CN111801346A

CN111801346A - 重组多肽及其使用方法

Info

Publication number: CN111801346A
Application number: CN201780097984.1A
Authority: CN
Inventors: Y-H.陈; T-L.林
Original assignee: Immune Laboratories Pte Ltd
Current assignee: Immune Laboratories Pte Ltd; Imunami Laboratories Pte Ltd
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2020-10-20
Also published as: AU2017444998A1; CA3082769A1; AU2017444998B2; EP3732190A1; JP2021509019A; WO2019132765A1; JP7216104B2

Abstract

本公开提供了重组多肽、编码重组多肽的核酸以及使用这些多肽和/或核酸在有此需要的受试者中增强或诱导免疫应答的方法。本公开还提供了通过将公开的多肽和/或核酸施用于有此需要的受试者来治疗细胞增殖性病症、诸如癌症的方法。

Description

重组多肽及其使用方法

序列表

本申请含有已经经由EFS-Web以ASCII格式提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述ASCII拷贝，在2017年11月21日创建，名为IMHC-001/F01US_ST25.txt，并且大小为42KB。

发明背景

免疫原性细胞死亡是细胞死亡或凋亡的一种形式。与传统的凋亡(其主要是非免疫原性的)不同，癌细胞中的免疫原性细胞死亡可以通过活化树突细胞来诱导有效的抗肿瘤免疫应答。凋亡前状态被定义为活化胱天蛋白酶3/7之前的状态，即细胞凋亡的表现。免疫原性细胞死亡的特征在于在死亡中的细胞表面上的凋亡前损伤相关分子模式(DAMP)的表达。存在三种在免疫原性细胞死亡期间暴露于细胞表面的重要的凋亡前DAMP：钙网蛋白(CRT)、HSP70和HSP90。这三种凋亡前DAMP信号通过经由HSP70和HSP90的CRT和树突细胞成熟/活化在树突细胞募集和细胞吞噬作用中起重要作用，产生有效的抗肿瘤免疫应答。化学疗法和放射疗法的选择形式可以诱导附带的免疫原性细胞死亡。尽管这些疗法可以诱导三种凋亡前DAMP信号中的一种或两种，但它们不诱导所有三种凋亡前DAMP信号的表达。此外，化学疗法和放射疗法是免疫抑制疗法，其减少淋巴细胞的数目，并且还引起对周围非肿瘤细胞的附带损害，分别导致不良的抗肿瘤免疫应答以及不良事件。

需要这样的组合物，其通过诱导所有三种凋亡前DAMP信号的表达来以增加的效率和效力来诱导免疫原性细胞死亡，同时使副作用最小化。本公开解决了该需求。

发明概述

本公开提供了酸性重组多肽。

本公开提供了重组多肽，其包含选自SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1-16的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一个方面，所述重组多肽包含选自SEQ IDNO:1-8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一个方面，所述重组多肽包含选自SEQ ID NO:9-16的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9-16的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一个优选方面，所述重组多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

在一个方面，所述重组多肽包含选自SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1-16的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所述重组多肽是如通过pI确定的酸性重组多肽。在一个方面，所述重组多肽的pI低于SEQ ID NO:1-16的pI。在一个方面，天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一个方面，所述酸性重组多肽的氨基酸序列包含天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)，作为所述氨基酸序列内的三种最丰富的残基或丰度大于或等于所述酸性重组多肽的下一最丰富的氨基酸残基。

本公开还提供了编码本文公开的重组多肽中的任一种的核酸分子。在一个方面，所述核酸分子编码SEQ ID NO:1-16的重组多肽。在一个方面，所述核酸分子包含SEQ IDNO:17-32的核酸序列或与SEQ ID NO:17-32的核酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的核酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

本公开还提供了包含本文公开的核酸中的任一种的表达载体或质粒。本公开还提供了包含本文公开的重组多肽和/或核酸中的任一种的宿主细胞。本公开还提供了包含本文公开的重组多肽和/或核酸中的任一种和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个方面，所述药学上可接受的载体包含缓冲溶液，其包含浓度为约0.4M至约1.0M的NaCl，pH为约7.5至约9.0。

本公开提供了增强或诱导有此需要的受试者中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本文公开的重组多肽和/或核酸中的任一种。本发明提供了增强或诱导有此需要的受试者中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用包含本文公开的重组多肽和/或核酸中的任一种的药物组合物。

在一个方面，所述免疫应答是通过免疫原性细胞死亡。在一个方面，所述免疫原性细胞死亡包括内源性树突细胞活化。在一个方面，所述细胞具有凋亡前损伤相关分子模式(DAMP)信号的增加表达，所述凋亡前损伤相关分子模式(DAMP)信号包括钙网蛋白(CRT)、热休克蛋白70 (HSP70)、热休克蛋白90 (HSP90)或其组合。在一个方面，所述细胞是癌细胞。在一个方面，所述癌细胞选自肺癌、结肠癌或乳腺癌细胞。

本公开提供了增强或诱导有此需要的受试者中的细胞表面上的疾病相关抗原的内源性呈递的方法，其包括向所述受试者施用本文公开的重组多肽和/或核酸中的任一种。本公开提供了增强或诱导有此需要的受试者中的细胞表面上的疾病相关抗原的内源性呈递的方法，其包括向所述受试者施用包含本文公开的重组多肽和/或核酸中的任一种的药物组合物。在一个方面，所述细胞是癌细胞。在一个方面，所述癌细胞选自肺癌、结肠癌或乳腺癌细胞。

本公开提供了治疗、预防或减轻有此需要的受试者中的细胞增殖性病症的至少一种症状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文公开的重组多肽和/或核酸中的任一种。本公开提供了治疗、预防或减轻有此需要的受试者中的细胞增殖性病症的至少一种症状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的包含本文公开的重组多肽和/或核酸中的任一种的药物组合物。在一个方面，所述细胞增殖性病症是癌症。在一个方面，所述癌症选自肺癌、结肠癌或乳腺癌。

本公开还提供了试剂盒，其包含用于进行本文公开的任何方法的本文公开的组合物。

任何上述方面可以与任何其他方面组合。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

如本文所用，单词的单数形式也包括单词的复数形式，除非上下文另有清楚地规定；作为实例，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”被理解为是单数或复数，且术语“或”被理解为包括性的。通过实例的方式，“一个要素”意指一个或多个元素。

在整个说明书中，词语“包含(comprising)”或变型诸如“包含(comprises)”将被理解为暗示包括所述要素、整数或步骤或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤或要素、整数或步骤的组。在整个说明书中，词语“由…组成(consisting of)”或变型诸如“由…组成(consists of)”将被理解为暗示包括所述要素、整数或步骤或要素、整数或步骤的组，并且排除任何其他要素、整数或步骤或要素、整数或步骤的组。在整个说明书中，词语“基本上由…组成(consisting essentially of)”或变型诸如“基本上由…组成(consists essentially of)”将被理解为暗示包括所述要素、整数或步骤或要素、整数或步骤的组，以及不实质性影响请求保护的发明的基本和新型特征的任何其他要素、整数或步骤或要素、整数或步骤的组。

约可以被理解为在所示值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%内。除非从上下文另外清楚，否则本文提供的所有数值都通过术语“约”进行修饰。

尽管与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料可以用于实施或测试本公开，但下文描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以其整体通过引用并入。本文引用的参考文献不被承认是请求保护的公开内容的现有技术。在冲突的情况下，将以本说明书，包括定义，为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不意欲是限制性的。本公开的其他特征和优点从以下详述和权利要求将是显而易见的。

附图简述

图1是免疫原性细胞死亡的一些特征的示意图。对于细胞死亡标记的肿瘤细胞具有凋亡前损伤相关分子模式(DAMP)信号、诸如钙网蛋白(CRT)、HSP70和HSP90的细胞表面表达。树突细胞在识别DAMP信号后被活化。成熟的树突细胞迁移至淋巴结，且进而可以引发CD4+和CD8+ T-细胞，其对于介导免疫原性细胞死亡是重要的。

图2显示描绘如通过质谱法测定的约20kDa的CRYA_1B重组多肽的分子量(SEQ IDNO:9)的图。

图3A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H441人肺癌细胞系(HTB-174，ATCC)后表达CRT(钙网蛋白)的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将H441细胞在37℃下孵育1小时。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用CRT mAb (Abcam)测定表达CRT的H441细胞。图3B显示用于定量的流式细胞术概况。

图4A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H460人肺癌细胞系(HTB-177，ATCC)后表达CRT的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至0.1、1、10、25、35、50 µg/ml的最终浓度，并将H460细胞在37℃下孵育30分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用CRT mAb (Abcam)测定表达CRT的H460细胞。图4B显示用于定量的流式细胞术概况。

图5A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理HCT15人结肠癌细胞系(CCL-225, ATCC)后表达CRT的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将HCT15细胞在37℃下孵育55分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用CRT mAb (Abcam)测定表达CRT的HCT15细胞。图5B显示用于定量的流式细胞术概况。

图6A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理MCF7人乳腺癌细胞系(HTB-22，ATCC)后表达CRT的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将MCF7细胞在37℃下孵育1小时10分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用CRT mAb (Abcam)测定表达CRT的MCF7细胞。图6B显示用于定量的流式细胞术概况。

图7A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H441人肺癌细胞系(HTB-174，ATCC)后表达HSP70 (70 kDa热休克蛋白)的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将H441细胞在37℃下孵育1小时50分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp70 mAb(Enzo Life Sciences)测定表达Hsp70的H441细胞。图7B显示用于定量的流式细胞术概况。

图8A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H460人肺癌细胞系(HTB-177，ATCC)后表达HSP70的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至0.1、1、10、25、35、50 µg/ml的最终浓度，并将H460细胞在37℃下孵育1小时15分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp70 mAb (EnzoLife Sciences)测定表达Hsp70的H460细胞。图8B显示用于定量的流式细胞术概况。

图9A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理HCT15人结肠癌细胞系(CCL-225, ATCC)后表达HSP70的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将HCT15细胞在37℃下孵育1小时50分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp70 mAb (Enzo LifeSciences)测定表达Hsp70的HCT15细胞。图9B显示用于定量的流式细胞术概况。

图10A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理MCF7人乳腺癌细胞系(HTB-22，ATCC)后表达HSP70的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将MCF7细胞在37℃下孵育1小时40分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp70 mAb (Enzo LifeSciences)测定表达Hsp70的MCF7细胞。图10B显示用于定量的流式细胞术概况。

图11A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H441人肺癌细胞系(HTB-174，ATCC)后表达HSP90 (90 kDa热休克蛋白)的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将H441细胞在37℃下孵育1小时40分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp90 mAb(Enzo Life Sciences)测定表达Hsp90的H441细胞。图11B显示用于定量的流式细胞术概况。

图12A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H460人肺癌细胞系(HTB-177，ATCC)后表达HSP90的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至0.1、1、10、25、35、50 µg/ml的最终浓度，并将H460细胞在37℃下孵育1小时5分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp90 mAb (Enzo LifeSciences)测定表达Hsp90的H460细胞。图12B显示用于定量的流式细胞术概况。

图13A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理HCT15人结肠癌细胞系(CCL-225, ATCC)后表达HSP90的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将HCT15细胞在37℃下孵育1小时30分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp90 mAb (Enzo LifeSciences)测定表达Hsp90的HCT15细胞。图13B显示用于定量的流式细胞术概况。

图14A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理MCF7人乳腺癌细胞系(HTB-22，ATCC)后表达HSP90的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将MCF7细胞在37℃下孵育1小时45分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp90 mAb (Enzo LifeSciences)测定表达Hsp90的MCF7细胞。图14B显示用于定量的流式细胞术概况。

图15A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H441人肺癌细胞系(HTB-174，ATCC)后表达胱天蛋白酶3/7的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50和75 µg/ml的最终浓度，并将H441细胞在37℃下孵育2小时45分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用胱天蛋白酶3/7(Invitrogen)测定法测定H441细胞。图15B显示用于定量的流式细胞术概况。

图16A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H460人肺癌细胞系(HTB-177，ATCC)后表达胱天蛋白酶3/7的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至0.1、1、10、25、35和50 µg/ml的最终浓度，并将H460细胞在37℃下孵育2小时45分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用胱天蛋白酶3/7 (Invitrogen)测定法测定H460细胞。图16B显示用于定量的流式细胞术概况。

图17A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理HCT15人结肠癌细胞系(CCL-225, ATCC)后表达胱天蛋白酶3/7的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将HCT15细胞在37℃下孵育2小时30分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用胱天蛋白酶3/7 (Invitrogen)测定法测定HCT15细胞。图17B显示用于定量的流式细胞术概况。

图18A显示柱状图，其定量在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理MCF7人乳腺癌细胞系(HTB-22，ATCC)后表达胱天蛋白酶3/7的细胞的百分比。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75 µg/ml的最终浓度，并将MCF7细胞在37℃下孵育2小时45分钟。通过FACSCalibur (BD Biosciences)流式细胞术使用胱天蛋白酶3/7(Invitrogen)测定法测定MCF7细胞。图18B显示用于定量的流式细胞术概况。

发明详述

本公开提供了重组多肽，和编码这些多肽的核酸，包含这些多肽和/或核酸的药物组合物，以及使用这些多肽和/或核酸来增强或诱导有此需要的受试者中的免疫应答的方法。

本公开的组合物

本公开提供了重组多肽，其包含表1A中显示的氨基酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成。本公开还提供了重组多肽，其包含与表1A中显示的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

本公开还提供了酸性重组多肽变体，其包含表1A中显示的氨基酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成，其中所述重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定。本公开还提供了酸性重组多肽变体，其包含与表1A中显示的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

“酸性变体”是目标多肽的变体，其比目标亲本或原始多肽更酸性(例如，如通过计算pI所确定)。多肽的“pI”或“等电点”是指多肽的正电荷平衡其负电荷的pH。pI可以通过本领域中已知的任何方式例如从所述多肽的氨基酸残基的净电荷计算，或者可以通过等电聚焦来测定。

在一些方面，通过进行氨基酸取代从原始亲本序列衍生酸性变体。通过用酸性氨基酸(D或E)取代原始亲本序列的任何碱性氨基酸(K、R或H)、中性非极性氨基酸(G、A、V、L、I、M、F、W或P)或中性极性氨基酸(S、T、C、Y、N或Q)来进行第一突变取代。通过进行所述第一突变取代的反向突变取代来进行第二突变取代。例如，来自原始亲本序列的所有丝氨酸(S)残都用谷氨酸(E)残基取代(第一取代)。此外，来自原始亲本序列的所有谷氨酸(E)残基都用丝氨酸(S)残基取代(第二取代)。在一个方面，所述反向取代包含以下，基本上由其组成，或由其组成：原始亲本序列的所有丝氨酸(S)残基都突变为谷氨酸(E)且原始亲本序列的所有谷氨酸(E)残基都突变为丝氨酸(S)残基；原始亲本序列的所有丝氨酸(S)残基都突变为天冬氨酸(D)且原始亲本序列的所有天冬氨酸(D)残基都突变为丝氨酸(S)残基；原始亲本序列的所有缬氨酸(V)残基都突变为天冬氨酸(D)且原始亲本序列的所有天冬氨酸(D)残基都突变为缬氨酸(V)残基；或原始亲本序列的所有丝氨酸(S)残基都突变为亮氨酸(L)残基且原始亲本序列的所有亮氨酸(L)残基都突变为丝氨酸(S)残基。在一个优选方面，所述氨基酸取代产生重组多肽，其中天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一个优选方面，所述氨基酸取代产生重组多肽，其具有亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)，作为酸性变体的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性变体的下一最丰富的氨基酸残基。在一些方面，可以进行氨基酸的多个反向突变取代。

本公开还提供了酸性重组多肽变体，其包含表1A中显示的氨基酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成，其中所述重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定，其中所述重组肽变体的pI低于衍生所述重组肽的肽序列的pI，且其中亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。本公开还提供了酸性重组多肽变体，其包含表1A中显示的氨基酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成，其中所述重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定，且其中亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性变体的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性变体的下一最丰富的氨基酸残基。本公开还提供了酸性重组多肽变体，其包含与表1A中显示的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

表1A. 重组多肽序列

在一个优选方面，本公开提供了重组多肽，其包含表1B中显示的氨基酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成。本公开还提供了重组多肽，其具有与表1B中显示的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列。

表1B. 重组多肽序列

本公开提供了包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自家鹅(Anser cygnoides domesticus)α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank # XP_013036875.1)的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。

本公开提供了包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自家鹅(Anser cygnoides domesticus)α-A-晶体蛋白(CRYAA) (GenBank # XP_013036875.1)的氨基酸序列(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)，或包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)。在一些方面，所述重组多肽的pI低于SEQ ID NO:1的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富的氨基酸残基。

在一个优选方面，所述重组多肽是包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自家鹅(Anser cygnoides domesticus)α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank # XP_013036875.1)的酸性变体，或包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80%序列同一性，SEQ IDNO:9是酸性的，如通过pI所确定，SEQ ID NO:9的pI低于SEQ ID NO:1的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于SED ID NO:9内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在(即，谷氨酸(E)是SEQ ID NO:9的173氨基酸序列的23个残基，亮氨酸(L)是SEQ ID NO:9的173氨基酸序列的15个残基，且天冬氨酸(D)是SEQ ID NO:9的173氨基酸序列的14个残基，其中脯氨酸(P)(14个残基)是SEQ ID NO:9内的下一最多存在的氨基酸残基)。

本公开提供了包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自美洲鸵(Rhea Americana)α-A-晶体蛋白(CRYAA) (GenBank# P02505.1)的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。

本公开提供了包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自美洲鸵(Rhea Americana)α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank # P02505.1)的氨基酸序列(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)，或包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)。在一些方面，所述重组多肽的pI低于SEQ ID NO:2的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富的氨基酸残基。

在一个优选方面，所述重组多肽是包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自美洲鸵(Rhea Americana)α-A-晶体蛋白(CRYAA) (GenBank #P02505.1)的酸性变体，或包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75%序列同一性，SEQ ID NO:10是酸性的，如通过pI所确定，SEQ ID NO:10的pI低于SEQ ID NO:2的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于SED ID NO:10内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。

本公开提供了包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自绿头鸭(Anas platyrhynchos)α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank # O12984.1)的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成、由其组成的重组多肽。

本公开提供了包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自绿头鸭(Anas platyrhynchos)α-A-晶体蛋白(CRYAA) (GenBank # O12984.1)的氨基酸序列(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)，或包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)。在一些方面，所述重组多肽的pI低于SEQ ID NO:3的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富的氨基酸残基。

在一个优选方面，所述重组多肽是包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自绿头鸭(Anas platyrhynchos)α-A-晶体蛋白(CRYAA) (GenBank# O12984.1)的酸性变体，或包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80%序列同一性，SEQ ID NO:11是酸性的，如通过pI所确定，SEQ ID NO:11的pI低于SEQ ID NO:3的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于SED ID NO:11内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。

本公开提供了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自绿头鸭(Anas platyrhynchos)α-B-晶体蛋白(CRYAB)(GenBank # Q05557.1)的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成、由其组成的重组多肽。

本公开提供了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自绿头鸭(Anas platyrhynchos)α-B-晶体蛋白(CRYAB) (GenBank # Q05557.1)的氨基酸序列(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)，或包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)。在一些方面，所述重组多肽的pI低于SEQ ID NO:4的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富的氨基酸残基。

在一个优选方面，所述重组多肽是包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自绿头鸭(Anas platyrhynchos)α-B-晶体蛋白(CRYAB) (GenBank# Q05557.1)的酸性变体，或包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:4的多肽具有至少80%序列同一性，SEQ ID NO:12是酸性的，如通过pI所确定，SEQ ID NO:12的pI低于SEQ ID NO:4的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于SED ID NO:12内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。

本公开提供了包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自智人(Homo sapiens)α-A-晶体蛋白(CRYAA) (GenBank #AAH69528.1)的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。

本公开提供了包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自智人(Homo sapiens)α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank # AAH69528.1)的氨基酸序列，其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定，或包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体，其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定。在一些方面，所述重组多肽的pI低于SEQ ID NO:5的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富的氨基酸残基。

在一个优选方面，所述重组多肽是包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自智人(Homo sapiens)α-A-晶体蛋白(CRYAA) (GenBank #AAH69528.1)的酸性变体，或包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80%序列同一性，SEQ ID NO:13是酸性的，如通过pI所确定，SEQ ID NO:13的pI低于SEQ ID NO:5的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于SED ID NO:13内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。

本公开提供了包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的HSP23重组多肽序列或衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) HSP23 (GenBank #AAA28637.1)的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。

本公开提供了包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的HSP23重组多肽变体序列或衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) HSP23 (GenBank# AAA28637.1)的氨基酸序列(其中所述HSP23重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)，或包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性HSP23重组多肽变体(其中所述HSP23重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)。在一些方面，所述重组多肽的pI低于SEQ ID NO:6的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性HSP23重组多肽变体中的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性HSP23重组多肽变体的下一最丰富的氨基酸残基。

在一个优选方面，所述重组多肽是包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) HSP23 (GenBank #AAA28637.1)的酸性变体，或包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80%序列同一性，SEQ ID NO:14是酸性的，如通过pI所确定，SEQ ID NO:14的pI低于SEQ ID NO:6的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于SED ID NO:14内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。

本公开提供了包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的HSP22重组多肽序列或衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) HSP22 (GenBank #AAA28635.1)的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列的重组多肽。

本公开提供了包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性HSP22重组多肽变体序列或衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) HSP22(GenBank # AAA28635.1)的氨基酸序列(其中所述HSP22重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)，或包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性HSP22重组多肽变体(其中所述HSP22重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)。在一些方面，所述重组多肽的pI低于SEQ ID NO:7的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性HSP22重组多肽变体中的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性HSP22重组多肽变体的下一最丰富的氨基酸残基。

在一个优选方面，所述重组多肽是包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) HSP22 (GenBank #AAA28635.1)的酸性变体，或包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:7的多肽具有至少65%序列同一性，SEQ ID NO:15是酸性的，如通过pI所确定，SEQ ID NO:15的pI低于SEQ ID NO:7的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于SED ID NO:15内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。

本公开提供了包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自家鹅(Anser cygnoides domesticus)α-B-晶体蛋白(CRYAB)(GenBank # XP_013042703.1)的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。

本公开提供了包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自家鹅(Anser cygnoides domesticus)α-B-晶体蛋白(CRYAB) (GenBank # XP_013042703.1)的氨基酸序列(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)，或包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中所述α晶体蛋白重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定)。在一些方面，所述重组多肽的pI低于SEQ ID NO:8的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的三种最丰富的氨基酸残基或丰度大于或等于所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富的氨基酸残基。

在一个优选方面，所述重组多肽是包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自家鹅(Anser cygnoides domesticus)α-B-晶体蛋白(CRYAB)(GenBank # XP_013042703.1)的酸性变体，或包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80%序列同一性，SEQ IDNO:16是酸性的，如通过pI所确定，SEQ ID NO:16的pI低于SEQ ID NO:8的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以大于或等于SED ID NO:16内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。

本公开提供了编码重组多肽的分离的核酸分子，所述重组多肽包含表1A中显示的氨基酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成。本公开还提供了编码重组多肽的分离的核酸分子，所述重组多肽包含与表1A中显示的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

本公开还提供了编码重组多肽变体的分离的核酸分子，所述重组多肽变体包含表1A中显示的氨基酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成，其中所述重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定。本公开还提供了编码重组多肽变体的分离的核酸分子，所述重组多肽变体包含与表1A中显示的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

本公开还提供了编码酸性重组多肽变体的分离的核酸分子，所述酸性重组多肽变体包含表1A中显示的氨基酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成，其中所述重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定，其中所述重组肽变体的pI低于衍生所述重组肽的肽序列的pI，且其中亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以大于或等于所述重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量的量存在。本公开还提供了编码酸性重组多肽变体的分离的核酸分子，所述酸性重组多肽变体包含表1A中显示的氨基酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成，其中所述重组多肽变体是酸性的，如通过等电点(pI)所确定，且其中亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是所述酸性变体的三种最丰富的氨基酸序列或丰度大于或等于所述酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富的氨基酸残基。本公开还提供了编码酸性重组多肽变体的分离的核酸分子，所述酸性重组多肽变体包含与表1A中显示的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

本公开还提供了分离的核酸分子，其包含表2A中显示的核酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成。本公开还提供了核酸分子，其包含与表2A中显示的核酸分子中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的核酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

表2A. 核酸序列

在一个优选方面，本公开提供了分离的核酸分子，其包含表2B中显示的核酸序列中的任一种，基本上由其组成，或由其组成。本公开还提供了核酸分子，其包含与表2B中显示的核酸分子中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的核酸序列，基本上由其组成，或由其组成。

表2B. 核酸序列

本公开还提供了包含本文公开的重组多肽或核酸的药物组合物。

将本发明的药物组合物配制为与其意欲的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(局部)和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)调节pH。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

在一个方面，所述药物组合物可以包含药学上可接受的载体中的本文公开的重组多肽中的任一种，基本上由其组成，或由其组成。在一些方面，将所述药物组合物配制为水性制剂。所述水性制剂可以包含盐缓冲剂，基本上由其组成，或由其组成，所述盐缓冲剂可以选自，但不限于，NaCl、KCl和NaOAc。在一个优选方面，所述盐缓冲剂包含NaCl。在一个更优选方面，所述NaCl浓度为约0.4M至约1.0M。在一个方面，所述缓冲溶液的pH在约7.5和约9.0之间。

本发明的化合物或药物组合物可以以目前用于化学治疗的许多众所周知的方法施用于受试者。例如，为了治疗癌症，可以将本发明的化合物直接注射至肿瘤中，注射至血流或体腔中，口服或用贴剂通过皮肤应用。

如本文所用的术语“治疗有效量”是指药剂治疗、改善或预防鉴定的疾病或病况或表现出可检测的治疗或抑制作用的量。该作用可以通过本领域中已知的任何测定法来检测。受试者的确切有效量将取决于受试者的体重、大小和健康；病况的性质和程度；和选择用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。对于给定情况的治疗有效量可以通过临床医师的技术和判断之内的常规实验来确定。在一个方面，待治疗的疾病或病况是细胞增殖性病症。在一个优选方面，待治疗的疾病或病况是癌症。

对于任何化合物，可以在细胞培养测定(例如，肿瘤细胞的细胞培养测定)或动物模型(通常是大鼠、小鼠、兔、狗或猪)中初步估计治疗有效量。动物模型还可以用于确定适当的浓度范围和施用途径。然后，此类信息可以用于确定用于在人中施用的有用的剂量和途径。可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定治疗/预防效力和毒性，例如，ED₅₀(50%群体中治疗有效的剂量)和LD₅₀(50%群体中致死的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为比率LD₅₀/ED₅₀。优选表现出大治疗指数的药物组合物。剂量可以在该范围内根据采用的剂型、患者的敏感性和施用途径而改变。

调整剂量和施用以提供足够水平的活性剂或维持期望作用。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度，受试者的总体健康，受试者的年龄、重量和性别，饮食，施用的时间和频率，药物组合，反应敏感性和耐受性/对治疗的应答。

含有本发明的活性化合物的药物组合物可以以通常已知的方式制造，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣、磨细、乳化、胶囊化、捕获或冻干方法的方式。可以使用一种或多种药学上可接受的载体(包括有助于将活性化合物加工成可以药学使用的制剂的赋形剂和/或辅助剂)以常规方法配制药物组合物。当然，适当的制剂依赖于选择的施用途径。

适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的并且应当在存在简单可注射性的程度上是流体。其必须在制造和储存的条件下是稳定的，并且必须针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用进行保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用包衣剂、诸如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可以实现微生物作用的防止。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨糖醇)、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。

无菌可注射溶液可以根据需要通过将活性化合物以所需的量与上面列举的成分中的一种或组合并入适当的溶剂中、随后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其他期望组分。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的药学上可接受的载体。它们可以封装在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂一起并入并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体制备，用于用作漱口水，其中口服施用并擦干和祛痰或吞咽流体载体中的化合物。可以包括药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任何以下成分或类似性质的化合物：粘合剂(诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶)；赋形剂(诸如淀粉或乳糖)，崩解剂(诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉)；润滑剂(诸如硬脂酸镁或Sterotes)；助滑剂(诸如胶体二氧化硅)；甜味剂(诸如蔗糖或糖精)；或调味剂(诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂)。

所述药物组合物可以包括本文所述的重组多肽和核酸中的任一种的共制剂。

药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。

本公开还提供了质粒、表达载体和宿主细胞，其包含本文公开的重组多肽和编码本文公开的重组多肽的核酸分子。在一个方面，本公开提供了质粒或表达载体，其含有包含SEQ ID NO:17-32中的任一种的核苷酸序列的核酸分子、分子，或与SEQ ID NO:17-32的核酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的核酸序列，或其片段。在一个方面，本公开提供了含有包含SEQ ID NO:1-16中的任一种的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列或其片段的重组多肽的宿主细胞，或含有包含SEQ ID NO:17-32中的任一种的核酸序列或与SEQ ID NO:17-32的核酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的核酸序列或其片段的分子的宿主细胞。

如本文所用，术语“转化”、“转染”和“转导”是指将核酸(即，核苷酸聚合物)转移至细胞中。如本文所用，术语“遗传转化”是指将DNA、尤其是重组DNA转移和并入细胞中。转移的核酸可以经由表达载体而引入细胞中。

通过将所述分子置于载体中对包含期望的多核苷酸序列的多核苷酸分子进行增殖。可以使用病毒和非病毒载体，包括质粒。质粒的选择将取决于期望增殖的细胞类型和增殖的目的。某些载体可用于扩增和制造大量的期望的DNA序列。其他载体适合于在培养中的细胞中进行表达。还有其他载体适合于在整个动物或人中的细胞中进行转移和表达。适当载体的选择完全在技术人员的技术之内。许多此类载体是市售的。通常借助于DNA连接酶附接至载体中切割的限制性酶位点来将部分或全长多核苷酸插入载体中。或者，可以通过体内同源重组来插入期望的核苷酸序列。通常，这伴随有将同源性区域附接至载体中期望的核苷酸序列的两侧上。例如，通过连接寡核苷酸或通过使用包含同源性区域和期望的核苷酸序列的一部分的引物的聚合酶链反应添加同源性区域。

对于表达，可以采用表达盒或系统。为了表达编码本文公开的多肽的核酸，将编码所述多肽的核酸分子引入宿主细胞中，所述核酸分子可操作地连接至控制在表达载体中的转录表达的调节序列。除了转录调节序列、诸如启动子和增强子以外，表达载体可以包括翻译调节序列和适合于选择携带表达载体的细胞的标记基因。本公开的多核苷酸编码的基因产物表达于任何方便的表达系统(包括例如细菌、酵母、昆虫、两栖动物和哺乳动物系统)中。在表达载体中，在适当时将多肽编码多核苷酸连接至调节序列以获得期望的表达特性。这些可以包括启动子、增强子、终止子、操纵子、抑制子和诱导物。启动子可以是调节性的(例如，来自类固醇诱导性pIND载体(Invitrogen)的启动子)或组成性的(例如，来自CMV、SV40、延伸因子或LTR序列的启动子)。使用如上文关于连接至载体所述的技术将这些连接至期望的核苷酸序列。可以使用本领域中已知的任何技术。因此，表达载体将通常提供转录和翻译起始区，其可以是诱导性的或组成性的，其中在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下可操作地连接编码区。

可以将表达盒(“表达单元”)引入各种载体，例如质粒、BAC、YAC、噬菌体(诸如λ、P1、M13等)、植物或动物病毒载体(例如，基于逆转录病毒的载体、腺病毒载体)等，其中载体通常特征在于选择包含表达载体的细胞的能力。载体可以提供染色体外维持，尤其是作为质粒或病毒，或用于整合至宿主染色体中。在期望染色体外维持的情况下，提供起点序列用于复制质粒，其可以是低或高拷贝数。各种各样的标志物可用于选择，尤其是针对毒素进行保护的那些，更尤其是针对抗生素进行保护的那些。根据宿主的性质来选择选择的特定标志物，其中在一些情况下，可以用营养缺陷型宿主进行补充。DNA构建体的引入可以使用任何方便的方法，包括例如缀合、细菌转化、钙沉淀的DNA、电穿孔、融合、转染、用病毒载体感染、生物弹法等。

因此，本公开内使用的多肽可以根据常规技术在基因工程改造的宿主细胞中产生。合适的宿主细胞是可以用外源性DNA转化或转染且在培养基中生长的那些细胞类型，并且包括细菌、真菌细胞和培养的高级真核细胞(包括多细胞生物体的培养细胞)，尤其是培养的哺乳动物细胞。用于操纵克隆的DNA分子和将外源性DNA引入各种宿主细胞中的技术由以下文献公开：Sambrook和Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001)，和Ausubel等人, Short Protocols in Molecular Biology (第4版, John Wiley & Sons,1999)。例如，可以从细菌大肠杆菌细胞表达本公开的重组多肽。

为了将重组多肽引导至宿主细胞的分泌途径中，可以在表达载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列)。分泌信号序列可以是重组蛋白的天然形式的分泌信号序列，或可以源自另一种分泌蛋白或重新合成。将分泌信号序列可操作地连接至编码多肽的DNA序列，即，将两个序列在正确的阅读框中接合且进行定位以便将新合成的多肽引导至宿主细胞的分泌途径中。分泌信号序列通常位于编码目标多肽的DNA序列的5'，但某些信号序列可以位于目标DNA序列中的其他地方(参见例如Welch等人,美国专利号5,037,743；Holland等人,美国专利号5,143,830)。

培养的哺乳动物细胞可以是适合于产生在本公开内使用的重组多肽的宿主。用于将外源性DNA引入哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等人, Cell14:725, 1978; Corsaro和Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham和Van der Eb, Virology 52:456, 1973)、电穿孔(Neumann等人, EMBO J. 1:841-845,1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等人,同上)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等人, Focus 15:73, 1993; Ciccarone等人, Focus 15:80, 1993)。培养的哺乳动物细胞中的重组多肽的产生由例如以下文献公开：Levinson等人,美国专利号4,713,339；Hagen等人,美国专利号4,784,950；Palmiter等人,美国专利号4,579,821；和Ringold,美国专利号4,656,134。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCCCCL61；CHO DG44；CHO DXB11(Hyclone，Logan，UT)；也参见例如Chasin等人,Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCCCCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40-转化的猴肾细胞(COS-1；ATCCCRL 1650)和鼠胚细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。额外合适的细胞系是本领域中已知的，并且可得自公共保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心, Manassas, Virginia。可以使用强转录启动子，诸如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。参见例如美国专利号4,956,288。其他合适的启动子包括来自金属硫蛋白基因的那些(美国专利号4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。

药物选择通常用于选择其中已插入外来DNA的培养的哺乳动物细胞。此类细胞通常被称为“转染子”。在选择剂存在的情况下培养且能够将目标基因传递给其后代的细胞被称为“稳定转染子”。示例性选择标记包括编码对抗生素新霉素的抗性的基因，其允许在新霉素类型药物诸如G-418等存在的情况下进行选择；针对黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的gpt基因，其允许宿主细胞在霉酚酸/黄嘌呤存在的情况下生长；和提供对博来霉素、博莱霉素、杀稻瘟菌素和潮霉素的抗性的标记(参见例如Gatignol等人, Mol. Gen. Genet.207:342, 1987; Drocourt等人, Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990)。选择系统还可以用于增加目标基因的表达水平，即被称为“扩增”的过程。通过在低水平选择剂存在的情况下培养转染子，且然后增加选择剂的量以选择产生高水平的引入的基因的产物的细胞来进行扩增。示例性可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶，其可以赋予对氨甲蝶呤的抗性。还可以使用其他药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多药物耐药性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。

还可以使用其他高级真核细胞作为宿主，包括昆虫细胞、植物细胞和禽类细胞。Sinkar等人, J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987已经综述了使用毛根农杆菌作为在植物细胞中表达基因的载体。Guarino等人,美国专利号5,162,222；和WO 94/06463公开了昆虫细胞的转化和在其中产生外来多肽。

可以用通常源自苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞。参见King和Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide(Chapman & Hall, London); O’Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., New York 1994); 和Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson编, HumanaPress, Totowa, NJ, 1995)。还可以通过使用Luckow等人 (J. Virol. 67:4566-4579,1993)描述的基于转座子的系统来产生重组杆状病毒。利用转移载体的该系统可以以试剂盒形式市售(BAC-TO-BAC试剂盒；Life Technologies，Gaithersburg，MD)。转移载体(例如，PFASTBAC1；Life Technologies)含有用于将编码目标蛋白的DNA移动至作为大质粒(称为“杆粒”)维持于大肠杆菌中的杆状病毒基因组中的Tn7转座子。参见Hill-Perkins和Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning等人, J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; 和Chazenbalk和Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995。另外，转移载体可以包括如上文所公开与编码多肽延伸或亲和力标签的DNA的框内融合。使用本领域中已知的技术，将含有编码蛋白的DNA序列的转移载体转化至大肠杆菌宿主细胞中，且针对含有指示重组杆状病毒的中断lacZ基因的杆粒筛选所述细胞。使用常用技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA，且用于转染草地贪夜蛾细胞，诸如Sf9细胞。随后产生表达目标蛋白的重组病毒。通过本领域中通常使用的方法制备重组病毒储备物。

对于蛋白产生，可以使用重组病毒感染宿主细胞，通常为源自草地粘虫、草地贪夜蛾(例如Sf9或Sf21细胞)或粉纹夜蛾(例如HIGH FIVE细胞；Invitrogen，Carlsbad，CA)的细胞系。一般参见Glick和Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994)。还参见美国专利号5,300,435。使用无血清培养基来生长和维持所述细胞。合适的培养基制剂是本领域中已知的且可以获自商业供应商。使所述细胞从近似2-5 x 10⁵个细胞的接种密度生长至1-2 x 10⁶个细胞的密度，此时以0.1至10、更通常接近3的感染复数(MOI)添加重组病毒储备物。使用的程序一般描述于可用的实验室手册中(参见例如King和Possee,同上；O’Reilly等人,同上；Richardson,同上)。

本公开内也可以使用真菌细胞，包括酵母细胞。在这方面的酵母物种包括酿酒酵母、巴斯德毕赤氏酵母和甲醇毕赤酵母。例如，用外源性DNA转化酿酒酵母细胞和由其产生重组多肽的方法由以下文献公开：Kawasaki,美国专利号4,599,311；Kawasaki等人,美国专利号4,931,373；Brake,美国专利号4,870,008；Welch等人,美国专利号5,037,743；和Murray等人,美国专利号4,845,075。通过由选择标记、通常抗药性或在特定营养物(例如亮氨酸)不存在的情况下生长的能力确定的表型来选择转化的细胞。用于酿酒酵母中的示例性载体系统是Kawasaki等(美国专利号4,931,373)公开的POT1载体系统，其允许通过在含有葡萄糖的培养基中生长来选择转化的细胞。用于酵母中的合适的启动子和终止子包括来自糖解酶基因(参见例如Kawasaki,美国专利号4,599,311；Kingsman等人,美国专利号4,615,974；和Bitter,美国专利号4,977,092)和醇脱氢酶基因的那些。还参见美国专利号4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454。用于其他酵母，包括多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉米黑粉菌、巴斯德毕赤氏酵母、甲醇毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母和麦芽糖假丝酵母的转化系统是本领域中已知的。参见例如Gleeson等人,J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986；Cregg, 美国专利号4,882,279；和Raymond等人, Yeast 14:11-23, 1998。可以根据McKnight等人,美国专利号4,935,349的方法利用曲霉细胞。Sumino等人,美国专利号5,162,228公开了用于转化产黄头孢的方法。Lambowitz,美国专利号4,486,533公开了用于转化脉孢菌的方法。美国专利号5,716,808、5,736,383、5,854,039和5,888,768中公开了在甲醇毕赤酵母中产生重组蛋白。

原核宿主细胞，包括细菌大肠杆菌、芽孢杆菌属和其他属的菌株，也是本公开内可用的宿主细胞。用于转化这些宿主和表达其中克隆的外来DNA序列的技术是本领域中众所周知的(参见例如Sambrook和Russell, 同上)。当在细菌诸如大肠杆菌中表达重组蛋白时，蛋白可以保留在细胞质中，通常作为不溶性颗粒，或可以被细菌分泌序列引导至周质间隙。在前一种情况下，细胞被裂解，且颗粒被回收并且使用例如异硫氰酸胍或尿素使其变性。然后，变性蛋白可以再折叠且通过稀释变性剂来二聚化，诸如通过针对尿素溶液及还原型和氧化型谷胱甘肽的组合进行透析，随后针对缓冲盐水溶液进行透析。在替代方案中，蛋白可以以溶解形式从细胞质中回收且在不使用变性剂的情况下分离。蛋白作为例如磷酸盐缓冲盐水中的水性提取物形式从细胞回收。为了捕获目标蛋白，将提取物直接应用于色谱介质，诸如固定的抗体或肝素-琼脂糖凝胶柱。可以通过破坏细胞(例如，通过声处理或渗透性冲击)以释放周质间隙的内含物且回收蛋白，由此避免对变性和再折叠的需要而从周质间隙回收呈可溶解和功能形式的分泌蛋白。

根据常规程序在含有营养物和所选宿主细胞生长所需的其他组分的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。各种合适的培养基，包括限定的培养基和复合型培养基，是本领域中已知的，且一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。培养基还可以根据需要含有组分诸如生长因子或血清。一般将通过例如药物选择或必需营养物缺乏来选择用于含有外源添加DNA的细胞的生长培养基，所述必需营养物通过表达载体上携带或共同转染至宿主细胞中的选择标记来补充。

可以通过常规的蛋白纯化方法，通常通过色谱技术的组合来纯化重组多肽。一般参见Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKBBiotechnology, Uppsala, Sweden, 1988); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York 1994)。可以使用额外的纯化步骤诸如凝胶过滤来获得期望的纯度水平或提供脱盐、缓冲液交换等。

本公开的方法

本公开提供了用于增强或诱导有此需要的受试者中的免疫应答的方法，所述有此需要的受试者可以是具有细胞增殖性病症的受试者。在一个方面，所述受试者具有癌症，且所述细胞是癌细胞。在一个优选方面，所述受试者具有肺癌、结肠癌或乳腺癌。在一个优选方面，所述癌细胞可以是肺癌细胞、结肠癌细胞或乳腺癌细胞。

在一个方面，用于增强或诱导有此需要的受试者中的免疫应答的方法包括施用至少一种本公开的重组多肽或编码本公开的重组多肽的核酸。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:1-8的重组多肽或与SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列或如本文所述的其酸性变体。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:9-16的重组多肽或与SEQID NO:9-16的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列。在一个优选方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:9的重组多肽。

本公开还提供了用于增强或诱导有此需要的受试者中的细胞表面上的疾病相关抗原的内源性呈递的方法。所述有此需要的受试者可以是具有细胞增殖性病症的受试者。在一个方面，所述受试者具有癌症，且所述细胞是癌细胞。在一个优选方面，所述受试者具有肺癌、结肠癌或乳腺癌。在一个优选方面，所述癌细胞可以是肺癌细胞、结肠癌细胞或乳腺癌细胞。

在一个方面，用于增强或诱导有此需要的受试者中的细胞表面上的疾病相关抗原的内源性呈递的方法包括施用至少一种本公开的重组多肽或编码本公开的重组多肽的核酸。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:1-8的重组多肽或与SEQ IDNO:1-8的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列或如本文所述的其酸性变体。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:9-16的重组多肽或与SEQ ID NO:9-16的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列。在一个优选方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:9的重组多肽。

在一个方面，增强或诱导“免疫应答”可以是例如细胞因子释放应答或体液(抗原特异性)免疫应答。待增强的免疫应答例如可以是先天免疫应答、局部免疫应答、粘膜免疫应答或全身免疫应答。如本文所用，术语“增强(enhance)”或“增强(enhancing)”是指强化(加强)现有的免疫应答。术语“诱导”是指免疫应答的起始。

在一个方面，“免疫应答”是指“免疫原性细胞死亡”或“免疫原性凋亡”，其特征在于针对由死亡中的细胞表达的抗原的稳健免疫应答(图1)。死亡中的细胞，诸如癌细胞，可以具有凋亡前损伤相关分子模式(DAMP)信号(包括钙网蛋白(CRT)、HSP70、HSP90或其组合)的增加表达。在一个优选方面，所述细胞具有CRT、HSP70和HSP90各自的增加表达。本领域技术人员已知的技术可以用于评价这些细胞表面标志物的表达。例如，可以使用标准技术(诸如流式细胞术，免疫细胞化学(例如，用组织特异性或细胞标志物特异性抗体染色)，荧光活化的细胞分选(FACS)，磁活化的细胞分选( MACS)或本领域中已知的其他类似方法评价细胞表面标志物的表达。荧光活化的细胞分选(FACS)是用于基于颗粒的荧光特性分离颗粒(包括细胞)的众所周知的方法(Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165)。单独颗粒中的荧光部分的激光激发产生小电荷，允许从混合物电磁分离正和负颗粒。在一个方面，用独特的荧光标记物标记细胞表面标志物-特异性抗体或配体。细胞通过流式细胞仪进行处理，允许基于细胞结合使用的抗体的能力分离细胞。在一个方面，本公开的方法诱导细胞表面、诸如癌细胞表面上的凋亡前的HSP70、HSP90或钙网蛋白的表达。

在一个方面，“免疫原性细胞死亡”或“免疫原性凋亡”涉及树突细胞与细胞、诸如癌细胞的相互作用，导致内源性树突细胞活化、树突细胞成熟和吞噬作用的更快速率。树突细胞对凋亡前DAMP信号(包括钙网蛋白(CRT)、HSP70、HSP90或其组合)的识别触发“内源性树突细胞活化”。这导致“树突细胞成熟”，其包括主要组织相容性复合物(MHC)分子从胞内内吞隔室至树突细胞表面的重新分布，抗原内化的下调，共刺激分子(包括CD80和CD86)的表面表达的增加，细胞骨架重组，趋化因子、细胞因子和蛋白酶的分泌，粘附分子的表面表达和趋化因子受体的表面表达。已暴露于通过免疫原性细胞死亡而正在死亡的癌细胞的成熟树突细胞可以迁移至淋巴结并诱导大量的肿瘤特异性T淋巴细胞(包括CD4+和CD8+ T细胞)。这触发针对癌细胞的靶向T-细胞介导的应答。“免疫原性细胞死亡”或“免疫原性凋亡”的过程显示于图1中。本领域技术人员将理解，并非所有已知诱导细胞死亡的技术都将必然诱导免疫原性细胞死亡。只有诱导免疫原性细胞死亡的药剂将引发有效的内源性树突细胞活化。在一个方面，“免疫应答”是指内源性树突细胞活化、树突细胞成熟或T-细胞介导的应答或其组合。

在一个方面，“凋亡”是用于描述被称为程序性细胞死亡的细胞信号传导级联的术语。对于诱导凋亡的分子存在各种治疗适应症(例如癌症)。可以通过本领域中已知和可得的任何许多可用技术来监测凋亡，所述技术包括例如，测量DNA的片段化、膜不对称性的改变、凋亡胱天蛋白酶的活化和/或细胞色素C和AIF释放的测定法。在一个方面，通过胱天蛋白酶3/7的活化和表达来测量凋亡。

本公开还提供了用于治疗、预防或减轻有此需要的受试者中的细胞增殖性病症的至少一种症状的方法。在一个方面，所述方法减轻有此需要的受试者中的细胞增殖性病症的至少一种症状。在一个方面，所述细胞增殖性病症是癌症。在一个优选方面，所述癌症是肺癌、结肠癌或乳腺癌。

在一个方面，用于治疗、预防或减轻有此需要的受试者中的细胞增殖性病症的至少一种症状的方法包括施用至少一种本公开的重组多肽或编码本公开的重组多肽的核酸。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:1-8的重组多肽或与SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列或如本文所述的其酸性变体。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ IDNO:9-16的重组多肽。在一个优选方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:9的重组多肽或与SEQ ID NO:9-16的氨基酸序列中的任一种具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列。

如本文所用，“受试者”可以是任何哺乳动物，例如，人、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、骆驼。在一个优选方面，所述受试者是人。在一个方面，“有此需要的受试者”是具有细胞增殖性病症的受试者，或发展细胞增殖性病症的风险相对于整个群体增加的受试者。在一个方面，有此需要的受试者具有癌前病况。在一个优选方面，有此需要的受试者具有癌症。

如本文所用，“治疗”描述为了对抗疾病、病况或病症的目的管理和护理患者，并且包括减少或减轻症状或并发症，或消除疾病、病况或病症。如本文所用，“预防”描述停止所述疾病、病况或病症的症状或并发症的发作。如本文所用，“减轻”描述减少所述疾病、病况或病症的症状或并发症。

如本文所用，术语“细胞增殖性病症”是指其中细胞的未调节或异常生长或两者可以导致癌性的或非癌性的不希望的病况或疾病的发展的病况。本公开的示例性细胞增殖性病症涵盖其中细胞分裂不受调节的各种病况。示例性细胞增殖性病症包括，但不限于，赘生物、良性肿瘤、恶性肿瘤、癌前病况、原位肿瘤、包膜肿瘤、转移性肿瘤、液体瘤、实体瘤、免疫肿瘤、血液肿瘤、癌症、癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、快速分裂中的细胞。如本文所用的术语“快速分裂中的细胞”被定义为以超过或大于在同一组织内的相邻或并列细胞间期望或观察的速率分裂的任何细胞。细胞增殖性病症包括癌前(precancer)或癌前(precancerous)病况。细胞增殖性病症包括癌症。优选地，本文提供的方法用于治疗或减轻癌症症状。术语“癌症”包括实体瘤，以及血液肿瘤和/或恶性瘤。“癌前(precancer)细胞”或“癌前(precancerous)细胞”是显现癌前(precancer)或癌前(precancerous)病况的细胞增殖性病症的细胞。“癌细胞(cancer cell)”或“癌细胞(cancerous cell)”是显现作为癌症的细胞增殖性病症的细胞。任何可再现的测量方式可以用于鉴定癌细胞或癌前细胞。可以通过组织样品(例如，活检样品)的组织学分型或分级来鉴定癌细胞或癌前细胞。可以通过使用适当的分子标志物来鉴定癌细胞或癌前细胞。

示例性非癌症病况或病症包括，但不限于，类风湿性关节炎；炎症；自身免疫性疾病；淋巴组织增殖性病况；肢端肥大症；类风湿性脊椎炎；骨关节炎；痛风，其他关节炎病况；败血症；感染性休克；内毒素休克；革兰氏阴性细菌败血症；中毒性休克综合征；哮喘；成人呼吸窘迫综合征；慢性阻塞性肺病；慢性肺部炎症；炎性肠病；克罗恩氏病；银屑病；湿疹；溃疡性结肠炎；胰腺纤维化；肝纤维化；急性和慢性肾脏疾病；肠易激综合征；胃灼热(pyresis)；再狭窄(restenosis)；脑型疟疾；中风和缺血性损伤；神经损伤；阿尔茨海默氏病；亨廷顿氏病；帕金森氏病；急性和慢性疼痛；过敏性鼻炎；过敏性结膜炎；慢性心力衰竭；急性冠状动脉综合征；精神萎顿；疟疾；麻风病；利什曼病；莱姆病；赖特尔综合征；急性滑膜炎；肌肉变性、黏液囊炎；肌腱炎；腱鞘炎；成疝、疝气、或椎间盘突出综合征；骨硬化病；血栓症；再狭窄；矽肺；肺肉瘤病；骨吸收疾病，诸如骨质疏松症；移植物抗宿主反应；多发性硬化症；狼疮；纤维肌痛；AIDS和其他病毒性疾病，诸如带状疱疹、单纯性疱疹I或II，流感病毒和巨细胞病毒；和糖尿病。

示例性癌症包括，但不限于，肾上腺皮质癌、AIDS相关的癌症、AIDS相关的淋巴瘤、肛门癌、肛门直肠癌、肛管癌、阑尾癌、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、胆道癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、泌尿(uringary)膀胱癌、骨和关节肿瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑癌、脑肿瘤、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原发性神经外胚层(neuroectodeimal)肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、胃肠道、神经系统癌症、神经系统淋巴瘤、中枢神经系统癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增殖性病症、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、淋巴赘生物、蕈样真菌病、塞扎瑞(seziary)综合征、子宫内膜癌、食道癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、成视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠期滋养层肿瘤胶质瘤、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、眼癌、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、卡波西氏肉瘤、肾脏癌、肾癌、喉癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、瓦尔登斯特伦(Waldenstram)巨球蛋白血症、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、梅克尔细胞癌、恶性间皮瘤、间皮瘤、转移性鳞状颈部癌症、口腔癌、舌癌、多发性内分泌瘤综合征、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增殖性病症、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原发性神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾盂和输尿管、移行性细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤因家族肉瘤肿瘤、卡波西肉瘤、子宫癌、子宫肉瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、幕上原发性神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管和其他泌尿器官的移行性细胞癌、妊娠期滋养层肿瘤、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、子宫体癌、阴道癌、外阴癌和威尔姆氏肿瘤。

“肺癌”是一种涉及肺细胞的细胞增殖性病症。在一个方面，肺癌包括影响肺细胞的所有形式的细胞增殖性病症。在一个方面，肺癌包括肺癌、肺癌的癌前(precancer)或癌前(precancerous)状况、肺的良性生长或病变和肺的恶性生长或病变以及除了肺以外的身体中的组织和器官中的转移性病变。在一个优选方面，本公开的方法可以用于治疗肺癌或肺的细胞增殖性病症。在一个方面，肺癌包括所有形式的肺癌。在另一个方面，肺癌包括恶性肺肿瘤、原位癌、典型的类癌和非典型类癌。在另一个方面，肺癌包括小细胞肺癌(“SCLC”)、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、大细胞癌、腺鳞状细胞癌和间皮瘤。在另一个方面，肺癌包括“瘢痕癌”、支气管肺泡癌、巨细胞癌、梭形细胞癌和大细胞神经内分泌癌。在一个方面，肺癌包括0期、IA期、IB期、IIA期、IIB期、IIIA期、IIIB期和IV期肺癌。在另一个方面，肺癌包括具有组织学和超结构异质性(例如，混合细胞类型)的肺癌。

在一个方面，肺癌包括影响肺细胞的所有形式的细胞增殖性病症。在一个方面，肺的细胞增殖性病症包括肺癌、肺的癌前病况。在一个方面，肺的细胞增殖性病症包括肺的增生、化生和发育不良。在另一个方面，肺癌包括石棉诱导的增生、鳞状化生和良性反应性间皮化生。在另一个方面，肺的细胞增殖性病症包括用分层的鳞状上皮替代柱状上皮，和粘膜发育不良。在另一个方面，暴露于吸入的有害环境剂、诸如香烟烟雾和石棉的个体可能处于发展肺的细胞增殖性病症的增加风险。在另一个方面，可能使个体易于发展肺的细胞增殖性病症的先前的肺病包括慢性间质性肺病、坏死性肺病、硬皮病、类风湿性疾病、结节病、间质性肺炎、结核病、反复性肺炎、特发性肺纤维化、肉芽肿、石棉沉着症、纤维化肺泡炎和霍奇金氏病。

“结肠癌”是一种涉及肺细胞的细胞增殖性病症。在一个优选方面，本公开的方法可以用于治疗结肠癌或结肠的细胞增殖性病症。在一个方面，结肠癌包括所有形式的结肠癌。在另一个方面，结肠癌包括散发性和遗传性结肠癌。在另一个方面，结肠癌包括恶性结肠肿瘤、原位癌、典型的类癌和非典型类癌。在另一个方面，结肠癌包括腺癌、鳞状细胞癌和腺鳞状细胞癌。在另一个方面，结肠癌与遗传性综合征相关，所述遗传性综合征选自遗传性非息肉病性结肠直肠癌、家族性腺瘤性息肉病、加德纳氏综合征、Peutz-Jeghers综合征、Turcot氏综合征和青少年息肉病。在另一个方面，结肠癌由遗传性综合征引起，所述遗传性综合征选自遗传性非息肉病性结肠直肠癌、家族性腺瘤性息肉病、加德纳氏综合征、Peutz-Jeghers综合征、Turcot氏综合征和青少年息肉病。

在一个方面，结肠癌包括影响结肠细胞的所有形式的细胞增殖性病症。在一个方面，结肠癌包括结肠癌、结肠的癌前病况、结肠的腺瘤性息肉病和结肠的异时性病变。在一个方面，结肠癌包括0期、I期、IIA期、IIB期、IIC期、IIIA期、IIIB期、IIIC期、IVA期、IVB期和IVC期结肠癌。在一个方面，结肠癌包括腺瘤。在一个方面，结肠癌的特征在于结肠的增生、化生或发育不良。在另一个方面，可能使个体易于发展结肠的细胞增殖性病症的先前结肠疾病包括先前结肠癌。在另一个方面，可能使个体易于发展结肠的细胞增殖性病症的当前疾病包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。在一个方面，结肠的细胞增殖性病症与选自p53、ras、FAP和DCC的基因中的突变相关。在另一个方面，由于选自p53、ras、FAP和DCC的基因中的突变的存在，个体具有发展结肠的细胞增殖性病症的升高风险。

“乳腺癌”是一种涉及乳房细胞的细胞增殖性病症。在一个优选方面，乳腺癌包括影响乳房细胞的所有形式的细胞增殖性病症。在一个方面，乳腺癌包括乳腺癌、乳腺癌的癌前(precancer)或癌前(precancerous)状况、乳房的良性生长或病变和乳房的恶性生长或病变以及除了乳房以外的身体中的组织和器官中的转移性病变。在另一个方面，乳腺癌包括乳房的增生、化生和发育不良。

在一个方面，乳腺癌是乳腺癌的癌前病况。在一个方面，本公开的方法可以用于治疗乳房的癌前病况。在一个方面，乳腺癌的癌前病况包括乳腺癌的非典型增生、原位导管癌(DCIS)、导管内癌、原位小叶癌(LCIS)、小叶瘤形成以及乳房的0级或0级生长或病变(例如，0期或0级乳腺癌或原位癌)。在另一个方面，已经根据美国癌症联合委员会(AJCC)接受的TNM分类方案对乳腺癌的癌前病况进行分期，其中原发性肿瘤(T)已被分配为T0或Tis期；且其中区域性淋巴结(N)已被分配为N0期；且其中远端转移(M)已被分配为M0期。

在一个方面，本公开的方法可以用于治疗乳腺癌。在一个方面，乳腺癌包括所有形式的乳腺癌。在一个方面，乳腺癌包括原发性上皮乳腺癌。在另一个方面，乳腺癌包括其中乳腺癌与其他肿瘤、诸如淋巴瘤、肉瘤或黑色素瘤有关的癌症。在另一个方面，乳腺癌包括乳癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、乳腺未分化癌、乳腺叶状囊肉瘤、乳腺血管肉瘤和乳腺原发性淋巴瘤。在一个方面，乳腺癌包括I期、II期、IIIA期、IIIB期、IIIC期和IV期乳腺癌。在一个方面，乳腺导管癌包括侵入性癌、具有主要导管内组分的原位侵入性癌、炎性乳腺癌和乳房的导管癌，其具有选自以下的组织学类型：粉刺、粘液性(胶体)、髓质、具有淋巴浸润物的髓质、乳头状、硬化性和管状。在一个方面，乳腺小叶癌包括具有主要原位组分的侵入性小叶癌、侵入性小叶癌和浸润性小叶癌。在一个方面，乳腺癌包括佩吉特氏病、具有导管内癌的佩吉特氏病和具有侵入性导管癌的佩吉特氏病。在另一个方面，乳腺癌包括具有组织学和超结构异质性(例如，混合细胞类型)的乳腺癌。

在一个方面，治疗癌症导致肿瘤大小减小。肿瘤大小的减小也可以被称为“肿瘤消退”。优选地，在治疗后，肿瘤大小相对于其治疗前的大小减小5%或更多；更优选地，肿瘤大小减小10%或更多；更优选地，减小20%或更多；更优选地，减小30%或更多；更优选地，减小40%或更多；甚至更优选地，减小50%或更多；且最优选地，减小大于75%或更多。肿瘤的大小可以通过任何可再现的测量手段来测量。在一个优选方面，肿瘤的大小可以测量为肿瘤的直径。

在另一个方面，治疗癌症导致肿瘤体积减小。优选地，在治疗后，肿瘤体积相对于其治疗前的大小减小5%或更多；更优选地，肿瘤体积减小10%或更多；更优选地，减小20%或更多；更优选地，减小30%或更多；更优选地，减小40%或更多；甚至更优选地，减小50%或更多；且最优选地，减小大于75%或更多。肿瘤体积可以通过任何可再现的测量手段来测量。

在另一个方面，治疗癌症导致肿瘤数目减少。优选地，在治疗后，肿瘤数目相对于治疗前的数目减少5%或更多；更优选地，肿瘤数目减少10%或更多；更优选地，减少20%或更多；更优选地，减少30%或更多；更优选地，减少40%或更多；甚至更优选地，减少50%或更多；且最优选地，减少大于75%。肿瘤数目可以通过任何可再现的测量手段来测量。在一个优选方面，肿瘤的数目可以通过对肉眼可见或指定放大倍数下的肿瘤计数来测量。在一个优选方面，指定的放大倍数是2x、3x、4x、5x、10x或50x。

在另一个方面，治疗癌症导致远离原发肿瘤部位的其他组织或器官中的转移病灶的数目减少。优选地，在治疗后，转移病灶的数目相对于治疗前的数目减少5%或更多；更优选地，转移病灶的数目减少10%或更多；更优选地，减少20%或更多；更优选地，减少30%或更多；更优选地，减少40%或更多；甚至更优选地，减少50%或更多；且最优选地，减少大于75%。转移病灶的数目可以通过任何可再现的测量手段来测量。在一个优选方面，转移病灶的数目可以通过对肉眼可见或指定放大倍数下的转移病灶计数来测量。在一个优选方面，指定的放大倍数是2x、3x、4x、5x、10x或50x。

在另一个方面，与仅接受载体的群体相比，治疗癌症导致治疗的受试者的群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的手段来测量。在一个优选方面，可以例如通过针对群体计算在用活性化合物开始治疗后的平均存活长度来测量群体的平均存活时间的增加。在另一个优选方面，还可以例如通过针对群体计算在完成第一轮用活性化合物的治疗后的平均存活长度来测量群体的平均存活时间的增加。

在另一个方面，与未治疗的受试者的群体相比，治疗癌症导致治疗的受试者的群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的手段来测量。在一个优选方面，可以例如通过针对群体计算在用活性化合物开始治疗后的平均存活长度来测量群体的平均存活时间的增加。在另一个优选方面，还可以例如通过针对群体计算在完成第一轮用活性化合物的治疗后的平均存活长度来测量群体的平均存活时间的增加。

在另一个方面，与接受不是本公开的重组多肽的疗法的群体相比，治疗癌症导致治疗的受试者的群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加超过30天；更优选地，超过60天；更优选地，超过90天；且最优选地，超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的手段来测量。在一个优选方面，可以例如通过针对群体计算在用活性化合物开始治疗后的平均存活长度来测量群体的平均存活时间的增加。在另一个优选方面，还可以例如通过针对群体计算在完成第一轮用活性化合物的治疗后的平均存活长度来测量群体的平均存活时间的增加。

在另一个方面，与仅接受载体的群体相比，治疗癌症导致治疗的受试者的群体的死亡率降低。在另一个方面，与未治疗的群体相比，治疗癌症导致治疗的受试者的群体的死亡率降低。在一个进一步方面，与接受用不是本公开的重组多肽的药物的单一疗法的群体相比，治疗癌症导致治疗的受试者的群体的死亡率降低。优选地，所述死亡率降低超过2%；更优选地，超过5%；更优选地，超过10%；最优选地，超过25%。在一个优选方面，治疗的受试者的群体的死亡率的降低可以通过任何可再现的手段来测量。在另一个优选方面，可以例如通过针对群体计算在用活性化合物开始治疗后的每单位时间的疾病相关的死亡的平均数目来测量群体的死亡率的降低。在另一个优选方面，也可以例如通过针对群体计算在完成第一轮用活性化合物的治疗后的每单位时间的疾病相关的死亡的平均数目来测量群体的死亡率的降低。

在另一个方面，治疗癌症导致肿瘤生长速率降低。优选地，在治疗后，肿瘤生长速率相对于治疗前的数目降低至少5%；更优选地，肿瘤生长率降低至少10%；更优选地，降低至少20%；更优选地，降低至少30%；更优选地，降低至少40%；更优选地，降低至少50%；甚至更优选地，降低至少50%；且最优选地，降低至少75%。肿瘤生长速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。在一个优选方面，根据每单位时间肿瘤直径的变化来测量肿瘤生长速率。

在另一个方面，治疗癌症导致肿瘤再生长减少。优选地，在治疗后，肿瘤再生长小于5%；更优选地，肿瘤再生长小于10%；更优选地，小于20%；更优选地，小于30%；更优选地，小于40%；更优选地，小于50%；甚至更优选地，小于50%；且最优选地，小于75%。肿瘤再生长可以通过任何可再现的测量手段来测量。在一个优选方面，例如通过测量在治疗之后的先前肿瘤缩小之后肿瘤直径的增加来测量肿瘤再生长。在另一个优选方面，通过在治疗已经停止后肿瘤不能再发生来表明肿瘤再生长的减少。

在另一个方面，治疗、预防或减轻癌症导致细胞增殖速率降低。优选地，在治疗后，细胞增殖速率降低至少5%；更优选地，至少10%；更优选地，至少20%；更优选地，至少30%；更优选地，至少40%；更优选地，至少50%；甚至更优选地，至少50%；且最优选地，至少75%。细胞增殖速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。在一个优选方面，例如通过测量每单位时间组织样品中分裂中的细胞的数目来测量细胞增殖速率。

在另一个方面，治疗、预防或减轻癌症导致增殖中的细胞的比例降低。优选地，在治疗后，增殖中的细胞的比例降低至少5%；更优选地，至少10%；更优选地，至少20%；更优选地，至少30%；更优选地，至少40%；更优选地，至少50%；甚至更优选地，至少50%；且最优选地，至少75%。增殖中的细胞的比例可以通过任何可再现的测量手段来测量。在一个优选方面，例如通过定量组织样品中的分裂中的细胞的数目相对于非分裂中的细胞的数目来测量增殖中的细胞的比例。在另一个优选方面，增殖中的细胞的比例等于有丝分裂指数。

在另一个方面，治疗、预防或减轻癌症导致细胞增殖的区域或地区的大小的减小。优选地，在治疗后，细胞增殖的区域或地区的大小相对于其治疗前的大小减小至少5%；更优选地，减小至少10%；更优选地，减小至少20%；更优选地，减小至少30%；更优选地，减小至少40%；更优选地，减小至少50%；甚至更优选地，减小至少50%；且最优选地，减小至少75%。细胞增殖的区域或地区的大小可以通过任何可再现的测量手段来测量。在一个优选方面，细胞增殖的区域或地区的大小可以被测量为细胞增殖的区域或地区的直径或宽度。

在另一个方面，治疗、预防或减轻癌症导致具有异常外观或形态的细胞的数目或比例减少。优选地，在治疗后，具有异常形态的细胞的数目相对于其治疗前的大小减少至少5%；更优选地，减少至少10%；更优选地，减少至少20%；更优选地，减少至少30%；更优选地，减少至少40%；更优选地，减少至少50%；甚至更优选地，减少至少50%；且最优选地，减少至少75%。异常的细胞外观或形态可以通过任何可再现的测量手段来测量。在一个方面，通过显微镜检查、例如使用倒置的组织培养显微镜测量异常的细胞形态。在一个方面，异常的细胞形态采取核多态性的形式。

在一个方面，治疗癌症或细胞增殖性病症导致细胞死亡，并且优选地，细胞死亡导致群体中的细胞数目减少至少10%。更优选地，细胞死亡意指减少至少20%；更优选地，减少至少30%；更优选地，减少至少40%；更优选地，减少至少50%；最优选地，减少至少75%。群体中的细胞数目可以通过任何可再现的手段来测量。在一个方面，群体中的细胞数目通过荧光活化的细胞分选(FACS)来测量。在另一个方面，群体中的细胞数目通过免疫荧光显微镜检查来测量。在另一个方面，群体中的细胞数目通过光学显微镜检查来测量。在另一个方面，测量细胞死亡的方法如Li等人, (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. 100(5):2674-8中所示。在一个优选方面，细胞死亡通过免疫原性细胞死亡发生。

任何上述方面可以与如本文所述的任何其他方面组合。

实施例1：产生重组多肽的方法

材料和方法

产生本公开的重组多肽的方法利用表3中公开的PCR引物。

表3. 引物序列

模板DNA的制备

在使用Pfu聚合酶的PCR反应中扩增来自家鹅(Anser cygnoides domesticus)的全长CRYAA序列(SEQ ID NO:17)。在PCR反应中使用A1引物(SEQ ID NO:33)和A2引物(SEQ IDNO:34)。使用制造商的方案，将该基因克隆至pET24a载体(Novagen)中的NdeI和HindIII位点。将连接混合物转化至大肠杆菌DH5α细胞中，并在LB氨苄青霉素板上选择转化体。从几个转化体分离质粒DNA，并通过NdeI和HindIII位点的限制性消化进行筛选。鉴定含有家鹅(Anser cygnoides domesticus) CRYAA (SEQ ID NO:17)的序列验证的克隆，并将其用作模板。

含有CRYA_1B重组多肽序列的质粒的克隆

以以下方式制备含有CRYA_1B (SEQ ID NO:25)的重组质粒：使用上述模板DNA、正向引物IoE1 (SEQ ID NO:35)和反向引物IoE2 (SEQ ID NO:36)进行PCR。PCR温度和时间如下编程：在95℃下变性5分钟；随后为30个循环的PCR反应：在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下延伸1分钟；最终在72℃下延伸10分钟。所有PCR扩增都用Pfu Ultra聚合酶(Stratagene)进行。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。使用GFX^™PCR DNA和凝胶结合纯化试剂盒(GE Healthcare)从凝胶提取DNA片段，并连接至pET24a(Novagen)载体中。将连接混合物转化至DH5α大肠杆菌菌株中，并在含有氨苄青霉素的LB板上选择转化体。从转化体分离质粒DNA。序列验证的克隆，质粒_1，被用作模板，用于下一轮PCR扩增。

使用质粒_1、正向引物IoE3 (SEQ ID NO:37)和反向引物IoE4 (SEQ ID NO:38)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，32个循环的(95℃持续30秒，65℃持续30秒，72℃持续1分钟)，随后在72℃下5分钟。纯化PCR产物，并使用NdeI和HindIII限制性位点克隆至pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_2，被用作模板，用于下一轮PCR扩增。

使用质粒_2、正向引物IoE5 (SEQ ID NO:39)和反向引物IoE6 (SEQ ID NO:40)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，随后在35个循环中95℃持续30秒，58℃持续30秒，72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶切下，提取并克隆至pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_3，被用作模板，用于下一轮PCR扩增。

使用质粒_3、正向引物IoE7 (SEQ ID NO:41)和反向引物IoE8 (SEQ ID NO:42)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，随后在28个循环中95℃持续30秒，55℃持续30秒，72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶切下，提取并克隆至pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_4，被用作模板，用于下一轮PCR扩增。

使用质粒_4、正向引物IoE9 (SEQ ID NO:43)和反向引物IoE10 (SEQ ID NO:44)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，随后在33个循环中95℃持续30秒，53℃持续30秒，72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶切下，提取并克隆至pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_5，被用作模板，用于下一轮PCR扩增。

使用质粒_5、正向引物IoE11 (SEQ ID NO:45)和反向引物IoE12 (SEQ ID NO:46)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，随后在30个循环中95℃持续30秒，57℃持续30秒，72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶切下，提取并克隆至pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_6，被用作模板，用于下一轮PCR扩增。

使用质粒_6、正向引物IoE13 (SEQ ID NO:47)和反向引物IoE14 (SEQ ID NO:48)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，随后在32个循环中95℃持续30秒，51℃持续30秒，72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶切下，提取并克隆至pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_7，被用作模板，用于下一轮PCR扩增。

使用质粒_7、正向引物IoE15 (SEQ ID NO:49)和反向引物IoE16 (SEQ ID NO:50)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，随后在32个循环中95℃持续30秒，54℃持续30秒，72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶切下，提取并克隆至pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_8，被用作模板，用于下一轮PCR扩增。

使用质粒_8、正向引物IoE17 (SEQ ID NO:51)和反向引物IoE18 (SEQ ID NO:52)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，随后在32个循环中95℃持续30秒，52℃持续30秒，72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶切下，提取并克隆至pET24a质粒中。将连接混合物转化至大肠杆菌细胞的DH5α菌株中，并在含有氨苄青霉素的LB板上选择转化体。序列验证的克隆，质粒_9，在正确的阅读框中含有CRYA_1B (SEQ IDNO:25)。

重组多肽CRYA_1B的表达

将质粒_9转化至表达大肠杆菌菌株BL21中，并选择氨苄青霉素抗性菌落。CRYA_1B重组多肽的预期分子量为20kDa(图2)。选择来自补充有100 µg/ml氨苄青霉素的Luria-Betani(LB)-琼脂板的单个菌落。在该制备中，含有3 ml LB培养基(每L 10g胰蛋白胨、10g NaCl和5g酵母提取物)和100 µg/ml氨苄青霉素的50 ml锥形管用单个菌落接种，并在设定为37℃和200 RPM的振荡培养箱中生长过夜。通过将3 ml培养物添加入含有100 ml 2YT培养基(每L 16g胰蛋白胨、15g酵母提取物和8g NaCl)和100 µg/ml氨苄青霉素的无菌500 mlErlenmeyer烧瓶中进一步扩增培养物，并在设定为37℃和200 RPM的振荡培养箱中生长过夜。这产生种子培养物。

使用6L生物反应器来进一步扩增种子培养物。将4L含有100 µg/ml氨苄青霉素的2YT培养基用100 ml种子培养物接种，在设定为37℃和200 RPM的振荡培养箱中生长过夜。在生物反应器中，将培养物在37℃、气流和2 SLPM(每分钟标准衬管数)和200 RPM的搅拌下孵育。当OD600达到0.65至0.75时，用1.0 mM 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白过表达。使细胞生长7至8小时，并将搅拌速度、温度和空气流量分别设定为400 RPM、28℃和4 SLPM。为了控制发泡，根据需要添加聚乙二醇P-2000消泡剂。在诱导7至8小时后，通过在4℃下以8000 rpm离心15分钟来收获细胞。将细胞沉淀冷冻并保存在-80℃。

重组多肽CRYA_1B的纯化

在该制备中，将等于6g CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)的沉淀重悬浮于40 ml缓冲液A(50 mM Tris-HCl缓冲液)中，并通过在冰上声处理(28个循环的使用超声波细胞破碎仪Misonix Ultrasonic Liquid Processors S-4000, USA以30-s间隔、30%幅度进行10-s脉冲)来破坏，以获得总蛋白提取物，用于溶解度分析。在4℃下使用Sorvall RC5C Plus(USA)超速离心机使用SS-34型转子，将总蛋白提取物以14,000 rpm离心45 min。将上清液通过0.45 µm过滤器(Millipore)过滤，并加载至在相同缓冲液中平衡的Q-Sepharose阴离子交换柱上。将Q-Sepharose装入C 26/40柱(GE Healthcare)中至20 cm的床高。使用AKTAFPLC (GE Healthcare)以5 ml/min的流速将40mL体积的含有CRYA_1B重组多肽(SEQ IDNO:9)的上清液加载至柱上。通过使用含有50 mM Tris-HCl、NaCl缓冲液的平衡缓冲液通过浓度梯度洗脱CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)，并基于A280吸光度收集在单一峰中，用于进一步应用于疏水相互作用柱上。通过15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析收集的洗脱液。

疏水相互作用色谱

在离子交换色谱后，将洗脱的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)合并在一起，通过Amicon Ultra 15 ml离心过滤器(Merck)浓缩，且随后添加至饱和硫酸铵缓冲液(50 mMTris- HCl，3.8 M硫酸铵，1 mM DTT和1 mM EDTA)，导致1.2 M硫酸铵的最终浓度。具有添加的硫酸铵的浓缩产物使用0.45 µm针筒式过滤器(Millipore)过滤，并以2 ml/min的流速加载至疏水相互作用色谱柱(C 10/20柱, Ge Healthcare)。将Source 15PHE (GEHealthcare)装入C 10/20柱(GE Healthcare)中至10 cm的床高，并用缓冲液A (50 mMTris-HCl，1.2 M硫酸铵，10%甘油，1 mM DTT和1 mM EDTA)预平衡。该柱用缓冲液A洗涤，并用硫酸铵渐降和甘油渐增的线性梯度实现使用缓冲液B (50mM Tris-HCl，10%甘油，1 mMDTT和1 mM EDTA)洗脱蛋白。通过15% SDS-PAGE分析洗脱的蛋白。通过Amicon Ultra 15 ml离心过滤器(Merck)进一步浓缩级分。

使用凝胶过滤的缓冲液交换

通过使用Sephadex G-25柱将纯化的重组多肽进一步交换至PBS缓冲液中。将SephadexG-25装入C 26/100柱(GE Healthcare)中至85 cm的床高，并用PBS缓冲液以1 ml/min的流速进行预平衡。浓缩的蛋白在2.5小时后洗脱，并通过15% SDS-PAGE分析。然后通过AmiconUltra 15 ml离心过滤器(Merck)浓缩所得洗脱液。

实施例2：诱导或增强免疫应答的方法

用CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理癌细胞系，将CRYA_1B重组多肽稀释至各种浓度，并与人癌细胞系H441(肺癌，HTB-174，ATCC)、H460(肺癌，HTB-177，ATCC)、HCT15(结肠癌，CCL-225，ATCC)和MCF7(乳腺癌，HTB-22，ATCC)孵育，全部在37℃下。关于CRT、HSP70、HSP90和Caspase 3/7测定，H441的重组多肽孵育时间分别为60min、1h50min、1h40min和2h45min，H460的重组多肽孵育时间分别为30min、1h15min、1h5min和2h30min，HCT15的重组多肽孵育时间为55min、1h50min、1h30min和2h30min，且MCF7的重组多肽孵育时间分别为1h10min、1h40min、1h45min和2h45min。流式细胞术用于评价用CRYA_1B重组多肽处理的细胞和未处理的对照细胞中的钙网蛋白(CRT)(图3-6)、HSP70(图7-10)、HSP90(图11-14)和胱天蛋白酶3/7(图15-18)的细胞表面表达。这使用FACSCalibur (BD Biosciences)分别使用CRT mAb (Abcam)、HSP70 mAb (Enzo Life Sciences)、HSP90 mAb (Enzo Life Sciences)和胱天蛋白酶3/7 (Invitrogen assay)进行。