およびハメス（Ｂ、Ｄ
、ｌＩａｍｅｓ）　編）　、３９頁（１９８２）を参照
されたい、溶出もまた、電気溶出、拡散、ゲル溶解（ア
ガロースゲル）または物理的押出しくアガロースゲル）
のような、用いるゲルに適切な数多くの技術を用いて成
し遂げられるであろう、さらに、溶出は高品質の低融解
温度のアガロースのようなある種のゲルでは必要ないこ
とがＬこめられている。

ひとたび！ＩＧＩ＋遺伝子を含むフラグメントを単離し
ても、そのフラグメントをベクター内に挿入する前にさ
らなる操作が必要とされるであろう、このような抛作に
は、これらに制限されるわけではないが、リンカ−を添
加すること、またはフラグメントをプラントエンド（平
滑末端）にすることが含まれるであろう。

ｓＧＨ遺伝子を単離した後、遺伝子は呈上ヱ律辷ｃｈｉ
ａ）に適合するプラスミドまたは線状の形質転換ベクタ
ーのような適切なベクター内に挿入されス プラスミドはずっと以前から組換えＤＮＡ技術で使用さ
れる基本成分の１つであった。プラスミドは微生物内に
見い出される環状の染色体外の二本鎖ＤＮＡである。プ
ラスミドは１細胞あたり１コピーまたは多コピー存在す
ることが認められている。

プラスミドＤＮＡ内には、プラスミドを再生産するため
に必要とされる情報、即ち自己複製配列または八Ｉｔｓ
　　（複製開始点は細菌の複製のために含まれるであろ
う）、が含まれている。形質転換された細胞内のプラス
ミドを表現型で選択する１つ以上の手段もまた、プラス
ミド内にコードされた情報に含まれるであろう、抗生物
質耐性または宿主の生化学的代謝経路の欠損を補足する
遺伝子のような表現型または選択マーカーは、形質転換
された宿主細胞のクローンを認知し、選択し、及び維持
することを可能にする。

−く土１−（Ｐｉｃｈｉａ）内で５Ｇ）ｌ遺伝子を発現
させるためには、ｓＧＨ遺伝子をピキアに適合する！Ｊ
ｉｌ　ｆｌｆｆ領域および３′終止配列に機能しうるよ
うに連結しなければならず、こうすることによって発現
カセットが形成され、この発現カセットかベクターの形
で宿主内に挿入されるであろう。

次の用語をここに説明の目的で定義する。

ｌｊ　ｓｃ　ｏ　ｍとはｓＧＨ遺伝子が発現した結果性
したポリペプチドを指す。

゛機能しうるように連結した”とは、成分がそれらの機
能を果たせるように配列された並び方を指す。

°“調節領域゛とは、いろいろな刺激と反応し、かつａ
＋ＨＡの転写頻度に影響を与える異質（ｈｅｔｅｒｏ−
ｇｅｎｅｏｕｓ）のＤＮＡ配列を指す。

“３′終止配列°゛とは、ポリアデニル化またはステム
ループ（ｓｔｅｍ　１ｏｏｐ）構造を作り出す配列のよ
うにｍ１ｉＮ＾を安定化するために機能する終止コドン
までの３′側配列を指す。

“ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）適合生゛とは、ｅ４ヱ、また
のように近接した関連に ある酵母に起源を有する調節領域および３′終止配列の
ように呈上１内で正常に機能するＤＩＩＡ配列を指す。

本発明を実施するにあたって好適なのは、欧州出願第８
６１１４７００．７号に記載され、現在では欧州特許公
報第２２６７５２号として発表されている、フレラグ（
ｃｒｅｇｇ）の線状部位特異的組込みベクターのような
組込ベクターである。このようなベクターは、少なくと
も１）第一の挿入可能なＤＮＡフラグメント；２）選択
可能なマーカー遺伝子；および３）第二の挿入可能なＤ
ＮＡフラグメント；からなる。

第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントはそれ
ぞれ少なくとも約２００ヌクレオチドの長さであり、呈
上１属の種のゲノムＤＮＡの一部分と相同なヌクレオチ
ド配列を持つ、ｍ込みベクターのいろいろな成分は、発
現カセットおよび選択可能なマーカー遺伝子が第一の挿
入可能なＤＮＡフラグメントの３′末端と第二の挿入可
能なＤＮＡフラグメントの５′末端との間に位置するよ
うなＤＮＡの線状フラグメントを形成するように連続的
に配置されている。第一および第二の挿入可能なＤＮＡ
フラグメントは、それらがピキアのゲノム内で方向付け
られているのと同様に、連続配置の線状フラグメント内
でもお互いに方向が合うように配置されている。

第一および第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントとして
有効なヌクレオチド配列は、ゲノムの修飾が起こるはず
の本来のピキアのゲノム部位での切り離された一部分と
相同なヌクレオチド配列である。従って、例えば、ゲノ
ムの修飾がアルコールオキシダーゼの遺伝子座で起こる
はずであるならば、使用する第一および第二の挿入可能
なＤＮＡフラグメントはアルコールオキシダーゼ遺伝子
座より切り離された部分と相同な配列となるであろう。

本発明に従って起こるゲノムの修飾のために、２つの挿
入可能なＤＮＡフラグメントはそれらが立ヱのゲノム内
で存在するのと同一の方向関係で線状フラグメント内に
互いに方向を合わせて配置されねばならない、第一およ
び第二の挿入可能なＯＮ八へラグメントとして使用され
うるヌクレオチド配列の代表的例は、アルコールオキシ
ダーゼｎ■辻遺伝子、ジヒドロキシアセトン　シンター
ゼ］遺伝子、ρ４０遺伝子、および国運転子からなる群
より選択されるヌクレオチド配列である０皿遺伝子、］
−遺伝子、ρ４０遺伝子、およびＨＩＳ４遺伝子は欧州
公開特許出願第０１８３０７１号〔フィリップス　ベト
ロレウム　カンパニー（Ｐｈ−ｉｌ＋ｉｐｓ　Ｐｅｔｒ
ｏｌｅｕｍ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　）の中に含まれている
。

第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントは：発現カセット
内で使用される調節領域からなる機能しうる調節領域を
含むであろう、第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントを
発現カセットについての調節領域として使用することは
、本発明の好適な実施態様である。第２図Ｃは、カセッ
トの調！ｆｆｗｔ域として、第一の挿入可能なＤＮＡフ
ラグメントを利用するベクターの図を提供する。

さらに第２図Ｃに示すように、挿入部位（群）および３
′終止配列は第一の挿入可能なフラグメントの３′末端
に隣接した位置に配置されるであろう。

このような線状部位特異的組込みベクターの配座は、適
合する３′終止配列の追加を必要とすることなく、構造
遺伝子を挿入するために準備された部位を提供するとい
う点でも有利である。

ｐＨＩＬＺＯ１ベクター内に提供されるように、第一の
挿入可能な配列と３′終止配列との間に切断部位が数多
くあるということは、ベクター内に構造遺伝子を挿入す
るために必要とされるリンカ−がより少数ですむという
利点もある。

また、宿主株を形質転換するために使用されるＤＮＡに
は少なくとも１個の選択可能なマーカー遺伝子が含まれ
ていることが必要である。こうする耳２ ことによって、形質転換ＤＮＡを組込んだ微生物の選択
および単離が容品になる。マーカー遺伝子は形質転換さ
れた微生物の宿主が保持していない表現型特性；例えば
、形質転換されていない宿主株が特定アミノ酸合成経路
に欠損をもつ場合にその特定アミノ酸の生産能を回復さ
せること、または抗生物質耐性など；を付与する。

典型的な選択可能なマーカー遺伝子は、且土ヱイ□エエ
よ（・　・　８　　ｉｓおよＵ九ムＬユま立回°セレビ
シアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）からの■旦遺転子およびＵ組遺転子、孟ユ左旦
ま立入・立２に之ヱ盃からのインベルターゼ遺伝子ｕ匹
鉱、大腸菌の転置成分（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ　ｅ
ｌｅｍｅ−ｎ　ｔ）　Ｔｎ６０１またはＴｎ９０３のＧ
４１８ホスホトランスフエラーゼ遺伝子からなる群より
選択されるであろう。

当業者は、さらに、例えば細菌性プラスミドＤＮＡおよ
びバクテリオファージＤＮＡなどのようなさらなるＤＮ
Ａ配列を、本発明の実施において用いられるベクター内
にも組込むことができることを認識している。そのよう
な配列は、これらのベクターを細菌宿主内で増輻および
保持することを可能にする。

もし第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントが調節領域を
含んでいないならば、機能しうる発現カセットを提供す
るためには、適切な風土ヱ適合性の調節領域が構造遺伝
子に対して機能しうるように連結するように挿入される
必要があるだろう、同様に、もし３′終止配列が発現カ
セットを完全なものにするために挿入部位に提供されて
いないならば、３′終止配列を挿入された構造遺伝子に
対して機能しうるように連結しなければならないであろ
う。

当業者は、特徴的でありかつ呈上１属との接合に使用さ
れうる調節領域を数多く知っている。典型的な風土工適
合性調節領域には、これらに限定されるわけではないが
、遣Ｊ１すＬえ±ノヨ・皇ｙ旦之ヱ盃より単離された酸
性ホスファターゼ、ガラクトキナーゼ、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ、チトクロムＣ１α−交配因子およびグリ
セルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ピキア・
バス上ニスに起源を存する第一アルコールオキシダーゼ
ｎ吠■、ジヒドロキシアセトンシンターゼ旦旦鉦）　、
ｐ４０調節領域、および■汀調節頚域などからなる群よ
り選択された酵母の調節領域が含まれる。現在のところ
、本発明の実施にあたって用いられる好適な調節領域は
、欧州公開特許出願第０１８３０７１号に開示されてい
るｇ、皿１、ρ４０および肛旦からなる群°より選択さ
れた調Ｍ　ｅｌｌ城のようにメタノール含有培地に反応
する能力によって特徴付けられるものである。

本発明の実施にあたって最も好適な調節領域は観■調ｌ
！Ｉｆｆ領域である。

３′終止配列は上述の発現カセットまたはベクターの一
部分で利用されるであろう、３′終止配列は、遺伝子に
機能しうるように連結した場合に構造遺伝子によってコ
ード化されるメツセンジャー１１ＦＩＡを終結化、ポリ
アデニル化および／または安定化するように機能するで
あろう０本発明の実施にあたって、３′終止配列の実例
となる起源の数少ない例には、これらに限定されるわけ
ではないが５．竺−。

ユ左！主立入・皇之旦之ヱ盃、バｌ皇スプ・困悲玉土ヱ
Ｌ、および呈上ヱの３′終止配列が含まれる。

特に好適なのは、観■遺伝子、Ｕ旦Ｉ遺伝子、ｐ４０遺
伝子および］遺伝子の３′終止配列よりなる群から選択
された遺伝子のような−ζ土１−・バ≦ＬＬＬ久に起源
を有する３′終止配列である。

本発明の実施にあたっては、現在のところ第１図Ｂおよ
びＣに示した構成をもつｈｌＩＩフラグメントのような
線状の形質転換ベクターを使用することが望ましい。

ｓＧＨ遺伝子の適切なベクターへの挿入は、選ばれたベ
クターを適切な部位（群）で切断し、その結果ベクター
内に存在する５ＧＩ（遺伝子を含む少なくとも１個の発
現カセ７）を生じる、任意の適切な技術によって成し遂
げられるであろう。

ｓＧＨ遺伝子の連結反応は、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼの利
用といったような任意の適切な連結反応技術によって成
し遂げられるであろう。

５ＧＩｆ遺伝子およびベクターの連結反応混合物の最初
の選択、伝播およびさらなる増幅は、（連結反応混合物
を直接酵母宿主内に形質転換することも可能であるか）
混合物を太ＩＬｉのような細菌宿主に形質転換すること
によって実行するのが望ましい、ｆＪａにとって適切な
形質転換技術はこの技術分野で熟知されている。さらに
ベクターを細菌宿主内に保持するために必要とされる選
択マーカーおよび細菌の複製開始点もまたこの技術分野
では熟知されている。

発現システム内のｓＧＨ遺伝子を含む所望のプラスミド
の単離および／または精製は、プラスミドＤＮＡを宿主
ＤＮＡから分離するための任意の適切な手段によって成
し遂げられるであろう。

同様に、連結反応によって作り出されたベクターも伝播
の後試験して、ｓＧＩ！遺伝子が存在していることなら
びにｓＧ■遺伝子が調節領域および３′終終止列に機能
しうるように連結されていることを６１認することが望
ましい、このような事柄は、これらに限定されるわけで
ばないが、エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、ま
たはエンドヌクレアーゼ消化−サザン　バイブ！ノダイ
ゼーンゴン（ＳｏｕｔｈｅｒｌｌｈｙｂｒｉｄｉｚａＬ
ｉｏｎ）を含むいろいろな技術によって成し遂げられる
であろう。

プラスミドまたは線状ベクターの酵母宿主内への形質転
換は、これらに限定されるわけではないが、ヒンメン（
ｔｌｊｎｎｅｎ）ら、ブｏ’ｉ−−’　　ｙｆｘユ１、
１９２９（１９７８）　；イト−（Ｉ　ｔｏ）　　ら、
２」：ＺＬ配ニオブ・バ　−官オロジー（ム堕匹肛圏ｕ
、」刹。

１６３　（１９８３）　：フレラグ（ｃｒｅｇｇ）ら、
％ｌ、−土五立二・　ン゛・セルーー・バイオロジー（
Ｍｏｌ　Ｃａ１ｌ■ユ）、ム３３７６（１９８５）　　
；またはスリークリシュナ（Ｓｒｅｅ−ｋｒｉｓｈｎａ
）ら、乏ニア　（Ｇａｐｅ）、５９．１１５（１９８７
）が教授する技術を含む適切な形質転換技術によって成
し遂げられるであろう０本発明の実施にあたって好適な
のは、フレラグまたはスリークリシュナの形質転換技術
である０本発明の実施にあたっでは過剰の線状ベクター
を用い、かつ多数の挿入をサザン　ハイブリダイゼーシ
ョンによって選択することが望ましい。

形質転換用の酵母宿主は適切をメチロトローフピキア宿
主であればどのような宿主でも良いであろう、現在のと
ころ、好適な−ク土１〜宿主は、米国デパートメント・
オブ・アグリカルチャー・ノーザン・レジオナル・リサ
ーチ・ラボラトリ−（ｔｌ、Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ＲｅｇｌｏｎａＩＲｅｓｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ、ｙ）に１９８４年８月３１日
に寄託された、Ｇ５１１５（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８５１
）のような栄養素要求性の旦土ヱ株である。

しかしながら、もし５ｔｌＣ２またはＧ４１Ｂのような
適当な抗生物質耐性マーカーを用いれば、野性型味を用
いても同じ様にうま（いくことが確認されている。

形質転換されたピキア細胞は、これらに限定されるわけ
ではないが、形質転換後（栄養素要求性細胞にとって）
必要な生化学的生産物が存在しない条件下であらかじめ
栄養素要求生細胞を培養すること、新規の表現型〔メタ
ノールスロー（ｍｅｔｈ−ａｎｏｌ　ｓｌｏｗ））を検
出することによる選択、または形質転換体に含まれる耐
性遺伝子が存在しない場合にはピキアに対して毒性を持
つ抗生物質の存在下で培養すること；を含む適切な技術
を用いることによって選択されうる。

単離した形質転換呈上ヱ細胞は、振とうフラスコ発酵ま
たは米国特許第４，４１４，３２９号が教授するような
高密度発酵技術のような適切な発酵技術によって培養さ
れる。

発現は使用した調節領域に適切な方法によって成し遂げ
られであろう、好適には、もしメタノール応答性の調節
領域が用いられていれば、発現の誘導は実施例Ｖに概説
した技ｊネｉによって成し遂げられるであろう。

５ＧＩＩ遺伝子の発現の後、２２ｋＤおよび２５ｋＤの
蛋白質の両方の存在が、ウェスタンプロット法（Ｗｅｓ
−ｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）によって検出された。　５ＧＩ
Ｉ蛋白質の総生産量は全細胞蛋白質の約１〜３％である
と概算された。　２２ｋｆｌの形で存在する総５Ｇｔｌ
の割合は、修正ウェスタンプロット法によって定量した
ところ存在する全ｓＧＩ＋の約５〜２０％であると概算
された。

次の実施例は限度を目的とするものではなく、本発明の
さらなる例証を提供するものである。

（実施例） 実施例に関する一般情報： 、抹 ザ・ユナイティッド・ステイク・デパートメント・オブ
・アグリカルチャー・ノーザン・レジオナル・リサーチ
・ラボラトリーズ（ｔｈｅ　ＬｔｎｉｔｅｄＳｔａｔｅ
ｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｊｃｕｌｔｕ
ｒｅ　ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に１９８４年８月
３１日に寄託さた呈上ヱ　１入（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａ−
ｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５負ｎｕがこれら実施例中で用
いられた宿主の酵母株である。

大腸菌（Ｌ劇１ｉ）ＤＧ７５圃１．ユ剋−６１皿。

ｔｌ＋ｒ−１，」吐風４．　　圏１■ｌａｍｂｄａ　［
−１１ｏｒ　Ｊ旧０７勤皿韮１江植％、旦■、圃１７．
鉦匹４４９皿。

ｌａｍｂｄａ（−）　＋　Δ（ｌａｃ−ＰｒｏＡＢ）＋
（Ｆ’　、　ｔｒａＤ３６．　ＰｒｏＡＢＩａｃｌ”２
６Ｍ１５１１　　は、プラスミドＤＮＡの伝播と同様に
プラスミド構築のために用いられた。

１・・・　　六′　　・　”ｎｌ 以下の実施例中に用いた緩衝液および溶液は以下に示す
成分を持つ。

（実施例１．　ｐｕｌＬ２０１の作成）ｐＡＯ８０４プ
ラスミドは大腸菌宿主内に挿入されており、ザ・ノーザ
ン・レジオナル・リサーチ・センター・オプ・ザ・ユナ
イテインド・ステイク・デパートメント・オプ・アグリ
カルチャー（ｔｈｅＮｏｒＬｈｅｒｎ　　ｌｌｅｇｉｏ
ｎａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｃｅｎｔｅｒ　　ｏｒ
　　Ｌｈｅ　　Ｕｎ−ｉｔｅｄ　５ｔａＬｅｓ　Ｄｅｐ
ａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、ベ
オリア（Ｐｅｏｒｉａ）、イリノイ（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ
）　（受入番号Ｂ−１８０２１）より入手可能であり、
この株はザ・ノーザン・レジオナル・リサーチセンター
に１９８５年１１月１日に寄託した。この株の生産物お
よび特徴もまた欧州特許出Ｊｉｆｌ第２６３３１１号（
フィリップス　ペトロレウム　カンパニー（Ｐｈ口１ｉ
ｐｓ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　Ｃｏｍ−ｐａｎｙ）　）に
記載されている。プラスミドｐＨＩＬ２０１はｐＡＯ８
０４を出発物質として次のようにして構築した：　ｐＡ
Ｏ８０４（約４尾）は２分割して、２５μｌの高塩濃度
緩衝液（１０１塩化マグネシウム、５０ｍ１ｌ　トリス
塩酸　ｐＨ７，５，１ｍＭジチオスレイトール、１００
ｍＭ塩化ナトリウムおよびｌｏｎＩＪｇ／−生血清アル
ブミン）中、２０単位のＥｃｏＲＩ制限酵素で完全に消
化した。消化は１．５時間、３７°Ｃで行なった０次い
でこの混合物を７０’Ｃで６分間、水浴中で加熱し、さ
らにその後氷水浴に移した。溶液中に存在するＤＮＡは
３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび８０μｌの無水エタ
ノールを加えることによって沈澱させた。　ＤＮＡの沈
降は一２０°Ｃで１３５分間インキエベーションするこ
とによって促進された。　ＤＮＡ沈澱物は３０分間、４
°Ｃでミクロフユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）内で遠心
分離することによって収集した。　ＤＮＡのペレットは
真空下で乾燥した。各々のＤＮＡペレットを７８μｌの
アルカリホスファターゼ緩衝液（５０ＩＩＩＭトリスー
塩酸、ρ■９．０および１１塩化マグネシウム）に溶解
し、０．５単位の牛の腸のアルカリホスファターゼを加
えて３０分間３７゛Ｃでインキュベーションした。さら
に０．５単位のアルカリホスファターゼを加えて３０分
間３７゛Ｃでのインキュベーションをくす返した。

こうした後反応混合物をフェノール−クロロホルム混合
物で３回、クロロホルムで２＠、さらに５００μ！のエ
ーテルで４回抽出した。残存エーテルは真空蒸発させた
。アリコートを収集し、そして（ｉ１１八を上述のよう
に沈澱させた。［１ＩＩＡペレントを２０μｌの水に溶
解し、使用するまで一２０°Ｃに保存した。このＤＮＡ
を“ベクター”と呼ぶ。

プラスミドｐａｃｔｓ　　（約１０題）は！ＬＩＬＬｌ
（２０単位）およびＨ４ｎｄｌｌＩ　Ｃ１０単位）を加
え、２０μ！の高塩濃度緩衝液（上記）中、３７°Ｃで
１時間消化した。　Ｂａ１ｌ消化は連結反応中にρＵＣ
ｌ３が再生することによって住するバックグラウンドを
減少させるのに役立つ、塩化ナトリウムおよびトリスを
加えて緩衝液濃度を上述の高温状態とし、さらにＥｃｏ
ＲＩ（２０単位）を加えて３７°Ｃで６０分間インキュ
ベーションすることによって汎用クローニングサイトを
遊離させた。

消化後ＤＮＡは上述のようにして沈澱させた。ＤＮＡ沈
澱物は２０ｐ！の水に溶解し、さらに後に使用するまで
一２０°Ｃで保存した。このＤＮＡを“バツセンジ＋　
−（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ）　”と呼ぶ。

ベクターおよびパラセンジャーＤＮＡは２０ｐ！のＤＮ
Ａ連結反応用緩衝液（５０ｐ！Ｍトリス塩酸ｐＨ７，４
，１０ａ＋Ｍ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイ
トール、ｌ＋＊Ｍ　ＡＴＰおよび１００ｇ／ｄの牛血清
アルブミン）中、ＩＰＤＮＡ濃度が１０ｐｌｇ／ｌｄに
なるようにｌ　：　２．５（ｗ／ｓ）の比率で混合し、
さらに２単位のＴ４ＤＮ＾リガーゼを加えて一晩４°Ｃ
でインキュベーシヨンした。結合させた試料の半分を用
いて大腸菌３１０７株をダゲルト（Ｄａｇｃｒｔ）およ
びエールリッチ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）の方法〔乏二ヱ剋亜
旦、　６．２３（１９７９）　）で形質転換した。数種
のアンピシリン耐性クローンが得られ、さらにそれらを
アン１°シリン、エックスギャル（Ｘ−ｇａｌ）および
ＩＰＴＧを含む最少培地上で試験した。

白色および青のコロニーの混合物が得られた。青のコロ
ニーはｐＵｃ１８のバックグラウンドである。

このように、宿主として北１０７を使用すると、バンク
グラウンドのコロニーに含まれるｐＵｃ１８を除去する
ことができる。数種類の白色コロニーを小規模で溶菌し
さらにに吐１−Ｂａｍｔｌｆ制限分析を行ない、その結
果ｐＨＩＬ２０１（第１図Ｃを参照されたい）を含むク
ローンが同定された。大規模のプラスミド調製はそのよ
うにして得られたクローンの１つから行なわれ、次の段
階（実施例■を参照されたい）で十分量のｐＨＩＬ２０
１を得た。

（実施例■、ｐｓＧ旧Ｂ旧跡２の５ＧＩＩ遺伝子の回収
）約０．９ｋｂに相当する５ＧＩＩ遺伝子（このフラグ
メントのヌクレオチド組成を下に示す）は、ｐｓＧＩＩ
ＩＢ２から肛門■消化によって遊離させた。約１０ｇの
プラスミドｐｓＧＨＩＢ２　　（セキネ（Ｓｅｋｉｎｅ
）ら、プロシー紅討」ｄ」話、）旺、　４３０６−４３
１０（１９８５）に記載〕を３７°Ｃで４時間、１０単
位のｌｌ１ｎｄ［［を加えることによって、４０μｌの
生塩濃度緩衝液（１０ｍＭ　トリス塩酸ｐＨ７，５，１
０ｇＭ塩化マグネシウム、ｌｄジチオスレイトール、５
０＋ｍＭ塩化ナトリウムおよび４馬牛血清アルブミン）
中で消化した。消化後、８ｔｔｌ（約２ＲのＤＮＡ）の
反応混合物を０．９ｚアガロースで電気泳動した。この
ような条件下では５０％以上のプラスミドが肛門Ｉ［１
によって切断さていることがわかった。

ゲル電気泳動のパターンはｓＧＨ遺伝子に相当するおよ
そ０．９ｋｂのＤＮＡフラグメントが存在することを明
確に示していた。

ｐｓＧｔｌｌＢ２をＨｉｎｄＩ［Ｉで切断した結果得ら
れた付着末端のＤＮＡフラグメントは太服ＩのＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント
を用い次のようにしてプラントエンドにした：３２ｐｌ
のｌ１ｉｎｄｌｌｌ切断ｐｓＧＨＩＢ２（およそ８）ｔ
ｇＤＮ＾を含む）に２．５ｕｌのｄＮＴＰ混合物（それ
ぞれ２ｇ＋ＭずつのｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ。

ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）、５尾のｌＯ倍濃度
のニックトランスレーション用緩衝液（０，５Ｍ　トリ
ス塩酸ｐＨ１，２，０，１）ｌ硫酸マグネシウム、１ｓ
Ｍジチオスレイトールおよび５００．、、／ｄ牛血清ア
ルブミン）、１０ｐｌの二回蒸留水および０．５ｔｔｌ
　（１０単位）のＤＩＩＡポリメラーゼＩのクレノーフ
ラグメントを加えて混合した０反応混合物を２２“Ｃで
３０分間インキュベーションし、さらに７０℃に５分間
加熱することによって反応を終了させた。こうした後、
全試料を０．９％アガロースゲルで電気泳動し、ｓＧＨ
遺伝子（およそ０．９ｋｂ）に相当するＤＮＡフラグメ
ントを含むゲルの部分を残りのゲルから削り出し、さら
にゲル断片に存在するＤＮＡを透析バッグ内に入れ４０
０＃ｌの５ｍＭＥＩｌｌＴ＾（ｐＨ８，０）中へ電気溶
出した。溶出したＤＮＡは上記の実施例Ｉのように、フ
ェノール−クロロホルムで抽出し、沈澱させ、洗浄し、
乾燥させ、さらに５０ｐｌの二回蒸留水に溶解した。　
５ＧＨ−ＤＮＡフラグメントの収率は約１肩であった。

こうして得られたＤＮＡフラグメントをρ［Ｌ５１構築
（実施例■を参照されたい）用ｓＧＨフラグメント源と
して使用した。

ヌＵ口１死 開始コドン＾ＴＧおよび翻訳終止コドンＴＡＧは第１表
中に下線で示した。小文字で示したヌクレオチドはプラ
ントエンドの５ＧＩＩ遺伝子フラグメントを得るために
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメンとを用いて
補充した部分を表わしている。

（実施例ＤＩ、　ｐＨＩＬ５１プラスミドの作製）実施
例■記載の方法で得たｐｓＧｔｌｌＢ２からのプラント
エンドのｓＧＨ遺伝子フラグメントを次のようにしてｐ
ＨＩＬ２０１プラスミド（実施例■に記ｉ３りの５ｐａ
（（プラントエンド）サイトに挿入したニブラスミドｐ
ＨＩＬ２０１　（２河）は２０１の中塩濃度暖街液（実
施例■に記載）に溶解し、５単位のＳｍａ　ｌを加え３
７°Ｃで２時間インキエベーシランすること←よって切
断した。こうした後、約２００ｎｇの消化ＤＮＡを０．
９χアガａ−スゲルで電気泳動して大部分のＤＮＡが匣
によって切断されていることを確認した。菫で消化した
プラスミドを実施例Ｉに記載したように牛の腸内アルカ
リホスファターゼで処理した。　５ｅａｌで切断しかつ
アルカリホスファターゼ処理したｐＨＩＬ２０１をｔｏ
ｏ　ｐｉの水に溶解した。

連結反応を行なわせるために、Ｓｅａ　＋で切断しかつ
アルカリホスファターゼで処理した１１００ｎのρ旧り
を２００１１１のプラントエンドにした５Ｇｔｌ遺伝子
フラグメント（実施例■）と共に２０ｐｌ＄Ｉ−の連結
反応用塩緩衝液（実施例Ｉに記Ｒ）中で混合し、Ｔ４−
ＤＮＡ　リガーゼを加えて一晩４°Ｃで結合させた。こ
うした後、６５°Ｃに５分間インキエベーシッンするこ
とによって連結反応を終了させた。結合した試料は前述
のように５単位の元を加え３０分ｉｊ　３７°Ｃで消化
した。連結反応後のｈａ消化は、自己結合したｐＨＩＬ
２０１による形質転換の妨害を減少させる。

皿で消化した連結反応混合物を用いて大腸菌ＤＧ７５’
を形質転換した。数種類のアンピシリン耐性クローンが
得られ、さらにそれらをアルカリで溶菌することによっ
て分析して所望のｐｌＩ１１５１プラスミドを含むクロ
ーンを同定した。大規模でのプラスミドの調製はそのよ
うなりローンの１つを処理し、呈上ヱ・バム上ユ久Ｇ５
１１５を形質転換するために用いた。

ｌ実施例■、ピキア　バストリスの形質転換）Ａ、ベク
ターの調製 太１［１ＤＧ７５’から得られた１００席のプラスミド
ｐＨＩＬ５１は勤ＬＬ［Ｉで部分消化した。　６．ｌｋ
ｂの狙■フラグメントが得られた：第２図Ｃを参照され
たい。

５ＧＩＩはその構造遺伝子内部に用■サイトを含むため
、完全消化を行なうとその結果１１ｉＩＪ能不能かつ不
完全な組込みベクターが回収されるために完全消化を行
なうことはできない。

ｐＨＩＬ５１の部分消化によって得られたフラグメント
をアガロースゲル電気永動にかけた。より小さいＩＩＩ
Ｉフラグメントの混入した線状部位選択的組込み５Ｇｌ
（ベクターＩＩ！ｇがこの操作によって得られた。この
ＤＮＡフラグメント混合物を用いてノーザン・レジオナ
ル・リサーチ・センター・オブ・ザ・ユナイティッド・
ステイク・デパートメント・オプ・アグリカルチャーに
寄託された呈上ヱ・バム上ユ入Ｇ５１１５株血４−）（
寄託番号１１ＲＲＬ　Ｙ−１５８５１）を形質転換した
。ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクタ
ーでの形質転換がこの株のヒスチジン生合成経路の欠損
を補ない、それによってＧ５１１５形質転換細胞は旧Ｓ
゛に変わるであろう、それ故、形質転換体のスクリーニ
ングは形質転換後の細胞をヒスジン欠乏増殖環境下で培
養し、さらにこの条件下で増殖可能な細胞を回収するこ
とによって節単に成し遂げられるであろう。

Ｂ、細胞増殖 呈上ヱ・べ入玉ニス（ｈΩｉａ　ｐａｓ旦ム酎Ｇ耐１１
５（ＮＩ？ＲＬ　Ｙ−１５８５１）を約１ＯＩ７１のＹ
ＰＤ培地に接種し、振とうしながら３０°Ｃで１２〜２
０時間培養した。　１００ｍ１のＹＰＤ培地に種培養を
接種して００．。。が約０．００１になるようにした。

培地は振とうフラスｊ中３０°Ｃで約１２〜２０時間培
養した。培養液は０．　ｏ、。。が約０．２〜０．３（
約１６〜２０時間後）になった時ｔｓｏｏ　ｇで５分間
、ソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ５Ｃで遠心分離を行
なうことによって集菌した。

Ｃ，スフェロプラストの調製 細胞をｌローの無菌水で１回洗浄し、その後１５００ｇ
で５分間遠心分離した。（別な方法が記載されていない
場合、遠心分離は洗浄する度ごとにヱバ二止　■競皿Ｂ
（鉢■虹Ｉ　ＲＴ並並肚を用いて１５００　ｇで５分間
行なった。）次いで細胞を１０ｍの調製したばかりのＳ
ＥＤで一回、１０ｄの無菌の１Ｍソルビトールで一回洗
浄し、最後に１０ｄのＳＣＥ　ｌｆｉ街液に再懸濁した
。　７．５　ｐｌの３　ｍｇ／ｄザイモリアーゼ（Ｚｙ
−ｍｏｌｙａｓｅ）　（１００，０００単位／ｇ、マイ
ルス　ラボラトリ−（？ｌ１ｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｒｅｓ）より得た〕を細胞溶液に加えた０次いで細胞
を３０゛Ｃで１０分間インキュベーションした−　（Ｏ
Ｄｈｏ。の６０％減少を集菌時間および濃度マーカーと
して利用した。）スフェロプラストは１０Ｉ１１の無菌
ｌ１１−ソルビトール中、７００ｇで５〜ｌＯ分間遠心
分離することによって一回洗浄した。（遠心分離の時間
および速度は、スフェロプラストをペレット状にするの
に充分な遠心力をもち、スフェロプラストを遠心力で破
壊する程大きくない範囲で変えることができる。）１０
−の無菌ＣａＳを最終細胞洗浄として用い、さらに細胞
を再度７００ｇで５〜１０分間遠心分層して０．６ｄの
ＣａＳに再懸濁した。

Ｄ、形質転換 Ｇ５１１５細胞はスリークリシュマ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓ
ｈｎａ）ら、グニノ（堕吐）、錦、１１５−１２５（１
９８７）のスフェロプラスト形質転換技術を用い、■河
の線状５ＧＩＩベクターで形質転換した。ＤＮＡ試料を
１２Ｘ７５ｍの無菌ポリプロピレンチューブに（２０ａ
７容量以下）加えた。　　（ＤＮＡはＴＥＩｙＩ衝液の
ような適切な緩衝液中に存在すべきである＊　）　　；
１００　ｐｌのスフェロプラストをそれぞれのＤＮＡ試
料に加え、室温で約２０分間インキエベーシゴンした。

ｌ−のＰＥＧ　ｉ液をそれぞれの試料に加え、室温で約
１５分間インキュベージぢンし、さらに７００ｇで５〜
１０分間遠心分離した。　ＳＯ５（１５０ｐりをペレッ
トに加え、３０分間室温でインキュベージタンした。最
後に８５０ｐ／のｌ？Ｉソルビトールを加えた。

Ｅ、スフェロプラストの再生 ２０ａｄの再生用寒天ＳＤＲを底部寒天層にするために
、形質転換試料が準備される少なくとも３０分前にプレ
ートに注ぎ込んだ、さらに、８Ｉ！ＩＱ分割量の再生用
寒天を、形質転換試料がＳＯＳ中に存在する期間中に１
５１ｉの円錐形コーニングチューブに分配し４５℃浴中
に置いた。　５０．２５０または８００　ｔｔ１分Ｓり
量の形質転換した試料を４５°Ｃに保たれた８−分割量
の融解状態の再生用寒天に加え、さらに２０ｍの底部寒
天固体層を備えたプレート上に注いだ、プレートを３０
’Ｃで３〜５日間インキュベーションした。

Ｆ、形質転換体の選択 形質転換体はＳＤＲヒスチジン欠乏培地で培養すること
によって選択した。さらに、ヒスチジン存在下で増殖し
た培養物を°“メタノール　スロー（■ｅＬｈａｎｏｌ
　５ｌｏ−ど表現型（部位選択的組込みを示す）で選択
した０次いで、画表現型の存在を示す形ｎ転１桑６５１
１５細胞を培養し、さらに５ＧＩＩの生産についてアッ
セイを行なった。呈上ヱ　バ久上ユＸ　（Ｐ　ｉ　ｃ　
ｈ　ｉ　ａ　ｐ　鮭圏丘ｕＧ　Ｓ　１１５　／　ｐ　Ｉ
Ｉ　Ｉ　Ｌ　５１−６２はこのような方法で選択し、さ
らに１９８８年３月２９日、ブダペスト条約（Ｂｕｄａ
ｐｅｓｔ　Ｔｒｅａｔｙ）に従ってザ・ノーザン・レジ
オナル・リサーチ・センター（ｔｈｅ　Ｎｏ−ｒｔｈｅ
ｒｎ　Ｒ＋４ｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｃｅｎｔｅ
ｒ）　、ベオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、イリノイ（Ｉｌｌ
ｉｎｏｉｓ）、に寄託（寄託番号ＮＲＩ？Ｌ　Ｐ−１８
３５３）　した。

（実施例■、ｓＧＨの発現） Ａ、細胞培養 呈上ヱ・バ込上ユ入（肚値ｉａ　ｐａｓ圏社■Ｇ５１１
５／ｐＨ１１５１−６２を２１の２％グリセロール含有
１？Ｉ−３培地、３０°Ｃ１に接種した。このバッチの
グリセロールが完全に消費された後は、１０％グリセロ
ール含有のＦＭ−２１培地を加えて連続増殖させた。連
続培養は希釈率（ダイリーシジンレート）を０．０６５
（保持時間−１５，４時間）に維持し、細胞密度がおよ
そ５０ｇ／／！（乾燥細胞型！’）になるまで行なった
。

反応器容量の４倍量の供給培地を発酵槽に供給した後、
発酵の連続段階を終了させた。サケの成長ホルモンの生
産は、メタノール濃度がＯ１１〜０．８％に維持される
ように培養液容量の０，２５〜０．５％のメタノールを
繰返し注入することによって誘導、維持した。試料はサ
ケの成長ホルモンを分析するために、メタノールを培養
液に加え始めてから０１２４、５０および７３時間後に
収集した。メタノール添加開始より７３時間後に、細胞
を遠心分離により集菌した。およそ３００ｇの湿潤状態
の細胞ペーストが１．５ｆ容量の残存培養液より得られ
た。これは１９９ｇ／ｌの湿潤細胞ペースト、またはお
よそ５０ｇ／ｌの乾燥細胞重量に相当し、このことは細
胞の質量が発酵のメタノール誘導段階の間にほとんど減
少しないことを示している。

Ｂ、ｓＧＨの検出 ０、Ｄｂｏｏで５〜１０１１１の細胞１０！ｄを発酵槽
より得た。細胞はソーパルＲＴ６０００Ｂ冷却遠心機を
用いて５０００ｒｐ−で遠心分離した。ベレットをｌｌ
ｌ１ｌのブレーキング　バッファーで洗浄し、上述のよ
うに遠心分離し、さらに０．５ｄのブレーキング　バッ
ファーに再懸濁した。混合物は、η容量の酸で洗浄した
ガラスピーズ〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）　、４５０　ミク
ロン）を用い、−回に２〜４分ずつ計８分間うす巻き撹
拌した。混合物は、ミクロフユージを用いて再び１２．
００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して細胞砕片をベレット
状にした。得られたペレットは２００μｌの溶液：１０
Ｊ　　）リス塩酸ｐ１１８．１．ｏｍＭ−ＥＤＴＡ、　
２．５χＳＯＳ　、　５％β−メルカプトエタノール、
およびｏ、ｏｉ％ＢＰＢ　（ブロモフェノールブルー）
；に再懸濁した。　ｓＧＨを検出するために、この溶液
を１５％ＳＯＳポリアクリルアミドゲルにかけ、およそ
２５分間走行させた。標準には精製された２５ｋＯ５Ｇ
ＩＩおよびバイオランド（Ｂｉｏｒａｄ）の低分子量標
準蛋白質（ｌｏｗ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ
　５ｔａｎｄａｒｄ）を用いた。蛋白質はゲルをコマジ
ブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）で染色するこ
とによって目に見えるようにした。全細胞蛋白質のおよ
そ１〜３％がｓＧＨであり、かつこのｓＧＨの５〜２０
％が活性型の２２ｋＤ　−ｓＧＨであった。

５Ｇ１１の活性型２２ｋＯおよび２５ｋ［ｌ！の存在の
検出は、三重抗体検出法（ａ　ｔｒｉｐｌｅ　ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）　
：　５ＧＩｌマウスＭｏＡｂ／抗マウス・ヤギ＾ｂ／抗
ヤギ・ウサギＡｂ−アルカリホスファターゼ；を用いた
修正ウェスタン法（ａ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｗｅｓｔｅ
ｒｎ）によっても行なった８両方のハンドがゲル上に検
出された。

ここに提供した実施例は単に本発明の実施例を例証する
ものにすぎず、本発明の範囲または特許請求の範囲を限
定するものとしてとらえるべきではない０本発明の本質
および精神から離れることのない道理にかなった変法お
よび修正は、所望しかつ要求する特許請求の範囲内にあ
るものと期待する。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａは、ｐｕｃ１８の模式図を表わす。 第１図Ｂは、ｐＡＯ８０４の模式図を表わす。 第１図Ｃは、ｐ旧Ｌ２０１の模式図を表わす。 第２図Ａは、ｐｓＧＩＩＩＢ２の模式図を表わす。 第２図Ｂは、ｐ旧Ｌ２０１の模式図を表わす。 第２図Ｃば、ｐＨＩＬ５１の模式図を表わす。 図面の浄書（内容に童男なし） ＳｍｉＩ＋ ＦＩＧ、　　１ρ ＦＩＧ、　　ＩＢ 要　　　　ｊ ′：、　　　　　　　二 Ｆｌに、　　ＩＣ ＦＩＧ、２Ａ 手続補正書 １．′ＩＩ件の表示 平成１年特許願第１２２６８２号 ３、補止をする者 事件との関係　　特ｉ′１゛出願人 名　称　　フィリップスーベトロリウム・カンパニー新
大手町ビル　２０６区

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、２２ｋＤのサケ成長ホルモン（ｓＧＨ）蛋白質の改
   良された生産方法であって、 ａ）￥ピキア￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥）属のメチロトロー
   フ酵母株を、調節領域および３′終止配列に機能しうる
   ように連結したｓＧＨ構造遺伝子を含む￥ピキア￥適合
   の発現カセットを含む少なくとも１個のベクターで形質
   転換すること；およびそうした後に ｂ）その結果得られた形質転換した￥ピキア￥属の酵母
   株を適切な条件下で培養して２２ｋＤのｓＧＨを生産さ
   せること； からなる上記の方法。 ２、前記ベクターがプラスミドまたは線状組込み部位特
   異的ベクターからなる群より選択される、請求項１記載
   の方法。 ３、ベクターが線状組込み部位特異的ベクターである、
   請求項２記載の方法。 ４、前記線状組込み部位特異的ベクターが下記成分（ａ
   ）〜（ｃ）の連続的配列； ａ）第一の挿入可能なＤＮＡフラグメント、ｂ）マーカ
   ー遺伝子ならびに調節領域および３′終止配列に機能し
   うるように連結したｓＧＨ構造遺伝子を含む少なくとも
   １個の￥ピキア￥適合性発現カセット、および ｃ）第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント；を含み、成
   分（ｂ）のマーカー遺伝子とカセットとの順序は入れ替
   えることができる、請求項３記載の方法。 ５、第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントおよび第二の
   挿入可能なＤＮＡフラグメントが￥ピキア￥・￥パスト
   リス￥（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔｏｒｉｓ￥）より
   単離された遺伝子のＤＮＡ配列に起源を有し、かつ￥Ａ
   ＯＸ１￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩＳ４￥を
   含む群より選択される、請求項４記載の方法。 ６、前記発現カセットが、 ａ）￥ピキア￥・￥パストリス￥から単離した￥ＡＯＸ
   １￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩＳ４￥；￥サ
   ッカロミセス￥・￥セレビシアエ￥（￥Ｓａｃｃｈａｒ
   ｏｍｙｃｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）より単離し
   た酸性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、アルコール
   デヒドロゲナーゼ、チトクロムＣ、α−交配因子および
   グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼからな
   る群より選択され、下記成分（ｂ）に機能しうるように
   連結した、調節領域、 ｂ）ｓＧＨをコードし、下記成分（ｃ）に機能しうるよ
   うに連結した、ｓＧＨ構造遺伝子、 ｃ）￥ＡＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥
   遺伝子、および￥ＨＩＳ４￥遺伝子より単離した３′終
   止配列からなる群より選択した￥ピキア￥・￥パストリ
   ス￥由来の３′終止配列、 からなる、請求項４記載の方法。 ７、前記マーカー遺伝子が￥ピキア￥・￥パストリス￥
   から単離された￥ＨＩＳ４￥および￥ＡＲＧ４￥、￥サ
   ッカロミセス￥・￥セレビシアエ￥から単離された￥Ｓ
   ＵＣ２￥ならびに細菌の￥Ｔｎ９０３￥および￥Ｔｎ６
   ０￥のＧ４１８＾ｎ遺伝子からなる群より選択される、
   請求項４記載の方法。 ８、前記ベクターが、 ａ）￥ピキア￥・￥パストリス￥から単離した約１キロ
   ベースの５′￥ＡＯＸ１￥調節領域であり、下記成分（
   ｂ）に機能しうるように連結した、第一の挿入可能なＤ
   ＮＡフラグメント、 ｂ）下記成分（ｂ）に機能しうるように連結した、ｓＧ
   Ｈ構造遺伝子、 ｃ）￥ピキア￥・￥パストリス￥から単離される、下記
   成分（ｄ）に連結した￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、ｄ
   ）￥ピキア￥・￥パストリス￥から単離した￥ＨＩＳ４
   ￥であり、下記成分（ｅ）に連結したマーカー遺伝子、
   ｅ）約０．６５キロベースの３′￥ＡＯＸ１￥終止配列
   である、第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント、 からなる、請求項４記載の方法。 ９、下記成分（ａ）〜（ｃ）の連続的配列；ａ）第一の
   挿入可能なＤＨＡフラグメント、ｂ）マーカー遺伝子な
   らびに調節領域および３′終止配列に機能しうるように
   連結したｓＧＨ構造遺伝子を含む少なくとも１個のピキ
   ア適合性発現カ￥セット￥、および ｃ）第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント、からなり、
   成分（ｂ）のマーカー遺伝子とカセットとの順序を入れ
   替えることのできる、線状組込み部位特異的ベクター。 １０、前記の第一の挿入可能なＤＮＡフラグメントおよ
   び前記の第二の挿入可能なＤＮＡフラグメントが￥ピキ
   ア￥・￥パストリス￥から単離した遺伝子のＤＨＡ配列
   に起源を有し、かつ￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ
   ￥および￥ＨＩＳ￥からなる群より選択される、請求項
   ９記載のベクター。 １１、前記発現カセットが、 ａ）￥ピキア￥・￥パストリス￥から単離した￥ＡＯＸ
   １￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥および￥ＨＩＳ￥；￥サッ
   カロミセス￥・￥セレビシアエ￥から単離した酸性ホス
   ファターゼ、ガラクトシダーゼ、アルコールデヒドロゲ
   ナーゼ、チトクロムＣ、α−交配因子およびグリセルア
   ルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群より選
   択され、下記成分（ｂ）に機能しうるように連結した、
   調節領域、 ｂ）ｓＧＨをコードし下記成分（ｃ）に機能しうるよう
   に連結したｓＧＨ構造遺伝子、 ｃ）￥ピキア￥・￥パストリス￥から単離した￥ＡＯＸ
   １￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子および
   ￥ＨＩＳ４￥遺伝子から単離した３′終止配列からなる
   群より選択した３′終止配列； からなる、請求項９記載のベクター。 １２、前記マーカー遺伝子が￥ピキア￥・￥パストリス
   ￥より単離した￥ＨＩＳ４￥および￥ＡＲＧ４￥；￥サ
   ッカロミセス￥・￥セレビシアエ￥より単離した￥ＳＵ
   Ｃ２￥；細菌性￥Ｔｎ９０３￥および￥Ｔｎ６０１￥の
   Ｇ４１８＾ｎからなる群より選択される、請求項９記載
   のベクター。 １３、前記ベクターが ａ）￥ピキア￥・￥パストリス￥スより単離された約１
   キロベースの長さをもつ５′￥ＡＯＸ１￥遺伝子の機能
   しうる調節領域であり、下記成分（ｂ）に機能しうるよ
   うに連結した、第一の挿入可能なＤＮＡフラグメント、
   ｂ）下記成分（ｃ）に機能しうるように連結したｓＧＨ
   構造遺伝子、 ｃ）￥ピキア￥・￥パストリス￥より単離され、下記成
   分（ｄ）に連結した￥ＡＯＸ１￥の３′終止配列、ｄ）
   ￥ピキア￥・￥パストリス￥より単離した￥ＨＩＳ４￥
   であり下記成分（ｅ）に連結したマーカー遺伝子、ｅ）
   約０．６５キロベースの３′￥ＡＯＸ１￥終止配列であ
   る、第二の挿入可能なＤＮＡフラグメント、 からなる、請求項９記載のベクター。 １４、ベクターｐＨＩＬ５１。 １５、３′終止配列に機能しうるように連結したｓＧＨ
   遺伝子に機能しうるように連結した調節領域を含む￥ピ
   キア￥適合性発現カセットを包含するベクターを形質転
   換された￥ピキア属￥のメチロトローフ酵母。 １６、酵母が￥ピキア￥・￥パストリス￥である、請求
   項１５記載の￥ピキア属￥のメチロトローフ酵母。 １７、酵母が￥ピキア￥・￥パストリス￥ＧＳ１１５で
   ある、請求項１６記載の￥ピキア属￥のメチロトローフ
   酵母。 １８、ベクターｐＨＩＬ５１から切断した線状の￥Ｂｇ
   ｌ￥II／￥Ｂｇｌ￥II部位特異的組込みベクターで形質
   転換された、請求項１６記載の￥ピキア￥・￥パストリ
   ス￥ＧＳ１１５。 １９、請求項９記載のベクターで形質転換された￥ピキ
   ア￥・￥パストリス￥。 ２０、￥ピキア￥・￥パストリス￥ＧＳ１１５／ｐＨＩ
   Ｌ５１−６２ＮＲＲＬ（Ｙ−１８３５３）。