NO176923B

NO176923B - Fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris, isolert i serie ordnet linært DNA-fragment og lukket sirkelformet plasmid

Info

Publication number: NO176923B
Application number: NO864275A
Authority: NO
Inventors: James Michael Cregg
Original assignee: Res Corp Technologies Inc; Phillips Petroleum Co
Priority date: 1985-10-25
Filing date: 1986-10-24
Publication date: 1995-03-13
Also published as: ATE197962T1; PH25990A; AU6388286A; IL80286A0; JPS62104585A; DK510786D0; JP2614215B2; AU581107B2; HU208552B; NO864275L; ES2152233T3; DE3650749D1; EP0226752B1; IN166443B; KR930002738B1; NZ217809A; NO864275D0; EP0560401B1; PT83618B; FI98931B

Description

Oppfinnelsen angår rekombinant DNA-teknologi. En side ved oppfinnelsen angår fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris. En annen side ved oppfinnelsen angår isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment. Nok en side ved oppfinnelsen angår lukket sirkelformet plasmid.

Etter hvert som rekombinant DNA-teknologi har utviklet seg

i den senere tid, er den regulerte fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke forskjellige nyttige polypeptider blitt mulig. Mange eukaryotiske polypeptider, f.eks. menneskelig veksthormon, leukosyttinterferoner, menneskelig insulin og menneskelig proinsulin er allerede blitt fremstilt ved forskjellige mikroorganismer. Det ventes at den fortsatte anvendelse av teknikker som allerede beherskes, i fremtiden vil tillate fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke andre nyttige polypeptidprodukter.

Et grunnleggende element som ofte anvendes i rekombinant teknologi, er plasmidet, som er et ekstrakromosomalt, dobbelttrådet DNA som finnes i visse mikroorganismer. Der hvor plasmider

er funnet å eksistere naturlig i mikroorganismer, er de ofte funnet å opptre i flere kopier pr. celle. Foruten naturlig forekommende plasmider er en rekke kunstige plasmider eller hybride vektorer blitt fremstilt av mennesker. Dessverre er det ikke alltid mulig for vertscellen å opprettholde plasmidet.

I stedet går plasmidet tapt når organismen reproduseres og

føres gjennom flere generasjoner vekst. Metoder for den stabile innføring av fremmed DNA i egnede vertsorganismer er derfor av stor interesse og potensielt av stor verdi.

Inntil nå har industrielle anstrengelser med hensyn til anvendelse av rekombinant DNA-teknologi for fremstilling av forskjellige polypeptider konsentrert seg om Escherichia coli som en vertsorganisme. I visse situasjoner kan imidlertid E. coli vise seg å være uegnet som vert. For eksempel inneholder E. coli en rekke giftige pyrogene faktorer som må elimineres

fra et hvilket som helst polypeptid som er nyttig som et

farmasøytisk produkt. Virkningsfullheten med hvilken denne rensing kan oppnås, vil selvsagt variere med det spesielle polypeptid. Dessuten kan de proteolytiske aktiviteter av E. coli i alvorlig grad begrense utbyttene av visse nyttige produkter. Videre har en rekke heterologe genprodukter som er blitt produsert i E. coli, vist seg å bli produsert i uoppløselig form. Disse og andre betraktninger har ført til øket interesse for alternative verter. Særlig er bruken av eukaryotiske organismer for produksjonen av polypeptidprodukter tiltrekkende.

Tilgjengeligheten av midler til fremstillingen av polypeptidprodukter i eukaryotiske systemer, f.eks. gjær, kan by på betydelige fordeler sammenlignet med bruken av prokaryotiske systemer såsom E. coli for fremstillingen av polypeptider som er kodet for ved rekombinant DNA. Gjær er blitt anvendt i fermenteringer i stor skala i århundrer sammenlignet med den relativt nye bruk av E. coli-fermenteringer i stor skala. Gjær kan generelt dyrkes til høyere celletettheter enn bakterier og kan lett tilpasses kontinuerlig fermenteringsbehandling. Dyrkingen av gjær såsom Pichia pastoris til ultrahøye celletettheter, dvs. celletettheter høyere enn 100 g/l, er angitt av Wegner i US-PS 4 414 329. Ytterligere fordeler med gjærverter innbefatter det faktum at mange kritiske funksjoner av organismen, f.eks. oksidativ fosforylering, er anordnet inne i organeller og derfor ikke utsatt for mulige skadelige virkninger forårsaket av organismens produksjon av polypeptider som er fremmede for vertsceller av den ville type. Som en eukaryotisk organisme kan gjær vise seg å være i stand til å glyko-sylere uttrykte polypeptidprodukter, noe som kan vise seg å være av betydning der hvor slik glykosylering er viktig for bioaktiviteten av polypeptidproduktet. Det er også mulig at som en eukaryotisk organisme vil gjæren oppvise de samme kodonpreferanser som høyere organismer og være tilbøyelig til mer effektiv produksjon av ekspresjonsprodukter fra patte-dyrgener eller fra komplementært DNA (cDNA) som fås ved revers-transkripsjon fra f.eks. pattedyr-mRNA.

Utviklingen av dårlig karakteriserte gjærarter som vert/vektor-systemer er i høy grad hindret av mangelen på kunnskap om transformasjonsbetingelser og egnede metoder til stabil in-troduksjon av fremmed DNA i vertscellen. Dessuten er auxotrofe mutasjoner ofte ikke tilgjengelige, hvilket utelukker en direkte utvelgelse for transformanter ved auxotrof komple-menter ing. Dersom rekombinant DNA-teknologi fullt ut skal oppfylle hva den lover, må nye vert/vektor-systemer konstrueres som letter manipuleringen av DNA samt optimaliserer ekspresjonen av innsatte DNA-sekvenser, slik at de ønskede polypeptidprodukter kan fremstilles under regulerte betingelser og med høy utbytte.

En hensikt med oppfinnelsen er derfor en fremgangsmåte til innsetting av DNA i genomet av gjær ved på forhånd utvalgte steder i gjærgenomet.

En annen hensikt med oppfinnelsen er en fremgangsmåte til fremstilling av stabile auxotrofe mutanter av gjær som stort sett ikke kan gjennomgå reversjon.

Nok en hensikt med oppfinnelsen er stabile auxotrofe mutanter som stort sett ikke kan gjennomgå reversjon.

Nok en hensikt med oppfinnelsen er nye DNA-sekvenser som er nyttige for transformasjonen av gjær.

En videre hensikt med oppfinnelsen er produksjonen av alkoholoksidase minus mutant vert for den forbedrede produksjon av heterologe proteiner ved gjær.

Disse og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå fra beskrivelsen og de tilhørende krav.

I henhold til oppfinnelsen er der utviklet en ny fremgangsmåte for den sete-rettede modifikasjon av genomet av gjær av slekten Pichia. Ved transformasjon av gjær med et lineært DNA-fragment som omfatter ved hver ende insettbare DNA-sekvenser, dvs. sekvenser med homologi for vertsgenomet, som hver er på minst 200 nukleotider i lengde, og minst ett ytterligere DNA-fragment, f.eks. et selekterbart markeringsgen derimellom, blir markeringsgenet og de flankerende innsettbare DNA-sekvenser tatt opp av verten med stor hyppighet. Som et resultat av transformasjonen med dette lineære DNA produseres modifiserte gjærstammer hvor DNA-sekvensen på integrasjonssetet er blitt avbrutt og/eller slettet, og det selekterbare markeringsgen såvel som eventuelt annet DNA innlemmet som en del av det transformerende lineære DNA-fragment, er blitt innlemmet i vertsgjærens genom.

Fremmed DNA innsatt i vertsgjærens genom på den ovenfor be-skrevne måte holdes stabilt gjennom mange generasjoners vekst av verten. Praksisen ifølge den foreliggende oppfinnelse elimi-nerer derved problemet med tap av fremmed DNA på grunn av plasmid-instabilitet når fremmed DNA isteden skaffes som en del av et autonomt-replikerende ekstrakromosomalt fragment eller når fremmed DNA isteden integreres inn i genomet som del av et sirkelformet DNA-molekyl. Slike integrasjoner av sirkelformet DNA-molekyl resulterer i innsettingen av fremmede DNA-sekvenser flankert ved en direkte gjentagelse av verts-genomiske sekvenser inn i vertsgenomet. Da slike direkte repeterende sekvenser er substrater for videre rekombinasjon,

er fremmed DNA som er innsatt mellom de direkte repeterende sekvenser ustabilt.

Den sete-rettede genomiske modifisering ifølge den foreliggende oppfinnelse gjør det mulig å produsere mutanter som mangler alle eller utvalgte partier av spesielle gener. Ved eliminering av betydelige partier av genet hvor en mutasjon ønskes, blir sannsynligheten for reversering av mutasjonen stort sett elimi-nert. De resulterende mutantstammer fremstilt i henhold til oppfinnelsen er således meget stabile mutanter.

Den sete-rettede genomiske modifisering ifølge oppfinnelsen sammen med de in vitro rekombinant DNA-teknikker som er kjent av fagfolk, muliggjør også en rekke forskjellige presise verts-genomiske modifikasjoner, f.eks. tilføyelsen av ett eller flere heterologe gener til vertsgenomet, forandringen av regulerende sekvenser som styrer ekspresjonen av et nativt gen, utskiftningen av et nativt gen med et gen av ikke-nativ opprinnelse og lignende.

Det er overraskende funnet at den metanolinduserte ekspresjon av heterologe gener i Pichia forøkes drastisk ved at der som vert for genekspresjonen anvendes en stamme av Pichia hvor det primære alkoholoksidase-gen av Pichia er blitt avbrutt.

Det er videre funnet at. stammer av organismen Pichia pastoris er et andre alkoholoksidase-gen som tillater en vertsstamme hvor det primære alkoholoksidase-gen er blitt avbrutt å bibe-holde evnen til å vokse på metanol, skjønt med en redusert hastighet i forhold til nativt Pichia pastoris.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 er et restriksjonskart av plasmid pYMI1.

Fig. 2 viser innsettingen av et parti av plasmid pYMIl i

HIS4-locuset av Pichia-kromosomet.

Fig. 3 er et restriksjonskart av plasmid pYJ8.

Fig. 4 er et restriksjonskart av plasmid pYMI3a.

Fig. 5 viser innsettingen av et parti av plasmid pYMl3a i

HIS4-locuset av Pichia-kromosomet.

Fig. 6 er et restriksjonskart av plasmid pBPGl-1.

Fig. 7 er et restriksjonskart av plasmid pYMI7.

Fig. 8 viser innsettingen av et parti av plasmid pYMI7 i

alkoholoksidase-locuset av Pichia-kromosomet.

Fig. 9 viser konstruksjonen av plasmid pYM39 fra plasmider

pSA0H5 og pTHBS3.

Fig. 10 viser konstruksjonen av plasmid pYMl6 fra plasmider

pYM39 og pPG3.2.

Fig. 11 viser konstruksjonen av plasmid pBSAGI5I fra plasmid

pYMI6 og pBSAG5I.

Fig. 12 er et restriksjonskart som viser større detaljer av

plasmid pBSAGI5I enn det som er angitt på fig. 11.

Fig. 13 viser innsetinngen av et parti av plasmid pBSAGI5I

i alkoholoksidase-locuset av Pichia-kromosomet.

Fig. 14 er et restriksjonskart av plasmid pYMI12a.

Fig. 15 viser innsettingen av et parti av plasmid pYMI12a

i locuset av det andre Pichia-alkoholoksidase-gen (A0X2). Fig. 16 er et restriksjonskart av Pichia-innføyelsene i de pBR322-baserte plasmider pPG4.0 og pPG3.0. Innføyelsen vist på fig. 16a er fra locuset av det første Pichia-alkoholoksidase-gen (A0X1), mens innføyelsen vist på fig. 16b er fra locuset av det andre Pichia-alkoholoksidase-gen (A0X2). Fig. 16c viser det kjente alkoholoksidase (AOX) kodende parti av A0X1-genlocuset (med henvisning til fig. 16a).

Fig. 17 er et restriksjonskart av plasmid pYM25.

Fig. 18 er et restriksjonskart av plasmid pT76H3.

De følgende forkortelser er brukt i beskrivelsen for å repre-sentere de anvendte restriksjonsenzymer:

På de ledsagende figurer er restriksjonsseter som er anvendt for manipuleringen av DNA-fragmenter, men som ødelegges ved ligatisering, angitt ved at forkortelsen for det ødelagte sete er innesluttet i parenteser.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet en fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris på et på forhånd bestemt genomisk sete. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den omfatter å transformere en vertstamme av Pichia pastoris med et serieordnet lineært DNA-fragment som omfatter et første innsettbart DNA-fragment, et selekterbart markørgen, og et andre innsettbart DNA-fragment; idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver tilnærmet 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native Pichia pastoris genomiske sete hvor genomisk modifikasjon skal skje; idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hverandre i nevnte lineære DNA-fragment slik de er orientert i Pichia pastoris-genomet og hvor nevnte markørgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og hvor nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter blir valgt fra gruppen som består av fragmenter av; alkoholoksidase-genene, og histidinolhehydrogenasegenet; og eventuelt at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et hetereologt gen, hvori nevnte hetereologe gen, såvel som nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment; eller eventuelt at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et reguleringsområde, og et hetereologt gen, hvor nevnte hetereologe gen er under kontroll av reguleringsområdet, og hvor reguleringsområdet hetereologe gen - konstruksjonen, i tillegg til nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment .

Det er foretrukket at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er fragmenter av alkoholoksidasegenet, spesielt AOX 1-genet og AOX 2-genet, og histidinoldehydrogenasegenet.

Videre i henhold til oppfinnelsen er der skaffet et isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som omfatter et første innsettbart DNA-fragment, et selekterbart markørgen og et andre innsettbart DNA-fragment, idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA i Pichia pastoris, idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er anordnet med hensyn på hverandre i det lineære DNA-fragment slik som de er anordnet i Pichia pastoris-genomet, hvor nevnte markørgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og hvor nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er selektert fra gruppen som består av fragmenter av; alkoholoksidasegenene, og histidinoldehydrogenasegenet; og eventuelt ett av følgende alternativer;

(a) at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et hetereologt gen, hvor nevnte hetereologe gen, såvel som nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment, (b) at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et reguleringsområde, og et hetereologt gen, idet nevnte hetereologe gen er under kontroll av reguleringsområdet og hvor reguleringsområdet hetereologe genkonstruksjon, i tillegg til nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment, (c) at nevnte DNA-fragment ytterligere omfatter bakteriell plasmid DNA.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter bør hver være på minst 200 nukleotider i lengde, idet lengder generelt i området fra 20 0 inntil 5 000 nukleotider vanligvis anvendes. Fortrinns-vis, for enkel manipulering og håndtering anvendes fragmenter i området 500-2000 nukleotider.

Nukleotidsekvenser som er nyttige som de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er nukleotidsekvenser som er homo-

loge med separate partier av det native Pichia genomiske sete hvor genomisk modifisering skal finne sted. Således, dersom f.eks. genomisk modifisering skal finne sted ved locuset av alkoholoksidase-genet, vil de første og andre innsettbare DNA-fragmenter som anvendes, være sekvenser som er homologe med separate partier av alkoholoksidase-genlocuset. For at genomisk modifikasjon i henhold til den foreliggende oppfinnelse skal finne sted, må de to innsettbare DNA-fragmenter være orientert med hensyn til hverandre i det lineære fragment med den samme relative orientering som de har i Pichia-genomet.

De tre minimumskomponenter av det transformerende DNA som anvendes ved utførelse av oppfinnelsen, er ordnet i serie for å danne et lineært DNA-fragment hvor det selekterbare markeringsgen er anordnet mellom det første innsettbare fragment og det andre innsettbare fragment. Eksempler på selekterbare markeringsgener innbefatter ARG4-genet fra Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae, HIS4-genet fra Pichia pastoris og S.cerevivisiae, G418-fosfotransferase-genet fra det E. coli overførbare element Tn601 og lignende. Fagfolk vil også innse at en rekke egnede flankeringssekvenser, dvs. de første og andre innsettbare DNA-fragmenter, kan avledes fra gener som er blitt isolert fra Pichia pastoris-genomet. Eksempler på gener innbefatter alkoholoksidase-genene (A0X1 og A0X2, Pichia har to alkoholoksidase-gener), dihydroksyacetonsyntase-genet (DAS), argininosuccinatlyase-genet (ARG4), histidinoldehydrogenasegenet (HIS4) og lignende.

De transformerende lineære DNA-fragmenter kan innbefatte en rekke andre DNA-sekvenser som f.eks. heterologe gener, dvs.

et hvilket som helst gen eller parti av et gen som ikke normalt finnes på det locus av genomet hvor innsetting i vertscellen skal finne sted, hvilken ekspresjon ønskes i P. pastoris. Generelt betyr uttrykket heterologt et DNA som ikke er nativt for verts-Pichia-cellen. Det heterologe gen kan eventuelt

kombineres med et reguleringsområde som uavhengig styrer produksjonen av det heterologe genprodukt, eller det heterologe gen kan uttrykkes i den transformerte celle under påvirkning av det native reguleringsområde av genet som er blitt avbrutt

i transformasjonsprosessen.

Dessuten kan det transformerende lineære DNA-fragment som anvendes ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse, også innbefatte bakterielt plasmid DNA, som f.eks. pBR322- eller pBR325-sekvenser. Slike bakteriesekvenser er nyttige for in vitro-manipuleringen og produksjonen ved forstørrelse i E. coli av disse DNA-sekvenser.

En spesiell nyttig form for det transformerende lineære DNA er et lukket sirkelformet plasmid som omfatter det lineære DNA-parti som angitt om den isolerte i serie ordnede lineære DNA-fragment, og bakteriell plasmid DNA hvor nevnte bakterielle plasmid DNA er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment.

Det nevnte plasmid er pSA0H5 (NRRL B-15862), pYMl2a, vist i fig. 4, og pYMI7, vist i fig. 7.

I en foretrukket utførelsesform blir det lukkede sirkelformede plasmid konstruert bestående av to partier, "transformasjons"-partiet og "bakterie"-partiet. Transformasjonspartiet omfatter, i rekkefølge anordnet, det første innsettbare DNA-fragment,

det selekterbare markeringsgen og det andre innsettbare DNA-fragment, idet de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hverandre på samme måte som de eksisterer i Pichia-genomet, og det selekterbare markeringsgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment. Det bakterielle parti er da anordnet slik at det forbinder det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og derved danner en lukket, sirkelformet vektor.

Den lukkede, sirkelformede vektor fremstilt som beskrevet

i avsnittet ovenfor, kan anvendes til å produsere store mengder plasmid i E. coli, hvilket plasmid deretter isoleres og diges-teres med egnede restriksjonsenzymer for å kløyve transformasjonspartiet fra bakteriepartiet. Det lineære transforma-sjonsparti av gjær-DNA kan deretter anvendes til å transformere stammer av slekten Pichia for å utføre den ønskede genomiske modifikasjon.

Det vil selvsagt være åpenbart for fagfolk at "transformasjons"-partiet av det lukkede, sirkulære plasmid som er beskrevet ovenfor, kan inneholde ytterligere DNA-sekvenser. For eksempel kan de bakteriesekvenser som anvendes in vitro for manipulering og produksjon av DNA ved forstørrelse i E. coli, være en del av det transformerende DNA, dvs. bakterisekvensene kan på

samme måte som sekvensene for de selekterbare markeringsgen-sekvenser også være anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre DNA-fragment. Når en slik konfigura-sjon av DNA komponenter anvendes, vil bakteriesekvensene også bli innlemmet i genomet av vertsgjæren som underkastes fremgangsmåten for genomisk modifikasjon ifølge oppfinnelsen.

Transformasjonen av Pichia pastoris er tidligere blitt beskrevet i den samtidig innleverte søknad nr. 666 5 79 til Stroman et al., overdratt til Phillips Petroleum Company. De eksperi-mentelle fremgangsmåter som anvendes for transformasjonen av Pichia pastoris, er vist i større detalj nedenunder (se eksempel I). Gjærstammer av slekten Pichia kan transformeres ved enzymatisk digestion av celleveggene for å gi sfæroplaster. Sfæroplastene blir deretter blandet med det transformerende

DNA og inkubert i nærvær av kalsiumioner og polyetenglykol, deretter regenerert i selektivt vekstmedium. Det transformerende DNA innbefatter et selekterbart markeringsgen som tillater seleksjon av celler som har tatt opp transformerende DNA,

da bare transformerte celler kan overleve og vokse under de selektive dyrkingsbetingelser som anvendes (de selektive dyrkingsbetingelser er en funksjon av det selektive markeringsgen som anvendes som en del av det transformerende DNA).

Når stammer av Pichia hvor det primære alkoholoksidase-gen (A0X1) ble avbrutt, ble anvendt som verter for ekspresjonen av heterologe gener, ble det overraskende observert at ekspresjonsnivået av de heterologe genprodukter, når de var under styring av visse promotorer (f.eks. A0X1- eller DAS-promotorer), gjennomgikk en mangedobling i forhold til det ekspresjonsnivå som ble oppnådd når en fullt ut alkoholoksidase-kompetent vert ble anvendt. Som et resultat av denne observasjon og ytterligere utforskning av dette fenomen, er det blitt fastslått at en generell metode til å øke ekspresjonsnivået i vertsorganismer av heterologe gener eksisterer, hvilken omfatter dyrking av vertsstammen under ernæringsmessig begrensende betingelser på et substrat for hvilket der eksisterer et område med en sterk promotor som reagerer på substratet, idet det heterologe gen er under regulerende styring av denne sterke, på substrat reagerende promotor.

De "ernæringsmessig begrensende betingelser" som kreves for

den økte genekspresjon ifølge oppfinnelsen, kan skaffes enten ved at cellene mates med begrensende mengder av et nærings-middel eller ved anvendelse av en mutant vert, hvilken, som et resultat av mutasjonen, er ernæringsmessig begrenset under visse vekstbetingelser. Således, f.eks. når det er ønskelig å øke nivået av ekspresjon av heterologe gener som holdes under styring av de sterke alkoholoksidase- eller dihydroksyacetonsyntase-promotorer, som begge reagerer på nærværet av metanol i dyrkingsmediet, vil enten bruken av en vert som er delvis defekt med hensyn til sin evne til å benytte metanol, eller bruken av metanolbegrensede vekstbetingelser sammen med en fullt ut alkoholoksidase-kompetent vert, skaffe de ønskede ernæringsmessig begrensende betingelser slik at forbedret genekspresjon vil oppnås.

Det antas at fremgangsmåten til forbedring av ekspresjonen

av heterologe genprodukter som her er beskrevet, er en generell metode som er nyttig i en hvilken som helst organisme for hvilken promotorer som reagerer på ernæringsmessige begrens-

ninger, eksisterer. Således, ved plassering av et heterologt gen under styring av et slikt promotorområde og deretter dyrking av vertsorganismen under betingelser med ernæringsmessige begrensninger med hensyn til det eller de næringsmidler som bevirker at den sterke promotor blir skrudd på, bør øket genekspresjon finne sted. De for tiden foretrukne metoder til å skaffe ernæringsmessig begrensede vekstbetingelser, er å anvende en mutant vertsorganisme som er delvis defekt i evnen til å metabolisere næringsmidlene, hvilket bevirker at visse promotorer uttrykkes ved meget høyere nivåer enn i den ikke-mutante vert. I Pichia er dette blitt vist som beskrevet i nærmere detalj i eksempel V.

Når en stamme av Pichia pastoris hvor det primære alkoholoksidase-gen ble avbrutt ved fremgangsmåten for genomisk modifikasjon ifølge oppfinnelsen, ble dyrket med metanol som karbonkilde, ble det overraskende funnet at slike stammer som er defekte i det primære alkoholokside-gen, fortsatt var i stand til å vokse på metanol, skjønt med en redusert hastighet i forhold til Pichia-celler av vill type. Denne observasjon antydet det mulige nærvær av et andre alkoholoksidase-gen i metanol som anvender stammer av Pichia.

Sortering av et arkiv av Pichia kromosomalt DNA har ført til isoleringen av et 3 kbp fragment som synes å kode for et parti av et andre alkoholoksidase-gen (A0X2). Dette fragment er blitt deponert som en innføyelse i pBR322 (ved det unike BamHI-sete). Plasmidet er betegnet som pPG3.0, og det bæres av E. coli-verten LE392. Denne stamme er deponert hos the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois for å sikre offentlig adgang ved utstedelse av den foreliggende søknad som et patent og er blitt gitt aksesjonsnr. NRRL B-18022.

Et restriksjonskart av pPG3.0 er angitt på fig. 16b, hvor det sammenlignes med et genomisk fragment av det primære alkoholoksidase-gen pPG4.0. Det sistnevnte fragment er tidligere blitt angitt og beskrevet i detalj i søkernes samtidig innleverte søknad nr. 666 391 til Stroman et al., overdratt til Philips Petroleum Company. En sammenligning mellom de to alkoholoksidase-gener (se fig. 16) gjør det klart at de to fragmenter er ikke bare overlappende partier av det samme genomiske locus. Der er helt klart en viss homologi mellom de to fragmenter, slik man kan se ved tilstedeværelsen av flere felles restriksjonsseter på de to fragmenter. Restriksjonssetene som er felles for de to gener, A0X1 og A0X2, er angitt på

fig. 16 ved stjerner. Tilstedeværelsen av flere restriksjonsseter på hvert fragment som ikke foreligger på det andre, indikerer imidlertid at der er flere forskjeller mellom frag-mentene på nukleotidnivået.

Oppfinnelsen skal nå beskrives i nærmere detalj under henvisning til de følgende eksempler.

EKSEMPLER

Buffrene og oppløsningene anvendt i de følgende eksempler har de nedenfor angitte sammensetninger:

De følgende forkortelser er brukt i eksemplene med den følgende betydning:

EKSEMPEL I

Pichia pastoris transformasjonsfremgangsmåte

A. Celledyrking

1. Pod en koloni av Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) inn i ca. 10 ml YPD-medium og rist kulturen ved 30°C i 12-

20 timer.

2. Etter 12-20 timer, fortynn cellene til en OD6UU

på 0,01-0,1 og hold cellene i logaritmisk vekstfase i YPD-medium ved 30°C i 6-8 timer. 3. Etter 6-8 timer, pod 100 ml YPD-medium med 0,5 ml av startkulturen ved en OD^qq på ca. 0,1 (eller ekvivalent mengde). Rist ved 30°C i 12-20 timer. 4. Høst kulturen når "ODg00 er 0,2-0,3 (etter 16-20 timer) ved sentrifugering ved 1500 g i 5 min.

B. Fremstilling av sfæroplaster

1. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt vann (alle sentrifu-geringer for trinn 1-5 er ved 1500 g i 5 min.).

2. Vask cellene en gang i 10 ml nylig fremstilt SED.

3. Vask cellene to ganger i 10 ml steril 1 M sorbitol.

4. Resuspender cellene i 10 ml SCE-buffer.

5. Tilsett 5-10 ul av 4 mg/ml Zymolase 60.000 (Miles Laboratories). Inkuber cellene ved 30°C i 30-60 min.

Da fremstillingen av sfæroplaster er et kritisk trinn i trans-formasjonsfremgangsmåten, bør dannelsen av sfæroplaster over-våkes som følger: Tilsett 100 ul porsjoner av celler til 900 yl av 5% SDS og 900 yl av 1 M sorbitol før eller like etter tilsetningen av zymolase og ved forskjellige tidspunkter under inkubasjonsperioden. Stopp inkubasjonen ved det punkt hvor cellene lyserer i SDS, men ikke i sorbitol (vanligvis mellom 30 og 60 minutters inkubasjon). 6. Vask sfæroplastene to ganger i 10 ml steril M sorbitol ved sentrifugering ved 1.000 g i 5-10 min (tiden og hastigheten for sentrifugeringen kan variere; sentrifuger tilstrekkelig til å pelletere sfæroplastene, men ikke så mye at de brytes opp ved kraften).

7. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt CaS.

8. Resuspender cellene i en samlet mengde på 0,6 ml CaS.

C. Transformasjon

1. Tilsett DNA-prøver (inntil 20 yl volum) til 12 x 75 mm sterile polypropenrør (DNA bør foreligge i vann eller TE-buffer; for maksimale transformasjonshypppigheter med små mengder DNA er det tilrådelig å tilsette ca. 1 yl av 5 mg/ml lydbehandlet (sonicated) E. coli-DNA til hver prøve). 2. Tilsett 10 yl sfæroplaster til hver DNA-prøve, og inkuber ved værelsetemperatur i ca. 20 min. 3. Tilsett 1 ml PEG-oppløsning til hver prøve, og inkuber ved værelsetemperatur i ca. 15 min. 4. Sentrifuger prøvene ved 1.000 g i 5-10 min, og dekanter PEG-oppløsningen. 5. Resuspender prøvene i 150 yl SOS og inkuber i 30 min ved værelsetemperatur. 6. Tilsett 850 yl steril 1 M sorbitol og dann plater av porsjoner av prøver som beskrevet nedenunder.

D. Regenerering av sfæroplaster

1. Oppskrift for regenereringsagarmedium:

a. Agar-KCl: 9 g Bacto-agar, 13,4 g KC1, 240 ml H20, autoklav. b. 10X glukose: 20 dekstrose, 100 ml H20, autoklav. c. 10X SC: 6,75 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, 100 ml P^O, autoklav (tilsett en hvilken som helst ønsket aminosyre eller nukleinsyre inntil en konsentrasjon på 200 yg/ml før eller etter autoklaving). d. Tilsett 30 ml 10X glukose og 30 ml 10X SC til 240 ml av den smeltede agar/KCl-oppløsning. Tilsett 0,6 ml av 0,2 mg/ml biotin og en hvilken som helst annen ønskelig aminosyre eller nukleinsyre til en konsentrasjon på 20 ug/ml. Hold smeltet regenereringsagar på 55-60°C.

2. Plating av transformasjonsprøver:

Hell bunnagarlag på 10 ml regenereringsagar pr. plate minst

30 min før transformasjonsprøvene er klare. Fordel 10 ml porsjoner av regenereringsagar på rør i et bad på 45-50°C i løpet av den periode som transformasjonsprøvene er i SOS. Tilsett porsjoner av transformasjonsprøver beskrevet ovenfor til rør med regenereringsagar og hell oppå bunnagarlaget av platene. 3. Bestemmelse av kvaliteten av sfaeroplastfremstilling: Fjern 10 yl av en prøve og fortynn 100 ganger ved tilsetning til 990 yl av 1 M sorbitol. Fjern 10 yl av oppløsningen som er fortynnet 100 ganger, og fortynn ytterligere 100 ganger ved tilsetning til en andre 990 yl porsjon av 1 M sorbitol. Stryk ut på agarplater 100 pl av begge fortynninger inneholdende YPD-medium for å bestemme konsentrasjonen av ikke-sfæroplast-dannede hele celler som er tilbake i preparatet. Tilsett 100 yl av hver fortynning til 10 ml regenereringsagar supplert med 40 yg/ml histidin for å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster. Gode verdier for et transformasjonseksperiment er 1-3 x 10 samlede regenererbare sfæroplaster/ml og ca. 1x10 3 hele celler/ml.

4. Inkuber platene ved 30°C i 3-5 dager.

EKSEMPEL II

Sete- spesifikk innsetting av Saccharomyces ARG4- genet og pBR322 og sletting av Pichia HIS4 i GS190 ( NRRL Y- 18014)

Fig. 1 viser plasmid pYMI1, og fig. 2 viser et diagram av hendelser som fører til plasmidets sete-rettede innsetting i P. pastoris-genomet. Vektoren er konstruert for å sette inn Saccharomyces ARG4-genet og DNA-sekvenser fra pBR322 i Pichia HIS4-locuset, samtidig med sletting av hele HIS4-genlocuset fra Pichia-genomet. Andre sekvenser såsom ekspresjons-kasetter, kan med letthet innsettes i pYMI1 og deretter på samme måte innlemmes i P_;_ pastoris-genomet.

Plasmid pYMI1 er sammensatt av et EcoRI- BamHI-fragment som

er anordnet in situ ved 5'-enden av Pichia HlS4-genet, og et EcoRI- Clal-fragment som er anordnet 3' i forhold til Pichia HIS4-genet. Begge HIS4-gen-flankerende fragmenter kan fås

fra plasmid pYJ8 (tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center av De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois som NRRL B-15889, se fig.

3), og er ca. 400 bp lange og føyet sammen ved dere EcoRI-ender i pYMI1. Som en selekterbar markør inneholder pYMI1-vektoren et HindIII-SalI-fragment på 2,6 kbp fra pYM25 (tilgjengelig i en E. coli-vert som NRRL B-18015, se fig. 17)

som koder for Saccharomyces argininosuccinatlyase (ARG4-gen-produktet). Når det skjæres med EcoRI blir pYMI1 lineært med de HIS4-gen-flankerende fragmenter ved sine ender.

P. pastoris arg4-stammen, GS190 (NRRL Y-18014) ble transformert med EcoRI-skåret pYMI1 til argininprototrofi (ARg<+>). Regene-reringsagarmediet ble supplert med 40 ug/ml histidin for å unngå å utøve seleksjonstrykk mot transformantene som krevde histidin som et resultat av sletting av HIS4-genet.

Arg<+->transformantene ble deretter sortert for dem som var blitt His" som et resultat av slettingen av HIS4-genet. For å sortere for His~-transformanter ble regenereringsagaren med de innleirede Arg<+->kolonier overført til et sterilt 50 ml<1>s rør som inneholdt 25 ml sterilt vann. Agaren ble deretter pulverisert ved blanding ved et homogeniseringsapparat av typen Brinkman Instruments Polytron ved en innstilling på 5 i ca. 1 min. Gjærcellene ble separert fra agaren ved filtrer-ing gjennom tre lag av sterilt gasbind (gauze). En porsjon

av gjærcellene ble deretter lydbehandlet, fortynnet og spredt på SD-mediumagarplater supplert med 40 ug/ml histidin.

For lydbehandling ble prøver av celler fortynnet til A5qq=(^'1 og lydbehandlet i 10 s med en Sonifier Cell Disrupter 350

(Branson Sonic Power Co.) ved en styrkeinnstilling på 4, en behandling som er tilstrekkelig til å separere celler, men ikke til å redusere cellenes levedyktighet. Etter 2-3 dager ble kolonier som vokste på agarplatene av SD pluss histidin, platet i replikat på sett av SD-plater, en med og en uten histidin.

Proporsjonen av Arg<+> His -kolonier var i gjennomsnitt 0,7%

av de samlede Arg<+->transformanter. Genomisk DNA fra tre Arg<+ >His -stammer ble undersøkt ved Southern blot hybridisering. Hele His4-genet var fraværende i alle tre og det lineære plasmid ble innsatt som vist nederst på fig. 2.

Foruten det faktum at GS190-pYMI1-stammen krever histidin

og ikke lenger krever arginin for vekst, ble ingen andre for-andringer i ernæringsmessige behov eller veksthastigheter observert.

EKSEMPEL III

Sletting av HIS4- genet fra P. pastoris NRRL Y- 11430

Fig. 4 viser plasmid pYMI3a, og fig. 5 angir de hendelser som fører til den lineære innsetting av et fragment fra plasmidet inn i HIS4-locuset av P^ pastoris-stammen NRRL Y-11430. Vektoren inneholder G418 motstandsgenet (G418<R>) fra pBPG1-1 (tilgjengelig fra De forente staters landsbruksdeparte-ment, Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois i en E. coli-vert som stamme NRRL B-18020; se fig. 6) som en selekterbar markør. G418 -genet ble fjernet fra pBPG1-1

på et ca. 2,2 kbp BamHI (pBR322-sete)/ Bglll (PARS 1-sete)-fragment og innsatt i Bglll-setet av pYJ8 (NRRL B-15889; se fig. 3), hvilket erstattet 2,7 kbp BglII-fragmentet som inneholder Pichia HIS4-genet.

Vektoren pYM13a ble digestert med EcoRI for å produsere et

2,9 kbp-fragment som inneholdt G418 -genet flankert av ca.

450 og 250 bp av DNA fra området anordnet henholdsvis 5' og

3' i forhold til HIS4-genet. Det EcoRI-skårne plasmid ble transformert inn i P. pastoris-verten.

Transformantene ble valgt ved deres evne til å vokse i nærvær av 300 ug/ml av antibiotikaet G418. For G418-seleksjonen ble regenereringsmediumagaren modifisert fra den som er beskrevet i eksempel I, avsnitt D som følger:

1. Oppskrift for regenereringsagarmedium:

a. Agar-sorbitol: 9 g bacto-agar, 54,6 g sorbitol,

240 ml H20, autoklav.

b. 10x glukose: 20 g dekstrose, 100 ml H20, autoklav. c. 10x YP: 10 g gjærekstrakt, 20 g pepton, 100 ml H20, autoklav. d. Tilsett 30 ml 10x glukose og 30 ml 10x YP til 240 ml smeltet agar-sorbitol-oppløsning. Hold den smeltede regenereringsmediumagar på 55-60°C.

2. Plating av transformanter. Prøve:

Minst 30 min før transformasjonsprøver var klare ble der helt 10 ml/plate bunnagarlag av regenereringsmediumagar supplert med 600 yg/ml G418. I løpet av perioden var transformasjons-prøvene i SOS, 10 ml porsjoner av regenereringsmediumagar (uten G418) ble fordelt til rør i et bad på 45-50°C. Når trans-formasjonsprøvene var ferdige, ble porsjoner av prøvene satt til rørene med regenereringsagar og helt oppå bunnagarlaget på 10 ml inneholdende G418. Plater ble inkubert ved 30°C i 3-5 dager.

Etter at kolonier hadde dannet seg på regenereringsagarplatene med G418, ble cellene sortert for deres evne til å vokse uten histidin. Celler ble ekstrahert fra regenereringsagaren, lydbehandlet og spredt på SD-mediumagarplater supplert med 40 yg/ml histidin som beskrevet i eksempel II. Etter 2-3 dagers inkubasjon ved 30°C ble koloniene platet pånytt (replica plated)

på SD-mediumagarplater med og uten histidin.

Ca. 0,1% av G418<R->koloniene var His- (2 ut av ca. 2 000 sortert). Southern blot hybridiserings-eksperimenter viste at HIS4-genet var slettet fra genomene av begge His~-stammer

og at begge genomer inneholdt G418 R -genet som vist på o fig.

5. En av disse His~-stammer som er gitt laboratoriebetegnelsen KM31 (tilgjengelig fra De forente staters landbruksdepartement, Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois som NRRL Y-18018), er med hell blitt transformert med flere HIS4-holdige Pichia-baserte plasmider som f.eks. pSA0H5 (tilgjengelig i

en E. coli-vert som NRRL B-15862), hvilket gir ytterligere bevis på at KM31 er spesielt en HIS4-genslettende organisme.

Dette er første gang at "vill type" P^ pastoris NRRL Y-11430

er blitt transformert direkte (dvs. uten først å isolere og karakterisere et auxotroft derivat). En mulig fordel ved disse HlS4-mutantstammer er at fordi de ble konstruert ved den sete-spesifikke innsetting/slettings-metode, er de frie for sekundære mutasjoner som sannsynligvis eksisterer i Pichia auxotrofe verter som produseres, f.eks., ved kjemisk mutagenese, som f.eks. GS115 (NRRL Y-15851) og GS190 (NRRL Y-18014).

Det skal bemerkes at slettingen av Pichia HIS4-genet fra Pichia-genomet ved innsetting av EcoRI-fragmentet fra pYMI3a ikke resulterte i tilføyelsen av store porsjoner pBR322 (hvilket fant sted når pYMH ble innsatt; se eksempel II). Da de fleste autonome ARS-baserte Pichia-ekspresjonsvektorer som f.eks. PSA0H5 (se fig. 9) primært består av sekvenser fra pBR322

og Pichia HIS4-genet, har disse autonome vektorer liten homologi med genomet av disse Pichia HIS4-utslettingsverter og derfor bør den ikke integrere hyppig.

EKSEMPEL IV

Avbrytelse av det primære alkoholoksidase- gen Pichia-stammer som mangler alkoholoksidase-gener (det primære alkoholoksidase-gen er her betegnet som A0X1 og det sekundære alkoholoksidase-gen er betegnet som A0X2) er av interesse av minst to grunner. For det første som et hjelpemiddel i undersøkelsene vedrørende regulering av genekspresjon ved

metanol. For eksempel, med en mutant stamme defekt i A0X1-

og A0X2-genene som beskrevet i nærmere detalj i eksempel VII, kan bevis fås hvorvidt metanol eller noen annen metabolitt (formaldehyd, format etc.) er det faktiske induserende molekyl av metanol-regulerte gener. En annen interesse i en AOX-defekt Pichia-stamme ligger i den mulighet at en slik stamme muligens kunne uttrykke høyere nivåer av heterologe genprodukter som beskrevet i nærmere detalj i eksempel V og VI.

For å bryte opp AO-genet ble plasmid pYM17 dannet (fig. 7). Plasmidet ble konstruert ved innsetting av et 2,9 kbp fragment av BamHI- Sall fra plasmid pYM25 (NRRL B-18015; se fig. 17)

som inneholder Saccharomyces ARG4-genet inn i BamHI-skåret pPG4.0 (NRRL B-15868; se fig. 16a for et restriksjonskart av Pichia-partiet av dette plasmid). Innsettingen resulterer i en utsletting av ca. 600 bp fra 5'-partiet av AOX1-genet (ca. en fjerdedel av genet). Plasmid pYM17 ble linearisert ved digestion med PvuII og EcoRI og transformert inn i PPF1 ( arg4 his4, NRRL Y-18017) ved selektering for Arg<+->prototrofer. Transformanter ble ekstrahert fra regenereringsagaren og lydbehandlet som beskrevet i eksemel II og spredt på SD-mediumagarplater inneholdende 0,1% glukose (istedenfor 2%) og 40 yg/ml histidin. Kolonier som resulterte ble deretter replikatplatet på et sett SD-mediumagarplater (inneholdende histidin) med de følgende karbonkilder: 1) ikke noe karbon; 2) 0,5% metanol og 3) 2% glukose. Ca. 81,0% av Arg<+->koloniene kunne ikke vokse normalt på metanol. Southern blot anlyse av genomisk DNA fra to av disse ikke-brukere av metanol, dvs. KM71 og KM72, bekreftet at A0X1-genet var avbrutt i disse stammer,

og at vektoren var innsatt som vist nederst på fig. 8.

De PPF1-pYM17-alkoholoksidase-defekte konstruksjoner som har genotypen: (his4 aox1::SARG4) er av stor potensiell verdi. For eksempel, da stammen er his4, kan Pichia-vektorer som inneholder HIS4-genet som en selekterbar markør, såsom pSA0H5 (NRRL B-15862; se fig. 9), transformeres inn i denne vert slik det er beskrevet i nærmere detalj i eksempel V nedenunder.

EKSEMPEL V

Metanolregulert ekspresjon av lacZ- genet i en alkoholoksidåse- defekt mutantstamme av Pichia pastoris Dette eksempel beskriver forsøk angående ekspresjonen av lacZ-genet i Pichia-verten KM71 (en PPF1-pYM17-alkoholoksidase-defekt konstruksjon) som ble fremstilt som beskrevet i eksempel

IV.

Aox1 -verten for disse sammenlignbare eksperimenter var KM71 (his4 aox1::SARG4) og Aox1<+->verten var PPF1 (arg4 his4; NRRL Y-18017). Ekspresjonskassetten A0X1-promotor/lacZ som ble transformert inn i begge stammer, var på plasmidet pSA0H5

(se fig. 9, NRRL B-15862). Flere stabile His<+->transformanter fra begge stammer ble isolert. Deres genomiske DNA ble undersøkt ved Southern blot analyse for å oppnå et matchet sett av stammer, hver inneholdende pSA0H5 integrert ved A0X1-promotor-locuset. På samme måte ble fusjonen av dihydroksyacetonsyntase (DAS)-promotor/lacZ-gen transformert inn i KM71 og PPF1 på plasmid pT76H3 (se fig. 18; NRRL B-18000) ved selektering for histidinprototrofi.

Hver av de fire stammer ble opprinnelig dyrket, i SD-medium bortsett fra at 2% glycerol var den eneste karbon- og energi-kilde istedenfor 2% glukose. Hver kultur ble deretter flyttet, dvs. samlet opp ved sentrifugering og overført til et annet medium, dvs. SD-medium med 0,5% metanol som den eneste karbonkilde. Prøver av disse kulturer ble analysert for B-galaktosidase, med de resultater som er angitt i tabell I.

A. Nødvendige oppløsninger:

2. O- nitrofenyl- B- D- galaktosid ( ONPG)

Løs opp 400 mg ONPG (Sigma N-1127) i 100 ml destillert vann for å gi 4 mg/ml ONPG-oppløsning.

B. Analysefremgangsmåte:

1. Ta ut en porsjon fra dyrkingsmediet (20-50 OD60Q av gjærceller), sentrifuger og vask cellepelleten med kaldt sterilt vann. 2. Tilsett 1 yl 40% Z-buffer til cellepelleten og 0,2 yg syrevaskede 0,45-0,50 mm glassperler. Hold alle prøvene på is. Svirr blandingen rundt på den høyeste innstilling fire (4) ganger i ett min hver gang. Prøvene bør holdes på is i minst ett min mellom hver gang de svirres. 3. Overfør lysatene til mikrosentrifugerør og sentrifuger i en mikrofuge ved 4°C i 5 min. Overfør de ovenpåflytende væsker til nye mikrosentrifugerør og hold ekstraktene på is. 4. Konsentrasjonen av samlet protein i et ekstrakt ble målt ved bruk av Bio-Rad Laboratories (Bradford) proteinanalyse-metode. For dette ble Bio-Rad Dye Reagent Concentrate fortynnet med fire volumer av avionisert E^ O og filtrert gjennom Whatman 3MM papir. En standard konsentrasjonskurve ble deretter fremstilt ved tilsetting av 3, 10, 30 og 100 yg bovinserumalbumen (BSA)

i 100 yl Z-buffer til et sett på 13 x 100 mm's glassrør som hver inneholdt 2,5 ml av fargereagensen. Prøvene ble blandet og holdt på værelsetemperatur i 5 min, og deres optiske densi-teter ved 595 nm ble bestemt. For ekstraktene ble 3, 10 og 30 yl's prøver bragt til 100 yl med en oppløsning inneholdende Z-bufferen og målt for proteininnhold som beskrevet ovenfor.

En proteinkonsentrasjonsverdi for hvert ekstrakt ble deretter interpolert ved bruk av BSA-konsentrasjonskurven. 5. For B-galaktosidase-målingene ble 10 yl aven 10x fortynning av ekstrakt satt til 1 ml Z-buffer, og blandingen ble inkubert i 5 min ved 30°C. 6. Start reaksjonen ved tilsetning av 0,2 ml ONPG (4 mg/ml), svirr rundt. 7. Stopp reaksjonen ved tilsetning av 0,5 ml av en 1 M Na2C0^-oppløsning ved passende tidspunkt (vanligvis mellom

1 og 30 min, og ved A^q < 1).

8. Les absorbansen av ovenpåflytende væske ved 420 nm.

C. Beregning av 8- galaktosidaseaktivitetenheter:

1 U = 1 nmol av ortonitrofenol (ONP) dannet pr. min ved 30°C

og pH 7.

1 nmol ONP har en absorbans ved 420 nm (a42q^ <p>^ 0,0045 med en 1 cm banelengde; således representerer en absorbans på 1 ved 420 nm 222 nmol ONP/ml eller 378 nmol/1,7 ml, da det samlede volum av ovenpåflytende væske som analyseres, er 1,7 ml. Enhetene vist i tabellene blir derfor beregnet som følger:

Hver av de fire kulturer viste nesten ingen påvisbar B-galaktosidaseaktivitet under glycerol-vekstfasen. 10-20 h etter ombytting til metanolmedium oppviste de to kulturer som inneholdt ekspresjonskassettene AOX1-lacZ og DAS-lacZ i Aox1<+->verten 8-galaktosidaseaktivitet som jevnet seg ut på ca. 20 enheter 8-galaktosidaseaktivitet pr. ug protein. AOX1-lacZ-kassetten i Aox1 -bakgrunnen viste imidlertid aktivitet som nådde opp i ca. 60 enheter/ug. DAS-lacZ-kassetten i Aox1 - verten viste også en økning i 6-galaktosidase-aktivitetsnivåene. Således uttrykte den transformerte Aox1 -vert, KM71, B-galaktosidase på et nivå som var 2-3 ganger nivået for den transformerte isogene Aox1 +-stamme, PPF1.

EKSEMPEL VI

Innsetting av hepatitt B overflate- antigen- genet

og sletting av AOX1- genet

I dette eksempel på sete-rettet innsetting/sletting ble hele kodesekvensen av AOX1-genet slettet og hepatitt B overflateantigen-genet (HBsAg) ble innsatt under styring av AOX1-gen-promotoren som forblir i genomet. For denne P^ pastoris verts-konstruksjon ble der dannet plasmid pBSAGI5I (deponert i en E. coli-vert hos the Northern Regional Research Center hos

De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois

og tilgjengelig for offentligheten uten restriksjoner ved

utstedelse av et patent fra den foreliggende søknad, med aksesjonsnr. NRRL B-18021; fig. 12). Plasmidet inneholder et 1,0 kbp-fragment fra sekvenser som flankerer 5'-enden av AOX1-genet fulgt av hepatitt B overflateantigen-sekvensen (HBsAg) og det 300 bp AOX1-avslutningsfragment, alt sammen sammensatt som vist på fig. 9, 10 og 11. Ekspresjonskassetten ble fulgt av fragmentet på 2,7 kbp som koder for Pichia HIS4-genet og til slutt et 1,5 kbp PvuII-fragment inneholdende sekvenser 3' til AOX1-genet. Når pBSAGI5I ble digestert med Bglll, ble en 7,2 kbp lineær vektor frigjort, som inneholdt 0,85 kbp av 5<1->AOX1-gensekvensen ved én ende og 1,1 kbp av 3'-AOX1-sekvensen ved den andre ende. Bglll-skåret pBSAGI5I ble transformert inn i GS115 ved selektering for histidin-prototrofi, transformanter ble ekstrahert fra regenereringsagaren og lydbehandlet som beskrevet i eksempel II og spredt på SD-mediumagarplater med 0,1% glukose (istedenfor 2,0%). Koloniene som resulterte, ble deretter replikatplatet på minimale agarplater med de følgende karbonkilder: 1) ingen karbonkilde, 2) 0,5% metanol og 3) 2% glukose. I gjennomsnitt kunne 32% av de undersøkte kolonier ikke vokse normalt på metanol.

Southern blot analyse av det genomiske DNA fra to av ikke-brukerne av metanol viste at A0X1-genet var slettet og at vektorsek-vensene var innsatt som vist på fig. 13.

Når den ble dyrket i metanol, uttrykte GS115-pBSAGI5I-stammen (aoxl::HBsAg-HIS4) HBsAg på høyere nivåer enn det som ble uttrykt ved fult alkoholoksidase-kompetente celler transformert på lignende måte.

EKSEMPEL VII

Identifisering av det andre alkoholoksidase- gen av

P. pastoris ved den sete- rettede innsettingsteknikk Nærværet av et andre alkoholoksidase-gen kan utledes fra de følgende observasjoner: 1) Southern blots hvor probene fra enten AOX cDNA eller et genomisk DNA ble hybridisert til begrenset Pichia-genomisk DNA viste alltid minst to bånd; 2) to Pichia genomiske DNA-fragmenter ble opprinnelig isolert, hvilke var like, men ikke identiske med hverandre (se fig. 16) og 3) mutante Pichia-stammer såsom KM71 og GS115-pBSAGI5I hvor det primære AOX-gen (A0X1) var slettet eller avbrutt, kunne fortsatt vokse på metanol og inneholdt alkoholoksidase-aktivitet. Veksthastigheten og AOX-aktivitet i metanoldyrkede celler av disse Aox -stammer var meget mindre enn i isogene Aox1<+->stammer. Det synes derfor som om det andre AOX-gen (A0X2) uttrykkes på et lavere nivå eller at dets produkt er mindre aktivt på metanol. I eksempel IV ble det vist at Pichia-DNA-fragmentet i pPG4.0 inneholder A0X1-genet.

Den mest overbevisende metode til å demonstrere at det genomiske DNA-fragment fra pPG3.0 inneholder minst en porsjon av A0X2-genet, er ved konstruksjon av en mutant stamme.hvor dette mulige A0X2-gen er blitt avbrutt eller slettet. For dette ble den sete-rettede vektor pYMI12a konstruert (fig. 14). Plasmidet består primært av pPG3.0 (fig. 16b) som inneholder det mulige A0X2-gen på et 3,0 kbp BamHI-fragment. Et 2,7 kbp Bglli-fragment som inneholder Pichia HIS4-genet, ble isolert fra pYJ8 (fig. 3; NRRL B-15889) og innsatt istedenfor sekvensene som var anordnet mellom Bglll- og det lengst til venstre Kpnl-setet av pPG3.0. (Kpnl-setet ble omdannet til et Bglll-sete med en oligonukleotid-adaptor før innsetting, og BamHI-setet av HIS4-genet ble ødelagt ved "innfylling" før innsetting i pPG3.0). Sammenligning mellom AOX1 og de mulige AOX2-gener (fig. 16) viser at denne konstruksjon burde føre til slettingen av ca. 800 bp fra midten av AOX2. Ved digestion av pYMI12a med BamHI ble en 4,5 kbp lineær vektor frigjort, som inneholdt HIS4-genfragmentet flankert ved sekvenser fra det mulige AOX2-locus på henholdsvis 1,1 og 0,7 kbp (se fig. 15).

Denne lineære vektor ble transformert inn i Aox1 -stammen, KM71, (aoxl his4::SARG4), og transformantene ble isolert ved selektering for histidin-prototrofer. Transformantene ble så sortert for evnen til å anvende metanol ved replikatplating på et sett av agarplater.

Den ikke-transformerte Aox1 -stamme KM71 vokste så langsomt

på metanolplater at dersom metanol ble innlemmet i agaren, fordampet den før noen betydelig vekst kunne observeres. Dette problem ble løst ved mating av metanol til cellene i dampfase. For denne fremgangsmåte ble ca. 0,2 ml 100% metanol plassert under lokket av en plate som ikke inneholdt noen karbonkilde i agarmediet. Platen ble etterlatt ved værelsetemperatur,

og lokket ble skiftet ut hver 2. til 4. dag med et lokk inneholdende nytt metanol. Etter 1-2 uker var forskjellen i metanoldyrking av vill type (Aox1<+> Aox2<+>) og mutantstammene (Aox1~ Aox2<+>) og (Aox1~ Aox2 ) klar.

Etter dampfase-matemetoden ble det funnet at ca. 0,1% av His<+->transformantene fra Aox1 -stammen var ute av stand til å vokse på metanol. DNA fra åtte av Aox1 -Aox2 -His+-transformantene ble analysert ved Southern filter hybridiseringsfremgangsmåte. Tre av disse DNA inneholdt den lineære pYMI12a-vektor innsatt som vist på fig. 15. Analyse ved en av Aox1 -Aox2 -dobbelt-mutantene, KM7121 (NRRL Y-18019), viste at stammen avgjort ikke vokser på metanol og at stammen ikke har påvisbar AOX-aktivitet. Fra disse resultater med KM7121 er det klart at Pichia-fragmentet i pPG3.0 ikke inneholder sekvenser fra et andre AOX-gen, og at bortsett fra disse to alkoholoksidaser eksisterer ingen andre metanoloksiderende aktiviteter i P. pastoris.

Claims

1. Fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris på et på forhånd bestemt genomisk sete, karakterisert ved at den omfatter å transformere en vertstamme av Pichia pastoris med et serieordnet lineært DNA-fragment som omfatter; et første innsettbart DNA-fragment, et selekterbart markørgen, og et andre innsettbart DNA-fragment; idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver tilnærmet 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native Pichia pastoris genomiske sete hvor genomisk modifikasjon skal skje; idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hverandre i nevnte lineære DNA-fragment slik de er orientert i Pichia pastoris-genomet og hvor nevnte markørgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og hvor nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter blir valgt fra gruppen som består av fragmenter av; alkoholoksidasegenene, og histidinolhehydrogenasegenet; og eventuelt at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et hetereologt gen, hvori nevnte hetereologe gen, såvel som nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-framgent; eller eventuelt at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et reguleringsområde, og et hetereologt gen, hvor nevnte hetereloge gen er under kontroll av reguleringsområdet, og hvor reguleringsområdet hetereologe gen - konstruksjonen, i tillegg til nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at av nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter anvendes fragmenter av alkoholoksidase-genet.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at av nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter anvendes fragmenter av AOX 1-genet.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at av nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter anvendes fragmenter av AOX 2-genet.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at av nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter anvendes fragmenter av histidinoldehydrogenasegenet.

6. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment, karakterisert ved at det omfatter et første innsettbart DNA-fragment, et selekterbart markørgen og et andre innsettbart DNA-fragment, idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA i Pichia pastoris, idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er anordnet med hensyn på hverandre i det lineære DNA-fragment slik som de er anordnet i Pichia pastoris-genomet, hvor nevnte markørgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og hvor nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er selektert fra gruppen som består av fragmenter av; alkoholoksidasegenene, og histidinoldehydrogenasegenet; og eventuelt ett av følgende alternativer; (a) at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et hetereologt gen, hvor nevnte hetereologe gen, såvel som nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment, (b) at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et reguleringsområde, og et hetereologt gen, idet nevnte hetereologe gen er under kontroll av reguleringsområdet og hvor reguleringsområdet hetereologe genkonstruksjon, i tillegg til nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment, (c) at nevnte DNA-fragment ytterligere omfatter bakteriell plasmid DNA

7. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er fragmenter av alkoholoksidasegenet.

8. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er fragmenter av AOX 1-genet.

9. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er fragmenter av AOX 2-genet.

10. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragment er fragmenter av histidinoldehydrogenasegenet .

11. Lukket sirkelformet plasmid, karakterisert ved at det omfatter det lineære DNA-parti som angitt i krav 6, og bakteriell plasmid DNA hvor nevnte bakterielle plasmid DNA er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment.

12. Lukket sirkelformet plasmid som angitt i krav 11, karakterisert ved at nevnte plasmid er PSA0H5 (NRRL B-15862).

13. Lukket sirkelformet plasmid som angitt i krav 11, karakterisert ved at nevnte plasmid er pYMI2a, vist i fig. 4.

14. Lukket sirkelformet plasmid som angitt i krav 11, karakterisert ved at nevnte plasmid er PYMI7, vist i fig. 7.