KR930002738B1 - 피치아속 효모의 자리 선택적 게놈 개조의 방법 및 폴리펩티드 제조방법 - Google Patents

피치아속 효모의 자리 선택적 게놈 개조의 방법 및 폴리펩티드 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

피치아속 효모의 자리 선택적 게놈 개조의 방법 및 폴리펩티드 제조방법
제 1 도는 플라스미드 pYMI1의 제한 지도이다.
제 2 도는 플라스미드 pYMI1의 부분을 피치아 염색체의 HIS4 위치에 삽입하는 것을 나타낸다.
제 3 도는 플라스미드 pYJ8의 제한 지도이다.
제 4 도는 플라스미드 pYMI3a의 제한 지도이다.
제 5 도는 플라스미드 pYMI3a의 부분을 피치아 염색체의 HIS4 위치에 삽입하는 것을 나타낸다.
제 6 도는 플라스미드 pBPG1-1의 제한 지도이다.
제 7 도는 플라스미드 pYMI7의 제한 지도이다.
제 8 도는 플라스미드 pYMI7의 부분을 피치아 염색체의 알코올 산화효소 위치에 삽입하는 것을 나타낸다.
제 9 도는 플라스미드 pSAOH5 및 pTHBS3으로부터 플라스미드 pYM39를 구성하는 것을 나타낸다.
제10도는 플라스미드 pYM39 및 pPG3.2로부터 플라스미드 pYM16을 구성하는 것을 나타낸다.
제11도는 플라스미드 pYM16 및 pBSAG51로부터 플라스미드 pBSAGI5I를 구성하는 것을 나타낸다.
제12도는 제11도에 나타낸 것보다 더욱 상세하게 플라스미드 pBSAGI5I를 나타내는 제한 지도이다.
제13도는 피치아 염색체의 알코올 산화효소 위치로 플라스미드 pBSAGI5I 부분을 삽입하는 것을 나타낸다.
제14도는 플라스미드 pYM12a의 제한 지도이다.
제15도는 두번째의 피치아 알코올 산화효소 유전자(AOX2)의 위치에 플라스미드 pYMI12a 부분을 삽입하는 것을 나타낸다.
제16도는 pBR322- 기본 플라스미드 pPG4.0 및 pPG3.0내의 피치아 삽입물의 제한 지도이다.
제16a도에 나타난 삽입물은 첫번째 피치아 알코올 산화효소 유전자(AOX1)의 위치로 부터의 것이고 제16b도에 나타난 삽입물은 두번째 피치아 알코올 산화효소 유전자(AOX2)의 위치로 부터의 것이다.
제16c도는 AOX1 유전자 위치의 공지의 알코올 산화효소(AOX) 코딩화 부분을 나타낸다.
제17도는 플라스미드 pYM25의 제한 지도이다.
제18도는 플라스미드 pT76H3의 제한 지도이다.
본 발명은 재조합 DNA 기술분야에 관한 것이다. 한 특징으로, 본 발명은 효모의 통합적 형질전환에 관한 것이다. 다른 특징으로, 본 발명은 효모의 자리-지적 변이에 관한 것이다. 다른 특징으로, 본 발명은 신규 DNA 서열에 관한 것이다. 다른 특징으로 본 발명은 신규 유기체에 관한 것이다.
재조합 DNA 기술이 최근에 발달됨에 따라 미생물에 의한 굉장히 다양한 유용한 폴리펩티드의 조절된 생산이 가능하게 되었다. 많은 진핵 폴리펩티드, 즉 예를들면 인간 성장 호르몬, 백혈구 인터페론, 인간 인슐린 및 인간 프로인슐린은 이미 여러가지 미생물에 의해 생산할 수 있다. 이미 준비중인 기술들의 계속적인 출원은 장래에 여러가지의 다른 유용한 폴리펩티드 생성물의 미생물에 의한 생산이 가능할 것으로 기대된다.
재조합 기술에 빈번히 사용되는 기본 요소는 몇몇 미생물에서 발견되는 염색체외의 이중-가닥 DNA인 플라스미드 이다. 플라스미드가 미생물에서 자연적으로 발생되는 경우, 이들은 흔히 세포당 여러개의 사본들이 발생되는 것으로 발견 된다. 자연적으로 발생되는 플라스미드에 첨가하여, 다양한 인공 플라스미드 또는 잡종 벡터를 제조할 수 있다. 불행하게도 숙주 세포에 플라스미드를 유지하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 대신에, 플라스미드는 유기체가 재생산되고 성장의 여러 세대를 거치는 동안 손실된다. 그러므로 외래 DNA의 적당한 숙주 유기체내로의 안정한 도입법은 매우 흥미롭고 가치있다.
지금까지, 여러가지 폴리펩티드를 생산하기 위한 재조합 DNA 기술을 사용하는 상업적 노력은 숙주 유기체로서 이 쉐리키아 콜리(Escherichia Coli)에 집중되었다. 그러나 몇몇 경우에 E. 콜리(E. coli)는 숙주로 적당하지 않다는 것이 판명되었다. 예를들면, E. 콜리(E. coli)는 제약학적 생산물로 유용한 폴리펩티드로부터 제거되어야 하는 다수의 독성 발열 인자를 포함한다. 정제와 함께 효율은 달성될 수 있고 물론 특정 폴리펩티드에 따라 다르다. 첨가로 E. 콜리의 단백질 분해 활성은 몇몇 유용한 생성물의 수율을 심각하게 제한한다. 더우기, E. 콜리내에 생성된 다수의 이형 유전자 생성물을 불용성 형태로 생산할 수 있음이 발견되었다. 이것 및 다른 고려점들은 대체적 숙주에 관한 관심을 증가시켰다. 특히, 폴리펩티드 생성물 생산을 위한 진핵 유기체의 사용이 나타났다.
진핵계, 예를들면 효모내의 폴리펩티드 생성물의 생산수단의 이용은 재조합 DNA로 코딩된 폴리펩티드 생산을 위한 E. 콜리와 같은 원핵계의 사용에 비해 중대한 이점을 제공한다. 효모는 대규모 E. 콜리 발효의 비교적 최근의 출현에 비해, 수세기동안 대규모 발효에 사용되어 왔다. 효모는 일반적으로 세균보다 더 높은 세포 밀도로 성장할 수 있고 연속적 발효 공정에 쉽게 채택될 수 있다. 사실상 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)같은 효모의 초-고 밀도 세포 즉, 100g/L의 초과량 세포 밀도로의 성장은 웨거의 미합중국 특허 제 4,414,329호(필립스, 페트롤레움 사에 양도함)에 기술되어 있다. 효모 숙주의 부가적 이점은 유기체의 많은 중요한 기능, 예를들면 산화적 인산화는 소기관내에서 행해지고 따라서 자연-형 숙주 세포에 외래 폴리펩티드 유기체 생산에 의한 가능한 나쁜 효과에 노출되지 않는다는 것이다. 진핵 유기체로서, 효모는 발현 폴리펩티드 생성물을 글리코실화 할 수 있는 것으로 판명되고 이는 글리코실화가 폴리펩티드 생성물의 생활성에 중요한 곳에 가치 잇있는 것으로 판명 되었다. 진핵 유기체로서 효모는 고등 유기체와 같은 코돈 선택을 나타내고 따라서 예를들면 포유동물 mRNA로부터 역전사에 의해 얻어진 상보적 DNA(cDNA)로부터 또는 포유동물 유전자로부터의 발현 생성물을 더욱 효과적으로 생산하는 경향이 있다.
숙주/벡터 계로서 잘 특징 지워지지 못한 효모종의 발달은 숙주 세포로 외래 DNA의 안정한 도입을 위한 적당한 수단 및 형질전환 조건에 대한 지식의 부족으로 대단히 힘들다. 첨가로 영양 요구성 변이주는 흔히 이용할 수 없고 영양 요구체 상보성에 의한 형질전환체의 직접적 선택을 차단한다. 재조합 DNA 기술이 그 규약을 완전히 지킨다면, 새로운 숙주/벡터계가 DNA 조작을 용이하게 할 뿐만 아니라 삽입된 DNA 서열의 발현을 최적화하여 조절된 조건하에서 높은 수율로 소요의 폴리펩티드 생성물을 제조할 수 있도록 고안되어야 한다.
그러므로 본 발명의 목적은 효모 게놈의 미리 선택된 위치에서 효모 게놈으로 DNA를 삽입하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 필수적으로 전환 불가능한 효모의 안정한 영양 요구성 변이주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 필수적으로 전환 불가능한 안전한 영양 요구성 변이주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효모를 형질전화시키는 데 유용한 신규한 DNA 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효모에 의한 이형 단백질의 증진된 생산을 위한 알코올 산화효소 결여 숙주의 생산을 제공하는 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 목적은 하기의 설명 및 청구범위로 자명해질 것이다.
본 발명에 따라, 피치아(Pichia)속 효모 게놈의 자리 지적 개조의 신규 방법이 발달되었다. 각 끝에 삽입성 DNA 서열 즉 숙주 게놈과 같은 서열로 각각은 길이에 적어도 약 200 뉴클레오티드를 갖는 것 및 그 사이의 적어도 하나의 첨가적 DNA 단편, 예를들면 선택성 표시 유전자로 구성된 직선 DNA 단편으로 효모를 형질전환시킴으로, 표시 유전자 및 측면에 삽입성 DNA 서열을 높은 빈도로 숙주에 포함시킨다. 이 직선 DNA로 형질전환시킬 결과로, 포함 자리의 DNA 서열이 찢기워지고 /지거나 삭제되고, 선태적 표시 유전자 뿐만 아니라 형질전환용 직선 DNA 단편의 부분으로 포함된 다른 DNA가 숙주 효모의 게놈에 합입된 개조된 효모 균주가 생성된다.
상기한 방법으로 숙주 효모의 게놈으로 삽입된 외래 DNA는 숙주의 여러 세대 성장을 통해 안정하게 유지된다. 이에 의해 본 발명의 실행은 외래 DNA가 자치적으로 복제되는 염색체의 단편의 부분으로 제공되거나 외래 DNA가 고리형 DNA 분자의 부분으로 게놈에 함입될 때 플라스미드 불안정성에 기인되는 외래 DNA 손실의 문제를 없앤다. 그러한 고리형 DNA 분자 함입은 숙주 게놈 서열이 측면에 직접적으로 반복된 외래 DNA 서열이 숙주 게놈으로 삽입되는 것을 초래한다. 그러한 직접적인 반복 서열은 또다른 재조합의 기질이기 때문에, 직접적인 반복 서열 사이에 삽입된 외래 DNA는 불안정하다.
본 발명의 자리-지시 게놈 개조는 특정 유전자 전부 또는 선택된 부분이 없는 변이주 생산을 가능하게 한다. 변이가 필요한 유전자의 실질적 부분을 제거함으로, 변이 전환의 가능성은 필수적으로 제거된다. 그러므로 본 발명에 따라 생산된 결과 변이주는 매우 안정한 변이주이다.
이 기술분야에 능숙한 사람들에게 알려진 실험실내의 재조합 DNA 기술과 함께 본 발명의 자리-지시 게놈 개조는 넓고 다양한 정확한 숙주 게놈 개조, 예를들면 숙주 게놈에 하나 또는 그 이상의 이종성 유전자의 첨가, 자연 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열의 대체, 비-자연 오리진의 유전자로 자연 유전자를 대치시킴 및 이와 유사한 것을 가능하게 한다.
놀라웁게도 피치아내의 이종성 유전자의 메탄올 유도 발현은 피치아의 일차 알코올 산화효소 유전자가 찢기워진 피치아 균주를 유전자 발현을 위한 숙주로 사용될 때 극적으로 증가된다는 것이 발견되었다.
더우기 유기체 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 균주는 숙주 균주가 일차 알코올 산화효소 유전자가 찢기웠을 때도 자연 피치아 파스토리스(Pichia pastrois)에 비해 감소된 속도로 메탄올상에서 성장하는 능력을 유지시키는 두번째 알코올 산화효소 유전자를 갖는 다는 것이 발견되었다.
다음의 약어는 사용된 제한 효소를 나타내기 위하여 본 명세서에 사용한다.
Figure kpo00001
첨부된 도면에서, 결합시 파괴된 DNA 단편 조작에 사용된 제한 자리는 괄호안에 파괴된 자리의 약어를 기록함으로써 표시하였다.
본 발명에 따라, 피치아속의 숙주 균주를 첫번째 삽입성 DNA 단편, 선택성 표시 유전자 및 두번째 삽입성 DNA 단편으로 구성된 일렬로 배열된 직선 DNA 단편으로 형질전환시키는 것으로 구성된 미리 정해진 게놈 자리에서 피치아 속의 효모를 자리-선택적 게놈 개조 방법을 제공한다. 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편은 각각 길이에 적어도 약 200 뉴클레오티드가 있고 게놈 개조가 발생하는 자리에서 천연 피치아 게놈의 분리된 부분과 동종인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 선택성 표시 유전자는 그 생성물이 유전자를 받는 세포에 선택성 표현형을 부여하는 유전자 예를들면 항생제 저항 유전자 또는 세포가 성장에 필요한 영양소를 합성할 수 있도록 하는 생합성 유전자이다. DNA 벡터상에 존재할 때, 선택성 표시 유전자는 벡터 DNA를 받은 세포에만 선택적 성장 조건하에서 성장할 수 있게 한다. 선택성 표시 유전자는 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편 사이에 위치하고 삽입성 DNA 단편은 직선 DNA 단편으로 게놈 개조를 수행하는 숙주 세포의 게놈에 존재하는 것과 서로 같은 방향으로 위치한다는 것은 필수적이다.
더우기, 본 발명에 따라, 첫번째 삽입성 DNA 단편, 선택성 표시 유전자 및 두번째 삽입성 DNA 단편으로 구성된 일렬로 배열된 직선 DNA 단편을 제공한다. 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편은 각각 길이에 적어도 약 200 뉴클레오티드가 있고 피치아속의 종의 게놈 DNA의 부분과 동종인 뉴클레오티드 서열을 갖고, 이들이 피치아 게놈에 존재할 때 직선 단편에 대하여 배향되어 있다. 표시 유전자는 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편 사이에 위치한다.
본 발명에 따라 피치아 속의 종을 형질전환시키는 기본 요소는 최소한 다음의 세 성분을 포함한다.
첫번째 삽입성 DNA 단편,
두번째 삽입성 DNA 단편, 및
선택성 표시 유전자.
첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편은 각각 길이에 적어도 약 200 뉴클레오티드가 있어야 하고, 길이는 일반적으로 약 200-5000 범위의 뉴클레오티드가 보통 사용된다. 바람직하게는 조작 및 취급을 용이하게 하기 위해, 약 500-2000 범위의 뉴클레오티드 단편을 사용한다.
첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편으로 유용한 뉴클레오티드 서열은 게놈 개조가 발생할 자연 피치아 게놈 자리의 분리된 부분과 동종인 뉴클레오티드 서열이다. 그러므로 예를들면 게놈 개조가 알코올 산화효소 유전자 위치에서 일어나면, 사용된 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편은 알코올 산화효소 유전자 위치의 분리된 부분과 동종인 서열이다. 본 발명에 따라 발생할 게놈 개조를 위해서, 두개의 삽입성 DNA 단편은 이들이 피치아 게놈에 존재할 때 같은 상대적 방향으로 직선 단편에서 서로 배향되어야 한다.
본 발명의 실행에 사용된 형질전환 DNA의 3개의 최소 성분은 선택성 표시 유전자가 첫번째 삽입성 단편 및 두번째 삽입성 단편 사이에 위치한 직선 DNA 단편을 형성하기 위해 일렬로 배열된다. 선택성 표시 유전자 예에는 피치아 파스 토리스(Pichia pastrois) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 ARG4 유전자, 피치아 파스토리스 및 S. 세레비시애로 부터의 HIS4 유전자 E. 콜리 수용 요소 Tn601로 부터의 G418 포스포트란스퍼레이스 유전자 및 이와 유사한 것이 있으나 이에 제한되지는 않는다. 이 기술 분야에 능숙한 사람들은 다수의 적당한 측면 서열, 즉 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편이 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)게놈으로부터 분리된 유전자로부터 유도될 수 있다는 것을 안다. 유전자예에는 알코올 산화효소 유전자(AOX1 및 AOX2 ; 피치아는 두개의 알코올 산화효소 유전자를 갖는다), 디히드록시아세톤 신타제 유전자(DAS), 알기노석시네이트 라이에이스 유전자(ARG4), 히스티디놀 디히드로게나제 유전자(HIS4) 및 이와 유사한 것이 있으나 이에 제한되지 않는다.
형질전환 직선 DNA 단편은 여러가지의 다른 DNA 서열, 예를들면 이종성 유전자 같은 것, 즉 P. 파스토리스(P. pastoris)에 필요한 발현인, 숙주 세포내의 삽입이 발생하는 게놈의 위치에서 보통 발견되지 않는 유전자 부분 또는 임의의 유전자를 포함할 수 있다. 일반적으로, 용어 "이종성"은 숙주 피치아 세포의 원래의 것이 아닌 DNA를 말한다. 이종성 유전자는 이종성 유전자 생성물의 생산을 독립적으로 조절하는 조절지역과 임의적으로 결합할 수 있거나 이종성 유전자는 형질전환 과정시 찢기워진 유전자의 자연 조절지역의 영향하에서 형질전환된 세포에 발현될 수 있다.
첨가로, 본 발명의 실행에 사용되는 형질전환 직선 DNA 단편은 세균 플라스미드 DNA, 예를들면 pBR322 또는 pBR325 서열과 같은 것이다. 그러한 세균 서열은 이들 DNA 서열의 E. 콜리내에서의 확대에 의한 생산 및 실험실내의 조작에 유용하다.
형질전환 직선 DNA의 특히 유용한 형태는 첫번째 삽입성 DNA단편, 두번째 삽입성 DNA 단편, 선택성 표시 유전자 및 세균 플라스미드 DNA로 구성된 폐쇄 고리 플라스미드이다. 이 플라스미드는 또한 상기한 바와 같이 부가적 DNA 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 폐쇄 고리 플라스미드는 두부분, "형질전환" 부분 및 "세균"부분으로 구성되어 있다. 형질전환부분은, 일렬로 배열된 첫번째 삽입성 DNA 단편, 선택성 표시 유전자 및 두번째 삽입성 DNA 단편으로 구성되고 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편은 이들 사이에 위치한 선택성 표시 유전자와 함께, 이들이 피치아 게놈에 존재할 때 서로에 관하여 배향된다. 세균 부분이 위치하여 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 삽입성 DNA 단편을 연결하고, 이렇게하여 폐쇄 고리형 벡터를 형성한다.
상기와 같이 제조된 폐쇄 고리 벡터는 E. 콜리내의 플라스미드의 다양 생산에 사용될 수 있고, 이 플라스미드는 분리되고 적당한 제한 효소로 소화되어 세균 부분으로부터 형질전환 부분을 절개할 수 있다. 효모 DNA의 직선 형질전환 부분은 소요의 게놈 개조를 수행하기 위해서 피치아속의 균주를 형질전환시키는데 사용할 수 있다.
물론, 이 기술분야에 능숙한 사람들은 상기한 폐쇄 고리 플라스미드의 "형질전환"부분이 첨가적 DNA 서열을 포함할 수 있다는 것을 안다. 예를들면, E. 콜리내의 확대에 의한 DNA 생산 및 조작을 위해 시험관내에서 사용된 세균 서열은 형질전환 DNA의 일부분일 수 있다. 즉 세균 서열 선택성 표시 유전자 서열과 같은 것은 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 삽입성 DNA 단편 사이에 위치할 수 있다. 그러나 DNA 성분 배위를 사용할때, 세균서열은 본 발명의 게놈 개조 공정에 놓인 숙주 효모의 게놈으로 함입될 수 있다.
피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 형질전환은 필립스 페트로데움사에 인수된 스트로만 일행의 동시계류중인 출원 일련번호 666,579에 이전에 개시되었다. 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 형질전환에 사용된 실험 공정은 하기에 더욱 상세히 기술할 것이다(실시예 1 참조). 피치아속의 효모 균주는 세포벽을 효소로 소화함으로 스페로 플라스트를 얻고 ; 이 스페로플라스트를 형질전환 DNA와 혼합하고 칼슘 이온 및 폴리에틸렌 글리콜 존재하에서 항온처리하고, 선택 성장 배지에서 재생성시킴으로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환 DNA는 형질환환된 세포만이 사용된 선택적 성장 조건하에서 (선택적 성장 조건은 형질전환 DNA의 부분으로 사용된 선택성 표시 유전자의 작용이다)의 생존 및 성장할 수 있기 때문에, 형질전환 DNA를 취한 세포를 선택하는 선택성 표시 유전자를 포함한다.
일차 알코올 산화효소 유전자(AOX1)가 찢기워진 피치아 균주가 이종성 유전자 발현을 위해 숙주로 사용될 때, 몇몇 촉진자(예를들면, AOX1 또는 DAS 촉진자) 조절하에서의 이종성 유전자 생성물의 발현 수준은 전 알코올 산화효소-능력 숙주를 상요할 때 얻어지는 발현 수준에 비해 여러배 증가되었다는 것이 놀라웁게도 관찰되었다. 이 현상의 탐구 및 관찰의 결과로, 강한 기질-반응 촉진자 지역이 존재하는 기질에 대한 영양적 제한 조건하에서 숙주 균주를 성장시키는 것으로 구성되고 이종성 유전자가 이 강한 기질-반응 촉진자의 규제적 조절하에 있는 ; 숙주 유기체에 존재하는 이종성 유전자의 발현 수준을 증가시키는 일반적 방법이 결정되었다.
본 발명의 증가된 유전자 발현에 필요한 "영양적 제한 조건"은 세포에 영양분의 제한양을 주입하거나 변이의 결과로 어떤 성장 조건하에서 영양적으로 제한되는 변이 숙주를 사용함으로 제공할 수 있다. 그러므로, 예를들면 강한 알코올 산화효소 또는 디히드록시아세톤 신타제 촉진자 조절하에서 유지된 이종성 유전자의 발현 수준을 높이는 것이 필요할 때, 메탄올 사용 능력이 부분적으로 결여된 숙주를 사용하거나 알코올 산화효소 전 능력을 갖는 숙주와 함께 메탄올-제한 성장 조건을 사용하는, 촉진자가 성장 배지내의 메탄올 존재에 감응하는 것 둘다는 소요의 영양적 제한 조건을 제공하여, 증가된 유전자 발현을 성취할 수 있다.
기술한 이종성 유전자 생성물의 발현을 증가시키는 방법은 영양 제한에 감응하는 촉진자가 존재하는 유기체에 유용한 일반적 방법이라고 믿어진다. 그러므로 이종성 유전자를 그러한 촉진자 지역의 조절하에 놓고, 강한 촉진자가 그 역활을 수행하게 하는 영양소(들)에 관한 영양적 제한 조건하에서 숙주 유기체를 배양함으로, 증가된 유전자 발현이 발생된다. 영양적 제한 성장 조건을 제공하는 현재의 바람직한 수단은 비-변이 숙주에서 보다 훨씬 높은 수준으로 몇몇 촉진자가 발현되게 하는, 영양소를 대사하는 능력이 부분적으로 결여된 변이숙주 유기체를 사용하는 것이다. 피치아에 있어서, 이것은 실시예 Ⅴ에 더욱 상세히 기술하여 설명하였다.
게놈 개조를 위한 본 발명의 방법에 의해 제 1 알코올 산화효소 유전자가 찢기워진 피치아 파스토리스 균주를 탄소원으로 메탄올을 사용하여 배양할 때, 놀라웁게도 제 1 알코올 산화효소 유전자가 결여된 그러한 균주는 메탄올에서 성장하기에 아직 안정하고 자연형 피치아 세포에 비해 감소된 속도로 성장한다는 것이 발견되었다. 이 관찰은 피치아의 메탄올 이용 균주내에 제 2 알코올 산화효소 유전자의 존재 가능성을 가리킨다.
피치아 염색체 DNA 라이브러리의 선별시험은 제 2 알코올 산화효소 유전자(AOX2)의 부분을 코딩하는 것으로 보이는 3kbp 단편의 분리를 유도했다. 이 단편은 pBR222내로의 삽입물로(BamH Ⅰ 자리에서) 기탁되었다. 이 플라스미드는 pPG3.0으로 언급되고 E. 콜리 숙주 LE392에 의해 옮겨진다. 이 균주는 일리노이스 페오리아 소재 미합중국 농무성 노던 리져널 리써취 센터에 기탁되어 특허로서 본 출원의 공공 발포수단을 확정하고, 기탁번호 NRRL B-18022을 받았다.
pPG3.0의 제한 지도는 제16b도에 나타냈고 이것은 제 1 알코올 산화효소 유전자 pPG4.0의 유전 단편과 비교되었다. 이 후자 단편은 상기했고, 필립스 페트롤레움사에 양도된 스트로만 일행의 동시 계류중인 출원 일련번호 666,391에 상세히 기술되었다. 두 알코올 산화효소 유전자를 비교하면(제16도 참조), 두 단편이 같은 게놈 위치에 겹쳐지는 부분이 없다는 것이 명백하다. 두 단편상에 여러가지 공통 제한 자리들이 있는 것으로, 두 단편 사이에 분명히 약간의 동질성이 있다. 두 유전자, AOX1 및 AOX2에 공통의 제한 자리는 에스터리스크(asterisks)에 의한 제16도에 나타냈다. 그러나, 다른 것에는 존재하지 않는 여러가지 제한 자리의 각 단편상에서의 존재는 뉴클레오티드 수준에서 단편들에 여러 차이점에 있다는 것을 나타낸다.
본 발명은 다음의 비-제한 실시예를 참고로 더욱 상세히 설명한다.
[실시예]
하기 실시예에서 사용된 완충액 및 용액은 다음과 같은 조성을 갖는다 :
1M 트리스 완충액 121.1g 트리스 염기(H2O 800mL 내) ; 진한(35%) 수성 HCl을 첨가하여 pH를 원하는 값으로 조절 ; 최종 pH 조절에 앞서 용액을 실온으로 냉각시킴 ; 최종 부피가 1L로 되게 희석.
TE 완충액 1.0mM EDTA[0.01M(pH 7.4) 트리스 완충액내]
LB(루리아-버타니) 배지 5g 박토-트립톤
5g 박토-효모 추출물 2.5g MaCl
(물 1L 내 ; NaOH를 사용, pH를 7.5로 조절)
2B 배지 0.2% NH4PO4
1.2% Na2HPO4
0.013% MgSO2·7H2O
0.074% CaCl2·2H2O
2㎍/mL 바이오틴
1㎍/mL 타이민
100㎍/mL 트립토판
0.4% 덱스트로스
0.2% 카사미노산
YPD 배지 1% 박토-효모 추출물
2% 박토-펩톤
2% 덱스트로스
SD 배지 6.75g 효모 질소 베이스
(아미노산 없음)(DIFCO)
2% 덱스트로스(물 1L 내)
SED 1M 소르비톨
25mM EDTA
25mM DTT
SCE 완충액 9.1g 소르비톨
1.47g 구연산나트륨
0.168g EDTA
50mL H2O
-- HCl을 사용, PH를 5.8로 조절
CaS 1M 소르비톨
100mM CaCl2
-- 여과 멸균
PEG 용액 20% 폴리에틸렌 글리콜 -3350
10mM CaCl2
10mM 트리스 -HCl(pH 7.4)
-- 여과 멸균
SOS 1M 소르비톨
0.3×YPD 배지
10mM CaCl2
실시예 전반에 걸쳐 사용된 하기 약어들은 다음고 같은 의미를 갖는다 :
EDTA 에틸렌디아민 사초산
SDS 황산도데실나트륨
DTT 디티오트레이톨
[실시예 Ⅰ]
[피치아 파스토리스 형질 전환과정]
A. 세포 배양
1. 피치아 파스토리스 GS115(NRRL Y-15851, KFCC-10359)의 콜로니를 약 10mL의 YPD 배지내에 접종하고 배양물을 30℃에서 12-20시간 동안 진탕한다.
2. 약 12-20시간후, 세포를 약 0.01-0.1의 OD600으로 희석하고, 30℃에서 약 6-8시간 동안 YPD 배지내에서 대수기에 세포를 유지한다.
3. 약 6-8시간 후, 100mL의 YPD 배지를 약 0.1(또는 등 가량)의 OD600에서 종자배양물 0.5mL로 접종한다. 30℃에서 약 12-20시간 동안 진탕하다.
4. OD600 약 0.2-0.3(약 16-20시간 후)일때 1500g에서 5분간 원심분리로써 배양물을 수확한다.
B. 스페로플라스트의 제조
1. 세포를 소독수 10mL 내에서 한번 씻는다(1-5 단게의 모든 원심분리는 1500g에서 5분간이다).
2. 세포를 새로 제조한 SED 10mL 내에서 한번 씻는다.
3. 세포를 소독한 1M 소르비톨 10mL 내에서 두번 씻는다.
4. 세포를 10mL의 SCE 완충액내에 재현탁시킨다.
5. 5-10μL의 4mg/mL 자이톨라아제 60,000(밀레즈 라보라토리스)을 가한다. 세포를 30℃에서 약 30-60분간 배양한다.
스페로플라스트의 제조는 형질 전환과정에서 중요한 단계이므로, 다음과 같이 스페로플라스트 형성을 점검해야 한다 : 자이몰라아제 첨가전이나 직후와 배양기간중에 여러번 100μL 분취량의 세포를 900μL의 5% SDS 및 900μL의 1M 소르비톨에 가한다. 세포가 SDS에 녹고 소르비톨에 녹지 않는 시점(대개 접종 30-60분 사이)에서 배양을 중단한다.
6. 스페로플라스트를 소독한 1M 소르비톨 10mL 내에서 1000g에서 5-10분간 원심분리로써 두번 씻는다.(원심분리에 대한 시간 및 속도는 다양할 수 있다 : 스페로 플라스트를 펠릿화하기에 충분히 그러나 힘에 의해 파열되지 않을 정도로 원심분리한다).
7. 세포를 10mL의 소독 CaS내에서 1번 씻는다.
8. 세포를 총 0.6mL의 CaS내에 재현탁시킨다.
C. 형질 전환
1. DNA 샘플(20μL 용적이하)을 12×75mm 소독 폴리프로필렌튜브에 가한다(DNA는 물이나 TE 완충액내에 존재해야 한다 ; 소량의 DNA로써 최대의 형질 전환빈도를 위하여, 약 1μL의 약 5mg/mL 초음파처리 E.coli DNA를 각 샘플에 가하는 것이 바람직하다).
2. 100μL의 스페로플라스트를 각 DNA 샘플에 가하고 실온에서 약 20분간 배양한다.
3. 1mL의 PEG 용액을 각 샘플에 가하고 실온에서 약 15분간 배양한다.
4. 샘플을 1000g에서 5-10분간 원심분리하고 PEG 용액을 따른다.
5. 샘플을 150μL의 SOS내에 재현탁하고 실온에서 30분간 배양한다.
6. 하기에 기술된 바와 같이 850μL의 소독 1M 소르비톨과 샘플의 평판 분취량을 가한다.
D. 스페로플라스트의 재생
1. 재생한천배지에 대한 처방 :
a. 한천-KCl-9g 박토-한천, 13.4g KCl, 240mL H2O, 오토클레이브.
b. 10×글로코오스(20g 덱스트로오스, 100mL H2O, 오토클레이브.
c. 10×SC -6.75g 아미노산을 갖지 않는 이스트 니트로겐베이스, H2O 100mL, 오토클레이브.(임의의 바람직한 아미노산 또는 핵산을 200㎍/mL 이하의 양으로 오토클레이빙 전 또는 후에 가한다).
d. 30mL의 10×글루코스와 30mL의 10×SC를 240mL의 용융 한천-KCl 용액에 가한다. 0.6mL의 0.2mg/mL 비오틴과 임의의 다른 바람직한 아미노산 또는 핵산을 20㎍/mL 농도까지 가한다. 용융된 재생한천을 55-60℃로 유지한다.
2. 형질 전환 샘플의 평판 배양 : 형질전환시료가 준비되기 적어도 30분 전에 평판당 10mL의 재생 한천의 바닥한천층을 붓는다. 형질 전환 샘플이 SOS내에 있는 기간중에 재생한천의 10mL 분취량을 45-50℃ 욕내튜브에 분배한다. 상기 설명된 형질 전환샘플의 분취량을 재생한천과 함께 튜브에 가하고 평판의 바닥의 한천층위에 붓는다.
3. 스페로플라스트제제의 품질결정 : 10μL의 한 샘플을 제거하고 990μL의 1M 소르비톨을 가하여 100배 희석한다. 100배 희석물의 10μL을 제거하고 두번째 990μL 분취량의 1몰 소르비톨을 가하여 다시 100배 희석한다. YPD 배지를 함유하는 한천평판상에 100μL의 두 희석물을 펴발라 제제내에 남아 있는 스페로플라스트되지 않은 전세포의 농도를 결정한다. 100μL의 각 희석물을 40㎍/mL 히스티딘을 보충한 재생한천 10mL에 가하여 총 재생가능 스페로플라스트를 결정한다. 형질 전환실험에 대해 우수한 값은 1-3×107총 재생가능 스페로플라스트/mL와 약 1×103전세포/mL이다.
4. 평판을 30℃에 3-5일간 배양한다.
[실시예 Ⅱ]
[사카로마이세스 ARG4 유전자 및 pBR322의 자리-특정 삽입 및 GS190(NRRL Y-18014, KFCC-10357)내 피치아 HIS4의 삭제]
제 1 도는 플라스미드 pYMI1을 나타내고 제 2 도는 P. 파스토리스 게놈속으로의 플라스미드의 자리-지적 삽입으로 결과되는 사건의 도해를 나타낸다. 벡터는 사카로마이세스 ARG4 유전자와 pBR322로 부터의 DNA 서열을 피치아 HIS4 좌위속에 삽입하고 동시에 전체 HIS 유전자 좌위를 피치아게놈으로부터 삭제하는 것을 가리킨다. 발현 카세트와 같은 다른 서열은 pYMI1 속으로 용이하게 삽입될 수 있으며 다음에 유사하게 P. 파스토리스 게놈속으로 삽입할 수 있다.
플라스미드 pYMI1은 피치아 HIS4 유전자의 5'말단에 위치한 EcoRⅠ-BamHⅠ 단편과 피치아 HIS4 유전자의 3'말단에 위치한 EcoRⅠ-ClaⅠ 단편으로 구성된다. 두 HIS4 유전자-측면 단편들은 플라스미드 pYJ8(일리노이주 페오리아의 미합중국 농무성의 노오던 리저널 리씨어치 센터로부터의 E.coli 숙주 NRRL B-15889(KFCC-10362)내에서 얻을 수 있음 ; 제 3 도 참조)로 부터 얻을 수 있고 400bp 길이이고 pYMI1내의 EcoRⅠ 말단에 결합되어 있다. 선택적 표시 유전자로서, pYMI1 벡터는 사카로마이세스아르기니노숙시네이트 라이에이스(ARG4 유전자산물)를 코딩하는 pYM25(E.coli 숙주 NRRL B-18015(KFCC-10363))내에서 얻을 수 있음 ; 제17도 참조)로 부터 2.6kbp Hind Ⅲ-SalⅠ 단편을 함유한다. EcoRⅠ로 잘랐을때, pYMI1이 선형이 되고, HIS4 유전자-측면단편을 그 말단에 가진다. P. 파스토리스 arg 4균주, GS 190(NRRL Y-18014)을 EcoRⅠ-절단 pYMI1으로 아르기닌 기본 유기영양균(Arg+)으로 형질 전환시켰다. 재생한천 배지에 40㎍/mL의 히스티딘을 보충하여 HIS4 유전자 삭제의 결과로서 히스티딘을 요구하는 형질 전환주에 대하여 주어지는 선택압력을 방지하였다.
Arg+형질 전환주를 다음에 HIS4 유전자의 삭제 결과로서 His-가 된 것들에 대해 선별 시험하였다. His-형질 전환주에 대해 선별시험하기 위하여, 잠겨진 Arg+콜로니를 갖는 재생한천을 25mL의 소독수를 갖는 소독한 50mL관에 옮겼다. 한천을 다음에 5에 조정한 브링크만 인스트루먼츠 폴리트론 호모게나이저로 1시간 혼합하여 분쇄한다. 효모세포를 3층의 소독가아제로 여과하여 한천으로부터 분리시켰다. 효모세포의 일부분을 다음에 초음파처리하고, 희석하고 40㎍/mL의 히스티딘을 보충한 SD 한천평판배지위에 펴바른다.
초음파처리를 위해, 세포샘플을 A600=0.1까지 희석하고 4에 조정한 소니화이어 셀 디스럽터 350(브랜슨 소닉 파우어 사)으로 10초간 초음파처리하였으며, 이는 세포를 분리하고 세포생존력은 감소시키지 않는데 충분한 처리이다. 2-3일 후, SD+ 히스티딘 한천평판 상에서 성장하는 콜로니를 하나는 히스티딘을 가지고 하나는 갖지 않는 SD 평판 세트에 복제평판배양 하였다. Arg+His-콜로니의 비율은 전체 Arg+형질 전환주의 0.7%가 평균이었다. 3Arg+His-균주로 부터 사우던 블롯교잡으로 조사하였다. 전체 HIS 유전자는 3균주 전부에 없었으며 선형 플라스미드는 제 2 도의 아래에 나타내진 바와같이 삽입되었다.
GS 190-pYMI1 균주가 성장을 위해 히스티딘을 필요로 하고 아르기닌을 더 이상 필요로 하지 않는다는 점이외에, 영양요구 또는 성장률에서 다른 변화는 일체 관찰되지 않았다.
[실시예 Ⅲ]
[P. 파스토리스 NRRL Y-11430(KFCC-10360)으로 부터 HIS4 유전자의 삭제]
제 4 도는 폴라스미드 pYMI3a를 나타내고 제 5 도는 폴라스미드로부터 P. 파스토리스 균주 NRRL Y-11430의 HIS4 좌위속으로 단편을 선상삽입하게 되는 사건들을 보여준다. 벡터는 pBPG1-1(일리노이주 페오리아의 미합중국 농무성 노오던 리저널 리씨어치 센터로부터의 E.coil 숙주 균주 NRRL B-18020(KFCC-10355)내에서 얻을 수 있음 ; 제 6 도 참고)으로 부터 선택적 표시 유전자로서 G418 저항 유전자(G418R)를 함유한다. G418R유전자를 약 2.2kbpBamHⅠ(pBR322 자리)/BglⅡ(PARS1 자리)분액상의 pBPG1-1로 부터 제거하고 pYJ8(NRRL B-15889 ; 제 3 도 참고)의 BglⅡ 자리속으로 삽입하고, 피치아 HIS4 유전자를 함유하는 2.7kbp BalⅡ 단편을 대치한다.
벡터 pYMI3a를 EcoRⅠ로 소화시켜 각각 HIS4 유전자의 5' 및 3'에 위치한 지역으로부터 약 450 및 250bp의 DNA가 측면에 붙은 G418 유전자를 함유하는 2.9kbp 단편을 생산한다. EcoRⅠ절단 플라스미드를 P. 파스토리스 숙주속으로 형질 전환시킨다.
300㎍/mL의 항생물질 G418 존재시의 성장능력에 따라 형질 전환주를 선택하였다. G418 선택을 위해, 재생배비한천을 실시예Ⅰ D 부분에 설명된 것을 다음과 같이 변형시켰다 :
1. 재생한천배지에 대한 처방 :
a. 한천-소르비톨-9g의 박토-한천, 54.6g의 소르비톨, 240mL H2O, 오토클레이브.
b. 10×글로코스-20g의 덱스트로스, 100mL의 H2O, 오토클레이브.
c. 10×YP-10g의 효모추출물, 20g의 펩톤, 100mL의 H2O, 오토클레이브.
d. 30mL의 10×글루코스와 30mL의 10×YP를 240mL의 용융 한천-소르비톨용액에 첨가. 용융재생한천을 55-60℃에 유지.
2. 형질변환주의 평판배양 샘플 : 형질변환샘플이 준비되기 적어도 30분전에, 600㎍/mL의 G418을 보충한 재생한천배지의 10mL/평판바닥한천층을 부었다. 이 기간중에 형질 전환샘플은 SOS내에 있었으며, 10mL 분취량의 재생배지한천(G418을 갖지 않음)을 45-50℃ 욕내 튜브에 분배하였다. 형질 전환샘플이 준비되면, 샘플의 분취량을 재생한천을 담은 튜브에 가하고 G418을 함유하는 10mL 바닥한천층위에 부었다. 평판을 30℃에서 3-5일간 배양하였다.
G418을 가진 재생한천 평판상에 콜로니가 형성된 후, 히스티딘이 없이 성장하는 능력에 대해 세포를 선별시험하였다. 세포를 재생한천으로부터 추출하고, 초음파처리하고, 실시예Ⅱ에 설명된 바와같이 40㎍/mL의 히스티딘을 보충한 Sd 배지한천평판상에 펴발랐다. 30℃에서 2-3일 배양 후에, 히스티딘을 가지고 가지지 않는 SD 배지한천평판상으로 복제평판 배양하였다.
약 0.1%의 G418R콜로니가 His-이었다(약 2,000 선별시험중 2). 사우던 블롯 교잡시험결과 HIS4 유전자가 양 His-균주의 게놈으로부터 삭제되었으며 양 게놈은 G418R유전자를 함유한 것을 알 수 있으며 제 5 도에 나타내진 바와같다. 실험실표시가 KM31인 이들 His-균중 하나는 (일리노이주 페오리아의 미합중국 농무성 노오던 리저널 리써어치 센터로부터 NRRL Y-18018로서 구입가능) 여러개의 HIS4-함유 피치아-기제플라스미드, 예컨대 PSAOH5(E.Coli 숙주 NRRL B-15862(KFCC-10361)내에서 얻을 수 있음)로써 성공적으로 형질변환되었으며, 이는 KM31이 특별히 HIS4 유전자 삭제 생물이라는 증거를 더 한층 제공한다.
이것은 "야생형"P. 파스토리스 NRRL Y-11430이 처음으로 직접 형질변환된 경우이다(즉, 영양요구주 유도체를 처음 분리 및 특성화하지 않은). 이들 HIS4 변이군주의 한 가능한 장점은 그들은 자리-특정 삽입/제거법으로 만들어지기 때문에, 예를들어 GS115(NRRL Y-15851) 및 GS 190(NRRL Y-18014)와 같은 화학적 변이유발에 의해 생산되는 피치아 영양요구주 숙주내에 존재할 수 있는 2차 변이가 없다.
pYMI3a로 부터 EcoRⅠ 단편의 삽입에 의한 피이아게놈으로부터 피치아 HIS4유전자의 제거는 많은 분량의 pBR322의 첨가를 초래하지 않는다(pYMJ1이 삽입되었을때 일어난 것과 같음 ; 실시예Ⅱ참고). 예컨대, pSAOH5(제 9 도참고)와 같은 대부분의 자율적 ARS-기제 피치아발현 벡터는 주로 pBR322로부터의 서열과 피치아 HIS4 제거숙주의 게놈과 동족관계가 거의 없으며, 따라서, 자주 통합하지 않아야 한다.
[실시예 Ⅳ]
[제 1 알콜 산화효소 유전자의 붕괴]
알콜 산화효소 유전자(제 1 알콜 산화효소 유전자를 AOX1이라 칭하고, 제 2 알콜 산화효소 유전자를 AOX2라 칭하기로 한다)가 결여되어 있는 피치아 균주는 최소한 두가지 이유로 인해 관심을 끄는 것들이다. 첫째, 메탄올에 의한 유전자 발현의 조절에 관한 연구에 도움을 준다. 예컨대, 하기 실시예 Ⅶ에서 보다 더 상세히 기재되는 바와같이 AOX1과 AOX2유전자가 결여된 변이균주를 사용하면, 메탄올 또는 어떤 다른 대사산물(포름알데히드, 포르메이트등)이 메탄올 조절 유전자의 실제적 유도 분자인지 아닌지에 관한 증거를 얻을 수 있다. AOX 가 결여된 피치아 균주에 있어서의 두번째 관심은, 그러한 균주가 이종 유전자 생성물을 더 높은 수준으로 발현할 수 있으리라는 가능성에 쏠려진다(실시예 Ⅴ와 Ⅵ에 상세히 기재됨).
AO 유전자를 붕괴하기 위하여 플라스미드 pYMI7을 만들었다(제 7 도). 이 플라스미드는 사카로마이세스 ARG4 유전자가 들어있는 플라스미드 pYM25(NRRL B-18015 : 제17도 참조)에서 유래된 2.9 kbp의 BamHⅠ-SalⅠ 단편을 SamHⅠ-절단 pPO4.0(NRRL B-15868, KFCC-10358 : 이 플라스미드의 피치아 위치에 대한 제한지도인 제16a도 참조)속에 삽입함으로써 만들어졌다. 이렇게 삽입한 결과, AOX1 유전자의 5-위치로부터 약 600bp가 삭제된다.
(이 유전자의 4분의 1 정도). PvuⅡ와 EcoRⅠ으로 소화시킴으로서 플라스미드 pYM17을 선형으로 만들고, Arg+기본유기영양군을 선택함으로써 PPF1(arg4 hig4, NRRL Y-18017, KFCC-10364)속으로 형질전환을 시켰다. 형질전환주들을 재생 한천으로부터 추출시키고, 실시예Ⅱ에 기재된 바와같이 초음파 처리를 한 후, 0.1%의 포도당(2% 대신)과 40㎍/mL의 히스티딘이 함유된 SD 배지 한천 평판위에 펴발랐다. 생성된 콜로니들을, 1) 탄소가 없는, 2) 0.5% 메탄올이 들어있는, 3) 2% 포도당이 들어있는 한 세트의 SD 배지 한천 평판(히시스티딘 함유) 위에다 복사평판 배양을 하였다. 약 81.0%의 Arg+콜로니들은 메탄올 위에서 정상적으로 생장할 수 없었다. 이들 메탄올 비사용자중의 두개(즉, KM71과 KM72)로 부터 유래된 게놈 DNA를 서던 블롯(Southern blot) 분석한 결과, AOX1 유전자가 이들 균주속에서 붕괴되었고, 벡터가 제 8 도의 바닥에 도시된 바와같이 삽입되었음이 확인되었다.
유전형(his4 aox1 : : SARG4)을 갖는 PPF1 pYM17알콜 산화효고-결여 구조들은 잠재적으로 매우 가치있는 것들이다. 예를들어, 균주가 his4 이므로, 선택성 표시 유전자로서 HIS4를 함유하는 피치아 벡터, 예컨대 pSAOH5(NRRL B-15862 ; 제 9 도 참조)를 이 숙주속에 형질전환시킬 수 있다(하기 실시예Ⅴ에서 보다 상세히 기재될 것임).
[실시예 Ⅴ]
[피치아 파스토리스의 알콜산화효소-결여 변이균주내 lacZ유전자의 메탄올-조절 발현]
본 실시예에는, 실시예Ⅳ에 기재된 바와같이 제조된 피치아 숙주 KM71(PPF1-pYM17알콜산화효소-결여구조)내 lacZ 유전자의 발현에 관한 실험이 기재되어 있다.
이들 비교 실험을 위한 Aox1_숙주는 KM71(his4 aox1 : : SARG4)이었으며, Aox1+숙주는 PPF1(arg4 his4 ; NRRL Y-18017)이었다. 두 균주속에 형질전환시킨 AOX1 촉진자 -lacZ발현 카세트는 플라스미드 pSAOH5(제 9 도 참조 ; NRRL B-15862)상에 존재하였다. 이 두 균주로 부터 안정한 His+형질전환주 몇개를 분리해냈다. 이들의 게놈 DNA들을 서던 블롯 분석에 의해 검사하여, 짝을 이룬 한 세트의 균주들을 얻었는데, 이들은 각기 AOX1 촉진자 장소에서 통합된 pSAOH5를 함유하였다. 그와 유사하게, 히스티딘 기본유기영양군을 선택함으로써 디히드록시아세톤 합성효소(DAS)촉진자-lacZ 유전자 융합체를 pT76H3(제18도 참조 ; NRRL B-1800)상에서 PPF1과 KM71 속에 형질전환시켰다.
네개의 균주를, 포도당 2% 대신 글리세롤 2%를 유일한 탄소 및 에너지원으로 사용한 SD 배지속에서 각각 초기 배양을 하였다. 그런다음, 각각으 배양물을 이동시켰다. 즉, 원심분리에 의해 수거하고, 각기 다른 배지(즉, 유일한 탄소원으로서 0.5% 메탄올이 들어있는 SD 배지로 옮겼다. 이들 배양물의 샘플들을 β-갈락토시다제에 대하여 분석하였는데, 그 결과가 하기 표1에 요약되어 있다.
[표 1]
β-갈락토시다제, 단위/㎍*
Figure kpo00002
*β-갈락토시다제 분석
A. 필요한 용액 :
Figure kpo00003
1L로 채움 ; pH는 7이어야 함.
2. O-니트로페닐-β-D-갈락토시다제(ONPG)증류수 100mL속에 400mg의 ONPG(시그마 N-1127)를 용해시켜 4mg/mL ONPG 용액을 제조한다.
B. 분석과정 :
1. 배지(효모세포 20-50 OD600)로부터 부분표본을 빼내어 원심분리시키고, 세포 펠릿을 차가운 멸균수로 세척한다.
2. 1μL의 40% Z 완충액을 세포 펠릿 및 0.2㎍의 산 세척 0.45-0.50mm유리 비이드에다 첨가한다.
모든 샘플들을 얼음위에 정치시킨다. 이 혼합물을 매회 1분씩 4회에 걸쳐 가장 높은 세팅으로 와동시킨다. 샘플들은 와동 사이사이에 최소한 1분동안 얼음위에서 정치시킨다.
3. 용해질을 미소원심분리관속에 옮기고, 그속에서 4℃하에 5분간 원심분리시킨다. 상등액을 새로운 미소원심분리관속에 옮기고, 추출물들을 얼음위에서 정치시킨다.
4. 바이오-래드 연구소(Bradford) 단백질 분석법을 이용하여 추출물내 총 단백질의 농도를 평가하였다.
이를 위하여, 바이오-래드 염료 시약 농축물을 탈이온수 네 부피로 희석한 후 와트만 3MM 용지를 통해 여과하였다.
Z 완충액 100μL 속의 소의 혈청 난백(BSA) 3, 10, 30 및 100㎍을 한 세트의 13×100mm유리관(이들 관속에는 2.5mL의 염료 시약이 각각 들어있다)속에 첨가함으로써 표준농도 곡선을 만들었다. 이 샘플들을 혼합하여 실온에서 5분간 정치시키고, 595nm에서 이들의 광학 농도를 측정하였다. 3, 10 및 30μL의 샘플을 Z 완충액이 함유된 용액을 사용하여 100μL로 만들고, 전술한 바와같이 단백질 함량을 분석하였다. 그런다음, BSA 농도 곡선을 이용하여 각각의 추출물에 대한 단백질 농도값을 써넣었다.
5. β-갈락토시다제의 분석을 위하여, 10배 희석 추출물 10μL을 Z 완충액 1mL 속에 첨가하고, 이 혼합물을 30℃에서 5분간 배양하였다.
6. 0.2mL의 ONPG(4mg/ml)를 첨가하고 와동시킴으로써 반응을 개시한다.
7. 적절한 시점에서(A420＜1에서 보통 1 내지 30분) 0.5ml의 1M Na2CO3용액을 첨가함으로써 반응을 끝낸다.
8. 420nm에서 상등액의 흡수율을 읽는다.
C. β-갈락토시다제 활성 단위의 계산 :
1U=30℃, pH7에서 분당 생성된 오르토니트로페놀(ONP) 1n몰.
1n몰의 ONP는 420nm에서 0.0045의 흡수율(A420)을 갖는다. (이때의 경로길이는 1cm). 따라서 그러므로 420nm에서의 흡수율 1은 222n 몰 ONP/mL 또는 378 n몰/1.7mL을 나타낸다(분석된 상등액의 총 부피가 1.7mL이기 때문에).
그러므로 표에 나와있는 단위들은 다음과 같이 계산된다.
Figure kpo00004
네개의 배양물 각각은, 글리세롤-생장기 도중 감지될만한 β-갈락토시다제 활성을 거의 나타내지 않았다. 메탄올 배지로 옮긴지 약 10-20시간이 지난후, AOX1+숙주내의 AOX1-lacZ과 DAS-lacZ 발현 카세트가 함유된 두개의 배양물은 단백질 1㎍ 당 β-갈락토시다제 활성 약 20단위에서 β-갈락토시다제 활성 평준화를 나타내었다. 그러나 AOX1-배경내의 AOX1-lacZ 카세트는 60단위/㎍ 근처에 다달하서 활성을 나타내었고, AOX1-숙주내의 DAS-lacZ 카세트는 β-갈락토시다제 활성 수준의 증가를 나타내었다.
따라서, 형질전환된 AOX1-숙주 KM71은 형질전환된 아이소게닉(isogenic)-AOX1+균주 PPF1의 수준보다 2-3배만큼 β-갈락토시다제를 발현한다.
[실시예 Ⅵ]
[간염 B 표면 항원 유전자의 삽입 및 AOX1 유전자의 삭제]
자리 지적 삽입/삭제에 관한 본 실시예에서는, AOX1 유전자의전체 코딩 서열을 삭제하고, 게놈속에 남아있는 AOX1 유전자의 촉진자의 조절하에 간염 B표면 항원(HBsAg) 유전자를 삽입하였다. 이를 위치하여 P. 파스토리스 숙주 구조를 플라스미드 pBSAGI5I을 만들었다. [E. 콜리숙주 속에 넣어진 채로 노던리조날 리서치 센터(이리노이주, 페오리아시의 미합중국 농무성)에 기탁되어 있고, 본 출원의 특허시 NRRL B-18021(KFCC-10356)이라는 기탁번호로 제한없이 대중에게 분양됨 ; 제12도] 이 플라스미드 속에는 AOX1 유전자의 5'-말단과 간염 B표면항원(HBsAg) 서열 및 300bp AOX1 말단유전자 단편이 차레로 붙어있는 서열로부터의 1.0kbp 단편이 들어있다(제9, 10 및 11도 참조). 이같은 발현 카세트 다음에는 피치아 HIS4 유전자를 암호화하는 2.7kbp의 단편이 뒤따르며, 끝으로 AOX1 유전자에 대한 3' 서열이 함유된 1.5kbp의 PvuⅡ 단편이 온다. pBSAGI5I을 BglⅡ로 소화시켰을때, 한쪽 말단에는 0.85kbp의 5'-AOX1 유전자 서열이 들어있고, 다른쪽 말단에는 1.1kbp의 3'-AOX1 서열이 들어있는 7.2kbp의 선형벡터가 방출되었다. 히스티딘 기본유기영양균을 선택함으로써 BglⅡ-절단 pBSAGI5I을 GS115 속에 형질전환주시키고 형질전환주들을 재생 한천으로부터 추출시키고 초음파 처리한 후(실시예11에 기재된 바와 같음), 0.1%의 포도당(2.0% 대신)이 들어있는 SD 배지 한천 평판위에 펴발랐다.
생성된 콜로니들을, 1) 탄소원이 없는, 2) 0.5%의 메탄올이 들어있는, 3) 2%의 포도당이 들어있는 최소 한천 평판 위에다 복사평판배양하였다. 시험된 콜로니중 평균 32%는 메탄올 상에서 정상적으로 생장하지 못하였다.
메탄올 비사용자중 두개로 부터 유래된 게놈 DNA 들을 서던 블롯 분석한 결과, AOX1 유전자가 삭제되고, 벡터 서열들이 삽입되었음이 입증되었다(제13도 참조).
메탄올속에 배양하였을때, GS115-pBSAGI5I 균주(aox1 : : HBsAg-HiS4)는 알콜 산화효소 전능력을 갖는 세포(유사하게 형질전환된 것)에 의해 발현된 것보다 더 높은 수준으로 HBsAg를 발현하였다.
[실시예 Ⅶ]
[위치 지적 삽입 기술에 의한 P.파스토리스의 제 2 알콜 산화 효소 유전자의 동정]
제 2 알코올 산화효소 유전자의 존재는 다음의 관찰들로 추측할 수 있다 : 1) AOX cDNA 또는 게놈 DNA 로 부터의 탐침체를 제한 피치아 게놈 DNAs로 교잡한 써던 블롯은 항상 적어도 두개의 띠를 나타냈다. 2) 두개의 피이차 게놈 DNA 단편은 서로 유사하나 같지 않는 것으로 원래 분리되었다(제16도 참조) ; 3) 제일 AOX 유전자(AOX1) 가 삭제되거나 찢기워진 KM71 및 GS115-pBSAGI5I와 같은 피치아 변이균주는 메탄올 상에서 계속 성장할 수 있었고 알코올 산화효소 활성을 함유하고 있었다. 이들 Aox-균주의 메탄올-성장 세포에서의 성장 속도 및 AOX 활성은 아이소제닉-Aox+균주에서보다 작았다. 그러므로 제 2 AOX 유전자(AOX2)는 낮은 수준으로 발현되거나 그 생성물이 메탄올상에서 덜 활성적이라는 것이 나타났다. 실시예Ⅳ에서, 이것은, pPG4.0 내의 피치아 DNA 단편은 AOX 유전자를 포함한다는 것을 설명했다.
pPG3.0으로부터의 게놈 DNA 단편은 적어도 AOX2 유전자 일부분을 포함한다는 것을 설명하는 가장 확실한 방법은 이 추정의 AOX2 유전자가 찢기워지거나 삭제된 변이 균주를 구성하는 것이다. 이를 위하여 자리-지적 벡터 pYMI12가 구성되었다(제14도). 이플라스미드는 3.0kbp BamHⅠ단편상에 이 추정 AOX2 유전자를 포함하는 pPG 3.0(제16도)으로 일차적으로 구성된다. 이 피치아 HIS4 유전자를 포함하는 2.7kbp BglⅡ 단편은 pYJ8(제 3 도 ; NRRL B-15889)로부터 분리되고 pPG 3.0의 KpnⅠ 자리들 및 BglⅡ 사이에 위치한 서열에 삽입한다. (pPG 3.0내에서 KpnⅠ 자리는 삽입에 앞서 올리고뉴클레오티드 어댑터에 의해 BglⅡ로 전환되고 ; HIS4 유전자의 BamHⅠ자리는 삽입에 앞서 "필링 인"(filling in)에 의해 파괴된다). AOX1 및 추정의 AOX2유전자(제16도)를 비교하면 이 구조는 AOX2의 중간으로부터 약 800bp가 삭제되는 것을 초래하는 것이 나타난다. BamHⅠ로 pYMI12a를 소화함으로, 각각, 추정 AOX2 위치로 부터의 1.1 및 0.7kbp의 서열이 측면에 있는 HIS4-유전자 단편을 포함하는 (제15도참조) 4.5kbp 직선 벡터가 방출되었다.
이 직선 벡터를 Aox-균주 KM71, (aox1, his4 : : SARG4)로 형질전환 시키고 형질전환주를 히스티딘 기본유기영양균을 선택함으로 분리한다. 이 형질 전환 주를 한천 평판상의 평판 복사법에 의해 메탄올을 이용하는 능력을 선별시험한다.
형질전환되지않은 Aox-균주 KM71은 메탄올 평판상에서 서서히 자라고, 메탄올을 한천에 포함시킬 경우, 상당한 성장이 발견되기 전에 이것이 증발되었다. 이 문제는 증기상으로 메탄올을 세포에 주입함으로 해결되었다.
이 공정을 위해 100% 메탄올 약 0.2mL를 한천 배지에 탄소원이 없는 평판의 뚜껑 밑에 넣는다. 이 평판을 실온에 놓고 뚜껑을 신선한 메탄올-포함 뚜껑으로 2-4일마다 바꾼다. 약 1-2주일후, 자연형(Aox+, Aox2+) 및 변이 균주(Aox-, Aox2+) 및 (Aox-, Aox2-)의 메탄올에서의 성장이 차이가 분명히 나타났다.
증기상 주입 공정에 따라 Aox-균주의 His+형질전환주의 약 0.1%는 메탄올상에서 성장할 수 없음이 발견되었다. Aox-Aox2-His+형질전환주 8개로 부터의 DNAs는 써던 여과 교잡 공정으로 분석하였다. 이들 DNAs 3개는 제15도에 나타난 바와같이 삽입된 직선 pYMI12a 벡터를 포함한다. Aox-, Aox2-이중 변이주, KM7121(NRRL Y-18019)의 하나를 분석하면 균주는 절대적으로 메탄올상에서 성장하지 못하고 균주는 발견할 수 있는 AOX 활성을 갖지 못한다는 것이 나타났다. KM7121의 이러한 결과로부터, pPG3.0내의 피치아 단편은 제 2 AOX 유전자로 부터의 서열을 포함하고, 두 알콜 산화효소가 아닌 다른 메탄올-산화 활성은 P. 파스토리스태에 존재하지 않는다는 것이 분명하다.

Claims (11)

  1. 첫번째 삽입성 DNA 단편, 선택성 표시 유전자 및 두번째 삽입성 DNA 단편으로 구성되고 ; 상기 첫번째 두번째 삽입성 DNA 단편은 각각 길이가 적어도 약 200뉴클레오티드이고 게놈 개조가 일어나는 자연 피치아 게놈 자리의 분리된 부분과 동종인 뉴클레오티드 서열을 갖고 ; 상기 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편이, 이들이 피치아 게놈에서 배향된 바와 같이 직선 DNA 단편에 서로에 대하여 배향되고 ; 상기 표시 유전자는 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 삽입성 DNA 단편사이에 위치하는, 일렬로 배열된 직선 DNA 단편으로 피치아 속의 숙주 균주를 형질전환시키는 것으로 구성되는 미리 정해진 게놈 위치에서의 피치아속의 효모의 자리 선택적 게놈 개조의 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편이 알코올 산화효소 유전자, 디히드록시 아세톤신타제 유전자, 알기노석시네이트 라이에이스 유전자 또는 히스티디놀 디히드로게나제 유전자의 각각 200-5000 염기쌍 범위의 길이를 갖는 단편인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편이 제 1 도의 제한 지도로 특정지워지는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편이 제 4 도의 제한 지도로 특징지워지는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편이 제 7 도의 제한 지도로 특징지워지는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편이 제12도의 제한 지도로 특징지워지는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 첫번째 및 두번째 삽입성 DNA 단편이 제14도의 제한 지도로 특징지워지는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 하나에 있어서, 상기 직선 DNA 단편이 상기 선택성 표시 유전자 뿐만 아니라 이종성 유전자도 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 삽입성 DNA 단편 사이에 위치하는 이종성 유전자를 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 직선 DNA 단편이 이종성 유전자가 조절 지역의 조절하에 있고 ; 상기 선택성 표시 유전자에 첨가하여, 조절 지역-이종성 유전자 구성이 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 삽입성 DNA 단편사이에 위치한 조절 지역을 포함하는 방법.
  10. 강한 천연 촉진자-이종성 DNA 폴리펩티드 코딩 서열 발현 카세트로 형질전환된 숙주 효모 균주를 영양적으로 제한된 조건하에서 상기 강한 천연 촉진자를 유도하는 기질 상에서 배양하는 것으로 구성되는 폴리펩티드 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 영양적 제한 조건이 상기 숙주 효모 균주로, 상기 기질상에서 비-제한 성장에 필요한 유전자 생성물이 결여된 효모를 사용함으로 제공되는 방법.
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