DE602004012424T2

DE602004012424T2 - Homogene herstellungen von il-29

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Publication number: DE602004012424T2
Application number: DE602004012424T
Authority: DE
Inventors: Lowell J. Tacoma BRADY; Kevin M. Bellevue KLUCHER; Chung Sammamish CHAN; Dennis L. Berwyn DONG; Hong Y. Liu; Paul O. Granite Falls SHEPPARD; Thomas R. Seattle BUKOWSKI
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2003-08-07
Filing date: 2004-08-09
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2024-08-10
Also published as: US7608428B2; US20070059804A1; US20070049737A1; US7662589B2; JP2007528719A; US7468423B2; US7485702B2; EP2251353B1; US7662590B2; US9499598B2; US20070073044A1; CY1114030T1; US7479542B2; US20070065406A1; DK2251353T3; JP4808157B2; US8734776B2; US20100104531A1; US20050037012A1; WO2005023862A2

Description

STAND DER TECHNIK
Zytokine spielen wichtige Rollen bei der Regelung der Hämatopoese und Immunreaktionen und können die Lymphozytenentwicklung beeinflussen. Zur humanen Klasse-II-Zytokinfamilie gehören Interferon-α (IFN-α) Subtypen, Interferon-β (IFN-β), Interferon-γ (IFN-γ), IL-10, IL-19 ( US-Patent 5.985.614 ), MDA-7 (Jiang et al., Oncogene 11, 2477–2486, (1995)), IL-20 (Jiang et al., Oncogene 11, 2477–2486, (1995)), IL-22 (Xie et al., J. Biol. Chem. 275, 31335–31339, (2000)) und AK-155 (Knappe et al., J. Virol. 74, 3881–3887, (2000)). Die meisten Zytokine binden und wandeln Signale entweder durch Zytokinrezeptoren der Klasse I oder der Klasse II. Zu den Mitgliedern der humanen Klasse-II-Zytokinrezeptorfamilie gehören Interferon-αR1 (IFN-αR1), Interferon-γ-R2 (IFN-γ-R2), Interferon-γ R1 (IFN-γ R1), Interferon-γR2 (IFN-γR2), IL-10R (Liu et al., J. Immunol. 152, 1821–1829, (1994)), CRF2-4 (Lutfalla et al. Genomics 16, 366–373, (1993)), IL-20Rβ (Slumberg et al., Cell 104, 9–19, (2001)) (auch bekannt als Zcytor7 ( US-Patent 5.945.511 ) und CRF2-8 (Kotenko et al., Oncogene 19, 2557–2565, (2000)), IL-20Rβ (Slumberg et al., ibid, (2001)) (auch bekannt als DIRS1 (PCT WO 99/46379 )), IL-22RA1 (IL-22 Rezeptor-α1, zur Genehmigung an die HUGO eingereicht) (auch bekannt als IL-22R (Xie et al., J. Biol. Chem. 275, 31335–31339, (2000)), Zcytor11 ( US-Patent 5.965.704 ) und CRF2-9 (Kotenko et al., Oncogene 19, 2557–2565, (2000)) und Gewebefaktor.
Klasse-II-Zytokinrezeptoren sind normalerweise Heterodimere, die sich aus zwei unterschiedlichen Rezeptorketten, den α- und β-Rezeptoruntereinheiten, zusammensetzen (Stahl et al., Cell 74, 587–590, (1993)). Generell sind die α-Untereinheiten die primären zytokinbindenden Proteine und die β-Untereinheiten werden für die Bildung von Stellen mit hoher Bindungsaffinität sowie für die Signalumwandlung benötigt. Eine Ausnahme ist der IL-20-Rezeptor, in dem beide Untereinheiten für die IL-20-Bindung benötigt werden (Slumberg et al., ibid, (2001)).
Die Klasse-II-Zytokinrezeptoren werden durch eine konservierte zytokinbindende Domäne mit ca. 200 Aminosäuren (D200) im extrazellulären Teil des Rezeptors identifiziert. Diese zytokinbindende Domäne setzt sich aus zwei Fibronectin-III-Domänen (FnIII) mit je ca. 100 Aminosäuren zusammen (Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6934–6938, (1990); Thoreau et al., FEBS Lett. 282, 16–31, (1991)). Jede FnIII-Domäne enthält konservierte Cys-, Pro- und Trp-Reste, welche ein charakteristisches Faltmuster aus sieben β-Strängen bestimmen, ähnlich der konstanten Domäne des Immunglobulins (Uze et al., J. Interferon Cytokine Res. 15, 3–26, (1995)). Die konservierten strukturellen Elemente der Klasse-II-Zytokinrezeptorfamilie ermöglichen die Identifizierung neuer Mitglieder dieser Familie auf Basis der Homologie in der primären Aminosäurensequenz.
Die Interleukine sind eine Familie von Zytokinen, die immunologische Reaktionen, einschließlich Entzündung, vermitteln. Der Mittelpunkt einer Immunreaktion ist die T-Zelle, welche viele Zytokine und adaptive Immunität gegen Antigene produziert. Die von der T-Zelle produzierten Zytokine wurden als Typ 1 und Typ 2 klassifiziert (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300–317, 1998). Zu den Typ-1-Zytokinen gehören IL-2, Interferon-Gamma (IFN-γ), LT-α; sie sind an den inflammatorischen Reaktionen, viraler Immunität, intrazelluläre Parasitenimmunität und Allograftabstoßung beteiligt. Zu den Typ-2-Zytokinen gehören IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13; sie sind an humoralen Reaktionen, Helminthen-Immunität und allergischen Reaktionen beteiligt. Zwischen Typ 1 und Typ 2 gemeinsame Zytokine sind IL-3, GM-CSF und TNF-α. Es gibt einige Nachweise, die andeuten, dass Typ-1- und Typ-2-produzierende T-Zellpopulationen bevorzugt in verschiedene entzündete Gewebearten wandern.
Von besonderem Interesse aus therapeutischer Sicht sind die Interferone (Untersuchungen zu Interferonen von De Maeyer und De Maeyer-Guignard, „Interferone" in The Cytokine Handbook, 3. Ausgabe, Thompson (ed.), S. 491–516 (Academic Press Ltd. 1998) und von Walsh, Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology, S. 158–188 (John Wiley & Sons 1998)). Interferone weisen verschiedene biologische Aktivitäten auf und eignen sich für die Behandlung von bestimmten Autoimmunerkrankungen, insbesondere für Karzinome, und für die Verbesserung der Immunreaktion gegen infektiöse Agenzien, einschließlich Viren, Bakterien, Pilze und Protozoa. Bisher wurden sechs Interferonformen identifiziert, die in zwei Hauptgruppen unterteilt wurden. Zu den so genannten „Typ-I"-INF gehören IFN-α, IFN-β, IFN-ω, IFN-δ und Interferon-T. Derzeit sind IFN-γ und eine Unterklasse von IFN-α die einzigen Typ-II-Interferone.
Typ-I-Interferone, von denen man annimmt, dass sie von dem gleichen Vorfahrensgen abgeleitet sind, haben eine ausreichend ähnliche Struktur beibehalten, um durch den gleichen Zelloberflächenrezeptor zu agieren. Die α-Kette des humanen Interferon-α/β-Rezeptors umfasst eine extrazelluläre N-Terminusdomäne, welche die Charakteristiken eines Klasse-II-Zytokinrezeptors aufweist. Interferon-γ weist keine signifikante Homologie mit den Typ-I-Interferonen oder dem Typ-II-Interferon-α-Subtyp auf, teilt aber eine Reihe von biologischen Aktivitäten mit den Typ-I-Interferonen.
Kliniker nutzen die mehrfachen Aktivitäten der Interferone, indem sie die Proteine für die Behandlung vieler verschiedener Krankheitszustände einsetzen. So wurde z. B. eine Form von Interferon-α in über 50 Ländern für die Verwendung zur Behandlung von Krankheitszuständen zugelassen, wie z. B. Haarzellleukämie, Nierenzellkarzinom, Basalzellkarzinom, malignes Melanom, AIDS-bezogenes Kaposisarkom, Multiples Myelom, chronische myelogene Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphom, laryngeale Papillomatose, Mycosis fungoides, Condyloma acuminata, chronischer Hepatitis B, Hepatitis C, chronischer Hepatitis D und chronischer Nicht-A-Nicht-B/C-Hepatitis. Die US-Arzneimittelaufsichtsbehörde (U.S. Food and Drug Administration/FDA) hat die Verwendung von Interferon-β zur Behandlung von Multipler Sklerose, einer chronischen Erkrankung des Nervensystems, zugelassen. Interferon-γ wird für die Behandlung von chronischen Granulomatose-Erkrankungen verwendet, wobei das Interferon die Immunreaktion des Patienten zur Zerstörung infektiöser bakterieller, fungaler und protozoaler Pathogene verbessert. Klinische Studien weisen auch darauf hin, dass Interferon-γ auch für die Behandlung von AIDS, Leishmaniose und lepromatöse Leprose nützlich sein könnte.
IL-28A, IL-28B und IL-29 umfassen eine vor kurzem neu entdeckte Familie von Proteinen mit Sequenzhomologie zu den Typ-I-Interferonen und genomischer Homologie zu IL-10. Diese neue Familie ist in der im gleichen Besitz befindlichen PCT-Anmeldung WO 02/086087 sowie von Sheppard et al., Nature Immunol. 4:63–68, 2003; die beide durch Verweis Bestandteil dieser Schrift sind, ausführlich beschrieben. Funktionell sind IL-28 und IL-29 den Typ-I-Interferonen ähnlich, nämlich in ihrer Fähigkeit zur Induktion eines antiviralen Zustands in Zellen, doch im Gegensatz zu den Typ-I-Interferonen weisen sie keine antiproliferative Aktivität gegen bestimmte B-Zelllinien auf.
Von IL-28 und IL-29 ist bekannt, dass sie eine ungerade Anzahl von Cysteinen enthalten (PCT-Anmeldung WO 02/086087 und Sheppard et al., supra.) Die Expression von rekombinantem IL-28 und IL-29 kann ein heterogenes Gemisch von Proteinen ergeben, das sich aus einer intramolekularen Disulfidbindung in mehreren Konformationen zusammensetzt. Die Trennung dieser Formen kann schwierig und mühsam sein. Deshalb ist die Bereitstellung von IL-28- und IL-29-Molekülen wünschenswert, die nach der Expression ein einzelnes intramolekulares Disulfidbindungsmuster aufweisen, sowie die Bereitstellung von Methoden für die Neufaltung und Aufreinigung dieser Präparationen zur Aufrechterhaltung der Homogenität.
In US 5 206 344 sind Interleukin-2-Muteine und deren Polymerkonjugation beschrieben.
Luxon et al., Clinical Therapeutics, Band 24, Nr. 9, S. 1363–1383, 1. September 2002, beschreibt pegylierte Interferone für die Behandlung der chronischen Hepatitis-C-Infektion.
Koslowski et al., J. Controlled Release, Band 72, Nr. 1–3, S. 217–224, 14. Mai 2001, beschreibt Verbesserungen in der Proteinpegylierung.
Rajarathnam et al., Biochemistry, Band 38, Nr. 24, S. 7653–7658, 15. Juni 1999, beschreibt Disulfidbrücken in Interleukin-8.
WO 02/086087 beschreibt die Zytokinproteinfamilie der Proteine Zcyto20, Zcyto21, Zcyto22, Zcyto24 und Zcyto25.
Sheppard et al., Nature Immunology, Band 4, Nr. 1, S. 63–68, Januar 2003, beschreibt IL-28, IL-29 und deren Klasse-II-Zytokinrezeptor IL-28R.
Francis et al., Int. J of Haematology, Band 68, Nr. 1, S. 1–18, beschreibt die Wichtigkeit der biologischen Optimierung der Kopplungsmethoden.
Die vorliegende Erfindung liefert Zusammensetzungen und Methoden für die Produktion homogener Präparationen von IL-29.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid bereit, das eine Aminosäurensequenz umfasst, die aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wurde: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein isoliertes Polypeptid bereit, das ein Polypeptid kodiert, wobei das kodierte Polypeptid eine Aminosäurensequenz umfasst, die aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wurde: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161.
In der nachfolgenden Beschreibung werden bestimmte Begriffe häufig verwendet. In den folgenden Definitionen werden diese Begriffe zum Zweck eines besseren Verständnisses der Erfindung erklärt.
Wenn nicht anderweitig angegeben, sind die Begriffe „ein/e/r/s", „die" und „mindestens ein/e/r/s" untereinander austauschbar und bedeuten „ein/e/r/s oder mehr als ein/e/r/s".
Der in dieser Schrift verwendete Begriff „Affinitäts-Tag" bezeichnet ein Polypeptidsegment, das an ein zweites Polypeptid angefügt werden kann, um die Reinigung oder Erkennung des zweiten Polypeptids zu bewirken oder Stellen für das Anfügen des zweiten Polypeptids an ein Substrat bereitzustellen. Grundsätzlich kann jedes Peptid oder Protein, für das ein Antikörper oder ein anderer spezifischer bindender Wirkstoff verfügbar ist, als Affinitäts-Tag verwendet werden. Affinitäts-Tags umfassen ein Polyhistidin-Trakt, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), Glutathion-S-Transferase (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), Glu-Glu-Affinitäts-Tag (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952–4, 1985), Substanz P, Flag^TM-Peptid (Hopp et al., Biotechnology 6:1204–10, 1988), streptavidinbindendes Peptid oder anderes Antigenepitop oder bindende Domäne. Siehe allgemein Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991. Affinitäts-Tag-kodierende DNA sind im Fachhandel erhältlich (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA).
Der in dieser Schrift verwendete Begriff „Allelvariante" bezeichnet jede der zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens, das denselben chromosomalen Locus belegt. Allelvariationen entstehen auf natürliche Weise durch Mutation und können zu phänotypischen Polymorphismen innerhalb von Populationen führen. Genmutationen können stille Mutationen sein (keine Veränderung im kodierten Polypeptid) oder sie können Polypeptide mit veränderter Aminosäurensequenz kodieren. Der in dieser Schrift verwendete Begriff Allelvariante wird auch zur Bezeichnung eines von einer Allelvariante eines Gens kodierten Proteins verwendet.
Die in dieser Schrift verwendeten Begriffe „aminoterminal" und „carboxylterminal" bezeichnen die Positionen innerhalb der Polypeptide. Wenn im Zusammenhang angebracht, werden diese Begriffe in Bezug auf eine bestimmte Sequenz oder einen Anteil eines Polypeptids verwendet, um die Nähe oder relative Position zu bezeichnen. Zum Beispiel eine bestimmte Sequenz carboxylterminal zu einer Referenzsequenz innerhalb eines Polypeptids, die proximal zum Carboxylterminus der Referenzsequenz positioniert ist, aber nicht unbedingt am Carboxylterminus des kompletten Polypeptids liegt.
Der Begriff „Komplement-/Antikomplement-Paar" bezeichnet nicht-identische Untereinheiten, die ein nicht-kovalent verbundenes, stabiles Paar unter den entsprechenden Bedingungen bilden. Biotin und Avidin (oder Streptavidin) sind z. B. prototypische Mitglieder eines Komplement-/Antikomplement-Paares. Weitere beispielhafte Komplement-/Antikomplement-Paare sind u. a. Rezeptor/Ligand-Paare, Antikörper/Antigen-(oder Hapten oder Epitop)Paare, Sense/Antisense-Polynukleotid-Paare u. ä. Wenn eine anschließende Dissoziation des Komplement-/Antikomplement-Paares wünschenswert ist, sollte das Komplement-/Antikomplement-Paar vorzugsweise eine Bindungsaffinität von < 10⁹ M^–1 aufweisen.
Der Begriff „degenerierte Nukleotidsequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleotiden, die eine oder mehrere degenerierte Codone umfasst (im Vergleich zu einem Polypeptid-kodierenden Referenzpolynukleotidmolekül). Degenerierte Codone enthalten verschiedene Nukleotiddrillinge, kodieren jedoch den gleichen Aminosäurerest (d. h. sowohl GAU- als auch GAC-Drillinge kodieren Asp).
Der Begriff „Expressionsvektor" wird zur Bezeichnung eines linearen oder ringförmigen DNA-Moleküls verwendet, das ein Segment umfasst, welches ein Polypeptid von Interesse kodiert, das mit weiteren Segmenten funktionell verknüpft ist, welche für dessen Transkription sorgen. Solche zusätzlichen Segmente beinhalten Promoter- und Terminatorsequenzen und können auch einen oder mehrere Replikationsursprünge, einen oder mehrere selektierbare Marker, einen Verstärker, ein Polyadenylationssignal usw. enthalten. Expressionsvektoren werden generell aus Plasmid oder viralem DNA abgeleitet oder können Elemente aus beiden enthalten.
Der Begriff „isoliert", wenn auf ein Polynukleotid angewandt, bezeichnet, dass das Polynukleotid aus seinem natürlichen genetischen Milieu entfernt wurde und somit frei von anderen fremden oder unerwünschten Kodierungssequenzen ist und eine Form aufweist, die für die Verwendung innerhalb von gentechnischen Proteinproduktionssystemen geeignet ist. Solche isolierten Moleküle sind von ihrem natürlichen Umfeld getrennt und umfassen cDNA und genomische Klone. Erfindungsgemäße isolierte DNA-Moleküle sind frei von den Genen, mit denen sie normalerweise verbunden sind, können jedoch natürlich auftretende nicht translatierte 5'- und 3'-Regionen aufweisen, wie z. B. Promoter und Terminatoren. Die Identifizierung der verbundenen Regionen ist fachkundigen Personen bekannt (siehe z. B. Dynan and Tijan, Nature 316:774–78, 1985).
Ein „isoliertes" Polypeptid oder Protein ist ein Polypeptid oder Protein, das in einem Zustand außerhalb seines natürlichen Umfeldes gefunden wird, wie z. B. getrennt von Blut und Tiergewebe. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das isolierte Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere von anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs. Es wird bevorzugt, die Polypeptide in einer hochreinen Form bereitzustellen, d. h. eine Reinheit von mehr als 95%, vorzugsweise mehr als 99%. Bei Verwendung in diesem Zusammenhang schließt der Begriff „isoliert" nicht die Gegenwart des gleichen Polypeptids in alternativen physischen Formen aus, wie z. B. Dimere oder alternativ glykosylierte oder derivatisierte Formen.
Der Begriff „Konzentration" (engl. Level) bedeutet in Bezug auf Immunzellen, wie NK-Zellen, T-Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen, B-Zellen u. ä., entweder eine erhöhte Konzentration von Zellen oder eine verstärkte Aktivität der Zellfunktion.
Der Begriff „Grad" (engl. Level) bedeutet in Bezug auf Virusinfektionen eine Veränderung im Grad der Virusinfektion und umfasst u. a. eine Veränderung in der Konzentration von CTL oder NK-Zellen (wie oben beschrieben) eine Reduzierung der Virenbelastung, einer Erhöhung der Konzentration von antiviralem Antikörpertiter, eine Reduzierung in den serologischen Konzentrationen der Alaninaminotransferase oder histologisch nachgewiesene Verbesserungen eines Zielgewebes oder -organs. Methoden zur Bestimmung, ob diese Veränderungen in der Konzentration signifikante Unterschiede oder Veränderungen sind, sind fachkundigen Personen bekannt.
„Funktionell verknüpft", wenn in Bezug auf DNA-Segmente verwendet, bedeutet, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie im Einklang für ihre beabsichtigten Zwecke funktionieren, d. h. die Transkription beginnt im Promoter und setzt sich durch das Kodiersegment zum Terminator fort.
Der Begriff „Ortholog" bezeichnet ein aus einer Spezies gewonnenes Polypeptid oder Protein, welches das funktionelle Gegenstück eines Polypeptids oder Proteins aus einer anderen Spezies ist. Sequenzunterschiede unter Orthologen sind das Resultat der Speziation.
„Paraloge" sind eindeutige, aber strukturell verwandte Proteine, die aus Organismen erzeugt wurden. Man nimmt an, dass Paraloge durch Genduplizierung entstehen. So sind z. B. α-Globin, β-Globin und Myoglobin Paraloge von einander.
Ein „Polynukleotid" ist ein ein- oder zweisträngiges Polymer aus Deoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen, das vom 5'- zum 3'-Ende gelesen wird. Polynukleotide umfassen RNA und DNA und können von natürlichen Quellen isoliert, in-vitro synthetisiert oder aus einer Kombination aus natürlichen und synthetischen Molekülen präpariert werden. Die Größen der Polynukleotide werden als Basenpaare (Abkürzung „bp"), Nukleotide („nt") oder Kilobasen („kb") ausgedrückt. Wenn es der Zusammenhang erlaubt, können die letzten zwei Begriffe zur Beschreibung von Polynukleotiden verwendet werden, die ein- oder doppelsträngig sind. Wird der Begriff auf doppelsträngige Moleküle angewandt, bezeichnet er die Gesamtlänge und ist als gleichwertig zu dem Begriff „Basenpaare" zu verstehen. Fachkundigen Personen ist bewusst, dass die zwei Stränge eines doppelsträngigen Polynukleotids eine leicht unterschiedliche Länge aufweisen können und dass die Enden aufgrund der enzymatischen Spaltung versetzt sein können; somit können eventuell nicht alle Nukleotide innerhalb eines doppelsträngigen Polynukleotidmoleküls gepaart werden.
Ein „Polypeptid” ist ein Polymer der Aminosäurereste, das durch Peptidverbindungen angefügt wird, ob natürlich oder synthetisch produziert. Polypeptide mit weniger als 10 Aminosäureresten werden generell als „Peptide" bezeichnet.
Der Begriff „Promoter” hat seine unter Fachleuten anerkannte Bedeutung der Denotierung eines Teils von genhaltigen DNA-Sequenzen, die für die Bindung der RNA-Polymerase und Einleitung der Transkription sorgen.
Promotersequenzen sind oft, aber nicht immer, in den nicht-kodierenden 5'-Regionen von Genen aufzufinden.
Ein „Protein" ist ein Makromolekül, das eine oder mehrere Polypeptidketten umfasst. Ein Protein kann auch Nicht-Peptid-Komponenten umfassen, wie z. B. Kohlenhydratgruppen. Kohlenhydrate und andere Nicht-Peptid-Substituenten können einem Protein durch die Zelle, die das Protein produziert, hinzugefügt werden, und sie unterscheiden sich je nach Zelltyp. Proteine werden in dieser Schrift in Bezug auf ihre Aminosäuren-Backbone-Strukturen definiert; Substituenten wie Kohlenhydratgruppen werden generell nicht spezifiziert, können aber trotzdem vorhanden sein.
Der Begriff „Rezeptor" bezeichnet ein zellverbundenes Protein, das an ein bioaktives Molekül (d. h. einen Liganden) bindet und die Wirkung des Liganden an die Zelle vermittelt. Membrangebundene Rezeptoren sind durch eine Multipeptidstruktur gekennzeichnet, welche eine extrazelluläre ligandbindende Domäne und eine intrazelluläre Effektordomäne, die normalerweise an der Signaltransduktion beteiligt ist, umfasst. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor resultiert in einer Konformationsveränderung im Rezeptor, welche die Wechselwirkung zwischen der Effektordomäne und anderen Molekül(en) in der Zelle verursacht. Diese Wechselwirkung führt wiederum zu einer Veränderung im Stoffwechsel der Zelle. Die mit Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Ligand verknüpften Stoffwechselereignisse sind u. a. Gentranskription, Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Erhöhung der zyklischen AMP-Produktion, Mobilisierung von zellulärem Kalzium, Mobilisierung der Membranlipide, Zelladhäsion, Hydrolyse von Inositollipiden und Hydrolyse von Phospholipiden. Rezeptoren können generell membrangebunden, zytosolisch oder nukleär, monomer (z. B. TSH-Rezeptor, beta-adrenerger Rezeptor) oder multimer (z. B. PDGF-Rezeptor, Wachstumshormonrezeptor, IL-3-Rezeptor, GM-CSF-Rezeptor, G-CSF-Rezeptor, Erythropoietinrezeptor und IL-6-Rezeptor) sein.
Der Begriff „sekretorische Signalsequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid (ein „sekretorisches Peptid") kodiert, das als Komponente eines größeren Polypeptids das größere Polypeptid durch einen sekretorischen Signalweg einer Zelle leitet, in dem es synthetisiert wird. Das größere Polypeptid wird meistens gespalten, um das sekretorische Peptid während des Transportes durch den sekretorischen Signalweg zu entfernen.
Der Begriff „Spleißvariante" bezeichnet alternative Formen des von einem Gen transkribierten RNA. Spleißvarianten entstehen auf natürlichem Wege durch die Verwendung von alternativen Spleißstellen innerhalb eines transkribierten RNA-Moleküls, oder weniger häufig zwischen separat transkribierten RNA-Molekülen, und können dazu führen, dass mehrere mRNA von dem gleichen Gen transkribiert werden. Spleißvarianten können Polypeptide kodieren, die eine veränderte Aminosäurensequenz aufweisen. Der in dieser Schrift verwendete Begriff Spleißvariante wird auch zur Bezeichnung eines Proteins verwendet, das durch eine Spleißvariante eines von einem Gen transkribierten mRNA kodiert wird.
Molekulargewichte und Polymerlängen, die durch ungenaue analytische Methoden (z. B. Gelelektrophorese) ermittelt werden, sind als ungefähre Werte zu verstehen. Wenn ein solcher Wert als „ungefähr" X oder „ca." X angegeben wird, ist der genannte Wert X mit einer Genauigkeit von ±10% zu verstehen.
„Zcyto20", „Zcyto21", „Zcyto22" sind frühere Bezeichnungen für humanes IL-28A, humanes IL-29 und humanes IL-28B. Die Nukleotid- und Aminosäurensequenz für IL-28A ist in SEQ ID-NR:1 und SEQ ID-NR:2 gezeigt. Die Nukleotid- und Aminosäurensequenzen für IL-29 sind in SEQ ID-NR:3 und SEQ ID-NR:4 gezeigt. Die Nukleotid- und Aminosäurensequenz für IL-28B ist in SEQ ID-NR:5 und SEQ ID-NR:6 gezeigt. Diese Sequenzen sind in der allgemein ZymoGenetics, Inc. zugeteilten PCT-Anmeldung WO 02/086087 ausführlich beschrieben.
„Zcyto24" und „Zcyto25" sind frühere Bezeichnungen für Maus-IL-28 und werden in SEQ ID-NR: 7, 8, 9, 10 gezeigt. Die Polynukleotide und Polypeptide sind in der allgemein ZymoGenetics, Inc. zugeteilten PCT-Anmeldung WO 02/086087 ausführlich beschrieben.
„Zcytor19" ist die frühere Bezeichnungen für die IL-28-Rezeptor α-Untereinheit und wird in SEQ ID-NR: 11 gezeigt. Die Polynukleotide und Polypeptide sind in der im Namen von Schering, Inc. erfolgten PCT-Anmeldung WO 02/20569 und der allgemein ZymoGenetics, Inc. zugeteilten WO 02/44209 ausführlich beschrieben. „IL-28-Rezeptor" bezeichnet die IL-28 α-Untereinheit und die einen heterodimeren Rezeptor bildende CRF2-4-Untereinheit.
Die vorliegende Erfindung bietet Polynukleotidmoleküle, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, welche Cysteinmutanten des IL-29 kodieren mit analoger Expression einer rekombinanten IL-29-Präparation, die eine homogene Präparation ist. Im Sinne dieser Erfindung ist eine homogene IL-29-Präparation eine Präparation, die mindestens 98% eines einzelnen intramolekulären Disulfidbindungsmusters im aufgereinigten Polypeptid umfasst. In anderen Ausführungsbeispielen ist die einzelne Disulfidkonformation in einer Präparation von aufgereinigtem Polypeptid zu 99% homogen. Diese Cysteinmutanten halten generell eine bestimmte biologische Aktivität des wildtypischen IL-29 aufrecht, wie in dieser Schrift beschrieben. Generell ist ein an seinen kognaten Rezeptor bindender Ligand spezifisch, wenn der K_D-Wert in den Bereich von 100 nM bis 100 pM fällt. Die spezifische Bindung im Bereich 100 mM bis 10 nM K_D ist eine Affinitätsbindung mit niedriger Affinität. Die spezifische Bindung im Bereich 2,5 mM bis 100 pM K_D ist eine Affinitätsbindung mit hoher Affinität. In einem weiteren Beispiel ist eine biologische Aktivität der IL-29-Cysteinmutanten vorhanden, wenn die Moleküle zu einem bestimmten Grad der antiviralen Aktivität in Verbindung mit wildtypischem IL-28 oder IL-29 fähig sind. Die Bestimmung des Grads der antiviralen Aktivität wird in dieser Schrift ausführlich beschrieben.
Bei der Bezugnahme auf IL-28 bedeutet der Begriff sowohl IL-28A als auch IL-28B. Früher wurde IL-28A als Zcyto20 (SEQ ID-NR:1 und 2), IL-29 als Zcyto21 (SEQ ID-NR:3 und 4) und IL-28B als Zcyto22 (SEQ ID-NR:5 und 6) bezeichnet. (Siehe PCT-Anmeldung WO 02/086087 und Sheppard et al., supra.) Die Mausorthologen für IL-28 wurden früher als Zcyto24 (SEQ ID-NR:7 und 8), Zcyto25 (SEQ ID-NR:9 und 10) bezeichnet.
Das wildtypische IL-28A-Gen kodiert ein Polypeptid von 200 Aminosäuren, wie in SEQ ID-NR:2 gezeigt. Die Signalsequenz für IL-28A umfasst vorhersehbar Aminosäurerest –25 (Met) bis Aminosäurerest –1 (Ala) der SEQ ID-NR:2. Das reife Peptid für IL-28A beginnt bei Aminosäurerest 1 (Val) der SEQ ID-NR:2. IL-28A-Helixe werden wie folgt vorhergesagt: Helix A ist definiert als Aminosäurereste 31 (Ala) bis 45 (Leu); Helix B durch Aminosäurereste 58 (Thr) bis 65 (Gln); Helix C durch Aminosäurereste 69 (Arg) bis 86 (Ala); Helix D durch Aminosäurereste 95 (Val) bis 114 (Ala); Helix E durch Aminosäurereste 126 (Thr) bis 142 (Lys); und Helix F durch Aminosäurereste 148 (Cys) bis 169 (Ala); wie in SEQ ID-NR:2 gezeigt.
Das wildtypische IL-29-Gen kodiert ein Polypeptid von 200 Aminosäuren, wie in SEQ ID-NR:4 gezeigt. Die Signalsequenz für IL-29 umfasst vorhersehbar Aminosäurerest –19 (Met) bis Aminosäurerest –1 (Ala) der SEQ ID-NR:4, SEQ ID-NR:119 oder SEQ ID-Nr:121. Das reife Peptid für IL-29 beginnt bei Aminosäurerest 1 (Gly) der SEQ ID-NR:4. IL-29 wurde in der PCT-Anmeldung WO 02/02627 beschrieben. IL-29-Helixe werden wie folgt vorhergesagt: Helix A ist definiert als Aminosäurereste 30 (Ser) bis 44 (Leu); Helix B durch Aminosäurereste 57 (Asn) bis 65 (Val); Helix C durch Aminosäurereste 70 (Val) bis 85 (Ala); Helix D durch Aminosäurereste 92 (Glu) bis 111 (Gln); Helix E durch Aminosäurereste 118 (Thr) bis 139 (Lys); und Helix F durch Aminosäurereste 144 (Gly) bis 170 (Leu); wie in SEQ ID-NR:4 gezeigt.
Das wildtypische IL-28B-Gen kodiert ein Polypeptid von 200 Aminosäuren, wie in SEQ ID-NR:6 gezeigt. Die Signalsequenz für IL-28B umfasst vorhersehbar Aminosäurerest –21 (Met) bis Aminosäurerest –1 (Ala) der SEQ ID-NR:6. Das reife Peptid für IL-28B beginnt bei Aminosäurerest 1 (Val) der SEQ ID-NR:6. IL-28B-Helixe werden wie folgt vorhergesagt: Helix A ist definiert als Aminosäurereste 31 (Ala) bis 45 (Leu); Helix B durch Aminosäurereste 58 (Thr) bis 65 (Gln); Helix C durch Aminosäurereste 69 (Arg) bis 86 (Ala); Helix D durch Aminosäurereste 95 (Gly) bis 114 (Ala); Helix E durch Aminosäurereste 126 (Thr) bis 142 (Lys); und Helix F durch Aminosäurereste 148 (Cys) bis 169 (Ala); wie in SEQ ID-NR:6 gezeigt.

Die vorliegende Erfindung liefert Mutationen in den IL-29 Wildtypsequenzen der SEQ ID-NR: 3 und 4, die in der Expression von Einzelformen des IL-29-Moleküls resultieren. Aufgrund der Annahme, dass die Heterogenität der Formen ein Resultat von mehrfachen intramolekulären Disulfidbindungsmustern ist, umfassen die erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiele auch Mutationen in den Cysteinresten innerhalb der wildtypischen IL-29-Sequenzen. Wenn IL-29 in E. coli exprimiert wird, ist ein N-terminales oder aminoterminal Methionin gegenwärtig. SEQ ID-NR:12–17 zeigt z. B. die Nukleotid- und Aminosäurerestnummerierung für IL-28A, IL-29 und IL-28B in Gegenwart des N-terminalen Met. Tabelle 1 zeigt die möglichen Kombinationen von intramolekulären disulfidgebundenen Cysteinpaaren für Wildtyp-IL-29. Tabelle 1

IL-28A SEQ ID-NR:2	C₁₆-C₁₁₅	C₄₈-C₁₄₈	C₅₀-C₁₄₈	C₁₆₇-C₁₇₄	C₁₆-C₄₈	C₁₆-C₅₀	C₄₈-C₁₁₅	C₅₀-C₁₁₅	C₁₁₅-C₁₄₈
Met IL-28A SEQ ID-NR:13	C₁₇-C₁₁₆	C₄₉-C₁₄₉	C₅₁-C₁₄₉₈	C₁₆₈-C₁₇₅	C₁₇-C₄₉	C₁₇-C₅₁	C₄₉-C₁₁₆	C₅₁-C₁₁₆	C₁₁₆-C₁₄₉
IL-29 SEQ ID-NR:4	C₁₅-C₁₁₂	C₄₉-C₁₄₅	C₁₁₂-C₁₇₁
Met IL-29 SEQ ID-NR:15	C₁₆-C₁₁₃	C₅₀-C₁₄₆	C₁₁₃-C₁₇₂
IL-28B SEQ ID-NR:6	C₁₆-C₁₁₅	C₄₈-C₁₄₈	C₅₀-C₁₄₈	C₁₆₇-C₁₇₄	C₁₆-C₄₈	C₁₆-C₅₀	C₄₈-C₁₁₅	C₅₀-C₁₁₅	C₁₁₅-C₁₄₈
Met IL-28B SEQ ID-NR:17	C₁₇-C₁₁₆	C₄₉-C₁₄₉	C₅₁-C₁₄₉	C₁₆₈-C₁₇₅	C₁₇-C₄₉	C₁₇-C₅₁	C₄₉-C₁₁₆	C₅₁-C₁₁₆	C₁₁₆-C₁₄₉

Die erfindungsgemäßen Polynukleotid- und Polypeptidmoleküle haben eine Mutation an einem oder mehreren der Cysteine, die in den Wildtyp-IL-29-Molekülen vorhanden sind, halten jedoch trotzdem eine bestimmte biologische Aktivität aufrecht, wie in dieser Schrift beschrieben. Tabelle 2 zeigt exemplarische Cysteinmutanten, insbesondere Punktmutationen des Cysteins (C) nach Serin (S). Tabelle 2

IL-28A C48S SEQ ID-NR:19

Met IL-28A C49S SEQ ID-NR:21

IL-28A C50S SEQ ID-NR:23

Met IL-28A C51S SEQ ID-NR:25

IL-29 C171S SEQ ID-NR:27

Met IL-29 C172S SEQ ID-NR:29
Bei allen Mitgliedern der Familie wurde die Bindung an den gleichen Klasse-II-Zytokinrezeptor, IL-28R, nachgewiesen. Die IL-28 α-Untereinheit wurde früher als Zcytor19-Rrezeptor bezeichnet. Die Bindung an eine Theorie soll zwar vermieden werden, doch es scheint, dass alle diese Moleküle aber den gleichen Signalweg durch den IL-28R-Rezeptor signalisieren. Der IL-28-Rezeptor ist beschrieben in einer allgemein zugeteilten. PCT-Anmeldung WO 02/44209 beschrieben, die durch Verweis Bestandteil dieser Schrift ist, von Sheppard et al., supra; Kotenko et al., Nature Immunol. 4:69–77, 2003 und in PCT WO/03/040345 . IL-28R ist ein Mitglied der Klasse-II-Zytokinrezeptoren, die durch die Gegenwart von einem oder mehreren Zytokinrezeptormodulen (CRM) in ihren extrazellulären Domänen gekennzeichnet sind. Weitere Klasse-II-Zytokinrezeptoren sind u. a. Zcytor11 (allgemeines Eigentum unter US-Patentnr. 5.965.704 ), CRF2-4 (Genbank Accession Nr. Z17227), IL-10R (Genbank Accession Nr. U00672 und NM_001558), DIRS1, Zcytor7 (allgemeines Eigentum unter US-Patentnr. 5.945.511 ) und Gewebefaktor. Wie alle bekannten Klasse-II-Rezeptoren außer Interferon-alpha/beta Rezeptor-alpha-Kette, hat der IL-28-Rezeptor nur ein CRM der Klasse II in seiner extrazellulären Domäne.
4-Helixbündel-Zytokine sind auch durch die Länge ihrer Komponentenhelixe gruppiert. Zytokine mit „langer Helixform" enthalten generell 24–30 Restehelixe und umfassen IL-6, den ciliären neutrotrophen Faktor (CNTF), den Leukämie-Inhibitions-Faktor (LIF) und das humane Wachstumshormon (hGH). Zytokine mit „kurzer Helixform" enthalten generell 18–21 Restehelixe und umfassen IL-2, IL-4 und GM-CSF. Studien mit CNTF und IL-6 zeigten, dass eine CNTF-Helix gegen die äquivalente Helix in IL-6 ausgetauscht werden kann, wobei die CTNF-bindenden Eigenschaften auf die Chimäre übertragen werden. Somit erscheint es, dass funktionelle Domänen von 4-Helix-Zytokinen unabhängig von der Sequenzidentität auf Basis der strukturellen Homologie bestimmt werden und die funktionelle Integrität in einer Chimäre erhalten können (Kallen et al., J. Biol. Chem. 274:11859–11867, 1999). Deshalb eignen sich Cystein-mutierte IL-28- und IL-29-Polypeptide für die Präparation von chimären Fusionsmolekülen, insbesondere mit anderen Interferonen, um die rezeptorbindende Spezifität zu bestimmen und zu modulieren. Von besonderem Interesse sind Fusionsproteine, welche Helix- und Schleifendomänen aus Interferonen und Zytokinen, wie INF-α, IL-10, humanes Wachstumshormon, kombinieren.
Die vorliegende Erfindung bietet Polynukleotidmoleküle, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, welche Cystein-mutierte IL-29-Polypeptide kodieren. Die vorliegende Erfindung bietet degenerierte Nukleotidsequenzen, welche die hier offen gelegten IL-29 C171S und Met IL-29 C172S Polypeptide kodieren. Fachkundigen Personen ist bewusst, dass angesichts der Degeneration des genetischen Codes eine beachtliche Sequenzvariation unter den Polynukleotidmolekülen möglich ist. SEQ ID-NR:30, 31, 32, 33, 34 und 35 sind degenerierte DNA-Sequenzen, die alle DNA umfassen, die jeweils IL-28A C48S, Met IL-28A C49S, IL-28A C50S, Met IL-28A C51S, IL-29 C171S und Met IL-29 C172S kodieren. Fachkundigen Personen ist bewusst, dass die degenerierte Sequenz von SEQ ID-NR:30, 31, 32, 33, 34 und 35 auch alle RNA-Sequenzen liefert, die SEQ ID-NR:30, 31, 32, 33, 34 und 35 kodieren, indem U gegen T ausgetauscht wird.
IL-28A-Polypeptide umfassen eine Mutation am zweiten Cystein, C2, des reifen Polypeptids. So ist z. B. C2 vom N-Terminus oder Aminoterminus des Polypeptids der SEQ ID-NR:2 das Cystein an der Aminosäurenposition 48 oder 49 (zusätzlich N-terminales Met), wenn in E. coli exprimiert (siehe z. B. SEQ ID-NR:13). Dieses zweite Cystein (von dem es sieben gibt, wie z. B. IL-28B) bzw. C2 des IL-28A kann z. B. zu Serin, Alanin, Threonin, Valin oder Asparagin mutiert werden. IL-28A-C2-mutierte Moleküle sind u. a. Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:20 und 22, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-28A-C2-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:21 und 23 kodieren. SEQ ID-NR:36 und 37 sind zusätzliche IL-28A-C2-Polypeptide.
Neben den IL-28A-C2-Mutanten können IL-28A-Polypeptide eine Mutation an der dritten Cysteinposition, C3, des reifen Polypeptids umfassen. So ist z. B. C3 vom N-Terminus oder Aminoterminus des Polypeptids der SEQ ID-NR:2 das Cystein an der Position 50 oder 51 (zusätzlich N-terminales Met), wenn in E. coli exprimiert (siehe z. B. SEQ ID-NR:13). IL-28A-C3-mutierte Moleküle sind u. a. Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:24 und 26, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-28A-C3-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:25 und 27 kodieren. SEQ ID-NR:38 und 39 sind zusätzliche IL-28A-C3-Polypeptide.
Die IL-28A-Polypeptides umfassen z. B. SEQ ID-NR:2, 13, 19, 21, 23 und 25, die durch IL-28A-Polynukleotidmolekülen aus jeweils SEQ ID-NR:1, 12, 18, 20, 22 und 24 kodiert werden. Des Weiteren umfassen IL-28A-Polypeptide SEQ ID-NR:36, 37, 38 und 39.
IL-28B-Polypeptide umfassen auch eine Mutation am zweiten Cystein, C2, des reifen Polypeptids. So ist z. B. C2 vom N-Terminus oder Aminoterminus des Polypeptids der SEQ ID-NR:6 das Cystein an der Aminosäurenposition 48 oder 49 (zusätzlich N-terminales Met), wenn in E. coli exprimiert (siehe z. B. SEQ ID-NR:17). Dieses zweite Cystein (von dem es sieben gibt, wie z. B. IL-28A) bzw. C2 des IL-28B kann z. B. zu Serin, Alanin, Threonin, Valin oder Asparagin mutiert werden. IL-28B-C2-mutierte Moleküle sind u. a. Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:122 und 124, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-28B-C2-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:123 und 125 kodieren. IL-28B-C2-mutierte Moleküle sind des Weiteren Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:130 und 132, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-28B-C2-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:131 und 133 kodieren (PCT-Publikation WO 03/066002 (Kotenko et al.)).
Neben den IL-28B-C2-Mutanten können IL-28B-Polypeptide eine Mutation an der dritten Cysteinposition, C3, des reifen Polypeptids umfassen. So ist z. B. C3 vom N-Terminus oder Aminoterminus des Polypeptids der SEQ ID-NR:6 das Cystein an der Position 50 oder 51 (zusätzlich N-terminales Met), wenn in E. coli exprimiert (siehe z. B. SEQ ID-NR:17). IL-28B-C3-mutierte Moleküle sind u. a. Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:126 und 128, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-28B-C3-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:127 und 129 kodieren. IL-28B-C3-mutierte Moleküle sind des Weiteren Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:134 und 136, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-28B-C3-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:135 und 137 kodieren (PCT-Publikation WO 03/066002 (Kotenko et al.)).
Die IL-28B-Polypeptides umfassen z. B. SEQ ID-NR:6, 17, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135 und 137, die durch IL-28B-Polynukleotidmolekülen aus jeweils SEQ ID-NR:5, 16, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 und 136 kodiert werden.
Erfindungsgemäße IL-29-Polypeptide umfassen z. B. auch eine Mutation am fünften Cystein, C5, des reifen Polypeptids. So ist z. B. C5 vom N-Terminus des Polypeptids der SEQ ID-NR:4 das Cystein an der Position 171 oder 172 (zusätzlich N-terminales Met), wenn in E. coli exprimiert (siehe z. B. SEQ ID-NR:15). Dieses fünfte Cystein bzw. C5 des IL-29 kann z. B. zu Serin, Alanin, Threonin, Valin oder Asparagin mutiert werden. Diese IL-29-C5-mutierten Polypeptide haben ein Disulfidbindungsmuster von C1(Cys15 der SEQ ID-NR:4)/C3(Cys112 der SEQ ID-NR:4) und C2(Cys49 der SEQ ID-NR:4)/C4(Cys 145 der SEQ ID-NR:4). Weitere erfindungsgemäße IL-29-C5-mutierte Moleküle umfassen u. a. Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:26, 28, 82, 84, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-29-C5-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:27, 29, 83, 85, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161 kodieren. Erfindungsgemäße IL-29-C5-mutierte Moleküle sind des Weiteren Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:86, 88, 94 und 96, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-29B-C5-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:87, 89, 95 und 97 kodieren (PCT-Publikation WO 03/066002 (Kotenko et al.)). Erfindungsgemäße IL-29-C5-mutierte Moleküle sind des Weiteren Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:102, 104, 110 und 112, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-29-C5-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:103, 105, 111 und 113 kodieren (PCT-Publikation WO 02/092762 (Baum et al.)).
Neben den IL-29-C5-Mutanten können IL-29-Polypeptide eine Mutation an der ersten Cysteinposition, C1, des reifen Polypeptids umfassen. So ist z. B. C1 vom N-Terminus des Polypeptids der SEQ ID-NR:4 das Cystein an der Position 15 oder 16 (zusätzlich N-terminales Met), wenn in E. coli exprimiert (siehe z. B. SEQ ID-NR:15). Diese IL-29-C1-mutierten Polypeptide haben somit ein vorhersehbares Disulfidbindungsmuster von C2(Cys49 der SEQ ID-NR:4)/C4(Cys145 der SEQ ID-NR:4) und C3(Cys112 der SEQ ID-NR:4)/C5(Cys171 der SEQ ID-NR:4). IL-29-C1-mutierte Moleküle umfassen des Weiteren Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:74, 76, 78 und 80, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-29-C1-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:75, 77, 79 und 81 kodieren. IL-29-C1-mutierte Moleküle umfassen des Weiteren Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:90, 92, 98 und 100, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-29-C1-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:91, 93, 99 und 101 kodieren (PCT-Publikation WO 03/066002 (Kotenko et al.)). IL-29-C1-mutierte Moleküle umfassen des Weiteren Polynukleotidmoleküle aus SEQ ID-NR:106, 108, 114 und 116, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, die IL-29-C1-mutierte Polypeptide aus jeweils SEQ ID-NR:107, 109, 115 und 117 kodieren (PCT-Publikation WO 02/092762 (Baum et al.)).
Erfindungsgemäße IL-29-Polypeptide umfassen z. B. SEQ ID-NR: 27, 29, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161, die von IL-29-Polynukleotidmolekülen aus SEQ ID-NR:3, 14, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160 kodiert werden und des Weiteren eine Signalsequenz aus SEQ ID-NR:119 oder eine Signalsequenz aus SEQ ID-NR:121 umfassen können. Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren die IL-29-Polypeptide aus SEQ ID-NR:40 und 41. Ein Polynukleotidmolekül, das das Signalsequenzpolypeptid der SEQ ID-NR:119 kodiert, ist als SEQ ID-NR:118 gezeigt. Ein Polynukleotidmolekül, das das Signalsequenzpolypeptid der SEQ ID-NR:120 kodiert, ist als SEQ ID-NR:121 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid bereit, das eine Sequenz von Aminosäureresten umfasst, die aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wurde: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161. In einem Ausführungsbeispiel ist das isolierte Polypeptid eine Aminosäurensequenz, die aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wurde: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161.
Ein Fusionsprotein kann ein Polypeptid umfassen, das eine Sequenz von Aminosäureresten umfasst, die aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wurde: 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161; und eine Polyalkyloxiduntereinheit. Die Polyalkyloxiduntereinheit kann wahlweise Polyethylenglycol sein, wie z. B. MPEG-Propionaldehyd 20 kD oder MPEG-Propionaldehyd 30 kD. Das Polyethylenglycol kann linear oder vernetzt sein. Das Polyethylenglycol kann N-terminal oder C-terminal kovalent mit dem Polypeptid verbunden werden.
Ein Fusionsprotein kann ein erstes Polypeptid und ein zweites Polypeptid umfassen, die durch eine Peptidbindung verbunden sind, wobei das erste Polypeptid eine Sequenz von Aminosäureresten umfasst, die aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wurde: 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161 und ein zweites Polypeptid. Das zweite Polypeptid kann wahlweise ein Antikörperfragment sein. Das Antikörperfragment kann wahlweise F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv und/oder eine minimale Erkennungseinheit sein. Das zweite Polypeptid kann wahlweise Humanalbumin sein. Das zweite Polypeptid kann wahlweise ein Polypeptid sein, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die Affinitätstags, Toxine, Radionukleotide, Enzyme und Fluorophore umfasst.

In Tabelle 3 sind die in SEQ ID-NR:30, 31, 32, 33, 34 und 35 verwendeten einstelligen Buchstabencodes zur Bezeichnung der degenerierten Nukleotid-Positionen aufgeführt. „Auflösungen" sind die mit einem Buchstaben-Code bezeichneten Nukleotide. „Komplement" ist der Code für das(die) Komplement-Nukleotid(e). Beispiel: Der Code Y bezeichnet entweder C oder T, und sein Komplement R bezeichnet A oder G, wobei A komplementär zu T und G komplementär zu C ist. Tabelle 3

Nukleotid	Auflösung	Komplement	Auflösung
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A\|G	Y	C\|T
Y	C\|T	R	A\|G
M	A\|C	K	G\|T
K	G\|T	M	A\|C
S	C\|G	S	C\|G
W	A\|T	W	A\|T
H	A\|C\|T	D	A\|G\|T
B	C\|G\|T	V	A\|C\|G
V	A\|C\|G	B	C\|G\|T
D	A\|G\|T	H	A\|C\|T
N	A\|C\|G\|T	N	A\|C\|G\|T

Die in SEQ ID-NR:30, 31, 32, 33, 34 und 35 verwendeten degenerierten Codone, die alle für eine gegebene Aminosäure möglichen Codone umfassen, sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4

Aminosäure	Buchstaben-Code	Codone	Degeneriertes Codon
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gln	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter	.	TAA TAG TGA	TRR
Asn\|Asp	B		RAY
Glu\|Gln	Z		SAR
Any	X		NNN

Fachkundigen Personen ist bewusst, dass bei der Bestimmung eines degenerierten Codons, das für alle möglichen aminosäurekodierenden Codone repräsentativ ist, eine leichte Zweideutigkeit auftreten kann. Ein degeneriertes Codon für Serin (WSN) kann z. B. unter bestimmten Umständen Arginin (AGR) kodieren, und das degenerierte Codon für Arginin (MGN) kann unter bestimmten Umständen Serin (AGY) kodieren. Eine ähnliche Beziehung besteht zwischen Codonen, die Phenylalanin und Leucin kodieren. Bestimmte Polynukleotide, die zur degenerativen Sequenz gehören, können somit variante Aminosäurensequenzen kodieren, die fachkundige Person kann jedoch solche variante Sequenzen durch Bezugnahme auf die Aminosäurensequenz z. B. der SEQ ID-NR:19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161 leicht erkennen. Variante Sequenzen lassen sich wie in dieser Schrift beschrieben leicht auf ihre Funktionalität prüfen.
Der fachkundigen Person ist auch bewusst, dass sich bei verschiedenen Spezies ein „bevorzugter Codongebrauch" zeigen kann. Siehe allgemein Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893–912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6:315–24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355–64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18:199–209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075–87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573–97, 1982. Im Sinne dieser Schrift bezieht sich der Begriff „präferenzieller Codongebrauch" oder „präferenzielle Codone" auf einen Fachbegriff, der sich auf die Proteintranslationscodone bezieht, die am häufigsten in den Zellen einer bestimmten Spezies verwendet werden und somit eine Bevorzugung eines oder mehrerer Vertreter der möglichen Codone, die jede Aminosäure kodieren (siehe Tabelle 4), darstellen. Die Aminosäure Threonin (Thr) kann z. B. von ACA, ACC, ACG oder ACT kodiert werden, doch in Säugetierzellen ist ACC das am häufigsten verwendete Codon; in anderen Spezies, z. B. in Insektenzellen, Hefe, Viren oder Bakterien, können andere Thr-Codone die präferenziellen Codone sein. Bevorzugte Codone für eine bestimmte Spezies können durch verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Methoden in die erfindungsgemäßen Polynukleotide eingeführt werden. Die Einführung von bevorzugten Codonsequenzen in rekombinante DNA kann z. B. die Proteinproduktion verbessern, indem die Proteintranslation innerhalb eines bestimmten Zelltyps oder einer Spezies effizienter gemacht wird. Deshalb dienen die in SEQ ID-NR:30, 31, 32, 33, 34 und 35 offen gelegten Codonsequenzen als Vorlage für die Optimierung der Polynukleotidexpression in verschiedene Zelltypen und Spezies, die im Stand der Technik häufig verwendet werden und hier offen gelegt sind. Die Sequenzen, die bevorzugte Codone enthalten, können wie hier beschrieben für die Expression in verschiedene Spezies optimiert und auf ihre Funktionalität geprüft werden.
Ein isoliertes Polynukleotid wird aus der Gruppe ausgewählt, die folgende SEQ ID-NR. umfasst: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160.
Ein isoliertes Polynukleotid ist fähig zur Hybridisierung an eine Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt, die folgende SEQ ID-NR. umfasst: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160 oder ein Komplement davon, unter den Hybridisierungsbedingungen 50% Formamid, 5 × SSC (1 × SSC: 0,15 M Natriumchlorid und 15 mM Natrumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung (100 × Denhardt-Lösung: 2% (Gewicht/Volumen) Ficoll 400, 2% (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon und 2% (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte abgescherte Lachsspermien-DNA bei ca. 42°C bis ca. 70°C, wobei das isolierte Polynukleotid ein Polypeptid, das antivirale Aktivität aufweist, kodiert. Wahlweise weist das kodierte Polypeptid antivirale Aktivität gegen Hepatitis B und/oder Hepatitis C auf. Wahlweise kann das isolierte Polynukleotid mindestens einen Teil einer Sequenz kodieren, die aus der Gruppe ausgewählt, die folgende SEQ ID-NR. umfasst: 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161. Das isolierte Polynukleotid kann ein Polypeptid kodieren, das durch folgende SEQ ID-NR. repräsentiert wird: 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 oder 161.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid bereit, das ein Polypeptid kodiert, wobei das kodierte Polypeptid aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wird: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161.
Wahlweise weist das kodierte Polypeptid antivirale Aktivität gegen Hepatitis B und/oder Hepatitis C auf.
Wie oben erwähnt, umfassen die erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotide DNA und RNA. Methoden für die Präparation von DNA und RNA sind aus dem Stand der Technik bekannt. Generell wird RNA aus einem Gewebe oder einer Zelle isoliert, welche(s) große Mengen der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-RNA produziert. Solche Gewebe und Zellen werden durch Northern Blotting identifiziert (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980) oder durch das Screening von konditioniertem Medium aus verschiedenen Zelltypen auf Aktivitäten auf den Zielzellen oder -geweben. Nach der Identifizierung der Aktivität oder der RNA-produzierenden Zellen oder Gewebe kann die Total RNA durch Guanidinium-Isothiocyanat-Extraktion gefolgt von einer Abtrennung durch Zentrifugieren in einem CsC1-Gradient präpariert werden (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52–94, 1979). Poly (A)⁺ RNA wird aus der Gesamt-RNA präpariert, wobei die Methode von Aviv und Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408–12, 1972) verwendet wird. Komplementäre DNA (cDNA) wird unter Einsatz bekannter Methoden aus der poly(A)⁺ RNA präpariert. Als Alternative kann genomische DNA isoliert werden. Anschließend werden die die Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptide kodierenden Polynukleotide identifiziert und beispielsweise durch Hybridisierung oder PCR isoliert.
Gesamtklon-kodierendes Cystein-mutiertes IL-28 oder IL-29 kann durch konventionelle Klonierungsverfahren gewonnen werden. Komplementäre DNA(cDNA)-Klone werden bevorzugt, obwohl für einige Anwendungen (z. B. Expression in transgene Tiere) eventuell die Verwendung eines genomischen Klons zu bevorzugen ist oder die Modifizierung eines cDNA-Klons, um mindestens ein genomisches Intron einzuschließen. Methoden für die Präparation von cDNA und genomischen Klonen sind bekannt und liegen im Wissen der fachkundigen Person, und umfassen die Verwendung der hier offen gelegten Sequenz, bzw. Teilen davon, für das Probing oder Priming einer Bibliothek. Expressionsbibliotheken können mit Antikörpern gegen IL-28-Rezeptorfragmente oder anderen spezifisch bindenden Partnern sondiert werden.
Fachkundigen Personen ist bewusst, dass die z. B. in SEQ ID-NR: 1, 3 und 5 offen gelegte Sequenz Mutationen von Einzelallelen der humanen IL-28- und IL-29-Banden darstellt und dass Allelvarianten und alternative Spleißung auftreten können. Es wurde z. B. eine IL-29-Variante identifiziert, bei der Aminosäurerest 169 (Asn) aus SEQ ID-NR:4 ein Arg-Rest ist, wie in WO 02/086087 beschrieben. Allelvarianten dieser Sequenz können durch cDNA-Probing oder Genombibliotheken von verschiedenen Personen gemäß den Standardverfahren kloniert werden. Allelvarianten der in SEQ ID-NR:3 gezeigten DNA-Sequenz, einschließlich derer mit stummen Mutationen und jener, bei denen Mutationen in Aminosäurensequenz-Veränderungen resultieren, liegen zusätzlich zu den Cysteinmutationen im Umfang der vorliegenden Erfindung, ebenso wie Proteine, die Allelvarianten von SEQ ID-NR:4 sind. cDNA, die aus alternativ gespleißten mRNA generiert werden, welche die Eigenschaften des Cystein-mutierten IL-29-Polypeptids erhalten, sind im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten, ebenso wie Polypeptide, die von solchen cDNA und mRNA kodiert werden. Allelvarianten und Spleißvarianten dieser Sequenzen können durch cDNA-Probing oder Genombibliotheken von verschiedenen Personen oder Geweben gemäß den aus dem Stand der Technik bekannten Standardverfahren kloniert werden und Mutationen zu Polynukleotiden, die Cystein oder Cysteinreste kodieren, können wie in dieser Schrift beschrieben eingefügt werden.
Isolierte variante oder Cystein-mutierte IL-28- und IL-29-kodierende Nukleinsäuremoleküle können unter strengen Bedingungen an Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160 enthalten, oder an Nukleinsäuremoleküle, welche eine zur SEQ ID-NR:18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160 komplementäre Nukleotidsequenz enthalten. Generell sind die gewählten strengen Bedingungen ungefähr 5°C niedriger als der thermale Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einem festgelegten ionischen Stärkewert und pH-Wert. T_m ist die Temperatur (unter der festgelegten ionischen Stärke und dem pH-Wert), bei der 50% der Zielsequenz an eine perfekt übereinstimmende Sonde hybridisiert werden.
Ein Paar Nukleinsäuremoleküle, wie z. B. DNA-DNA, RNA-RNA und DNA-RNA, können hybridisieren, wenn die Nukleotidsequenzen einen bestimmten Grad von Komplementarität aufweisen. Hybride können nicht übereinstimmende Paare in der Doppelhelix tolerieren, aber die Stabilität des Hybrids wird durch den Grad der Nichtübereinstimmung beeinflusst. Die T_m des nicht-übereinstimmenden Hybrids nimmt für jede Basenpaar-Nichtübereinstimmung von 1–1,5% um 1°C ab. Durch eine Variierung der Strenge der Hybridisierungsbedingungen kann der Grad der Nichtübereinstimmung im Hybrid kontrolliert werden. Der Grad der Strenge erhöht sich mit dem Anstieg der Hybridisierungstemperatur und die ionische Stärke des Hybridisierungspuffers verringert sich.
Fachkundige Personen haben die Fähigkeiten, diese Bedingungen für die Verwendung mit einem bestimmten Polypeptidhybrid anzupassen. Die T_m für eine spezifische Zielsequenz ist die Temperatur (unter den festgelegten Bedingungen), bei der 50% der Zielsequenz an eine perfekt übereinstimmende Sondensequenz hybridisiert werden. Diese Bedingungen, die sich auf die T_m auswirken, sind u. a. die Größe und der Basenpaarinhalt der Polynukleotidsonde, die ionische Stärke der Hybridisierungslösung und die Gegenwart von destabilisierenden Agenzien in der Hybridisierungslösung. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Gleichungen für die Berechnung der T_m bekannt und spezifisch für DNA, RNA und DNA-RNA-Hybride und Polynukleotidsondensequenzen verschiedener Längen (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); und Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Sequenzanalysensoftware wie z. B. OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN, USA) und Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA, USA) sowie Internet-Sites sind für die Analyse einer gegebenen Sequenz und Berechnung der T_m basierend auf benutzerdefinierten Kriterien verfügbar. Solche Programme können auch eine gegebene Sequenz unter definierten Bedingungen analysieren und geeignete Sondensequenzen identifizieren. Normalerweise wird die Hybridisierung von längeren Polynukleotidsequenzen mit > 50 Basenpaaren bei Temperaturen von etwa 20–25°C unter der berechneten T_m durchgeführt. Bei kleineren Sonden mit < 50 Basenpaaren wird die Hybridisierung meistens bei T_m oder 5–10°C unter der kalkulierten durchgeführt. Dadurch wird die maximale Hybridisierungsrate für DNA-DNA und DNA-RNA Hybride ermöglicht.
Nach der Hybridisierung können die Nukleinsäuremoleküle unter strengen oder hoch-strengen Bedingungen gewaschen werden, um nicht-hybridisierte Nukleinsäuremoleküle zu entfernen. Typische strenge Waschbedingungen umfassen das Waschen in einer Lösung aus 0,5×–0,2 × SSC mit 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 55–65°C. Das heißt, Nukleinsäuremoleküle, die variante oder Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Polypeptide kodieren, hybridisieren unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz aus jeweils SEQ ID-NR: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,5×–2 × SSC mit 0,1 % SDS bei 55–65°C, einschließlich 0,5 × SSC mit 0,1% SDS bei 55°C oder 2 × SSC mit 0,1% SDS bei 65°C entspricht. Die fachkundige Person kann leicht äquivalente Bedingungen entwickeln, z. B. durch Substitution von SSPE gegen SSC in der Waschlösung.
Typische hoch-strenge Waschbedingungen umfassen das Waschen in einer Lösung aus 0,1×–0,2 × SSC mit 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 50–65°C. Das heißt, Nukleinsäuremoleküle, die ein variantes oder Cystein-mutiertes IL-28- oder IL-29-Polypeptid kodieren, hybridisieren unter hoch-strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz aus jeweils SEQ ID-NR:18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,1×–0,2 × SSC mit 0,1% SDS bei 50–65°C, einschließlich 0,1 × SSC mit 0,1% SDS bei 50°C oder 0,2 × SSC mit 0,1% SDS bei 65°C entspricht.
IL-29-Polypeptide können eine im Wesentlichen ähnliche Sequenzidentität mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden aufweisen, z. B. SEQ ID-NR: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 oder 161. Der hier verwendete Begriff „im Wesentlichen ähnliche Sequenzidentität" bedeutet, dass Polypeptide eine Sequenzidentität von mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% mit den Sequenzen aus SEQ ID-NR:2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 oder 161 oder deren Orthologen aufweisen. Polypeptide können eine Aminosäurensequenz umfassen, die eine Sequenzidentität von mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Fragment davon aufweist. Erfindungsgemäße IL-29-Polypeptide sind vorzugsweise rekombinante Polypeptide. Erfindungsgemäße IL-29-Polypeptide enthalten mindestens 60 sequenzielle Aminosäuren. Methoden für die Bestimmung der Prozentidentität sind unten beschrieben.
Variante Nukleinsäuremoleküle können unter Verwendung von zwei Kriterien identifiziert werden: die Bestimmung der Ähnlichkeit zwischen dem kodierten Polypeptid und der Aminosäurensequenz aus SEQ ID-NR: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 oder 161 und/oder einem Hybridisierungs-Assay (wie oben beschrieben). Solche Varianten umfassen Nukleinsäuremoleküle, die: (1) unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisieren, das die Nukleotidsequenz aus SEQ ID-NR: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,5×–2 × SSC mit 0,1% SDS bei 55–65°C entspricht, oder (2) die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID-NR:19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 oder 161 aufweist. Alternativ können Varianten als Nukleinsäuremoleküle gekennzeichnet sein, die: (1) unter hoch-strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisieren, das die Nukleotidsequenz aus SEQ ID-NR: 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 und 160 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,1×–0,2 × SSC mit 0,1% SDS bei 50–65°C entspricht, und (2) die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID-NR:19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 oder 161 aufweist.
Die prozentuale Sequenzidentität wird durch konventionelle Methoden bestimmt. Siehe z. B. Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), und Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). Kurz zusammengefasst, es werden zwei Aminosäurensequenzen aliniert, um die Alignment-Scores zu optimieren, wobei 10 Strafpunkte für das Einfügen einer Lücke (Gap Opening Penalty), 1 Strafpunkt für die Erweiterung einer Lücke (Gap Extension Penalty) und die „BLOSUM62" Scoring-Matrix von Henikoff and Henikoff (ibid.) wie in Tabelle 4 gezeigt verwendet werden (Aminosäuren sind mit ihren standardmäßigen Buchstaben-Codes aufgeführt).
Fachleuten ist bewusst, dass für das Alignment von zwei Aminosäurensequenzen viele etablierte Algorithmen zur Verfügung stehen. Der „FASTA" Ähnlichkeit-Suchalgorithmus von Pearson and Lipman ist eine geeignete Protein-Alignmentmethode für die Prüfung der Identitätsebene zwischen der hier offen gelegten Aminosäuresequenz und der Aminosäuresequenz eines putativen varianten IL-28 oder IL-29. Der FASTA-Algorithmus wird beschrieben von Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) und Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
Kurz zusammengefasst, FASTA charakterisiert zuerst die Sequenzähnlichkeit durch Identifizierung der Regionen, die von der Abfragesequenz (z. B. SEQ ID-NR:2) gemeinsam verwendet werden, und einer Testsequenz, welche entweder die höchste Dichte von Identitäten (wenn die ktup-Variable 1 ist) oder Identitätspaare (wenn ktup = 2) aufweisen, ohne konservative Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen zu berücksichtigen. Die zehn Regionen mit der höchsten Identitätsdichte werden dann durch einen Vergleich der Ähnlichkeit aller gepaarten Aminosäuren neu bewertet, wozu eine Aminosäuresubstitutionsmatrix verwendet wird, und die Enden der Regionen werden „zugeschnitten", so dass sie nur noch die Reste enthalten, die zum höchsten Score beitragen. Wenn mehrere Regionen mit Scores über dem „Abgrenzwert" auftreten (berechnet durch eine festgelegte Formel basierend auf der Länge der Sequenz und des ktup-Wertes), werden die ursprünglichen zugeschnittenen Regionen geprüft, um zu bestimmen, ob die Regionen zur Bildung eines ungefähren Alignments mit Lücken verbunden werden können. Schließlich werden die Regionen der zwei Aminosäurensequenzen mit dem höchsten Score aliniert, wozu eine Modifizierung des Needleman-Wunsch-Sellers Algorithmus (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)) verwendet wird, welche Insertionen und Deletionen von Aminosäuren erlaubt. Die bevorzugten Parameter für die FASTA-Analyse sind: ktup = 1, Strafpunkte für das Einfügen einer Lücke = 10, Strafpunkte für die Erweiterung einer Lücke = 1 und Substitutionsmatrix = BLOSUM62. Diese Parameter können durch Modifizierung der Scoring-Matrix-Datei („SMATRIX"), wie in Anhang 2 von Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990) erklärt, in ein FASTA-Programm eingefügt werden.
FASTA kann auch zur Bestimmung der Sequenzidentität von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, wobei das oben offen gelegte Verhältnis Anwendung findet. Für Nukleotidsequenzvergleiche kann der ktup-Wert im Bereich von eins bis sechs, vorzugsweise im Bereich von drei bis sechs liegen und am besten drei betragen, wobei die anderen Parameter als Standardeinstellung eingestellt werden.

Variante IL-28- oder Cystein-mutierte IL-29-Polypeptide oder Polypeptide mit im Wesentlichen ähnlicher Sequenzidentität sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen aufweisen. Diese Veränderungen sind vorzugsweise minimal, d. h. konservative Aminosäuresubstitutionen (siehe Tabelle 6) und andere Substitutionen, die keine bedeutenden Auswirkungen auf die Faltung oder Aktivität des Polypeptids haben; kleine Deletionen, normalerweise bestehend aus einem bis etwa 30 Aminosäuren; und amino- oder carboxylterminale Erweiterungen wie ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linker-Peptid bis zu etwa 20–25 Resten oder ein Affinitäts-Tag. Polypeptide von etwa 146 bis 207 Aminosäureresten können eine Sequenz umfassen, die mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder mehr als 99% Sequenzidentität mit der entsprechenden Region der SEQ ID-NR:19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 oder 161 aufweisen. Polypeptide, die Affinitäts-Tags umfassen, können des Weiteren eine proteolytische Spaltstelle zwischen dem IL-28- und IL-29-Polypeptid und dem Affinitäts-Tag umfassen. Solche Stellen umfassen vorzugsweise Thrombinspaltstellen und Faktor-Xa-Spaltstellen. Tabelle 6 Konservative Aminosäuresubstitionen

Basisch:	Arginin
	Lysin
	Histidin
Sauer:	Glutaminsäure
	Asparginsäure
Polar:	Glutamin
	Asparagin
Hydrophob:	Leucin
	Isoleucin
	Valin
Aromatisch:	Phenylalanin
	Tryptophan
	Tyrosin
Klein:	Glycin
	Alanin
	Serin
	Threonin
	Methionin

Aminosäurereste, welche die für die Erhaltung der strukturellen Integrität wichtigen Regionen oder Domänen umfassen, können bestimmt werden. Innerhalb dieser Regionen können spezifische Reste bestimmt werden, die mehr oder weniger änderungstolerant sind und die tertiäre Gesamtstruktur des Moleküls aufrechterhalten. Methoden für die Analyse der Sequenzstruktur sind u. a. ohne Einschränkung Alignment von mehreren Sequenzen mit hoher Aminosäuren- oder Nukleotid-Identität, sekundäre Strukturtendenzen, binäre Muster, komplementäre Packung und verborgene polare Wechselwirkungen (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372–376, 1995 und Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:3–10, 1996). Bei der Konstruktion von Modifizierungen an Molekülen oder bei der Identifizierung spezifischer Fragmente muss generell bei der Bestimmung der Struktur auch die Aktivität der modifizierten Moleküle beurteilt werden.
Aminosäurensequenzänderungen werden in den Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptiden so vorgenommen, dass die Störung der für die biologische Aktivität notwendigen übergeordneten Struktur minimal gehalten wird. Wenn das Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Polypeptid z. B. eines oder mehrere Helixe umfasst, werden Änderungen in den Aminosäureresten so vorgenommen, dass die Helixgeometrie und andere Komponenten des Moleküls, in dem Veränderungen der Anordnung eine wichtige Funktion schwächen würden, z. B. die Bindung des Moleküls an seine Bindungspartner, nicht gestört werden. Die Auswirkungen von Veränderungen der Aminosäurensequenz können vorhergesagt werden, z. B. durch das oben offen gelegte Computer-Modeling oder durch eine Analyse der Kristallstruktur (siehe z. B. Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266–268, 1995). Weitere aus dem Stand der Technik bekannte Methoden sind ein Vergleich der Faltung eines varianten Proteins mit einem Standardmolekül (z. B. das native Protein). So kann z. B. ein Vergleich des Cysteinmusters in einem varianten und in Standardmolekülen durchgeführt werden. Massenspektrometrie und chemische Modifizierungen unter Verwendung von Reduktion und Alkylierung sind Methoden für die Bestimmung von Cysteinresten, welche mit Disulfidverbindungen in Verbindung stehen oder die frei von solchen Verbindungen sind (Bean et al., Anal. Biochem. 201:216–226, 1992; Gray, Protein Sci. 2:1732–1748, 1993; und Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727–3732, 1994). Es wird generell angenommen, dass die Faltung betroffen wird, wenn ein modifiziertes Molekül nicht das gleiche Cysteinmuster wie das Standardmolekül hat. Eine weitere gut bekannte und akzeptierte Methode für die Messung der Faltung ist der zirkuläre Dichroismus (Circular Dichroism/CD). Die Messung und der Vergleich der von einem modifizierten Molekül und einem Standardmolekül generierten CD-Spektren ist ein routinemäßiges Verfahren (Johnson, Proteins 7:205–214, 1990). Kristallographie ist eine weitere gut bekannte Methode für die Analyse der Faltung und Struktur. Kernmagnetische Resonanz (NMR), digestives Peptidmapping und Epitopmapping sind ebenfalls bekannte Methoden für die Analyse der Faltung und struktureller Ähnlichkeiten zwischen Proteinen und Polypeptiden (Schaanan et al., Science 257:961–964, 1992).
Es kann auch ein Hopp/Woods Hydrophilitätsprofil der in SEQ ID-NR: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 oder 161 gezeigten Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Proteinsequenz generiert werden (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824–3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1–18, 1986 und Triquier et al., Protein Engineering 11:153–169, 1998). Das Profil basiert auf einem gleitenden Fenster mit sechs Aminosäureresten. Verborgene G-, S- und T-Reste und exponierte H-, Y- und W-Reste wurden ignoriert. Fachkundige Personen erkennen, dass Hydrophilität oder Hydrophobität bei der Konstruktion von Modifizierungen in der Aminosäurensequenz eines Cysteinmutanten IL-28- oder IL-29-Polypeptids berücksichtigt werden, um eine Störung der Gesamtstruktur und des biologischen Profils zu vermeiden. Von besonderem Interesse für den Austausch sind hydrophobe Reste, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die Val, Leu und Ile enthält, oder der Gruppe, die Met, Gly, Ser, Ala, Tyr und Trp enthält.
Die Identitäten essenzieller Aminosäuren können auch aus der Analyse von Sequenzähnlichkeiten zwischen IFN-α und Mitgliedern der Familie der IL-28A, IL-28B und IL-29 (wie in Tabellen 1 und 2 gezeigt) ermittelt werden. Unter Verwendung von Methoden wie der oben beschriebenen „FASTA"-Analyse werden Regionen mit hoher Ähnlichkeit innerhalb einer Familie von Proteinen identifiziert und für die Analyse der Aminosäurensequenz für konservierte Regionen herangezogen. Ein alternativer Ansatz zur Identifizierung eines varianten Polynukleotids auf Basis der Struktur ist die Bestimmung, ob ein Nukleinsäuremolekül, das ein potenzielles variantes IL-28- oder IL-29-Gen kodiert, wie oben besprochen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisieren kann.
Andere Methoden zur Identifizierung essenzieller Aminosäuren in den erfindungsgemäßen Polypeptiden sind aus dem Stand der Technik bekannt, wie z. B. ortsspezifische Mutagenese oder Alaninscanning-Mutagenese (Cunningham and Wells, Science 244, 1081, (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs and Corey, „Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering„ in Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), S. 259–311 (Academic Press, Inc. 1998)). Bei der letzteren Methode werden einzelne Alaninmutationen an jedem Rest im Molekül eingefügt und die resultierenden Cystein-mutierten Moleküle werden wie unten offen gelegt auf biologische oder biochemische Aktivität geprüft, um die für die Aktivität des Moleküls wichtigen Aminosäurereste zu identifizieren. Siehe auch Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).
Funktionelle Fragmente der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptide und Nukleinsäuremoleküle, welche solche funktionellen Fragmente kodieren, sind gekennzeichnet durch eine proliferative oder differenzierende Aktivität, durch ihre Fähigkeit zur Induktion oder Inhibition spezialisierter Zellfunktionen oder durch ihre Fähigkeit zur spezifischen Bindung an einen Anti-IL-28- oder IL-29-Antikörper oder IL-28-Rezeptor (entweder löslich oder immobilisiert). Die spezialisierten Aktivitäten der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptide und die zu deren Bestimmung verwendeten Testmethoden werden in dieser Schrift beschrieben. Wie oben beschrieben sind IL-28- und IL-29-Polypeptide durch eine 6-Helix-Bündelstruktur gekennzeichnet. Fusionsproteine können somit Folgendes umfassen: (a) Polypeptidmoleküle, die eine oder mehrere der oben beschriebenen Helixe umfassen; und (b) funktionelle Fragmente, die eine oder mehrere dieser Helixe umfassen. Der andere Polypeptidanteil des Fusionsproteins kann von einem anderen Helixbündel-Zytokin oder Interferon, wie z. B. INF-α, oder von einem nicht-nativen und/oder unverwandten sekretorischen Signalpeptid beigetragen werden, das die Sekretion des Fusionsproteins ermöglicht.
Die erfindungsgemäßen Cystein-mutierten IL-29-Polypeptide können gemäß konventioneller Methoden unter Verwendung von Zellen, in die ein Polypeptid-kodierender Expressionsvektor eingefügt wurde, produziert werden. Im Sinne dieser Schrift sind „Zellen, in die ein Expressionsvektor eingefügt wurde", sowohl direkt durch die Einfügung exogener DNA-Moleküle manipulierte Zellen als auch Nachkommen dieser Zellen, welche die eingefügte DNA enthalten. Geeignete Wirtszellen sind jene Zelltypen, die mit exogener DNA transformiert oder transfektiert und in einem Nährmedium kultiviert werden können, u. a. Bakterien, Pilzzellen und kultivierte höhere Eukaryonten. Methoden für die Manipulation von klonierten DNA-Molekülen und Einführung von exogener DNA in verschiedene Wirtszellen wurden von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989, und Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, USA, 1987, offen gelegt.
In einem weiteren Aspekt bietet die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, der die folgenden funktionell verknüpften Elemente umfasst: einen Transkriptionspromoter; ein DNA-Segment, das ein hier beschriebenes Polypeptid kodiert; und einen Transkriptionsterminator.
Das DNA-Molekül kann des Weiteren eine sekretorische Signalsequenz umfassen, die mit dem DNA-Segment funktionell verknüpft ist. Das kodierende Polypeptid kann des Weiteren ein Affinitätstag laut Beschreibung in dieser Schrift umfassen. Die vorliegende Erfindung liefert auch eine kultivierte Zelle, welche den oben beschriebenen Expressionsvektor enthält. Wahlweise kann das kodierte Polypeptid antivirale Aktivität, z. B. gegen Hepatitis B und Hepatitis C aufweisen.
In einem weiteren Aspekt bietet die vorliegende Erfindung eine kultivierte Zelle, welche, wie oben offen gelegt, einen Expressionsvektor umfasst.
In einem weiteren Aspekt bietet die vorliegende Erfindung eine Methode für die Produktion eines Proteins, die Folgendes umfasst: Kultivierung einer Zelle, wie oben offen gelegt, unter Bedingungen, unter denen das DNA-Segment exprimiert wird; und Gewinnung des vom DNA-Segment kodierten Proteins.
Eine das Cystein-mutierte IL-29-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz ist generell mit anderen für ihre Expression notwendigen genetischen Elementen funktionell verknüpft und umfasst generell einen Transkriptionspromoter und -terminator innerhalb eines Expressionsvektors. Der Vektor umfasst generell auch einen oder mehrere selektierbare Marker und eine oder mehrere Replikationsquellen, obwohl der fachkundigen Person bewusst ist, dass innerhalb bestimmter Systeme selektierbare Marker auf separaten Vektoren bereitstehen können und dass die Replikation von exogener DNA durch Integration in das Wirtszellgenom ermöglicht werden kann. Die Selektion von Promoter, Terminatoren, selektierbaren Markern, Vektoren und anderen Elementen ist Sache der routinemäßigen Konstruktion im Rahmen der Fachkundigkeit. Viele solche Elemente sind in der Fachliteratur beschrieben und über den Fachhandel erhältlich.
Um ein Cystein-mutiertes IL-28- oder IL-29-Polypeptid in den sekretorischen Signalweg einer Wirtszelle zu leiten, ist im Expressionsvektor eine sekretorische Signalsequenz (auch als Leitsequenz, Präpro-Sequenz oder Präsequenz bekannt) vorgesehen. Die sekretorische Signalsequenz kann die eines Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29 sein, z. B. SEQ ID-NR:119 oder SEQ ID-NR:121, oder sie kann aus einem anderen sekretierten Protein (z. B. t-PA; siehe US-Patent 5.641.655 ) abgeleitet oder de-novo synthetisiert werden. Die sekretorische Signalsequenz ist mit der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-DNA-Sequenz funktionell verknüpft, d. h. die zwei Sequenzen sind im korrekten Lese-Frame verbunden und so positioniert, dass sie das neu synthetisierte Polypeptid in den sekretorischen Signalweg der Wirtszelle leiten. Sekretorische Signalsequenzen werden generell am 5'-Ende der DNA-Sequenz positioniert, welche das Polypeptid von Interesse kodiert, obwohl bestimmte Signalsequenzen auch an anderer Stelle in der DNA-Sequenz von Interesse positioniert sein können (siehe z. B. Welch et al., US-Patentnr. 5.037.743 ; Holland et al., US-Patentnr. 5.143.830 ).
Es ist eine große Vielfalt an geeigneten rekombinanten Wirtszellen verfügbar, u. a. gramnegative prokaryotische Wirtsorganismen. Geeignete E. coli-Stämme sind u. a. W3110, K12-Derivate MM294, TG-1, JM-107, BL21 und UT5600. Weitere geeignete Stämme sind u. a.: BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647, E. coli K12, E. coli K12 RV308, E. coli K12 C600, E. coli HB101, E. coli K12 C600 R_k- M_k-, E. coli K12 RR1 (siehe z. B. Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Weitere gramnegative prokaryotische Wirte sind u. a. Serratia, Pseudomonas, Caulobacter. Prokaryotische Wirte können auch grampositive Organismen umfassen, wie Bacillus, z. B. B. subtilis, B. thuringienesis und B. thuringienesis var. israelensis sowie Streptomyces, z. B. S. lividans, S. ambofaciens, S. fradiae und S. griseofuscus. Geeignete Stämme von Bacillus subtilus umfassen BR151, YB886, MI119, MI120 und B170 (siehe z. B. Hardy, "Bacillus Cloning Methods" in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)). Standardmethoden für Propagationsvektoren in prokaryotischen Wirten sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3. Ausgabe (John Wiley & Sons 1995); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)). In einem Ausführungsbeispiel wird in den erfindungsgemäßen Methoden Cystein-mutiertes IL-28- oder IL-29 verwendet, das in den W3110-Stamm exprimiert wurde, welcher in der American Type Culture Collection (ATCC) unter ATCC-Nr. 27325 gelagert ist.
Wenn eine groß angelegte Produktion von Cystein-mutierten IL-28 oder IL-29 unter Verwendung des erfindungsgemäßen Expressionssystem erforderlich ist, kann Batch-Fermentation eingesetzt werden. Die Batch-Fermentation umfasst generell eine erste Stufe mit Präparation eines Kulturansatzes, indem E. coli-Stämme, die Cystein-mutiertes IL-28 oder IL-29 exprimieren, in einer Schüttelflasche mit geeignetem Medium gezüchtet werden, um das Wachstum auf eine optische Dichte (OD) zwischen 5 und 20 bei 600 nm zu ermöglichen. Ein geeignetes Medium würde Stickstoff aus einer oder mehreren Quellen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumchlorid, Hefeextrakt, hydrolysierte Tierproteine, hydrolysierte Pflanzenproteine oder hydrolysierte Casein enthalten. Phosphat wird aus Kaliumphosphat, Ammoniumphosphat, Phosphorsäure oder Natriumphosphat bereitgestellt. Weitere Bestandteile wären Magnesiumchlorid oder Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder Eisenchlorid und andere Spurenelemente. Das Kulturmedium kann zur Förderung des Wachstums mit Kohlenhydraten ergänzt werden, z. B. Fruktose, Glukose, Galaktose, Laktose und Glyzerin. Alternativ kann eine Fed-Batch-Kultur verwendet werden, um einen hohen Ertrag des Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Proteins zu generieren. Die Cysteine-mutiertes IL-28 oder IL-29 produzierenden E. coli-Stämme werden unter ähnlichen Bedingungen gezüchtet wie für den Behälter der ersten Stufe zur Inokulation einer Batch-Fermentation beschrieben wurde.
Nach der Fermentation werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in Homogenisierungspuffer resuspendiert und homogenisiert, z. B. in einem APV-Gaulin Homogenisator (Invensys APV, Tonawanda, NY, USA) oder anderen Zelldisruptionsgerät, wie z. B. Bead Mills oder Sonifizierer. Alternativ werden die Zellen direkt aus dem Fermentator genommen und in einem APV-Gaulin Homogenisator homogenisiert. Zur Solubilisierung des gewaschenen Inklusionskörperpräparats kann Guanidinhydrochlorid (5–8 M) oder Urea (7–8 M) verwendet werden, welche/s einen Reduktor enthält, wie z. B. Beta-Mercaptoethanol (10–100 mM) oder Dithiothreitol (5–50 mM). Die Lösungen können in Tris, Phosphat, HEPES oder anderen geeigneten Puffer präpariert werden. Inklusionkörper können auch mit Natriumlaurylsulfat-haltiger (0,1–2%) Urea (2–4 M) mit solubilisiert werden. Im Prozess für die Gewinnung von aufgereinigten Cystein-mutierten IL-28 oder IL-29 aus den transformierten E. coli-Wirtsstämmen, in denen sich die Cystein-mutierten IL-28 oder IL-29 als refraktile Inklusionskörper sammeln, werden die Zellen disruptiert und die Inklusionskörper durch Zentrifugation gewonnen. Anschließend werden die Inklusionskörper solubilisiert und in 6 M Guanidinhydrochlorid mit Reduktor denaturiert. Das reduzierten Cystein-mutierten IL-28 oder IL-29 wird dann in einem kontrollierten Renaturierungsschritt oxidiert. Das neugefaltete Cystein-mutierte IL-28 oder IL-29 kann zur Klärung und zum Entfernen von unlöslichem Protein durch einen Filter passiert werden. Die Lösung wird dann zur Klärung und zum Entfernen von unlöslichem Protein durch einen Filter passiert. Nachdem das Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Protein neugefaltet und konzentriert wurde, wird das neugefaltete Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Protein in Verdünnungspuffer auf einer Kationenaustauschsäule unter Verwendung hydrophober Interaktionschromatographie gewonnen.
Kultivierte Säugetierzellen sind geeignete Wirte innerhalb der vorliegenden Erfindung. Methoden für die Einfügung von exogener DNA in Säugetierwirtszellen umfassen kalziumphosphatvermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1:841–5, 1982), DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al., ibid.) und liposomvermittelte Transfektion (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993, und virale Vektoren (Miller and Rosman, BioTechniques 7:980–90, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2:714–6, 1996). Die Produktion von rekombinanten Polypeptiden in kultivierten Säugetierzellen ist beispielsweise offen gelegt von Levinson et al., US-Patentnr. 4.713.339 ; Hagen et al., US-Patentnr. 4.784.950 ; Palmiter et al., US-Patentnr. 4.579.821 ; und Ringold, US-Patentnr. 4.656.134 . Geeignete kultivierte Säugetierzellen sind u. a. die Zelllinien COS-1 (ATCC-Nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC-Nr. CRL 1651), BHK (ATCC-Nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC-Nr. CRL 10314), 293 (ATCC-Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59–72, 1977) und Eierstock des chinesischen Hamsters (z. B. CHO-K1; ATCC-Nr. CCL 61). Weitere geeignete Zelllinien sind aus dem Stand der Technik bekannt und in öffentlichen Depositorien wie American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA, erhältlich. Generell werden starke Transkriptionspromoter bevorzugt, wie z. B. Promoter aus SV-40 oder Cytomegalovirus. Siehe z. B. US-Patentnr. 4.956.288 . Weitere geeignete Promoter sind u. a. jene aus Metallothionein-Genen ( US-Patentnr. 4.579.821 und 4.601.978 ) und der späte Adenovirus-Hauptpromoter.
Zur Selektion für kultivierte Säugetierzellen, in die fremde DNA eingefügt wurde, wird generell die Arzneimittelselektion verwendet. Solche Zellen werden allgemein als „Transfektanten" bezeichnet. Zellen, die in Gegenwart des selektiven Wirkstoffes kultiviert wurden und das Gen von Interesse an ihre Nachkommen weiterleiten können, werden als „stabile Transfektanten" bezeichnet. Ein bevorzugter selektierbarer Marker ist eine gen-kodierende Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin. Die Selektion wird in Gegenwart eines Neomycin-Arzneimittels, wie z. B. G-418 o. ä., durchgeführt. Selektionssysteme können auch verwendet werden, um den Expressionsgrad des Gens von Interesse zu erhöhen; ein Prozess, der als „Amplifizierung" bezeichnet wird. Zur Amplifizierung werden Transfektanten in Gegenwart einer geringen Konzentration des selektiven Wirkstoffes kultiviert und anschließend wird die Menge des selektiven Wirkstoffes erhöht, um für die Zellen, die hohe Konzentrationen der in die Gene eingeführten Produkte erzeugen, zu selektieren. Ein bevorzugter amplifizierbarer selektierbarer Marker ist Dihydrofolatreduktase, welche Resistenz gegen Methotrexat überträgt. Andere Arzneimittelresistenz-Gene (z. B. Hygromycin-Resistenz, Multiarzneimittelresistenz, Puromycinacetyltransferase) können ebenfalls verwendet werden. Alternative Marker, die einen veränderten Phänotyp einführen, wie z. B. grün fluoreszierendes Protein oder Zelloberflächenproteine, wie CD4, CD8, MHC Klasse I oder plazentale alkalische Phosphatase, können verwendet werden, um transfektierte Zellen von nicht-transfektierten Zellen mittels FACS-Sortierung oder Magnetic Bead Separation-Technologie auszusortieren.
Andere höhere Eukaryonten können ebenfalls als Wirte verwendet werden, einschließlich Pflanzen-, Insekten- und Vogelzellen. Die Verwendung von Agrobacterium rhizogenes als Vektor für die Expression von Genen in Pflanzenzellen wurde von Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47–58, 1987, untersucht. Die Transformation von Insektenzellen und die Produktion von fremden Polypeptiden darin wurde von Guarino et al., US-Patentnr. 5.162.222 und in der WIPO Publikation WO 94/06463 offen gelegt. Insektenzellen können mit rekombinantem Baculovirus infiziert werden, welches häufig aus dem Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) gewonnen wird. Siehe King, L.A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, USA, Oxford University Press., 1994; und Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, USA, Humana Press, 1995. Eine zweite Methode zur Herstellung eines rekombinanten Baculovirus verwendet ein Transposon-Basis-System, das von Luckow (Luckow, V.A. et al., J Virol 67:4566–79, 1993) beschrieben wurde. Dieses System wird im Bac-to-Bac Kit (Life Technologies, Rockville, MD, USA) verkauft. Dieses System nutzt einen Transfervektor, pFastBac1^TM (Life Technologies), der ein Tn7-Transposon enthält, um die das Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Polypeptid kodierende DNA in ein Baculovirusgenom zu bewegen, das in E. coli als ein großes Plasmid namens „Bacmid" erhalten wird. Der pFastBac1^TM Transfervektor nutzt den AcNPV-Polyhedrinpromoter, um die Expression des Gens von Interesse, in diesem Fall Cystein-mutiertes IL-28- oder IL-29, zu steuern. Der pFastBac1^TM kann jedoch in einem wesentlichen Maß modifiziert werden. Der Polyhedrinpromoter kann entfernt und durch den Baculovirus-Basisproteinpromoter (auch als Pcor, p6.9 oder MP-Promoter bekannt) substituiert werden, welcher früher in der Baculovirusinfektion exprimiert wurde und sich als vorteilhaft für die Expression sekretierter Proteine erwiesen hat. Siehe Hill-Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971–6, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75:1551–6, 1994; und Chazenbalk, G.D., und Rapoport, B., J. Biol Chem 270:1543–9, 1995. In solchen Transfervektorkonstrukten kann eine kurze oder lange Version des Basisproteinpromoters verwendet werden. Des Weiteren können Transfervektoren konstruiert werden, welche die nativen sekretorischen Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Signalsequenzen durch die aus Insektenproteinen gewonnenen sekretorischen Signalsequenzen ersetzen. So kann z. B. eine sekretorische Signalsequenz aus der Ecdysteroid-Glucosyltransferase (EGT), Honigbiene Melittin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) oder Baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA, USA) in Konstrukten verwendet werden, um die native sekretorische Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Signalsequenz zu ersetzen. Des Weiteren können Transfervektoren eine In-Frame-Fusion mit der DNA beinhalten, welche ein Epitop-Tag am C- oder N-Terminus des exprimierten Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptids exprimiert, z. B. ein Glu-Glu-Epitop-Tag (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952–4, 1985). Mittels der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden wird ein Cystein-mutiertes IL-28- oder IL-29 enthaltender Transfervektor in E. coli transformiert und für Bacmide gescreent, welche ein unterbrochenes, für rekombinantes Baculovirus indikatives lacZ-Gen enthalten. Die Bacmid-DNA, die das rekombinante Baculovirusgenom enthält, wird mittels allgemein bekannter Methoden isoliert und zum Transfektieren der Spodoptera frugiperda Zellen, z. B. Sf9-Zellen, verwendet. Anschließend wird das rekombinante Cystein-mutiertes IL-28 oder IL-29 exprimierende Virus produziert. Rekombinante Virenbestände werden mittels der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt.
Das rekombinante Virus wird zum Infizieren der Wirtszellen verwendet, meistens eine aus dem Spodoptera frugiperda (Fall Army Worm) gewonnene Zelllinie. Siehe allgemein Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., USA, 1994. Eine weitere geeignete Zelllinie ist die High FiveO^TM Zelllinie (Invitrogen), die aus Trichoplusia ni gewonnen wird ( US-Patentnr. 5.300.435 ).
Funguszellen, einschließlich Hefezellen, können ebenfalls innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Hefespezies von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang sind u. a. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris und Pichia methanolica. Methoden für die Transformation von S. cerevisicie-Zellen mit exogener DNA und die Produktion rekombinanter Polypeptide daraus wurden offen gelegt z. B. von Kawasaki, US-Patentnr. 4.599.311 ; Kawasaki et al., US-Patentnr. 4.931.373 ; Brake, US-Patentnr. 4.870.008 ; Welch et al., US-Patentnr. 5.037.743 ; und Murray et al., US-Patentnr. 4.845.075 . Die transformierten Zellen werden nach Phänotyp ausgewählt, der durch den selektierbaren Marker, meistens Arzneimittelresistenz oder Fähigkeit zum Wachsen in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffes (z. B. Leucin), bestimmt wird. Ein bevorzugtes Vektorsystem für die Verwendung in Saccharomyces cerevisiae ist das POT1-Vektorsystem, das von Kawasaki et al. ( US-Patentnr. 4.931.373 ) offen gelegt wurde und das die Selektion von transformierten Zellen nach Wachstum in glukosehaltigem Medium ermöglicht. Geeignete Promoter und Terminatoren für die Verwendung in Hefe sind u. a. jene aus glycolytischen Enzymgenen (siehe z. B. Kawasaki, US-Patentnr. 4.599.311 ; Kingsman et al., US-Patentnr. 4.615.974 ; und Bitter, US-Patentnr. 4.977.092 ) und Alkoholdehydrogenase-Gene. Siehe auch US-Patentnr. 4.990.446 ; 5.063.154 ; 5.139.936 und 4.661.454 . Transformationssysteme für andere Hefen, einschließlich Hansenula polymorphes, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii und Candida maltosa sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459–65, 1986 und Cregg, US-Patentnr. 4.882.279 . Aspergillus-zellen können gemäß den Methoden von McKnight et al., US-Patentnr. 4.935.349 verwendet werden. Methoden für die Transformation von Acremonium chrysogenum wurden von Sumino et al., US-Patentnr. 5.162.228 offen gelegt. Methoden für die Transformation von Neurospora wurden von Lambowitz, US-Patentnr. 4.486.533 , offen gelegt. Die Verwendung von Pichia methanolica als Wirt für die Produktion von rekombinanten Proteinen wurde in den US-Patenten Nr. 5.955.349 , 5.888.768 , 6.001.597 , 5.965.389 , 5.736.383 und 5.854.039 offen gelegt.
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Polypeptide und Proteine auf eine Reinheit von ≥ 80% gereinigt, besser auf ≥ 90% Reinheit und am besten auf ≥ 95% Reinheit, und insbesondere wird ein pharmazeutische reiner Zustand von mehr als 99,9% Reinheit bevorzugt in Bezug auf kontaminierende Makromoleküle, insbesondere andere Proteine und Nukleinsäuren, sowie völlige Freiheit von infektiösen und pyrogenen Stoffen. Ein gereinigtes Polypeptid oder Protein ist vorzugsweise im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden oder Proteinen, insbesondere von jenen tierischen Ursprungs.
Exprimierte rekombinante Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Proteine (einschließlich chimäre Polypeptide und multimere Proteine) werden durch konventionelle Proteinreinigungsmethoden gereinigt, typischerweise durch eine Kombination von chromatographischen Methoden. Siehe allgemein Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden, 1988; und Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, USA, 1994. Proteine, die ein Polyhistidin-Affinitäts-Tag umfassen (typischerweise ca. 6 Histidinreste) werden durch Affinitätschromatographie auf einem Nickelchelatharz aufgereinigt. Siehe z. B. Houchuli et al., Bio/Technol. 6: 1321–1325, 1988. Proteine, die ein Glu-Glu-Tag umfassen, können durch Immunaffinitätschromatographie gemäß konventionellen Methoden aufgereinigt werden. Siehe z. B. Grussenmeyer et al., supra. Maltosebindende Proteinfusionen werden auf eine Amylosesäule gemäß den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden aufgereinigt.
Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Polypeptide können auch durch chemische Synthese gemäß den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden präpariert werden, einschließlich exklusive Festphasensynthese, partielle Festphasenmethoden, Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese. Siehe z. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2. Ausgabe), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA, 1984; Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; und Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989. In-vitro-Synthese ist insbesondere vorteilhaft für die Präparation von kleineren Polypeptiden.
Unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden können Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Proteine als Monomere oder Multimere; glycolisiert oder nicht-glycolisiert; pegyliert oder nicht-pegyliert; als Fusionsproteine präpariert werden und können einen ersten Methioninaminosäurerest enthalten oder nicht enthalten. Für Therapiezwecke verwendete Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Konjugate können pharmazeutisch akzeptable wasserlösliche Polymeruntereinheiten enthalten. Es wurde nachgewiesen, dass die Konjugation von Interferonen mit wasserlöslichen Polymeren die zirkulierende Halbwertszeit des Interferons optimiert und die Immunogenität des Polypeptids reduziert (siehe z. B. Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996) und Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)).
Geeignete wasserlösliche Polymere sind u. a. Polyethylenglycol (PEG), Monomethoxy-PEG, Mono-(C1-C10)-Alkoxy-PEG, Aryloxy-PEG, Poly-(N-Vinylpyrrolidon)-PEG, Tresylmonomethoxy-PEG, Monomethoxy-PEG-Propionaldehyd, PEG-Propionaldehyd, Bissuccinimidylcarbonat-PEG, Propylenglycolhomopolymere, ein Polypropylenoxid/Ethylenoxidcopolymer, polyoxyethylierte Polyole (z. B. Glyzerin), Monomethoxy-PEG-Butyraldehyd, PEG-Butyraldehyd, Monomethoxy-PEG-Acetaldehyd, PEG-Acetaldehyd, Methoxyl-PEG-Succinimidylpropionat, Methoxyl-PEG-Succinimidylbutanoat, Polyvinylalkohol, Dextran, Cellulose oder andere kohlehydratbasische Polymere. Geeignete PEG können ein Molekulargewicht von etwa 600 bis etwa 60.000, einschließlich z. B. 5.000, 12.000, 20.000, 30.000 und 40.000 Dalton haben, die linear oder vernetzt sein können. Ein Cystein-mutiertes IL-28- oder IL-29-Konjugat kann auch ein Gemisch von solchen wasserlöslichen Polymeren enthalten.
Ein Beispiel eines Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Konjugats umfasst eine Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Untereinheit und eine Polyalkyloxiduntereinheit, die am N-Terminus der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Untereinheit haftet. PEG ist ein geeignetes Polyalkyloxid. Cystein-mutiertes IL-28 oder IL-29 kann beispielsweise mit PEG, dem so genannten Pegylierungsprozess, modifiziert werden. Für die Pegylierung von Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 kann jede der aus dem Stand der Technik bekannten Pegylierungsreaktionen verwendet werden (siehe z. B. EP 0 154 316 , Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994) und Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)). Die Pegylierung kann z. B. durch eine Azylierungsreaktion oder durch eine Alkylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglycolmolekül durchgeführt werden. In einem alternativen Ansatz werden die Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Konjugate durch Kondensation eines aktivierten PEG gebildet, wobei eine terminale Hydroxy- oder Aminogruppe des PEG gegen einen aktivierten Linker ausgetauscht wurde (siehe z. B. Karasiewicz et al., US-Patentnr. 5.382.657 ).
Die Pegylierung durch Azylierung erfordert normalerweise die Reaktion eines aktiven Esterderivats des PEG mit einem Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptid. Ein Beispiel eines aktivierten PEG-Esters ist ein zu N-Hydroxysuccinimid esterifiziertes PEG. Im Sinne dieser Schrift umfasst der Begriff "Azylierung" die folgenden Arten von Verknüpfungen zwischen Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 und einem wasserlöslichen Polymer: Amid, Carbamat, Urethan u. ä. Methoden für die Präparation von pegyliertem Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 durch Azylierung umfassen normalerweise die folgenden Schritte: (a) Reaktion eines Cystein-mutierten IL-28 oder IL-29-Polypeptids mit PEG (wie z. B. einem reaktiven Ester eines Aldehydderivats des PEG) unter Bedingungen, bei denen eine oder mehrere PEG-Gruppen am Cystein-mutierten IL-28 oder IL-29 haften, und (b) Gewinnung des/der Reaktionsprodukte/s. Die optimalen Reaktionsbedingungen für Azylierungsreaktionen werden generell basierend auf bekannten Parameter und den gewünschten Ergebnissen bestimmt. Je größer das Verhältnis zwischen PEG und Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 ist, desto höher ist der prozentuale Anteil des polypegylierten Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Produktes.
Die Pegylierung durch Alkylierung umfasst generell die Reaktion eines terminalen Aldehydderivats des PEG, z. B. Propionaldehyd, Butyraldehyd, Acetaldehyd u. ä., mit Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 in Gegenwart eines Reduktors. PEG-Gruppen werden vorzugsweise über eine -CH₂-NH₂-Gruppe am Polypeptid befestigt.
Die Derivatisierung durch reduktive Alkylierung zur Erzeugung eines monopegylierten Produktes nutzt die differenzielle Reaktivität von verschiedenen Typen primärer Aminogruppen, die für die Derivatisierung zur Verfügung stehen. Die Reaktion wird normalerweise bei einem pH-Wert durchgeführt, der die Nutzung der pKa-Differenzen zwischen den ε-Aminogruppen der Lysinreste und der α- Aminogruppe des N-Terminusrestes des Proteins zulässt. Durch diese selektive Derivatisierung kann die Befestigung eines wasserlöslichen Polymers, das eine reaktive Gruppe wie Aldehyd enthält, an ein Protein kontrolliert werden. Die Konjugation mit dem Polymer erfolgt prädominant am N-Terminus des Proteins und ohne wesentliche Modifizierung anderer reaktiver Gruppen, wie Aminogruppen der lysinseitigen Kette.
Die reduktive Alkylierung zur Erzeugung einer im Wesentlichen homogenen Population des monopolymeren Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Konjugatmoleküls kann die folgenden Schritte umfassen: (a) Reaktion eines Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptids mit einem reaktiven PEG unter reduktiven Alkylierungsbedingungen bei einem pH-Wert, der die selektive Modifizierung der α-Aminogruppe am Aminoterminus von Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 erlaubt, und (b) Gewinnung der/des Reaktionsprodukte/s. Der für die reduktive Alkylierung verwendete Reduktor sollte in wässriger Lösung stabil und vorzugsweise fähig sein, nur die im Anfangsprozess der reduktiven Alkylierung gebildete Schiffbase zu reduzieren. Bevorzugte Reduktoren sind u. a. Natriumborhydrid, Natriumcyanborhydrid, Dimethylaminboran, Trimethylaminboran und Pyridinboran.
Für eine im Wesentlichen homogene Population der monopolymeren Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Konjugate sind reduktive Alkylierungsreaktionsbedingungen notwendig, die eine selektive Befestigung der wasserlöslichen Polymeruntereinheit an den N-Terminus des Cystein-mutierten IL-28 oder IL-29-zulassen. Solche Reaktionsbedingungen umfassen generell pKa-Differenzen zwischen den Lysinaminogruppen und der α-Aminogruppe am N-Terminus. Der pH-Wert wirkt sich ebenfalls auf das zu verwendende Polymer-zu-Protein-Verhältnis aus. Bei einem niedrigeren pH-Wert wird generell eine größere Menge Polymer gegenüber dem Protein gewünscht, da bei einer weniger reaktiven N-Terminus-α-Gruppe mehr Polymer benötigt wird, um optimale Bedingungen zu erreichen. Ist der pH-Wert höher kann das Verhältnis zwischen Polymer und Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 kleiner sein, da mehr reaktive Gruppen verfügbar sind. Der pH-Wert fällt normalerweise in den Bereich 3–9 oder 3–6. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist das Molekulargewicht des wasserlöslichen Polymers. Je höher das Molekulargewicht des Polymers, desto geringer ist die Anzahl der am Protein haftenden Polymermoleküle. Für Pegylierungsreaktionen ist das typische Molekulargewicht etwa 2 kDa bis etwa 100 kDa, etwa 5 kDa bis etwa 50 kDa, etwa 12 kDa bis etwa 40 kDa oder etwa 20 kDa bis etwa 30 kDa. Das molare Verhältnis zwischen wasserlöslichem Polymer und Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 liegt generell im Bereich 1:1 bis 100:1. Das molare Verhältnis zwischen wasserlöslichem Polymer und Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 ist normalerweise 1:1 bis 20:1 für die Polypegylierung und 1:1 bis 5:1 für die Monopegylierung.
Allgemeine Methoden für die Produktion von Konjugaten, die ein Interferon und wasserlösliche Polymeruntereinheiten umfassen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Karasiewicz et al., US-Patentnr. 5.382.657 , Greenwald et al., US-Patentnr. 5.738.846 , Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)). Pegylierte Spezies können unter Verwendung standardmäßiger Aufreinigungsmethoden, wie z. B. Dialyse, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie u. ä., von nicht-konjugierten Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptiden getrennt werden.
Die erfindungsgemäßen Cystein-mutierten IL-29-Moleküle sind zur spezifischen Bindung des IL-28-Rezeptors und/oder Wirkung als antiviraler Wirkstoff fähig. Die Bindung der Cystein-mutierten IL-29-Polypeptide an den IL-28-Rezeptor kann unter Verwendung etablierter Ansätze analysiert werden. Cystein-mutiertes IL-29 kann unter Verwendung eines Iodobead (Pierce, Rockford, IL, USA) gemäß Herstelleranweisungen jodiert werden und das ¹²⁵I-IL-28 oder ¹²⁵I-IL-29 kann wie unten beschrieben eingesetzt werden.
In einem ersten Ansatz können fünfzig Nanogramm des ¹²⁵I-IL-29 mit 1000 ng des IL-28-Rezeptor-Human-IgG-Fusionsproteins kombiniert werden, und zwar in Gegenwart oder Abwesenheit möglicher Bindungskompetitoren, wie u. a. unmarkiertes Cystein-mutiertes IL-28, Cystein-mutiertes IL-29, IL-28 oder IL-29. Die gleiche Bindungsreaktion kann auch mit Substitution durch andere Zytokinrezeptor-Human-IgG-Fusionen als Kontrollen für die Spezifität durchgeführt werden. Nach der Inkubation bei 4°C, wird Protein-G (Zymed, San Francisco, CA, USA) zur Reaktion hinzugefügt, um die Rezeptor-IgG-Fusionen und alle daran gebundenen Proteine zu erfassen, und die Reaktionen werden dann eine weitere Stunde bei 4°C inkubiert. Die Protein-G-Sepharose wird dann gewonnen, dreimal mit PBS gewaschen und das gebundene ¹²⁵I-IL-29 wird durch einen Gammazähler (Packard Instruments, Downers Grove, IL, USA) gezählt.
In einem zweiten Ansatz kann die Fähigkeit der Moleküle zur Bindung des ¹²⁵I-IL-29 an plattengebundene Rezeptoren analysiert werden. Ein Fragment des IL-28-Rezeptors, das die extrazelluläre, ligandbindende Domäne darstellt, kann an die Wells einer 96-Wellplatte adsorbiert werden, indem 100 μl der 1 g/ml-Lösung des Rezeptors über Nacht in der Platte inkubiert werden. In einer zweiten Form kann eine Rezeptor-Human-IgG-Fusion an die Wells einer 96-Wellplatte gebunden werden, die mit einem gegen den Human-IgG-Teil des Fusionsproteins gerichteten Antikörper beschichtet wurde. Nach der Beschichtung der Platte mit Rezeptor wird die Platte gewaschen, mit SUPERBLOCK (Pierce, Rockford, IL, USA) blockiert und erneut gewaschen. Lösungen, die eine feste Konzentration von ¹²⁵I-IL-29 mit oder ohne steigende Konzentrationen von potenziell bindenden Kompetitoren, einschließlich Cystein-mutiertes IL-28, Cystein-mutiertes IL-29, IL-28 und IL-29, enthalten und 100 μl der Lösung werden in die entsprechenden Wells der Platte gegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 4°C wird die Platte gewaschen und das gebundene ¹²⁵I-IL-28 oder ¹²⁵I-IL-29 wird durch eine Zählung (Topcount, Packard Instruments, Downers Grove, IL, USA) bestimmt. Die Spezifität der Bindung des ¹²⁵I-IL-28 oder ¹²⁵I-IL-29 kann durch die in diesen Bindungsassays verwendeten Rezeptormoleküle sowie durch als Inhibitoren verwendete Moleküle bestimmt werden.
Neben der Pegylierung kann Humanalbumin genetisch an ein erfindungsgemäßes Polypeptide gekoppelt werden, um dessen Halbwertszeit zu verlängern. Humanalbumin ist das am häufigsten natürlich vorkommende Blutprotein im menschlichen Kreislauf und bleibt über zwanzig Tage im Körperkreislauf erhalten. Forschungsergebnisse zeigen, dass therapeutische Proteine, die genetisch an Humanalbumin fusioniert wurden, länger Halbwertszeiten haben. Ein IL28- oder IL29-Albuminfusionsprotein kann wie die Pegylierung lang-wirkende Behandlungsoptionen für Patienten bieten, die ein angenehmeres Verabreichungsregimen erlauben bei vergleichbarer oder besserer Wirksamkeit und Sicherheit im Vergleich zu den derzeit verfügbaren Behandlungen ( US-Patentnr. 6.165.470 ; Syed et al., Blood, 89(9):3243– 3253 (1997); Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1904–1908 (1992); und Zeisel et al., Horm. Res., 37:5–13 (1992)).
Wie die oben genannte Pegylierung und Humanalbumin kann auch ein Fc-Teil des Human-IgG-Moleküls an ein erfindungsgemäßes Polypeptid fusioniert werden. Das resultierende Fusionsprotein kann aufgrund der Fc-Untereinheit eine längere zirkulierende Halbwertszeit haben ( US-Patentnr. 5.750.375 , 5843.725 , 6.291.646 ; Barouch et al., Journal of Immunology, 61:1875–1882 (1998); Barouch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(8):4192–4197 (April 11, 2000); and Kim et al., Transplant Proc., 30(8):4031–4036 (Dez. 1998)).
Methoden für die Erkennung und Diagnose von Virusinfektionen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die zu verwendende exakte Methode für die Messung einer Reduzierung im Virus als Reaktion auf die Verabreichung der erfindungsgemäßen Moleküle hängt von der Virusspezies ab und davon, ob es sich um eine In-vitro- oder In-vivo-Infektion handelt. Bei einer In-vivo-Infektion erfolgt die Messung und Erkennung der Infektion und der Veränderungen im Infektionsgrad je nach infiziertem Proband, Art der Virusinfektion usw. unterschiedlich. Beispiele für Methoden sind u. a. die Messung der Veränderungen in CD4-Zellzahlen, serologische Tests, Messung der DNA des Virus und der RNA des Virus durch konventionelle und in Echtzeit durchgeführte quantitative PCR-Assays, virusinduzierte Antikörperkonzentrationen, Immunfluoreszenz-Assays und ELISA, zytopathische Wirkungen und Histologie.
Antivirale Wirkungen können direkt oder indirekt sein. Ein Beispiel für eine direkte antivirale Wirkung ist z. B., wenn das Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29-Polypeptid für einen Virusrezeptor oder Corezeptor kompetiert, um die Virusinfektion zu blockieren. Cystein-mutiertes IL-28 oder IL-29 kann parenteral verabreicht werden, um eine Virusinfektion zu verhindern oder die laufende Virusreplikation und Reinfektion zu reduzieren (Gayowski, T. et al., Transplantation 64:422–426, 1997). Ein Beispiel für eine indirekte antivirale Wirkung ist z. B., wenn das Cystein-mutierte IL-28- oder IL-29 an CD4 oder einen anderen Leukozytenrezeptor bindet und durch Modulation der Wirkungen der Immunantwort antivirale Wirkungen aufweist.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Cystein-mutiertem IL-28- oder IL-29 als antivirales Therapeutikum für virale Leukämien (HTLV), AIDS (HIV) oder gastrointestinale Virusinfektionen, die z. B. durch Rotavirus, Calicivirus (z. B. Norwalk Agent) und bestimmte Stämme des pathogenen Adenovirus, Hepatitis B und C verursacht werden.
Weitere Arten von Virusinfektionen für Cystein-mutiertes IL-28 oder IL-29 sind u. a.: durch DNA-Viren verursachte Infektionen (z. B. Herpes-Viren wie Herpes-Simplex-Viren, Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus; Pockenviren wie Variolavirus (Pocken); Hepadnaviren (z. B. Hepatitis-B-Virus); Papillomaviren; Adenoviren); RNA-Viren (z. B. HIV I, II; HTLV I, II; Poliovirus; Hepatitis A; Coronoviren wie Schweres Akutes Atemwegssyndrom (SARS); Orthomyxoviren (z. B. Influenzaviren); Paramyxoviren (z. B. Masernvirus); Tollwutvirus; Hepatitis-C-Virus), Flaviviren, Influenzaviren; Caliciviren; Tollwutviren, Rinderpestviren, Arenavirus u. ä. Weitere Beispiele für virusbedingte Erkrankungen, für die Cystein-mutiertes IL-28 oder IL-29 verwendet werden könnte, sind u. a.: Erworbenes Immundefektsyndrom, Schweres Akutes Atemwegssyndrom (SARS); Hepatitis; Gastroenteritis; hämorrhagische Erkrankungen; Enteritis; Karditis; Encephalitis; Paralyse; Brochiolitis; Erkrankung der oberen und unteren Atemwege; Respiratorische Papillomatose; Arthritis; Disseminierte Infektionen, Meningitis, Mononukleose. Des Weiteren können Cystein-mutiertes IL-28 oder IL-29 in verschiedenen Anwendungen der antiviralen Immuntherapie und in Verbindung mit anderen Zytokinen, anderen Protein- oder kleinmolekulären antiviralen Therapien u. ä. eingesetzt werden.
Klinische diagnostische Tests auf HCV umfassen serologische Assays für Antikörper und molekuläre Tests für Viruspartikel. Enzymimmunassays sind erhältlich (Vrielink et al., Transfusion 37:845–849, 1997), erfordern jedoch eventuell eine Bestätigung durch zusätzliche Tests, wie z. B. durch einen Immunblotassay (Pawlotsky et al., Hepatology 27:1700–1702, 1998). In qualitativen und quantitativen Assays werden generell PCR-Methoden eingesetzt und für die Beurteilung der Virämie und des Ansprechens auf die Behandlung bevorzugt (Poynard et al., Lancet 352:1426–1432, 1998; McHutchinson et al., N. Engl. J. Med. 339:1485–1492, 1998). Mehrere im Handel erwerbbare Tests sind verfügbar, z. B. quantitative RT-PCR (Amplicor HCV Monitor^TM, Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA) und vernetzter DNA-(Deoxyribonucleinsäure)Signalamplifikationsassay (Quantiplex^TM HCV RNA Assay [bDNA], Chiron Corp., Emeryville, CA, USA). Ein nicht-spezifischer Labortest auf HCV-Infektion misst den ALT-Spiegel (Alaninaminotransferase) und ist nicht teuer und leicht beziehbar (National Institutes of Health Consensus Development Conference Panel, Hepatology 26 (Suppl. 1):2S–10S, 1997). Eine histologische Beurteilung der Leberbiopsie wird generell als die genaueste Methode zur Bestimmung der HCV-Progredienz anerkannt (Yano et al., Hepatology 23:1334–1340, 1996.) Für eine Besprechung der klinischen Prüfungen auf HCV, siehe Lauer et al., N. Engl. J. Med. 345:41–52, 2001.
Es gibt mehrere aus dem Stand der Technik bekannte In-vivo-Modelle für die Untersuchung auf HBV und HCV. In Bezug auf HCV gibt es z. B. das HCV Replicon-Modell, ein zellbasiertes System zur Untersuchung der Wirksamkeit eines Arzneimittels bei der Hemmung der HCV-Replikation (Blight et al., Science, 290(5498):1972–1974 (8. Dez. 2000); und Lohmann et al., Science, 285(5424):110–113 (2. Juli 1999)). Ein aus dem Stand der Technik bekanntes und in Fachkreisen anerkanntes In-vitro-HBV-Modell kann verwendet werden, um die Anti-HBV-Aktivität eines von Korba et al., Antiviral Res., 19(1):55–70 (1992) und Korba et al., Antiviral Res., 15(3):217–228 (1991) offen gelegten Testmoleküls zu bestimmen.
Die Wirkungen des Cystein-mutierten IL-28 oder IL-29 bei mit HBV infizierten Säugetieren kann z. B. unter Verwendung eines Woodchuck-Modells (nordamerikanisches Waldmurmeltier) beurteilt werden. Kurz gefasst: Waldmurmeltiere mit chronischer WHV-Infektion (Woodchuck-Hepatitis-Virus) entwickeln Hepatitis und hepatozelluläre Karzinome, die mit dem Krankheitsbild bei Menschen mit chronischer HBV-Infektion vergleichbar sind. Das Modell wurde für die präklinische Beurteilung der antiviralen Aktivität verwendet. Es wurde ein chronisch infizierter WHV-Stamm etabliert und Neonaten wurden mit Serum geimpft, um Tiere für die Untersuchung der Wirkungen bestimmter Verbindungen unter Verwendung dieses Modells bereitzustellen. (Siehe Untersuchungen von Tannant et al., ILAR J. 42 (2):89–102, 2001). Auch Schimpansen können für die Beurteilung der Wirkung von Cystein-mutiertem IL-28 oder IL-29 auf HBV-infizierte Säugetiere verwendet werden. Bei Verwendung von Schimpansen wurde eine Charakterisierung des HBV erstellt und diese Studien zeigten, dass die Schimpansenkrankheit der Krankheit im Menschen auffällig ähnlich war (Barker et al., J. Infect. Dis. 132:451–458, 1975 and Tabor et al., J. Infect. Dis. 147:531–534, 1983.) Das Schimpansenmodell wurde zur Beurteilung der Impfstoffe verwendet (Prince et al., In: Vaccines 97, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997.) Therapien für HIV werden regelmäßig geprüft unter Verwendung von nicht-menschlichen Primaten, die mit Simian Immunodeficiency-Viren (SIV) infiziert sind (siehe Untersuchungen von Hirsch et al., Adv. Pharmcol. 49:437–477, 2000 und Nathanson et al., AIDS 13 (Suppl. A):S113-S120, 1999.) Für eine Besprechung der Verwendung von nicht-menschlichen Primaten für die Prüfung von HIV, Hepatitis, Malaria, Respiratory Syncytial Virus und andere Krankheiten, siehe Sibal et al., ILAR J. 42 (2):74–84, 2001. Ein kürzlich entwickeltes transgenes Mausmodell (Guidotti et al., Journal of Virology 69:6158–6169, 1995) unterstützt die Replikation von hohen Konzentrationen des infektiösen HBV und wurde als chemotherapeutisches Modell für die HBV-Infektion verwendet. Transgene Mäuse werden mit antiviralen Arzneimitteln behandelt und nach der Behandlung werden die Konzentrationen der HBV-DNA- und -RNA in der transgenen Mausleber und im Serum gemessen. HBV-Proteinkonzentrationen können im Anschluss an die Behandlung auch im transgenen Mausserum gemessen werden. Dieses Modell wurde für die Beurteilung der Wirksamkeit von Lamivudin und IFN-alpha bei der Senkung der HBV-Virustiter verwendet (Morrey et al., Antiviral Therapy 3:59–68, 1998).
Des Weiteren sind die erfindungsgemäßen Cystein-mutierten IL-29-Peptide und -Proteine durch ihre Aktivität gekennzeichnet, d. h. Modulation der Proliferation, Differenzierung, Migration, Adhäsion oder Stoffwechsel der ansprechenden Zelltypen. Die biologische Aktivität der Cystein-mutierten IL-29-Peptide und -Proteine wird unter Verwendung von In-vitro- oder In-vivo-Assays analysiert, die für die Erkennung von Zellproliferation, Differenzierung, Migration, Adhäsion oder Veränderungen in der Genexpression oder im zellulären Stoffwechsel (z. B. Produktion von anderen Wachstumsfaktoren oder anderen Makromolekülen) ausgelegt sind. Viele geeignete Assays sind aus dem Stand der Technik bekannt und in dieser Schrift werden repräsentative Assays offen gelegt. Assays, die kultivierte Zellen enthalten, eignen sich besonders gut für das Screening, z. B. für die Bestimmung der Auswirkungen auf Aminosäuresubstitionen, -deletionen oder -insertionen.
Die Aktivität der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Proteine kann in-vitro gemessen werden unter Verwendung kultivierter Zellen oder in-vivo durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Moleküle an ein entsprechendes Tiermodell. Assays zur Messung der Zellproliferation oder Differenzierung sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Proliferation messende Assays umfassen beispielsweise Chemo-Sensibilität gegen neutralen roten Farbstoff (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347–354, 1990), Einfügung von radiomarkierten Nukleotiden (wie z. B. offen gelegt von Raines and Ross, Methods Enzymol. 109:749–773, 1985; Wahl et al., Mol. Cell Biol. 8:5016–5025, 1988; und Cook et al., Analytical Biochem. 179:1–7, 1989), Einfügung von 5-Bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) in die DNA von proliferierenden Zellen (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169–179, 1985), und Verwendung von Tetrazoliumsalzens (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55–63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48:589–601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69–84, 1995; und Scudiero et al., Cancer Res. 48:4827–4833, 1988). Die Differenzierung kann unter Verwendung geeigneter Vorläuferzellen, die zur Differenzierung in einem reiferen Phänotyp induziert werden, analysiert werden. Assays für die Messung der Differenzierung umfassen die Messung der Zelloberflächenmarker in Verbindung mit stufenspezifischer Expression eines Gewebes, enzymatische Aktivität, funktioneller Aktivität oder morphologischer Veränderungen (Watt, FASEB, 5:281–284, 1991; Francis, Differentiation 57:63–75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161–171, 1989; alle durch Verweis in diese Schrift aufgenommen).
Die Aktivität des Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptids kann auch unter Verwendung von Assays erkannt werden, die für eine Messung der IL-28- oder IL-29-induzierten Produktion von einem oder mehreren zusätzlichen Wachstumsfaktoren oder anderen Makromolekülen konzipiert sind. Bei bestimmten Mitgliedern der Proteinfamilie, die IL-28 und IL-29 umfasst, zeigte sich in vivo ein Anstieg der zirkulierenden Monozytenzahl. Die Monozytenaktivierung ist sowohl für die natürliche als auch die adaptive Immunität wichtig. Es wurde z. B. nachgewiesen, dass die Aktivierung der Monozyten die Antigenpräsentation durch mehrere Mechanismen stimuliert. Antigenpräsentation fördert die Aktivierung und Proliferation der T-Zellen, sowohl der zytotoxischen als auch der Helfer-T-Zellen. Die Reifung und Aktivierung der dendritischen Zellen fördert auch die Aktivierung von T-Zellen sowie der natürlichen und adaptiven Immunität. Es wurde auch nachgewiesen, dass eine Erhöhung in den aktivierten Monozyten und Makrophagen mit einer gesteigerten zytolytischen Aktivität einhergeht. Deshalb werden Cystein-mutierte IL-29 als antiinfektiöser Wirkstoff nützlich sein, der natürliche, zellvermittelte und humorale Immunreaktionen verbessert. Es zeigte sich eine Erhöhung in der ICAM-Färbung in CD 14+ Monozyten, was darauf hinweist, dass IL-29 bei der Monozytenaktivierung eine Rolle spielt. Während die Daten zeigen, dass Familienmitglieder eine antivirale Reaktion auf den Virus fördern, können auch Bakterien und Parasiten davon betroffen sein.
Monozytenaktivierungs-Assays werden ausgeführt, um (1) die Fähigkeit der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Proteine zur weiteren Stimulierung der Monozytenaktivierung zu bestimmen, und (2) die Fähigkeit der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Proteine zur Modulation von Attachment-induzierter oder Endotoxin-induzierter Monozytenaktivierung zu untersuchen (Fuhlbrigge et al., J. Immunol. 138: 3799–3802, 1987). Die als Reaktion auf die Aktivierung produzierten IL-1α- und TNFα-Konzentrationen werden durch ELISA gemessen (Biosource, Inc. Camarillo, CA, USA). Monozyten-/Makrophagenzellen reagieren aufgrund des CD 14 (LPS-Rezeptors) außergewöhnliche empfindlich auf Endotoxin, und Proteine mit mäßigen Konzentrationen von Endotoxin-ähnlicher Aktivität aktivieren diese Zellen.
Erhöhte Monozytenkonzentrationen deuten darauf hin, dass Cystein-mutiertes IL-29 eine direkte Wirkung auf die myeloiden Progenitorzellen im Knochenmark haben kann. Eine erhöhte Differenzierung der myeloiden Progenitorzellen zu Monozyten ist notwendig, um die Immunkompetenz, z. B. nach der Chemotherapie, wiederherzustellen. Somit kann durch die Gabe von Cystein-mutiertem IL-29 an Chemotherapiepatienten deren Genesung und Resistenz gegen die häufig mit Chemotherapieregimen verbundene Infektion gefördert werden. Methoden für die Erweiterung der Monozytenzahl oder der Monozytenprogenitorzellen umfassen somit die Kultivierung entweder von Knochenmark oder peripheren Blutzellen mit den erfindungsgemäßen Molekülen, so dass eine Erhöhung in der Zahl von Monozyten oder Monozytenprogrenitorzellen für die Erzielung dieser Wirkung in vitro oder ex vivo erreicht wird. Die erfindungsgemäß Moleküle können für die Behandlung eines Säugetiers verwendet werden, welches eine erhöhte Anzahl von Monozyten oder Monozytenprogenitorzellen benötigt. Erhöhte Mengen von Monzyten- und Monozytenprogenitorzellen können mit den unter Klinikern, Ärzten und anderen Personen aus dem Fachkreis gut bekannten Methoden gemessen werden. Monozytenzellen gehören zur myeoloiden Zelllinie der hämatopoetischen Zellen, weshalb Auswirkungen auf andere Zellen in dieser Linie nicht ungewöhnlich wären. Wenn ein Faktor z. B. die Differenzierung oder Proliferation eines Zelltyps in der myeloiden oder lymphoiden Linie ermöglicht, kann sich das auf die Produktion anderer Zellen mit einer gemeinsamen Progenitor- oder Stammzelle auswirken.
Die hämatopoetische Aktivität der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Proteine kann auf verschiedenen hämatopoetischen Zellen in einer Kultur analysiert werden. Bevorzugte Assays umfassen primäre Knochenmarkkolonie-Assays und spätere Stufen von zellreihenbegrenzten Kolonie-Assays, die aus dem Stand der Technik bekannt sind (z. B. Holly et al., WIPO Publikation WO 95/21920 ). Die auf einem geeigneten halbfesten Medium (z. B. 50% Methylcellulose, die 15% fötales Rinderserum, 10% Rinderserumalbumin und 0,6% PSN-Antibiotikamischung enthält) plattierten Knochenmarkzellen werden in Gegenwart des Testpolypeptids inkubiert und dann mikroskopisch auf Koloniebildung untersucht. Bekannte hämatopoetische Faktoren werden als Kontrollen verwendet. Die mitogene Aktivität der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polypeptide auf hämatopoetischen Zelllinien kann wie oben offen gelegt gemessen werden.
Die Zellmigration wird im Wesentlichen gemäß dem von Kähler et al. (Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17:932–939, 1997) offen gelegten Verfahren analysiert. Ein Protein wird als chemotaktisch angesehen, wenn es die Migration von Zellen von einem Bereich einer niedrigen Proteinkonzentration in einen Bereich mit hoher Proteinkonzentration induziert. Es wird ein typischer Assay durchgeführt, bei dem modifizierte Boyden-Kammern verwendet werden und die zwei Kammern durch eine Polystryrolmembrane getrennt sind (Transwell; Corning Costar Corp.). Die Testprobe wird in einem Medium, das 1% Rinderserumalbumin (RSA) enthält, verdünnt und der unteren Kammer auf eine 24-Well-Platte mit Transwells gegeben. Die Zellen werden dann auf den Transwell-Einsatz gegen, der mit 0,2% Gelatine vorbehandelt wurde. Die Zellmigration wird nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C gemessen. Nicht-migrierende Zellen werden von der Oberseite der Transwell-Membran abgewischt, und die an der Unterseite der Membran haftenden Zellen werden fixiert und mit 0,1% Kristallviolett gefärbt. Die gefärbten Zellen werden dann mit 10% Essigsäure extrahiert und die Extinktion wird bei 600 nm gemessen. Die Migration wird dann aus einer Standardkalibrationskurve berechnet. Die Zellmigration kann auch unter Verwendung der Matrigelmethod von Grant et al. („Angiogenesis as a component of epithelial-mesenchymal interactions” in Goldberg and Rosen, Epithelial-Mesenchymal Interaction in Cancer, Birkhäuser Verlag, 1995, 235–248; Baatout, Anticancer Research 17:451–456, 1997) gemessen werden.
Die Zelladhäsionsaktivität wird im Wesentlichen gemäß dem von LaFleur et al. (J. Biol. Chem. 272:32798–32803, 1997) offen gelegten Verfahren analysiert. Kurz gefasst, die Mikrotiterplatten werden mit dem Testprotein beschichtet, nicht-spezifische Stellen werden mit RSA blockiert und die Zellen (wie Glattmuskelzellen, Leukozyten oder Endothelzellen) werden mit einer Dichte von etwa 10⁴–10⁵ Zellen/Well plattiert. Die Wells werden bei 37°C inkubiert (normalerweise etwa 60 Minuten), und dann werden nicht-adhärente Zellen durch ein sanftes Waschen entfernt. Adhärente Zellen werden anhand konventioneller Methoden quantifiziert (z. B. durch Färbung mit Kristallviolett, Lysieren der Zellen und Bestimmung der optischen Dichte des Lysats). Die Kontroll-Wells werden mit einem bekannten Haftprotein beschichtet, wie z. B. Fibronectin oder Vitronectin.
Die Expression der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Polynukleotide in Tiere liefert Modelle für die weitere Untersuchung der biologischen Auswirkungen der Überproduktion oder Inhibition der Proteinaktivität in-vivo. IL-28- oder IL-29-kodierende Polynukleotide und Antisense-Polynukleotide können unter Verwendung von viralen Vektoren oder nackter DNA, in Testtiere, z. B. Mäuse, eingeführt werden, oder es können transgene Tiere produziert werden.
Ein In-vivo-Ansatz für den Assay der erfindungsgemäßen Proteine setzt virale Abgabesysteme ein. Exemplarische Viren für diesen Zweck sind Adenovirus, Herpesvirus, Retrovirus, Vacciniavirus und Adeno-assoziiertes Virus (AAV). Adenvirus, ein doppelsträngiges DNA-Virus, ist der derzeit am besten untersuchte Gentransfervektor für die Lieferung von heterologen Nukleinsäuren. Siehe Untersuchung von Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161–89, 1994; und Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44–53, 1997. Das Adenovirussystem bietet mehrere Vorteile. Das Adenovirus kann (i) relativ große DNA-Einsätze aufnehmen; (ii) in einem hohen Titer wachsen; (iii) einen weiten Bereich von Säugetierzelltypen infizieren; und (iv) mit einer großen Anzahl verschiedener Promoter, einschließlich ubiquitärer, gewebespezfischer und regulierbarer Promoter, verwendet werden. Da Adenoviren im Blutstrom stabil sind, können sie durch intravenöse Injektion verabreicht werden. Siehe auch Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621–14624, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963–967, 1992; und Johnston and Tang, Meth. Cell Biol. 43:353–365, 1994.
Transgene Mäuse, die für die Expression des Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Gens entwickelt werden, sowie Mäuse mit einer vollständigen Abwesenheit der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Genfunktion, so genannte „Knockout-Mäuse" (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992) können ebenfalls generiert werden (Lowell et al., Nature 366:740–742, 1993). Diese Mäuse können zur Untersuchung des Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Gens und des davon kodierten Proteins in einem In-vivo-System verwendet werden. Bevorzugte Promoter für die transgene Expression sind u. a. die Genpromoter Metallothionein und Albumin.
Die meisten Zytokine sowie andere von aktivierten Lymphozyten produzierte Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Zelldifferenzierung, Aktivierung, Rekrutierung und Homöostase der Zellen im gesamten Körper. Man erwartet für Cystein-mutierte IL-29 und Hemmer ihrer Aktivität eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen. Diese therapeutischen Anwendungen umfassen die Behandlung von Krankheiten, welche eine Immunregulierung erfordern, u. a. Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Lupus erythmatosus und Diabetes. IL-29 ist eventuell auch wichtig für die Regulierung von Entzündungen und wäre deshalb auch für die Behandlung von rheumatoider Arthritis, Asthma und Sepsis nützlich. IL-29 spielt eventuell eine Rolle bei der Vermittlung der Tumorgenese, wobei ein Cystein-mutierter IL-29-Antagonist in der Krebsbehandlung nützlich wäre. IL-29 ist eventuell nützlich in der Modulierung des Immunsystems, wobei Cystein-mutierte IL-29-Antagonisten für die Reduzierung der Transplantatabstoßung, Verhinderung der Graft-vs-Host-Erkrankung, Stärkung der Immunität gegen infektiöse Erkrankungen, Behandlung von Patienten mit beeinträchtigtem Immunsystem (z. B. HIV⁺-Patienten) oder zur Verbesserung von Impfstoffen verwendet werden können.
Bei den Mitgliedern der erfindungsgemäßen Proteinfamilie wurde eine antivirale Wirkung nachgewiesen, die der von Interferon-alpha ähnlich ist. Interferone sind in den USA zugelassen für die Behandlung von Autoimmunkrankheit, Condyloma acuminatum, chronische Hepatitis C, Blasenkarzinom, Gebärmutterhalskarzinom, Laryngeale Papillomatose, Fungoide Mycose, chronische Hepatitis B, Kaposisarkom bei Patienten, die mit dem Human Immunodeficiency Virus, malignem Melanom, Haarzellleukämie und Multiple Sklerose infiziert sind. Des Weiteren kann Cystein-mutiertes IL-29 zur Behandlung von Formen der Arteriosklerose verwendet werden, wie Atherosklerose, indem die Zellproliferation gehemmt wird. Demgemäß zieht die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der Cystein-mutierten IL-29-Proteine, -Polypeptide und Peptide mit IL-29-Aktivität für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten sowie für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Retinopathie in Betracht. Des Weiteren zieht die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der Cystein-mutierten IL-29-Proteine, -Polypeptide und Peptide mit IL-29-Aktivität für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von lymphoproliferativen Krankheiten, u. a. auch B-Zelllymphom, chronisch lymphozytische Leukämie, akute lymphozytische Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphom, Multiples Myelom, akute myelozytische Leukämie, chronische myelozytische Leukämie. in Betracht.
Es wurde nachgewiesen, dass Interferone die Expression von Antigenen durch kultivierte Zellen induzieren (siehe z. B. Auth et al., Hepatology 18:546 (1993), Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994), Girolomoni et al., Eur. J. Immunol. 25:2163 (1995), und Maciejewski et al., Blood 85:3183 (1995). Diese Aktivität verbessert die Fähigkeit zur In-vitro-Identifizierung neuer mit Antigenen verbundener Tumoren. Des Weiteren deutet die Fähigkeit der Interferone zur Verstärkung des Grads der Expression von humanen Tumorantigenen darauf hin, dass Interferone nützlich als Adjuvans für die Immuntherapie oder zur Verstärkung der Immunszintigraphie unter Verwendung von Antitumorantigen-Antikörpern sein könnte (Guadagni et al., Cancer Immunol. Immunother. 26:222 (1988); Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994)). Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb auch die Verwendung der Cystein-mutierten IL-28- oder IL-29-Proteine, -Polypeptide und -Peptide mit IL-28- und IL-29-Aktivität als Adjuvans für die Immuntherapie oder zur Verbesserung der Immunszintigraphie unter Verwendung von Antitumorantigen-Antikörpern.
Aktivität und Wirkung des Cystein-mutierten IL-28 oder IL-29 auf die Tumorprogression und Metastase können in-vivo gemessen werden. Mehrere syngenetische Mausmodelle wurden entwickelt, um den Einfluss der Polypeptide, Verbindungen oder anderen Behandlungen auf die Tumorprogression zu untersuchen. Bei diesen Modellen werden die durch eine Kultur passierten Tumorzellen in Mäuse des gleichen Stammes wie der Tumorspender implantiert. Die Zellen entwickeln sich zu Tumoren mit ähnlichen Charakteristiken wie in den Empfängermäusen und die Metastase erfolgt ebenfalls in einigen der Modellen. Geeignete Tumormodelle für unsere Studie umfassen u. a. das Lewis-Lungenkarzinom (ATCC-Nr. CRL-1642) und B16-Melanom (ATCC-Nr. CRL-6323). Beides sind häufig verwendete Tumorreihen, syngenetisch zur C57BL6-Maus und leicht in-vitro kultivierbar und manipulierbar. Tumoren, die aus der Implantation einer dieser Zelllinien resultieren, sind fähig zur Metastase in die Lunge von C57BL6-Mäusen. Das Lewis-Lungenkarzinommodell wurde vor kurzem in Mäusen verwendet, um einen Angiogenesehemmer zu identifizieren (O'Reilly MS, et al. Cell 79: 315–328, 1994). C57BL6/J-Mäuse werden mit einem experimentellen Agens behandelt, entweder durch die tägliche Injektion des rekombinanten Proteins, Agonisten oder Antagonisten, oder durch eine einmalige Injektion des rekombinanten Adenovirus. Drei Tage nach dieser Behandlung werden 10⁵ bis 10⁶ Zellen unter die dorsale Haut implantiert. Alternativ können vor der Implantation die Zellen selbst mit rekombinantem Adenovirus, z. B. einem das Cystein-mutierte IL-28 und IL-29 exprimierenden Adenovirus, infiziert werden, damit das Protein am Tumorsitus oder intrazellulär und nicht systematisch synthetisiert wird. Bei den Mäusen entwickeln sich normalerweise innerhalb von 5 Tagen sichtbare Tumoren. Die Tumoren wachsen für einen Zeitraum bis zu 3 Wochen und erreichen in diesem Zeitraum in der Kontrollbehandlungsgruppe Größen von 1500 bis 1800 mm³. Tumorgröße und Körpergewicht werden während des gesamten Experiments sorgfältig überwacht. Am Tag der Opferung wird der Tumor zusammen mit der Lunge und Leber entfernt und gewogen. Es zeigte sich, dass das Lungengewicht mit der metastasierenden Tumorbelastung korreliert. Als zusätzliche Maßnahme werden die Lungenoberflächenmetastasen gezählt. Die resezierten Tumoren, Lungen und Lebern werden unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten und hier beschriebenen Methoden für die histopathologische Untersuchung, Immunhistochemie und in-situ Hybridisierung präpariert. Der Einfluss des untersuchten exprimierten Cystein-mutierten IL-28 und IL-29 auf die Fähigkeit des Tumors zur Rekrutierung der Vaskulatur und Metastasierung kann somit beurteilt werden. Neben der Verwendung von Adenovirus können die implantierten Zellen auch transient mit dem Cystein-mutierten IL-28 und IL-29 transfektiert werden. Die Verwendung von stabilen Cystein-mutierten IL-28- und IL-29-Transfektanten sowie die Verwendung von induzierbaren Promoter zur Aktivierung der Cystein-mutierten IL-28- und IL-29-Expression in-vivo sind aus dem Stand der Technik bekannt und können in diesem System verwendet werden, um die Induktion der Metastase zu beurteilen. Des Weiteren kann aufgereinigtes, mit Cystein-mutiertem IL-28 und IL-29 konditioniertes Medium direkt in dieses Mausmodell injiziert werden und somit in diesem System verwendet werden. Zur allgemeinen Bezugnahme siehe O'Reilly MS, et al. Cell 79:315–328, 1994; und Rusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349–361, 1995.
Cystein-mutiertes IL-28 und IL-29 kann auch für die Behandlung von Myokarditis verwendet werden, einer Krankheit, die bei Beteiligung des Herzens an einem inflammatorischen Prozess entsteht. Die Infiltration der Lymphozyten und Myozytolyse ist den Annahmen nach die Folge einer Infektion durch Virus, Bakterien, Pilzen oder Parasiten (siehe z. B. Brodison et al., J. Infektion 37:99 (1998)). Cystein-mutiertes IL-28 und IL-29 kann intravenös oder subkutan injiziert werden, um die mit Myokarditis verbundenen Infektionen zu behandeln. Cystein-mutiertes IL-28 und IL-29 kann auch als immunregulatorisches Zytokin zur Behandlung der Autoimmunmyokarditis intravenös injiziert werden. Die Interferondosis kann unter Verwendung eines Autoimmunmodells der Myokarditis in der A/J-Maus extrapoliert werden (Donermeyer, et al., J. Exp. Med. 182:1291 (1995)).
In neueren Berichten wird die Rolle der Typ-I-Interferone bei der Verhütung von viral induziertem Diabetes durch Induzierung eines starken antiviralen Zustands in den pankreatischen Betazellen in den Anfangsstadien der viralen Infektion hervorgehoben (Flodstroem et al., Nature Immunology 3, 373–382 (2002)). Dadurch wird der Verlust von Betazellen aufgrund von viral induziertem Zelltod und die begleitende Autoimmunität verhindert. Cystein-mutiertes IL-28 und IL-29 induziert auch einen antiviralen Zustand in den Zellen, die den IL-28-Rezeptor exprimieren. Der IL-28-Rezeptor wird in pankreatischem Gewebe stark exprimiert, weshalb IL-28 und IL-29 eine Rolle bei der Verhütung von viral induziertem Diabetes aufgrund von Beta-Zelltod spielen können. Des Weiteren kann sich die Rolle der Typ-I-Interferone bei der Verhütung von viral induziertem Diabetes auch auf andere viral induzierte Autoimmunkrankheiten erstrecken, und deshalb spielen IL-28 und IL-29 auch eine Rolle in der Verhütung von anderen Krankheiten, wie muskuläre Sklerose, Lupus und viral induzierte Autoimmunkrankheiten in Gewebe, das den IL-28-Rezeptor exprimiert.
Cystein-mutierte IL-28- und IL-29-Polypeptide können allein oder in Kombination mit anderen vaskulogenen oder angiogenen Agenzien, einschließlich VEGF, verabreicht werden. Bei Verwendung von Cystein-mutierten IL-28 und IL-29 in Kombination mit einem zusätzlichen Agens können die zwei Verbindungen je nach Eignung für die jeweilige behandelte Krankheit gleichzeitig oder sequenziell verabreicht werden.
Cystein-mutiertes IL-28 und IL-29 wird für die Behandlung der Tumorgenese nützlich sein und folglich auch für die Behandlung von Krebs. Ein IL-28 kann B-Zelltumorlinien hemmen, was auf einen potenziellen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von Patienten mit Cystein-mutiertem IL-28 und IL-29 zur Induzierung eines weniger proliferativen Zustands der B-Zelltumorzellen hinweist. Der Ligand könnte in Kombination mit anderen, bereits verwendeten Agenzien verabreicht werden, einschließlich konventioneller chemotherapeutischer Agenzien und auch Immunmodulatoren wie Interferon-alpha. Alpha/beta-Interferone haben sich bei der Behandlung von bestimmten Leukämien und Tierkrankheitsmodellen als wirksam erwiesen, und die wachstumshemmenden Wirkungen von Interferon-alpha und Cystein-mutierten IL-28 und IL-29 können für B-Zelltumor-abgeleitete Zelllinien additiv sein.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein isoliertes Polypeptid umfasst, das aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wurde: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161 sowie einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.
Für den pharmazeutischen Gebrauch werden Cystein-mutierte IL-29-Proteine für topische oder parenterale Gabe, insbesondere intravenöse oder subkutane Verabreichung gemäß konventioneller Methoden formuliert. Pharmazeutische Formulierungen umfassen generell ein Cystein-mutiertes IL-29-Polypeptid in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger wie z. B. Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, 5% Dextrose in Wasser o. ä. Formulierungen können des Weiteren einen oder mehrere Exzipienten, Konservierungsstoffe, Solubilisatoren, Pufferstoffe, Albumin zur Verhinderung des Proteinverlusts auf lebensfähigen Oberflächen usw. Methoden zur Formulierung sind aus dem Stand der Technik bekannt und z. B. in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19^th ed., 1995. Cystein-mutiertes IL-29 wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 10 bis 100 μg/ml des Gesamtvolumens verwendet, obwohl auch Konzentrationen im Bereich von 1 ng/ml bis 1000 μg/ml verwendet werden können. Für die topische Anwendung, z. B. zur Förderung der Wundheilung, wird das Protein mit einer Dosis im Bereich von 0,1 bis 10 μg/cm² Wundfläche aufgetragen, wobei die exakte Dosis gemäß den akzeptierten Standards und unter Berücksichtigung der Art und Schwere des zu behandelnden Zustands sowie der Eigenschaften des Patienten usw. vom Kliniker bestimmt wird. Die Bestimmung der Dosis liegt innerhalb des Wissens der fachkundigen Person. Die Dosierung kann täglich oder intermittierend über den Behandlungszeitraum erfolgen. Die intravenöse Gabe erfolgt mittels Bolusinjektion oder Infusion über einen typischen Zeitraum von einer bis mehreren Stunden. Formulierungen mit verzögerter Freisetzung können ebenfalls eingesetzt werden. Eine therapeutisch wirksame Menge der IL-29-Cysteinmutante ist generell eine Menge, die ausreicht, um eine klinisch signifikante Veränderung in dem behandelten Zustand zu bewirken, z. B. eine klinisch signifikante Veränderung in der Virenbelastung oder Immunfunktion, eine signifikante Reduzierung in der Morbidität oder eine signifikante Erhöhung des histologischen Score.
Pharmazeutische Formulierungen könnten beispielsweise in Form eines Kits bereitgestellt werden, das einen Behälter umfasst, welcher ein erfindungsgemäßes IL-29-Polypeptid enthält. Therapeutische Polypeptide können in Form einer injizierbaren Lösung für Einzel- oder Mehrfachdosen oder als steriles Pulver, das vor der Injektion rekonstituiert wird, bereitgestellt werden. Alternativ kann ein solches Kit einen Trockenpulverdispergierer, einen Flüssigaerosolgenerator oder Zerstäuber für die Verabreichung eines therapeutischen Polypeptids enthalten. Ein solches Kit kann auch schriftliche Informationen zu den Indikationen und zum Gebrauch der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten. Des Weiteren können solche Informationen eine Aussage beinhalten, dass die IL-29-Polypeptid-Zusammensetzung bei Patienten mit bekannter Überempfindlichkeit auf das IL-29-Polypeptid kontraindiziert ist.
Eine Methode für die Produktion eines Antikörpers gegen ein Polypeptid umfasst: Inokulieren eines Tieres mit löslichem Polypeptid, das aus einer Gruppe ausgewählt wird, die Folgende SEQ ID-NR. umfasst: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid im Tier eine Immunreaktion zur Produktion des Antikörpers auslöst, und der Antikörper aus dem Tier isoliert wird. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt (z. B. ein neutralisierender Antikörper), der durch die oben offen gelegte Methode produziert werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper an ein Polypeptid bindet, das aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wurde: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161. In einem Ausführungsbeispiel bindet der oben offen gelegte Antikörper spezifisch an ein Polypeptid, das aus der Gruppe mit folgenden SEQ ID-NR. ausgewählt wurde: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161. In einem weiteren Aspekt bietet die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der/das spezifisch an ein hier beschriebenes Polypeptid bindet. In einem Ausführungsbeispiel wird der Antikörper aus der Gruppe ausgewählt, die einen polyklonalen Antikörper, einen murinen monoklonalen Antikörper, einen aus einem murinen monoklonalen Antikörper gewonnenen humanisierten Antikörper, ein Antikörperfragment und humanen monoklonalen Antikörper umfasst. In einem Ausführungsbeispiel wird ein wie hier beschriebenes Antikörperfragment verwendet, wobei das Antikörperfragment aus der Gruppe mit F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv und einer minimalen Erkennungseinheit ausgewählt wird.
In einem weiteren Aspekt bietet die vorliegende Erfindung einen antiidiotypischen Antikörper, der spezifisch an den hier beschriebenen Antikörper bindet.
In dieser Schrift beinhaltet der Begriff „Antikörper" polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, antigenbindende Fragmente davon wie F(ab')₂ und Fab-Fragmente, einkettige Antikörper u. ä., einschließlich gentechnische Antikörper. Nicht-humane Antikörper können durch Verpflanzung von nicht-humanen CDR auf das humane Framework und konstante Regionen humanisiert werden, oder durch Integration der gesamten nicht-humanen variablen Domänen (wahlweise „Ummantelung" dieser mit einer humantypischen Oberfläche durch Austausch der exponierten Reste, wobei das Ergebnis ein „furnierter" Antikörper ist). In einigen Fällen können humanisierte Antikörper nicht-humane Reste innerhalb der Framework-Domänen der humanen variablen Region zurückbehalten, um die richtigen Bindungscharakteristiken zu verbessern. Durch die Humanisierung von Antikörpern kann die biologische Halbwertszeit erhöht und das Potenzial unerwünschter Immunantworten nach Verabreichung an den Menschen reduziert werden. Eine fachkundige Person kann humanisierte Antikörper mit spezifischen und konstanten Domänen (d. h. verschiedene Ig-Subklassen) generieren, um verschiedene Immunfunktionen, die mit bestimmten konstanten Antikörperdomänen in Verbindung stehen, zu ermöglichen oder zu hemmen. Antikörper werden als spezifisch bindend bestimmt, wenn sie an ein Cystein-mutiertes IL-29-Polypeptid oder -Protein binden mit einer Bindungsaffinität, die mindestens um das 10-Fache höher ist als die Bindungsaffinität an ein Kontroll-(Nicht-Cysteinmutiertes IL-29)-Polypeptid oder -Protein. Die Affinität eines monoklonalen Antikörpers lässt sich von der fachkundigen Person leicht bestimmen (siehe z. B. Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660–672, 1949).
Methoden für die Präparation von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, USA, 1982, durch Verweis in diese Schrift aufgenommen). Das Polypeptid-Immungen kann ein Gesamtmolekül oder ein Teil davon sein. Wenn der Polypeptidteil "Hapten-ähnlich" ist, kann dieser Teil vorteilhaft für die Impfung mit einem makromolekulären Träger (z. B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), Rinderserumalbumin (RSA) oder Tetanustoxoid) verbunden oder verknüpft werden.
Eine Vielfalt der aus dem Stand der Technik bekannten Assays können verwendet werden, um Antikörper zu erkennen, die spezifisch an Cystein-mutierte IL-29-Polypeptide binden. Exemplarische Assays sind ausführlich beschrieben in Using Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. Repräsentative Beispiele solcher Assays sind u. a.: parallele Immunelektrophorese, Radioimmunausfällung, Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), Dot-Blot oder Western Blot-Assay, Inhibition- oder Competition-Assay und Sandwich-Assay.
Für bestimmte Anwendungen, einschließlich In-vitro- und In-vivo-Diagnostikanwendungen, ist die Verwendung von markierten Antikörpern vorteilhaft. Geeignete direkte Tags oder Markierungen sind u. a. Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Fluoreszenzmarker, Chemilumineszenzmarker, magnetische Partikel u. ä.; indirekte Tags oder Markierungen können die Verwendung von Biotin-Avidin oder anderen Komplement/Anti-Komplement-Paaren als Zwischenprodukte beinhalten. Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch direkt oder indirekt an Arzneimittel, Radionuklide u. ä. konjugiert werden, und diese Konjugate können für in-vivo diagnostische oder therapeutische Anwendungen verwendet werden (z. B. Hemmung der Zellproliferation). Siehe allgemein Ramakrishnan et al., Cancer Res. 56:1324–1330, 1996.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden, in keinem Fall eingrenzenden Beispiele ausführlicher dargestellt.
BEISPIELE
Beispiel 1
Säugetier-Expressionsplasmide
Ein Expressionsplasmid, das Zcyto20 und Zcyto21 enthielt, wurde durch homologe Rekombination konstruiert. Fragmente der Zcyto20- und Zcyto21-cDNA wurden durch PCR-Amplifikation generiert. Dabei galten folgende PCR-Primer:
Zcyto20/pZMP21: ZC40923 und ZC43152 SEQ ID-NR:42 und 43 sowie Zcyto21/pZMP21: ZC40922 und ZC43153 SEQ ID-NR:2 sowie 73.
Das PCR-Reaktionsgemisch wurde auf 1%-igem Agarosegel gefahren und eine der Größe des Einsatzes entsprechende Bande wurde unter Verwendung eines QIAquick^TM Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) gelextrahiert.
Das Plasmid pZMP21, welches mit BglII geschnitten wurde, wurde für die Rekombination mit dem PCR-Fragment verwendet. Das Plasmid pZMP21 ist ein Säugetierexpressionsvektor, der eine Expressionskassette enthält mit dem frühen MPSV-Promoter, mehreren Restriktionsorten für die Einfügung der Kodierungssequenzen, einer E. coli-Replikationsquelle, einer Säugetierexpressionseinheit mit selektierbarem Marker bestehend aus einem SV40-Promoter, Verstärker und einer Replikationsquelle, einem DHFR-Gen und dem SV40-Terminator; und URA3- und CEN-ARS-Sequenzen, die für die Selektion und Replikation in S. cerevisiae notwendig sind. Er wurde konstruiert aus pZP9 (gelagert in der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA 20110-2209, unter Accession-Nr. 98668) wobei die Hefegenelemente aus pRS316 (gelagert in der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA 20110-2209, unter Accession-Nr. 77145) genommen wurden, einem internen Ribosom-Einfügungssituselement (IRES) vom Poliovirus und der extrazellulären Domäne von CD8, gekürzt am C-terminalen Ende der Transmembrandomäne.
Hundert Mikroliter der kompetenten Hefezellen (S. cerevisiae) wurden unabhängig kombiniert mit 10 μl der eingefügten DNA und 100 ng des oben geschnittenen pZMP21-Vektors und das Gemisch wurde in eine 0,2-cm-Elektroporationsküvette transferiert. Das Hefe/DNA-Gemisch wurde unter Verwendung der Netzteileinstellung (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) von 0,75 kV (5 kV/cm), „endlose" Ohm, 25 μF elektropulsiert. Der Küvette wurden 600 μl von 1,2 M Sorbitol zugegeben und die Hefe wurde dann in Aliquoten von 100-μl und 300 μl auf zwei URA-D-Platten plattiert und bei 30°C inkubiert. Nach etwa 72 Stunden wurden die Ura⁺ Hefetransformanten von einer einzelnen Platte in 1 ml H₂O resuspendiert und kurz zentrifugiert, um die Hefezellen zu pelletieren. Das Zellpellet wurde in 0,5 ml Lysepuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert. Fünfhundert Mikroliter der Lysemischung wurden in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben, das 250 μl säuregewaschene Glasperlen und 300 μl Phenolchloroform enthielt, dann 3 Minuten gewirbelt und dann 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge bei maximaler Drehzahl geschleudert. Dreihundert Mikroliter der wässrigen Phase werden in ein frisches Röhrchen transferiert und die DNA wird mit 600 μl Ethanol (EtOH) und 30 μl 3M-Natriumacetat ausgefällt, gefolgt von einer Zentrifugation für 30 Minuten bei maximaler Drehzahl. Das DNA-Pellet wird in 30 μl TE resuspendiert.
Die Transformation der elektrokompetenten E. coli-Wirtszellen (MC1061) wurde mit 5 μl Hefe-DNA-Präparation und 50 μl der Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden bei 2,0 kV, 25 μF und 400 Ohm elektropulsiert. Nach der Elektroporation wurden 1 ml SOC (2% Bacto^TM Trypton (Difco, Detroit, MI, USA), 0,5% Hefeextrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glucose) in 50-μl- und 200-μl-Aliquoten auf zwei LB AMP-Platten (LB Broth (Lennox), 1,8% Bacto^TM Agar (Difco), 100 mg/L Ampicillin) plattiert.
Die Einsätze von drei Klonen für jedes Konstrukt wurden einer Sequenzanalyse unterzogen und für jedes Konstrukt wurde ein Klon gewählt, der die richtige Sequenz enthielt. Eine großangelegte Plasmid-DNA-Isolation wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA, USA) gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Die korrekten Konstrukte wurden als Zcyto20/pZMP21 und Zcyto21/pZMP21 bezeichnet.
Beispiel 2
Expression der Säugetierkonstrukte in CHO-Zellen
200 μg eines Zcyto20/pZMP21- und Zcyto21/pZMP21-Konstrukts wurden mit 200 Einheiten Pvu I bei 37°C drei Stunden lang verdaut und dann mit IPA ausgefällt und in einem 1,5-ml-Microfuge-Zentrifugierröhrschen geschleudert. Der Überstand wurde vom Pellet dekantiert, das Pellet wurde mit 1 ml 70%-igem Ethanol gewaschen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Röhrchen wurde in einer Microfuge-Zentrifuge 10 Minuten bei 14.000 U/min geschleudert und der Überstand wurde vom Pellet aspiriert. Das Pellet wurde dann in 750 μl PF-CHO-Medium in einem sterilen Umfeld resuspendiert und bei 60°C für 30 Minuten inkubiert. Die CHO-Zellen wurden geschleudert und unter Verwendung der DNA-Mediumlösung resuspendiert. Das DNA/Zell-Gemisch wurde in eine 0,4-cm-Spalt-Küvette gegeben und mit folgenden Parameter elektroporiert: 950 μF, hohe Kapazität und 300 V. Der Inhalt der Küvette wurde entfernt, mit PF-CHO-Medium auf 25 ml verdünnt und in eine 125-ml-Schüttelflasche gegeben. Die Flasche wurde in einen Inkubator auf einem Schüttler gegeben und bei 37°C, 6% CO₂ und 120 U/min geschüttelt.
Beispiel 3
Aufreinigung und Analyse des Zcyto20-CHO-Proteins
A. Aufreinigung des Zcyto20-CHO-Proteins
Rekombinantes Zcyto20 (IL-28A)-Protein wurde aus einem Pool von DXB11-CHO-Zelllinien produziert. Die Kulturen wurden geerntet und das Medium wurde unter Verwendung eines 0,2-mm-Filters steril gefiltert.
Die Aufreinigung des Zcyto20-CHO-Proteins erfolgte durch sequenzielle Verwendung einer Poros HS50-Säule (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA), einer Monolithischen WCX-Säule (Isco, Inc., Lincoln, NE, USA), einer ToyoPearl Butyl 6505-Säule (TosoH, Montgomeryville, PA, USA) und einer Superdex 75-Säule (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Das Kulturmedium aus DXB111-CHO wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, bevor es auf eine Poros 50 HS-Säule geladen wurde. Die Säule wurde mit 50 mM MES (2-Morpholinoethanschwefelsäure), 100 mM NaCl, pH 6, gewaschen und das gebundene Protein wurde mit 10 Säulenvolumen (CV) und linearem Gradienten auf 60% des 50 mM MES, 2 M NaCl, pH 6, eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden erfasst und die Gegenwart des Zcyto20-Proteins wurde durch SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung bestätigt. Diese das Zcyto20-Protein enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, mit doppelter menge destilliertem Wasser auf eine Leitfähigkeit von 20 ms verdünnt und auf eine Monolithische WCX-Säule geladen. Die Säule wurde mit 93%-igem 50 mM MES, 100 mM NaCl, pH 6, und 7%-igem 50 mM MES, 2 M NaCl, pH 6, gewaschen. Das gebundene Protein wurde mit einem linearen 25-CV-Gradienten von 7% auf 50% 50 mM MES, 2 M NaCl, pH 6 eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden erfasst und die Gegenwart des Zcyto20-Proteins wurde durch SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung bestätigt. Die das Zcyto20-Protein enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, auf 1 M Ammoniumsulfat eingestellt und auf eine ToyoPearl Phenyl 650S-Säule geladen. Zcyto20 wurde mit einem abnehmenden Ammoniumsulfatgradienten eluiert und die reines Zcyto20 enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und für die Injektion in eine Superdex 75-Säule konzentriert. Die das Zcyto20-Protein aus der Gelfiltrationssäule enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, konzentriert, durch ein 0,2-mm-Filter filtriert und bei –80°C eingefroren. Die Konzentration der endgültigen aufgereinigten Proteine wurde durch BCA-Assay (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) und Aminosäurenanalyse bestimmt.
B. SDS-PAGE und Western Blot Analyse des Zcyto20-CHO-Proteins
Rekombinantes Zcyto20-Protein wurde durch SDS-PAGE (Nupage 4–12% Bis-Tris, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und Western Blot analysiert, wozu Kaninchen-Anti-Zcyto21-CEE-BV IgG als primärer Antikörper mit Kreuzreaktion auf das Zcyto20-CHO-Protein verwendet wurde. Das Gel wurde unter Verwendung des Invitrogen Xcell II Mini-Cell (Carlsbad, CA, USA) elektrophoriert und auf eine 0,2-mm-Nitrocellulosemembran (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) transferiert, wozu das Invitrogen Xcell II Blot-Modul gemäß den Anweisungen im Instrumentenhandbuch verwendet wurde. Der Transfer wurde bei 500 mA für 50 Minuten in einem Puffer gefahren, der 25 mM Tris-Base, 200 mM Glycin und 20% Methanol enthielt. Die Membran wurde mit 10%-iger fettfreier Trockenmilch in 1 × PBS für 10 Minuten blockiert und dann mit dem primären Antikörper in 1 × PBS mit 2,5% fettfreier Trockenmilch sondiert. Der Blot wurde eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln markiert. Für die sekundäre Antikörpermarkierung wurde der Blot dreimal 10 Minuten lang mit PBS gewaschen und dann mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) eine Stunde lang sondiert. Der Blot wurde dreimal mit 1 × PBS jeweils 10 Minuten lang gewaschen und unter Verwendung einer Mischung im Verhältnis 1:1 aus SuperSignal^® ULTRA Reagenzien (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) entwickelt und das Signal wurde unter Verwendung eines Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) erfasst.
C. Zusammenfassung der Proteinaufreinigung und Analyse
Das aus dem CHO-Medium aufgereinigte Zcyto20-Protein migrierte prädominant als Doublet bei ca. 20 kDA und als Minor-Triplet-Dimer bei ca. 38 kDa auf einem 4- bis 12%-igen Bis-Tris-Gel unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Alle kollabierten unter reduzierenden Bedingungen in eine einzelne 20 kDa große Bande. Eine MS-Peptid-Zuteilung zeigte ein Gemisch aus zwei Isomeren in Bezug auf die Disulfidverbindung und Gegenwart des O-verknüpften Glycolisierungssitus.
Beispiel 4
Aufreinigung und Analyse des Zcyto21-CHO-Proteins
A. Aufreinigung des Zcyto21-CHO-Proteins
Rekombinantes Zcyto21 wurde aus stabilen DXB11-CHO-Zelllinien produziert. Die Kulturen wurden geerntet und das Medium wurde unter Verwendung eines 0,2-mm-Filters steril gefiltert. Die Proteine wurden aus dem konditionierten Medium aufgereinigt, wobei mit einer Kombination aus kationischer und anionischer Austauschchromatographie begonnen wurde, gefolgt von einer hydrophoben Interaktionschromatographie und einer Größenausschlusschromatographie. Das DXB111-CHO-Kulturmedium wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, bevor es auf eine Poros 50 HS-Säule (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA) geladen wurde. Die Säule wurde mit 1 × PBS, pH 6, gewaschen und das gebundene Protein wurde mit 5 × PBS, pH 8,4, eluiert. Die eluierte Fraktion wurde erfasst und die Gegenwart des Zcyto21-Proteins wurde durch SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung bestätigt. Diese Fraktion wurde auf eine Leitfähigkeit von 13 mS verdünnt, ihr pH-Wert wurde auf 8,4 eingestellt und durch eine Poros 50 HQ-Säule gespült (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA). Der das Zcyto21-Protein enthaltende Durchfluss wurde mit Ammoniumsulfat auf ca. 127 ms eingestellt und auf eine ToyoPearl Butyl 650S-Säule (TosoH, Montgomeryville, PA, USA) geladen. Das Zcyto21-Protein wurde mit einem abnehmenden Ammoniumsulfatgradienten eluiert und die reines Zcyto21 enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und für die Injektion in eine Superdex 75-Säule (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) konzentriert. Die Konzentration der endgültigen aufgereinigten Proteine wurde durch BCA-Assay (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) und Aminosäurenanalyse bestimmt.
B. SDS-PAGE und Western Blot Analyse des Zcyto21-CHO-Proteins
Rekombinantes Zcyto21-Protein wurde durch SDS-PAGE (Nupage 4–12% Bis-Tris, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und Western Blot analysiert, wozu Kaninchen-Anti-Zcyto21-CEE-BV IgG als primärer Antikörper verwendet wurde. Das Gel wurde unter Verwendung des Invitrogen Xcell II Mini-Cell (Carlsbad, CA, USA) elektrophoriert und auf eine 0,2-mm-Nitrocellulosemembran (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) transferiert, wozu das Invitrogen Xcell II Blot-Modul gemäß den Anweisungen im Instrumentenhandbuch verwendet wurde. Der Transfer wurde bei 500 mA für 50 Minuten in einem Puffer gefahren, der 25 mM Tris-Base, 200 mM Glycin und 20% Methanol enthielt. Der transferierte Blot wurde mit 10%-iger fettfreier Trockenmilch in 1 × PBS für 10 Minuten blockiert und dann mit dem primären Antikörper in 1 × PBS mit 2,5% fettfreier Trockenmilch sondiert. Der Blot wurde eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln markiert. Für die sekundäre Antikörpermarkierung wurde der Blot dreimal 10 Minuten lang mit PBS gewaschen und dann mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) eine Stunde lang sondiert. Der Blot wurde dreimal mit 1 × PBS jeweils 10 Minuten lang gewaschen und unter Verwendung einer Mischung im Verhältnis 1:1 aus SuperSignal^® ULTRA Reagenzien (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) entwickelt und das Signal wurde unter Verwendung eines Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) erfasst.
C. Zusammenfassung der Proteinaufreinigung und Analyse
Das aus dem CHO-Medium aufgereinigte Zcyto21-Protein migrierte als zwei oder mehr Banden mit ca. 28 kDA auf einem 4- bis 12%-igen Bis-Tris-Gel unter reduzierenden und auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Eine MS-Peptid-Zuteilung zeigte ein Gemisch aus zwei Isomeren in Bezug auf die Disulfidverbindung und Gegenwart des N-verknüpften Glycolisierungssitus sowie mehrerer O-verknüpfter Glycolisierungssiten.
Beispiel 5
Identifizierung der IL-29-Formen
Spitzenfraktionen aus aufgereinigten Pools des IL-29 wurden über Nacht bei 37°C mit Trypsin in Sequenzierungsgüte (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von ca. 6,3 verdaut, um die Disulfidverschiebung einzugrenzen. Jedes Verdauungsprodukt wurde durch Umkehrphase-HPLC (Agilent, Palo Alto, CA, USA) mit serieller Verbindung mit einem Quadrupole-Time-of-Flight Hybridmassenspektrometer (Micromass, Milford, MA, USA) analysiert Die Spektren wurden erfasst, von Masse zu Ladungsverhältnis zu Masse konvertiert und mit allen theoretischen Peptiden und disulfidverknüpften Peptidkombinationen, die aus der Trypsinverdauung des IL-29 resultierten, verglichen. Die Disulfide wurden durch einen Vergleich der Spektren vor und nach der Reduzierung mit Zuweisung der entsprechenden Massen an disulfidverknüpfte Peptide in IL-29 zugeteilt. Das Material aus Fraktion 20 zeigte das Disulfidmuster C15–C112 und C49–C145, wobei C171 als ein S-Glutathionylcystein beobachtet wurde (alle in Bezug auf SEQ ID-NR:4). Das Material aus Fraktion 51 zeigte das Disulfidmuster C49–C145 und C112–C171, wobei C15 als ein S-Glutathionylcystein beobachtet wurde (in Bezug auf SEQ ID-NR:4).
Beispiel 6
E. coli-Expressionsplasmide
Konstruktion des Expressionsvektors pTAP237
Plasmid pTAP237 wurde generiert durch Insertion eines durch PCR generierten Linkers in den SmaI-Situs des pTAP186 durch homologe Rekombination. Plasmid pTAP186 wurde aus den Plasmiden pRS316 (a Saccharomyces cerevisiae Shuttle-Vektor) und pMAL-c2, ein E. coli-Expressionsplasmid, das aus pKK223-3 gewonnen wird und den tac-Promoter und rrnB-Terminator umfasst, gewonnen. Plasmid pTAP186 enthält ein Kanamycinresistenz-Gen, in dem der Sma I-Situs zerstört wurde, und es hat NotI- und SfiI-Siten, welche die Hefe-ARS-CEN6- und URA3-Sequenzen flankieren und deren Entfernung aus dem Plasmid durch Verdauung mit NotI ermöglichen. Der durch PCR generierte Linker ersetzte die Expressionskopplersequenz in pTAP186 durch die synthetische RBS II-Sequenz. Er wurde präpariert aus 100 pmol jedes Oligonukleotids ZC29.740 und ZC29.741 aus SEQ ID NR: 44 und 45 sowie ca. 5 pmol jedes Oligonukleotids ZC29.736 und ZC29.738 aus SEQ ID-NR:46 und 47. Diese Oligonukleotide wurden durch PCR kombiniert für 10 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden; gefolgt von einer Einweichung bei 4°C. Die resultierenden PCR-Produkte wurden durch Ausfällung mit dem zweifachen Volumen von 100% Ethanol konzentriert. Das Pellet wurde in 10 μl Wasser resuspendiert für die Verwendung zur Rekombination in dem mit SmaI verdauten Empfängervektor pTAP186, um ein Konstrukt zu produzieren, das die synthetische RBS II-Sequenz enthält. Etwa 1 μg des durch PCR generierten Linkers und 100 ng des mit SmaI verdauten pTAP186 wurden vermischt und in kompetente Hefezellen (S. cerevisiae) transferiert. Die Hefe wurde dann auf -URA D-Platten plattiert und bei Raumtemperatur etwa 72 Stunden belassen. Anschließend wurden die Ura+ Hefetransformanten von einer einzelnen Platte in 1 ml H₂O resuspendiert und kurz zentrifugiert, um die Hefezellen zu pelletieren. Das Zellpellet wird in 0,5 μl Lysepuffer resuspendiert. DNA wurde gewonnen und in E. coli MC1061 transformiert. Die Klone wurden durch Kolonnen-PCR wie oben offen gelegt unter Verwendung von 20 pmol jedes Oligonukleotids ZC29.740 und ZC29.741 aus SEQ ID NR: 44 und 45 gescreent. Die Klone, die auf Agarosegel die richtige Bandengröße aufwiesen, wurden einer Sequenzanalyse unterzogen. Der korrekte Plasmid wurde als pTAP237 bezeichnet.
Beispiel 7
Codonoptimierung der IL-29-Cysteinmutante
A. Codonoptimierungsgeneration des wildtypischen IL-29-Expressionskonstrukts
Die native humane IL-29-Gensequenz wurde nicht gut in den E. coli-Stamm W3110 exprimiert. Eine Untersuchung der in der IL-29-Kodierungssequenz verwendeten Codone zeigte, dass ein Überschuss der am wenigsten verwendeten Codone in E. coli mit einem CAI-Wert gleich 0,206 enthalten war. Der CAI ist ein statistisches Maß des synonymen Codongebrauchs (Bias) und kann für die Vorhersage des Grads der Proteinproduktion verwendet werden. (Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15(3):1281–95, 1987). Gene mit Codierung für stark exprimierte Proteine neigen zu hohen CAI-Werten (> 0,6), während die von Genen kodierten Proteine mit niedrigen CAI-Werten (≤ 0,2) generell ineffizient exprimiert werden. Dies bot sich als Grund für die mangelnde Produktion des IL-29 in E. coli an. Des Weiteren sind die seltenen Codone in der zweiten Hälfte des Signals in Cluster zusammengefasst, was zu einer größeren Wahrscheinlichkeit der translationalen Verzögerung, vorzeitigen Terminierung der Tanslation und Fehleinfügung der Aminosäuren führt (Kane JF. Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):494–500, 1995).
Es wurde nachgewiesen, dass der Expressionsgrad von Proteinen, deren Gene seltene Codone enthalten, drastisch erhöht werden kann, wenn die Konzentration bestimmter seltener tRNA innerhalb des Wirtes erhöht wird (Zdanovsky et al., Applied Enviromental Microb. 66:3166–3173, 2000; You et al,. Biotechniques 27:950–954, 1999). Das pRARE-Plasmid trägt Gene, welche tRNA für mehrere Codone kodieren, die ein selten verwendetes E. coli (argU, argW, leuW, proL, ileX und glyT) sind. Die Gene stehen unter der Kontrolle ihrer nativen Promoter (Novy, ibid.). Durch die Coexpression mit pRARE wurde die IL-29-Produktion in E. coli verstärkt und ergab ca. 200 mg/l. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine erneute Resynthesierung der Gencodierung für IL-29 mit einem passenderen Codongebrauch einen verbesserten Vektor für die Expression großer Mengen IL-29 bietet.
Die Codon-optimierte IL-29-Codierungssequenz wurde aus sechzehn überlappenden Oligonukleotiden konstruiert: ZC44.566 (SEQ ID-NR:48), ZC44.565 (SEQ ID-NR:49), ZC44.564 (SEQ ID-NR:50), ZC44.563 (SEQ ID-NR:51), ZC44.562 (SEQ ID-NR:52), ZC44.561 (SEQ ID-NR:53), ZC44.560 (SEQ ID-NR:54), ZC44.559 (SEQ ID-NR:55), ZC44.558 (SEQ ID-NR:56), ZC44.557 (SEQ ID-NR:57). Die Primererweiterung dieser überlappenden Oligonukleotide mit anschließender PCR-Amplifikation produzierte ein IL-29-Gesamtgen mit Codonen, die für die Expression in E. coli optimiert waren. Das endgültige PCR-Produkt wurde durch homologe Heferekombination in den Expressionsvektor pTAP237 eingefügt. Das Expressionskonstrukt wurde aus der Hefe extrahiert und in kompetente E. coli MC1061 transformiert. Gegen Kanamycin resistente Klone wurden durch Kolonnen-PCR identifiziert. Ein positiver Klon wurde durch Sequenzierung verifiziert und anschließend in den Produktionswirtstamm W3110 transformiert. Der Expressionsvektor mit optimierter IL-29-Sequenz wurde als pSDH184 bezeichnet. Das resultierende Gen wurde sehr gut in E. coli exprimiert und der Expressionsgrad mit dem neuen Konstrukt erhöhte sich auf etwa 250 mg/l.
B. Generation des Codon-optimierten Zcyto21 C172S-Cystein-mutierten Expressionskonstrukts
Die zum Generieren der Zcyto21 C172S-Cysteinmutante verwendete Strategie basiert auf dem QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Die Primer für die Einführung der C172S-Mutation wurden in Anlehnung an die Herstellerempfehlungen entwickelt. Diese Primer wurden als ZG44,340 (SEQ ID-NR:58) und ZG44,341 (SEQ ID-NR:59) bezeichnet. Eine PCR wurde gemäß QuikChange Mutagenese-Anweisungen durchgeführt, um die Zcyto21 C172S-Cysteinmutante zu generieren. Fünf identische 50-ml-Reaktionen wurden eingerichtet. 2,5 μl pSDH175 (fehlende Hefevektor-Backbone-Sequenz) DNA wurden pro Reaktion als Vorlage verwendet. Es wurde ein PCR-Cocktail mit folgenden Reagenzmengen hergestellt: 30 μl 10 × PCR-Puffer, 125 ng (27,42 μl) ZG44,340, 125 ng (9,18 μl) ZG44,341, 6 μl dNTP, 6 μl Pfu Turbopolymerase (Stratagene, La Jolla, CA, USA) und 206,4 ml Wasser. 47,5 μl des Cocktails wurden in jede Reaktion aliquotiert. Dabei galten folgende PCR-Bedingungen: 1 Zyklus mit 95°C für 30 Sekunden, gefolgt von 16 Zyklen mit 95°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute, 68°C für 7 Minuten, gefolgt von 1 Zyklus bei 68°C für 7 Minuten und abschließende Haltezeit bei 4°C. Alle fünf PCR-Reaktionen wurden in einem Röhrchen konsolidiert. Gemäß Herstelleranweisungen wurden 5 μl DpnI-Restriktionsenzym zur PCR-Reaktion gegeben und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 10% 3 M Natriumacetat und zwei Volumen 100% Ethanol ausgefällt. Die Ausfällung wurde 20 Minuten lang bei –20°C durchgeführt. Die DNA wurde bei 14.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet wurde durch Vakuumschnelltrocknung getrocknet. Das DNA-Pellet wurde in 20 μl Wasser resuspendiert. Die aus der PCR resultierende DNA wurde in den E.coli-Stamm DH10B transformiert. 5 μl DNA wurden mit 40 μl ElectroMAX DH10B-Zellen (Invitrogen) gemischt. Das Gemisch aus Zellen und DNA wurde anschließend in einer 0,1-cm-Küvette (Bio-Rad) in einem Bio-Rad Gene Pulser II^TM mit Einstellung auf 1,75 kV, 100 Ω und 25 mF elektroporiert. Die elektroporierten Zellen wurden dann bei 37°C für 1 Stunde ausgewachsen. Das Gemisch wurde auf einer LB + 25 μg/ml Kanamycinplatte plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Zehn Klone wurden auf die Gegenwart von Zcyto21 C172S-Einsatz gescreent. Die DNA wurde unter Verwendung des QIAprep^TM Spin Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) aus allen zehn Klonen isoliert und auf Gegenwart des Einsatzes analysiert, indem sie mit XbaI- und PstI-Restriktionsenzymen geschnitten wurde. Neun Klone enthielten den Einsatz und wurden sequenziert, um sicherzustellen, dass die Zcyto21 C172S-Mutation eingeführt wurde. Ein Klon wurde durch Sequenzierung verifiziert und als pSDH188 bezeichnet.
Beispiel 8
E. coli-IL-29-Expressionskonstrukt
Ein DNA-Fragment des IL-29, das die Wildtypsequenz enthielt, wurde durch PCR isoliert. Primer ZC41.212 (SEQ ID-NR: 60) mit 41 Basenpaaren (bp) der Vektorflankensequenz und 24 bp entsprechend dem Aminoterminus des IL-29 und Primer ZC41.041 (SEQ ID-NR:61) mit 38 bp entsprechend des 3'-Endes des Vektors, welcher den Zcyto21-Einsatz enthielt, wurden in der Reaktion verwendet. Dabei galten folgende PCR-Bedingungen: 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute; gefolgt von einer Einweichung bei 4°C. Eine kleine Probe (2–4 μl) der PCR-Reaktion wurde auf einem 1%-igen Agarosegel mit 1 × TBE-Puffer für die Analyse gefahren und die erwartete Bande des ungefähr 500 bp langen Fragments war sichtbar. Das restliche Volumen der 100 μl Reaktion wurde mit 200 μl absolutem Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde in 10 μl Wasser resuspendiert für die Verwendung zur Rekombination in dem mit SmaI geschnittenen Empfängervektor pTAP238, um ein Konstrukt zu produzieren, das das oben offen gelegte Zcyto21 kodiert. Der Klon mit der korrekten Sequenz wurde als pTAP377 bezeichnet. Klon pTAP377 wurde mit Not1/Nco1 (10 μl DNA, 5 μl Puffer 3 New England BioLabs, 2 μl Not 1, 2 μl Nco1, 31 μl Wasser für 1 Stunde bei 37°C) verdaut und mit T4 DNA Ligasepuffer (7 μl der vorherigen Verdauungsproduktes, 2 μl des 5 × Puffers, 1 μl der T4 DNA Ligase) erneut ligiert. Durch diesen Schritt wurde die Hefesequenz, CEN-ARS, entfernt, um den Vektor zu vereinfachen. Die pTAP337-DNA wurde mit Pvu2 und Pst1 diagnostisch verdaut, um die Abwesenheit der Hefesequenz zu bestätigen. P/taP377-DNA wurde in den E. coli-Stamm W3110/pRARE, transformiert, wobei der Wirtstamm extra Kopien der seltenen E. coli-tRNA-Gene trägt.
Beispiel 9
E. coli-IL-28A-Expressionskonstrukt
Ein DNA-Fragment, das die Wildtypsequenz des Zcyto20 (aus SEQ ID-NR:1) enthält, wurde durch PCR isoliert. Primer ZC43.431 (SEQ ID-NR: 62) mit 41 Basenpaaren (bp) der Vektorflankensequenz und 24 bp entsprechend dem Aminoterminus des Zcyto20 und Primer ZC43.437 (SEQ ID-NR:63) mit 38 bp entsprechend des 3'-Endes des Vektors, welcher den Zcyto20-Einsatz enthielt, wurden in der Reaktion verwendet. Dabei galten folgende PCR-Bedingungen: 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute; gefolgt von einer Einweichung bei 4°C. Eine kleine Probe (2–4 μl) der PCR-Reaktion wurde auf einem 1%-igen Agarosegel mit 1 × TBE-Puffer für die Analyse gefahren und die erwartete Bande des ungefähr 500 bp langen Fragments war sichtbar. Das restliche Volumen der 100 μl Reaktion wurde mit 200 μl absolutem Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde in 10 μl Wasser resuspendiert für die Verwendung zur Rekombination in dem mit SmaI geschnittenen Empfängervektor pTAP238, um ein Konstrukt zu produzieren, das das oben offen gelegte Zcyto20 kodiert. Der Klon mit der korrekten Sequenz wurde als pYEL7 bezeichnet. Er wurde mit Not1/Nco1 (10 μl DNA, 5 μl Puffer 3 New England BioLabs, 2 μl Not 1, 2 μl Nco1, 31 μl Wasser für 1 Stunde bei 37°C) verdaut und mit T4 DNA Ligasepuffer (7 μl der vorherigen Verdauungsproduktes, 2 μl des 5 × Puffers, 1 μl der T4 DNA Ligase) erneut ligiert. Durch diesen Schritt wurde die Hefesequenz, CEN-ARS, entfernt, um den Vektor zu vereinfachen. Die erneut ligierte pYEL7-DNA wurde mit Pvu2 und Pst1 diagnostisch verdaut, um die Abwesenheit der Hefesequenz zu bestätigen. PYEL7-DNA wurde in den E. coli-Stamm W3110/pRARE transformiert.
Beispiel 10
Zcyto21 C172S Cysteinmutante-Expressionskonstrukt
Die zum Generieren der Zcyto21 C172S-Cysteinmutante (SEQ ID-NR: 28) verwendete Strategie basiert auf dem QuikChange^® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Die Primer für die Einführung der C172S-Mutation wurden in Anlehnung an die Herstellerempfehlungen entwickelt. Diese Primer wurden als ZG44.327 und ZG44.328 (SEQ ID-NR:64 und 65) bezeichnet. Eine PCR wurde gemäß QuikChange Mutagenese-Anweisungen durchgeführt, um die Zcyto21 C1725-Cysteinmutante zu generieren. Fünf identische 50-ml-Reaktionen wurden eingerichtet. 2,5 ml pTAP377 (fehlende Hefevektor-Backbone-Sequenz) DNA wurden pro Reaktion als Vorlage verwendet. Es wurde ein PCR-Cocktail mit folgenden Reagenzmengen hergestellt: 30 μl 10 × PCR-Puffer, 125 ng (27,42 μl) ZG44.327 (SEQ ID-NR: 64), 125 ng (9,18 μl) ZG44.328 (SEQ ID-NR: 65), 6 μl dNTP, 6 μl Pfu Turbopolymerase (Stratagene) und 206,4 μl Wasser. 47,5 μl des Cocktails wurden in jede Reaktion aliquotiert. Dabei galten folgende PCR-Bedingungen: 1 Zyklus mit 95°C für 30 Sekunden, gefolgt von 16 Zyklen mit 95°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute, 68°C für 7 Minuten, gefolgt von 1 Zyklus bei 68°C für 7 Minuten und abschließende Haltezeit bei 4°C. Alle fünf PCR-Reaktionen wurden in einem Röhrchen konsolidiert. Gemäß Herstelleranweisungen wurden 5 μl DpnI-Restriktionsenzym zur PCR-Reaktion gegeben und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 10% 3 M Natriumacetat und zwei Volumen 100% Ethanol (Aaper Alcohol, Shelbyville, KY, USA) ausgefällt. Die Ausfällung wurde 20 Minuten lang bei –20°C durchgeführt. Die DNA wurde bei 14.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet wurde durch Vakuumschnelltrocknung getrocknet. Das DNA-Pellet wurde in 20 μl Wasser resuspendiert. Die aus der PCR resultierende DNA wurde in den E.coli-Stamm DH10B transformiert. 5 μl DNA wurden mit 40 μl ElectroMAX DH10B-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemischt. Das Gemisch aus Zellen und DNA wurde dann in einer 0,1-cm-Küvette (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) in einem Bio-Rad Gene Pulser II^TM mit Einstellung auf 1,75 kV, 100 Ω und 25 μF elektroporiert. Die elektroporierten Zellen wurden dann bei 37°C für 1 Stunde ausgewachsen. Das Gemisch wurde auf einer LB + 25 mg/ml Kanamycinplatte plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Zehn Klone wurden auf die Gegenwart des IL-29-Einsatzes gescreent. Die DNA wurde unter Verwendung des QIAprep^TM Spin Miniprep Kit (Qiagen) aus allen zehn Klonen isoliert und auf Gegenwart des Einsatzes analysiert, indem sie mit den Restriktionsenzymen XbaI (Roche) und PstI (New England Biolabs) geschnitten wurde. Neun Klone enthielten den Einsatz und wurden sequenziert, um sicherzustellen, dass die Zcyto21 C172S-Mutation eingeführt wurde. Ein Klon (Isolet 6) wurde durch Sequenzierung verifiziert und als pSDH171 bezeichnet. Eine ähnliche Strategie kann zur Generierung einer Zcyto21 C15S-Mutante implementiert werden.
Beispiel 11
Zcyto20 C49S Cysteinmutante-Expressionskonstrukt
Die Kodierungssequenz der Zcyto20 C49S-Cysteinmutante wurde durch Überlappungs-PCR (SEQ ID-NR:20) generiert. Die ersten 187 Basen der wildtypischen TL-28A-Sequenz (SEQ ID-NR:1) wurden durch PCR-Amplifaktion generiert, wozu pYEL7 (SEQ ID-NR:67) als Vorlage und die Oligonukleotidprimer ZC43.431 (SEQ ID-NR: 62) und ZC45.399 (SEQ ID-NR:66) verwendet wurden. Das zweite DNA-Fragment von Base 105 bis 531 wurde durch PCR-Amplifaktion generiert, wozu pYEL7 (SEQ ID-NR:67) als Vorlage und die Oligonukleotidprimer ZC45.398 (SEQ ID-NR: 68) und ZC43.437 (SEQ ID-NR:63) verwendet wurden. Die Primer ZC45.399 (SEQ ID-NR:66) und ZC45.398 (SEQ ID-NR:68) enthielten die spezifische modifizierte Sequenz, welche Cystein 49 in ein Serin verändert. Die zwei PCR-Produkte wurden zusammengefasst und die PCR-Überlappung wurde unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer ZC43.431 (SEQ ID-NR:62) und ZC43.437 (SEQ ID-NR:63) verstärkt. Das endgültige PCR-Produkt wurde durch homologe Heferekombination in den Expressionsvektor pTAP238 eingefügt (Raymond et al. Biotechniques. Jan. 26(1):134–8, 140–1, 1999). Das Expressionskonstrukt wurde aus der Hefe extrahiert und in kompetente E. coli DH10B transformiert. Kanamycinresistente Klone wurden durch Kolonnen-PCR gescreent. Ein positiver Klon wurde durch Sequenzierung verifiziert und anschließend in den Produktionswirtstamm W3110/pRARE transformiert. Das Expressionskonstrukt mit der Zcyto20 C49S-Cysteinmutante-Kodierungssequenz wurde als pCHAN9 bezeichnet.
Beispiel 12
Zcyto20 C51S Cysteinmutante-Expressionskonstrukt
Die Kodierungssequenz der Zcyto20 C51S-Cysteinmutante wurde durch Überlappungs-PCR (SEQ ID-NR:24) generiert. Die ersten 193 Basen der wildtypischen IL-28A-Sequenz wurden durch PCR-Amplifikation generiert, wozu pYEL7 (SEQ ID-NR:67) als Vorlage und die Oligonukleotidprimer ZC43.431 (SEQ ID-NR:62) und ZC45.397 (SEQ ID-NR:63) verwendet wurden. Das zweite DNA-Fragment von Base 111 bis 531 wurde durch PCR-Amplifikation generiert, wozu pYEL7 (SEQ ID-NR:67) als Vorlage und die Oligonukleotidprimer ZC45.396 (SEQ ID-NR:70) und ZC43.437 (SEQ ID-NR:63) verwendet wurden. Die Primer ZC45.397 (SEQ ID-NR:69) und ZC45.396 (SEQ ID-NR:70) enthielten die spezifische modifizierte Sequenz, welche Cystein51 in ein Serin verändert. Die zwei PCR-Produkte wurden zusammengefasst und die PCR-Überlappung wurde unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer ZC43.431 (SEQ ID-NR:62) und ZC43.437 (SEQ ID-NR:63) verstärkt. Das endgültige PCR-Produkt wurde durch homologe Heferekombination im Haus in den Expressionsvektor pTAP238 eingefügt (Raymond et al. supra). Das Expressionskonstrukt wurde aus der Hefe extrahiert und in kompetente E. coli DH10B transformiert. Kanamycin-resistente Klone wurden durch Kolonnen-PCR gescreent. Ein positiver Klon wurde durch Sequenzierung verifiziert und anschließend in den Produktionswirtstamm W3110/pRARE transformiert. Das Expressionskonstrukt mit der Zcyto20 C50S-Cysteinmutante-Kodierungssequenz wurde als pCHAN10 bezeichnet.
Beispiel 13
Expression von Il-28A, IL-29 und Cys zu Ser Cysteinmutante in E. coli
In separaten Experimenten wurde jedes der mit den in Beispielen 6 bis 9 beschriebenen Expressionsvektoren transformierte E. coli in 100 ml Superbroth II Medium (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) mit 0,01% Antifoam 289 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 30 μg/ml Kanamycin, 35 μg/ml Chloramphenicol geimpft und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Ein 5-ml-Inokulum wurde zu 500 ml des gleichen Mediums in einer 2-Liter-Kulturflasche hinzugefügt, die bei 250 U/min und 37°C geschüttelt wurde, bis die Kultur einen OD600 von 4 erreichte. IPTG wurde dann zugegeben für eine endgültige Konzentration von 1 mM und die Flasche wurde weitere 2,5 Stunden geschüttelt. Die Zellen wurden bei 4.000 × g für 10 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellpellets wurden bei –80°C für die spätere Verwendung eingefroren.
Beispiel 14
Neufaltung und Aufreinigung von IL-28
A. Präparation des Inklusionskörpers
Humanes wildtypisches IL-29 wurde als Inklusionskörper (wie hier beschrieben) in den E.-coli-Stamm W3110 exprimiert. Ein Zellpellet aus einer Fed-Batch-Fermentation wurde in 50 mM Tris, pH 7,3, resuspendiert. Die Suspension wurde dreimal bei 55,2 MPa durch einen APV-Gaulin Homogenisator (Invensys APV, Tonawanda, NY, USA) passiert. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 15.000 g für 30 Minuten gewonnen. Das Pellet wurde in Folge mit 50 mM Tris, 1 (v/v) Triton X100, pH 7,3 und 4 M Urea gewaschen. Der Inklusionskörper wurde dann in 50 mM Tris, 6 M Guanidinhydrochlorid, 5 mM DTT bei Raumtemperatur für 1 Stunde dispergiert. Das Material wurde dann bei 15.000 g für 1 Stunde zentrifugiert. Der Überstand aus diesem Schritt enthält reduziertes lösliches IL-29.
B. Neufaltung
Das solubilisierte IL-29 wurde bei Raumtemperatur unter Rühren langsam verdünnt in 50 mM Tris, pH 8, 0,75 M Arginin, 0,05% PEG3350, 2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 0,4 mM KCl, 10 mM NaCl, 4 mM reduziertes Glutathion, 0,8 mM oxidiertes Glutathion. Die endgültige Konzentration des IL-29 im Neufaltungspuffer betrug 0,1 mg/ml. Das Neufaltungsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die konzentrierte Essigsäure wurde dann zum Einstellen des pH der Suspension auf 5 verwendet. Die Suspension wurde anschließend durch einen 0,2-μm-Filter gefiltert. Die RP-HPLC-Analyse des Neufaltungsgemisches zeigte zwei prominente Spitzen.
C. Aufreinigung
Das Neufaltungsgemisch wurde in Serie verdünnt (1:2) mit 50 mM NaOAc bei einem pH-Wert von 5 und auf eine Pharmacia SP Sepharose Fast Flow Kationenaustauschsäule (North Peapack, NJ, USA) geladen. Die Säule wurde mit 3 Säulenvolumen 50 mM NaOAc, 400 mM NaCl, pH 5, gewaschen. Das gebundene IL-29 wurde mit 50 mM NaOAc, 1,4 M NaCl, pH 5, eluiert. (NH₄)₂SO₄ in fester Form wurde dem Eluatpool aus dem Kationenaustauschschritt zugegeben, so dass die endgültige (NH₄)₂SO₄-Konzentration 0,5 M betrug. Das Material wurde dann auf eine ToyoPearl Phenyl 650S HIC-Säule (Tosoh Biosee, Montgomery, PA, USA) geladen. Die Säule wurde mit 3 Säulenvolumen 50 mM NaOAc, 1 M (NH₄)₂SO₄, pH 5, gewaschen. Ein linearer Gradient von 10 Säulenvolumen 50 mM NaOAc, 1 M (NH₄)₂SO₄, pH 5, bis 50 mM NaOAc, pH 5, wurde zur Eluierung des gebundenen Zcyto21 verwendet. Die Fraktionen wurden vom Eluat gewonnen. In diesem Schritt wurden zwei prominente Spitzen beobachtet. An den Eluatfraktionen wurde eine RP-HPLC-Analyse durchgeführt. Zwei Produkte, die zwei Disulfidbindungsisomeren entsprechen, wurden nach dem endgültigen Pufferaustausch in PBS, pH 7,3, produziert.
Beispiel 15
Neufaltung und Aufreinigung der IL-29-Cysteinmutante
Wie in Beispiel 3 beschrieben, ergab die Aufreinigung des IL-29 zwei Disulfidbindungsisomere. Zum Trennen der zwei Formen wurde ein HIC FPLC-Schritt eingesetzt. Die Trennung konnte nicht an der Baseline gelöst werden. Es musste starkes Peak-Shaving eingesetzt werden, um im Wesentlichen reine Isomere (> 95%) zu erhalten. Der Ertrag dieses Schrittes und in der Erweiterung des gesamten Prozess war unzureichend. Die endgültigen Erträge waren 8% für die C15-C112-Form und 9% für die C112-C171-Form. Bei Wildtyp-IL-29, das in CHO- und Baculovirus-(BV)Systemen produziert wurde, zeigte sich ein ähnliches Phänomen. Es wurde bestimmt, dass die C15-C112-Form des Isomers in Disulfidbindungsmustern homolog zu den Typ-I-Interferonen ist. Die C15-C112-Form auch eine um das 30-Fache höhere Bioaktivität als die C112-C171-Form in einem ISRE-Assay (siehe unten).
Neufaltung und Aufreinigung von Zcyto21 Cys172Ser-Mutein
Die Präparation des Inklusionskörpers, Neufaltung und Aufreinigung des Zcyto21 C172S-Polypeptids (SEQ ID-NR:29) ist im Wesentlichen identisch mit der des IL-29-Wildtyps (SEQ ID-NR:4). Die RP-HPLC-Analyse des Neufaltungsgemisches des Muteins zeigte nur eine prominente Spitze, die der C15-C112-form des Wildtyp-IL-29 entsprach. Die anschließende HIC-Chromatographie zeigte nur eine Spitze. Deshalb war der Einsatz von starkem Peak-Shaving nicht notwendig. Der endgültige Ertrag für den gesamten Prozess liegt nahe an 50%. Das Zcyto21 Cys172Ser-Polypeptid (SEQ ID-NR:29) zeigte eine zur C15-C112-Form des Wildtyp-IL-29 im ISRE-Assay aus Beispiel 16 äquivalente Bioaktivität.
Beispiel 16
Antivirale Aktivität: Zytopathische Wirkung in Hela- und L929-Zellen
Erste funktionelle Assays auf antivirale Aktivität wurden unter Verwendung des konditionierten Medium aus transient transfektierten humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) durchgeführt. Die Produktion dieses konditionierten Mediums ist im Folgenden beschrieben. Ein Gesamt-cDNA für humane oder murine IL-28A, IL-28B oder IL-29 wurde unter Verwendung standardmäßiger Verfahren in den pzp7Z-Vektor kloniert. Die humanen oder murinen IL-28A-, IL-28B- oder IL-29-Konstrukte wurden in HEK-293-Zellen transfektiert. Kurz gefasst: Für jedes Konstrukt wurden 700.000 Zellen/Well (6-Well-Platten) etwa 18 Stunden vor der Transfektion in 2 Milliliter DMEM + 10% fetales Rinderserum plattiert. Pro Well wurden 1,5 μg humane oder murine IL-28A-, IL-28B- oder IL-29-DNA und 0,5 μg pIRES2-EGFP-DNA (Clontech) zu 6 μl Fugene 6-Reagenz (Roche Biochemicals) in eine Gesamtmenge von 100 μl DMEM zugegeben. Zwei μg pRES2-EGFP-DNA wurden alleine als negative Kontrolle verwendet. Diese Transfektionsgemische wurden 30 Minuten später zu den vorher plattierten 293-Zellen gegeben. Vierundzwanzig Stunden später wurde das Zellmedium entfernt und das DMEM + 0,1% Rinderserumalbumin wurden zugegeben. Das konditionierte Medium wurde nach 48 Stunden gewonnen, durch ein 0,45-μm-Filter filtriert und für antivirale und Reporter-Assays verwendet.

Antivirale Assays wurden unter Verwendung von humanen zervikalen Krebszellen (HeLa) und Maus-Fibroblastzellen (L929) durchgeführt. Am ersten Tag wurde das konditionierte Medium, das humanes oder murines IL-28A, IL-28B oder IL-29 enthielt, verdünnt und plattiert mit 50.000 Zellen in einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt und gegen Medium ausgetauscht, das Encephelomyokarditisvirus mit einer Multiplizität der Infektion von 0,1 enthielt. Die Zellen wurden erneut 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Kultur-Wells wurden visuelle auf einer 4-Punkte-Skala für die Gegenwart einer zytopathischen Wirkung bewertet, und der Score wurde wie in Tabelle 7 gezeigt in %CPE (Cytophatich Effect, zytopathische Wirkung) umgerechnet. Das konditionierte Medium, das nur GFP-transfektierte Zellen und aufgereinigtes humanes Interferon-a-2a oder murines Interferon-alpha enthielt, wurde als Kontrollen eingesetzt. Tabelle 7: Bestimmung der zytopathischen Wirkung

Bezeichnung	Beobachtung der zytopathischen Wirkung (CPE)
–	Keine CPE
+/–	Potenzielle CPE (etwa 1% der einschichtigen Oberfläche)
+	Auf eine Plaque begrenzte CPE (etwa 5% der Oberfläche)
+1	CPE ist auf drei Plaque begrenzt und betifft weniger als 25% der einschichtigen Lage
1	25% CPE
1–2	37% CPE
2	50% CPE
2–3	62% CPE
3	75% CPE
3–4	87% CPE
4	100% CPE

Tabelle 8 zeigt, dass das konditionierte Medium, das humanes oder murines IL-28A, IL-28B oder IL-29 enthält, eine Virusinfektion (% CPE) in HeLa-Zellen auf dosisabhängige Weise hemmte, während das konditionierte GFP-Kontrollmedium eine Hemmung des Erscheinens der zytopathischen Wirkung nicht signifikant blockieren konnte. Wie in Tabelle 9 gezeigt, konnte das konditionierte Medium mit humanem oder murinem IL-28A, IL-28B oder IL-29 die Virusinfektion in L929-Zellen nicht hemmen. In beiden Experimenten zeigte sich beim aufgereinigten Interferon eine positive antiviral Aktivität. Tabelle 8: Prozentuale zytopathische Wirkung der humanen oder murinen IL-28A, IL-28B oder IL-29 in HeLa-Zellen unter Verwendung von konditioniertem Medium (CM)

Relative CM-Konzentra-tion	Kontroll-GFP	Zcyto20 IL-28A (CM)	Zcyto21 IL-29 (CM)	Zcyto22 IL-28B (CM)	Zcyto24 Maus-IL-28 (CM)	Zcyto25 Maus-IL-28 (CM)	hIFN-2a	a-hIFN-a-2a-Konzentration
Keine Zugabe	87	87	87	87	87	87	87	0 ng/ml
0,008X	87	10	56	0	0	10	15	0,0001 ng/ml
0,0156X	87	2,5	31	0	0	5	8,3	0,001 ng/ml
0,0325X	87	5	10	0	0	5	1,7	0,01 ng/ml
0,0625X	87	2,5	10	0	0	0	0	0,1 ng/ml
0,125X	87	0	5	0	0	0	0	1 ng/ml
0,25X	87	0	0	0	0	0	0	10 ng/ml
0,5X	87	0	0	0	0	0	0	100 ng/ml

Tabelle 9: Prozentuale zytopathische Wirkung der humanen oder murinen IL-28A, IL-28B oder IL-29 in L929-Zellen unter Verwendung von konditioniertem Medium (CM)

Relative CM-Konz.	Kontroll-GFP	Zcyto20 (CM)	Zcyto21 (CM)	Zcyto22 (CM)	Zcyto24 (CM)	Zcyto25 (CM)	mIFN-alpha	mIFN-alpha-Konz.
Keine Zugabe	87	87	87	87	87	87	87	0 ng/ml
0,008X	87	87	87	87	87	87	87	0,0001 ng/ml
0,0156X	87	87	87	87	87	87	87	0,001 ng/ml
0,0325X	87	87	87	87	87	87	87	0,01 ng/ml
0,0625X	87	87	87	87	87	87	58	0,1 ng/ml
0,125X	87	87	87	87	87	87	6,7	1 ng/ml
0,25X	87	87	87	87	87	87	0	10 ng/ml
0,5X	87	87	87	87	87	87	0	100 ng/ml

Beispiel 17
Signalisierung über den Interferon-Reaktionssignalweg
Interaktion der Typ-1-Interferone mit ihren spezifischen Rezeptoren führt zur Induzierung einer Reihe von Genen, die für ihre antivirale/antiproliferative Aktivität verantwortlich sind. Dazu gehören 2'–5' Oligoadenylatsynthetase (2–5 OAS), doppelsträngige RNA-abhängige Pkr-Kinase (Pkr), Phospholipidscramblase und interzelluläres Adhäsionsmolektil-1 (ICAM-1). Die Induzierung von Genen mit bisher unbekannte Funktion, wie ein 56 kDa langes Interferon-stimuliertes Genprodukt (ISG-56k) tritt ebenfalls auf. Zur Bestimmung, ob einige oder alle dieser Gene nach der Behandlung der Zellen mit IL-28A induziert werden, wurden humane Daudi B-Lymphoidzellen 72 Stunden lang mit konditioniertem Medium aus Sf9-Zellen, die mit IL-28A-exprimierendem Baculovirus infiziert wurden, behandelt. Das konditionierte Medium aus Sf9-Zellen, die mit wildtypischem Baculovirus infiziert wurden, wurde als negative Kontrolle verwendet. Nach der Behandlung wurden die Zellen gewonnen und für die Isolierung der Gesamt-RNA lysiert. Eine μg der Gesamt-RNA wurde unter Verwendung der Umkehrtranskriptase zu cDNA konvertiert und als Vorlage für die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, wobei die für die oben beschriebenen humanen Interferon-stimulierten Gene spezifischen Oligonukleotidprimer verwendet wurden. Oligonukleotidprimer für humane Glycerol-3-Phosphatdehydrogenase (G3PDH) wurden als Nicht-Interferon-stimulierte-Gen-Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Induzierung der ISG-56k, Pkr, 2–5 OAS und Phospholipidscramblase nach der Behandlung der Zellen mit IL-28A. Für ICAM-1 oder die Nicht-Interferon-stimulierte-Gen-Kontrolle (G3PDH) wurde keine Induzierung beobachtet.
Beispiel 18
Signaltransduktionsreporter-Assay
Ein Signaltransduktionsreporter-Assay kann verwendet werden, um die funktionale Interaktion des humanen und murinen IL-28 und IL-29 mit dem IL-28-Rezeptor zu bestimmen. Humane embryonale Nierenzellen (HEK) werden mit einem Reporterplasmid transfektiert, das ein Interferon-stimuliertes Reaktionselement (ISRE) enthält, welches die Transkription eines Luciferasereportergens steuert und zwar in Gegenwart oder Abwesenheit der pZP7-Expressionsvektoren, die cDNA für Klasse-II-Zytokin-Rezeptoren (einschließlich humaner DIRS1-, IFNαR1-, IFNαR2- und IL-28-Rezeptor) enthalten. Eine Luciferaseaktivität nach Stimulation der transfektierten Zellen mit Klasse-II-Liganden (einschließlich IL-28A (SEQ ID-NR:2), IL-29 (SEQ ID-NR:4), IL-28B (SEQ ID-NR:6), Zcyto10, huIL10 und huIFNa-2a) reflektiert die Interaktion des Liganden mit transfektierten und native Zytokinrezeptoren auf der Zelloberfläche. Die Ergebnisse und Methoden sind unten beschrieben.
Zelltransfektionen
HEK-293-Zellen wurden wie folgt transfektiert: 700.000 293-Zellen/Well (6-Well-Platten) wurden etwa 18 Stunden vor der Transfektion in 2 Milliliter DMEM + 10% fetales Rinderserum plattiert. Pro Well wurden 1 μg pISRE-Luciferase-DNA (Stratagene), 1 μg Zytokinrezeptor-DNA und 1 μg pIRES2-EGFP-DNA (Clontech) zu 9 μl Fugene 6-Reagenz (Roche Biochemicals) in eine Gesamtmenge von 100 μl DMEM zugegeben. Zwei μg pIRES2-EGFP-DNA wurden verwendet, wenn keine Zytokinrezeptor-DNA enthalten war. Dieses Transfektionsgemisch wurde 30 Minuten später zu den vorher plattierten 293-Zellen gegeben. Vierundzwanzig Stunden später wurden die transfektierten Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA aus der Platte entfernt und zu etwa 25.000 Zellen/Well in 96-Well-Mikrotiterplatten erneut plattiert. Etwa 18 Stunden vor der Ligandstimulation wurde das Medium gewechselt zu DMEM + 0,5% FBS.
Signaltransduktionsreporter-Assays

Die Signaltransduktionsreporter-Assays wurden wie folgt durchgeführt: Nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C in DMEM + 0,5% FBS wurden die transfektierten Zellen mit Verdünnungen (in DMEM + 0,5% FBS) der folgenden Klasse-II-Liganden, IL-28A, IL-29, IL-28B, Zcyto10, huIL10 und hulFNa-2a stimuliert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Zellen lysiert und die relativen Lichteinheiten (RLU) wurden nach Zugabe eines Luciferasesubstrats auf einem Luminometer gemessen. Die erzielten Ergebnisse sind als Faltinduzierung der RLU der experimentellen Proben gegenüber der Nur-Medium-Kontrolle gezeigt (RLU der experimentellen Probe/RLU des Mediums alleine = Faltinduzierung). Tabelle 10 zeigt, dass IL-28A, IL-29 und IL-28B die ISRE-Signalisierung in mit ISRE-Luciferase transfektierten 293-Zellen induziert, mit einer 15- bis 17-fachen Induzierung der Luciferaseaktivität gegenüber dem Nur-Medium. Die Zugabe der IL-28-Rezeptor-Alpha-Untereinheit-DNA (SEQ ID-NR:11) unter Verwendung der endogenen CRF2-4 (SEQ ID-NR:71) zum Transfektionsgemisch resultierte in einer 6- bis 8-fachen weiteren Induzierung in der ISRE-Signalisierung durch IL-28A, IL-29 und IL-28B, mit einer 104- bis 125-fachen Gesamtinduzierung. Keine der anderen transfektierten Klasse-II-Zytokinrezeptor-DNA resultierte in einer erhöhten ISRE-Signalisierung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL-28A, IL-29 und IL-28B mit dem IL-28-Zytokinrezeptor funktionell interagieren. Tabelle 10 zeigt auch, dass huIFNa-2a die ISRE-Signalisierung in mit ISRE-Luciferase transfektierten 293-Zellen induzieren kann, mit einer 205-fachen Induzierung der Luciferaseaktivität im Vergleich zum Medium allein. Die Zugabe der IL-28-Rezeptor-DNA zur Transfektion führt jedoch zur 11-fachen Reduzierung in der ISRE-Signalisierung (im Vergleich zur ISRE-Luciferase-DNA allein), was darauf hin deutet, dass sich die IL-28-Rezeptor-Überexpression negativ auf die Interferonsignalisierung auswirkt im Gegensatz zu den positiven Auswirkungen der IL-28-Rezeptor-Überexpression auf die IL-28A-, IL-29- und IL-28B-Signalisierung. Tabelle 10 Interferon-Stimulierte-Reaktionselement (ISRE) Signalisierung von transfektierten 293-Zellen nach der Stimulation durch Klasse-II-Zytokine (Faltinduzierung)

Ligand	ISRE-Luc.	ISRE-Luc./IL-28R
IL-28A (125 ng/ml)	15	125
IL-29 (125 ng/ml)	17	108
IL-28B (125 ng/ml)	17	104
HuIFNa-2a (100 ng/ml)	205	18
Zcyto10 (125 ng/ml)	1,3	1
HuIL10 (100 ng/ml)	1	0,5

Beispiel 19
Signaltransduktionsassays mit IL-29-Cysteinmutanten
Zelltransfektionen
Zur Produktion von HEK-293-Zellen mit stabiler Überexpression des humanen IL-28-Rezeptors wurden 293-Zellen wie folgt transfektiert: 300.000 293-Zellen/Well (6-Well-Platten) wurden etwa 6 Stunden vor der Transfektion in 2 Milliliter DMEM + 10% fetales Rinderserum plattiert. Pro Well wurden 2 μg eines pZP7-Expressionsvektors, der die cDNA der humanen IL-28-Rezeptor-alpha-Untereinheit (SEQ ID NO: 11) enthielt, zu 6 μg Fugene 6-Reagenz (Roche Biochemicals) zugegeben für eine Gesamtmenge von 100 μl DMEM. Dieses Transfektionsgemisch wurde 30 Minuten später zu den vorher plattierten 293-Zellen gegeben. Achtundvierzig Stunden später wurden die transfektierten Zellen unter 2 μg/ml Puromicinselektion platziert. Puromicin-resistente Zellen wurden als eine Zellpopulation geführt.
Die HEK-293-Zellen, die den humanen IL-28-Rezeptor überexprimieren, wurden wie folgt transfektiert: 700.000 293-Zellen/Well (6-Well-Platten) wurden etwa 18 Stunden vor der Transfektion in 2 Milliliter DMEM + 10% fetales Rinderserum plattiert. Pro Well wurde 1 μg KZ157 mit einem Interferon-stimulierten Reaktionselement (ISRE), das die Transkription eines Luciferase-Reportergens steuert, zu 3 μl Fugene 6-Reagenz (Roche Biochemicals) für eine Gesamtmenge von 100 μl DMEM zugegeben. Dieses Transfektionsgemisch wurde 30 Minuten später zu den vorher plattierten HEK-293-Zellen gegeben. Achtundvierzig Stunden später wurden die transfektierten Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA aus der Platte entfernt und zu etwa 500 μg/ml erneut plattiert (Geneticin, Life Technologies). Puromicin- und G418-resistente Zellen wurden als eine Zellpopulation geführt.
Signaltransduktionsreporter-Assays
Die Signaltransduktionsreporter-Assays wurden wie folgt durchgeführt: HEK-293-Zellen, die humanen IL-28-Rezeptor überexprimieren, und KZ157 enthalten, wurden mit Trypsin-EDTA behandelt und zu etwa 25.000 Zellen/Well in 96-Well-Mikrotiterplatten erneut plattiert. Etwa 18 Stunden vor der Ligandstimulation wurde das Medium gewechselt zu DMEM + 0,5% FBS.
Nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C in DMEM + 0,5% FBS wurden die transfektierten Zellen mit Verdünnungen (in DMEM + 0,5% FBS) verschiedener Formen des aus Zcyto21 gewonnenen E. coli, das verschiedene Cysteinbindungsmuster aufweist, stimuliert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Zellen lysiert und die relativen Lichteinheiten (RLU) wurden nach Zugabe eines Luciferasesubstrats auf einem Luminometer gemessen. Die erzielten Ergebnisse sind als Faltinduzierung der RLU der experimentellen Proben gegenüber der Nur-Medium-Kontrolle gezeigt (RLU der experimentellen Probe/RLU des Mediums alleine = Faltinduzierung).
Tabelle 11 zeigt, dass die C1-C3-Form (C16–C113) des wildtypischen aus E. coli gewonnenen IL-29 eine bessere Fähigkeit zur Induzierung der ISRE-Signalisierung aufweist als die wildtypische C3-C5-Form (C113–C172) oder eine Mischung aus wildtypischer C1-C3-Form und C3-C5-Form (C16–C113, C113–C172), die sich alle auf SEQ ID-NR:15 beziehen.
Tabelle 12 zeigt, dass C1–C3 (C16–C113) des wildtypischen aus E. coli gewonnenen IL-29 und C1–C3 (C16–C113; SEQ ID-NR:15) des Cystein-mutierten (C172S) aus E. coli gewonnenen IL-29 (SEQ ID-NR:29) die gleiche Fähigkeit zur Induzierung der ISRE-Signalisierung in HEK-293-Zellen, die humanen IL-28-Rezeptor überexprimieren, aufweisen. Tabelle 11 ISRE-Signalisierung durch verschiedene Formen von aus E. coli gewonnenen IL-29 (Faltinduktion)

Zytokinkonzentration (ng/ml) C1-C3-Form (C16–C113) C3-C5-Form (C113–C172) Mischung aus C1–C3 und C3–C5

100 36 29 34

10 38 25 35

1 32 12 24

0,1 10 2 5

0,01 3 1 1

0,001 1 1 1

Tabelle 12 ISRE-Signalisierung durch verschiedene Formen von aus E. coli gewonnenen IL-29 (Faltinduktion)

Zytokinkonzentration (ng/ml) Wildtyp C1–C3 Cysteinmutante C172S C1–C3

1000 9,9 8,9

100 9,3 8,7

10 9,3 8,1

1 7,8 7

0,1 4,6 3,3

0,01 1,9 1,5

0,001 1,3 0,9
Beispiel 20
Induzierung von IL-28A, IL-29, IL-28B durch Poly-I:C- und Virusinfektion
Frisch isolierte humane periphere mononukleare Blutzellen wurden in Gegenwart von Polyinosinsäure-Polycytidylsäure (Poly-I:C; 100 μg/ml) (SIGMA; St. Louis, MO, USA), Encephalomyokarditisvirus (EMCV) mit einem MOI von 0,1 oder in Medium alleine gezüchtet. Nach 15 Stunden Inkubation wurde die Gesamt-RNA aus den Zellen isoliert und mit RNase-freier DNase behandelt. 100 ng Gesamt-RNA wurde als Vorlage für eine einstufige RT-PCR verwendet, wozu Superscript One-Step RT-PCR mit Platinum Taq Kit und genspezifischen Primern laut Herstellerempfehlungen (Invitrogen) eingesetzt wurden.
Geringe bis nicht-erkennbare Mengen von humanem IL-28A, IL-28B und IL-29, IFN-α und IFN-β RNA wurden in den unbehandelten Zellen beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine erhöhte Menge der IL-28A-, IL-29-, IL-28B-RNA sowohl bei Poly-I:C-Behandlung als auch Virusinfektion ebenso wie für Typ-I-Interferone. Diese Experimente deuten darauf hin, dass IL-28A, IL-29, IL-28B ebenso wie Typ-I-Interferone durch doppelsträngige RNA oder Virusinfektion induziert werden können.
Beispiel 21
IL-28-, IL-29-Signalisierungsaktivität im Vergleich zu IFNα in HepG2-Zellen
A. Zelltransfektionen
HepG2-Zellen wurden wie folgt transfektiert: 700.000 HepG2-Zellen/Well (6-Well-Platten) wurden etwa 18 Stunden vor der Transfektion in 2 Milliliter DMEM + 10% fetales Rinderserum plattiert. Pro Well wurden 1 μg pISRE-Luciferase-DNA (Stratagene), 1 μg pIRES2-EGFP DNA (Clontech) zu 6 μl Fugene 6-Reagenz (Roche Biochemicals) in eine Gesamtmenge von 100 μl DMEM zugegeben. Dieses Transfektionsgemisch wurde 30 Minuten später zu den vorher plattierten HepG2-Zellen gegeben. Vierundzwanzig Stunden später wurden die transfektierten Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA aus der Platte entfernt und zu etwa 25.000 Zellen/Well in 96-Well-Mikrotiterplatten erneut plattiert. Etwa 18 Stunden vor der Ligandstimulation wurde das Medium gewechselt zu DMEM + 0,5 % FBS.
B. Signaltransduktionsreporter-Assays
Die Signaltransduktionsreporter-Assays wurden wie folgt durchgeführt: Nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C in DMEM + 0,5% FBS wurden die transfektierten Zellen mit 100 ng/ml IL-28A, IL-29, IL-28B, Zcyto24, Zcyto25 und huIFN-α2a-Liganden stimuliert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Zellen lysiert und die relativen Lichteinheiten (RLU) wurden nach Zugabe eines Luciferasesubstrats auf einem Luminometer gemessen. Die erzielten Ergebnisse sind als Faltinduzierung der RLU der experimentellen Proben gegenüber der Nur-Medium-Kontrolle gezeigt (RLU der experimentellen Probe/RLU des Mediums alleine = Faltinduzierung). Tabelle 13 zeigt, dass IL-28A, IL-29, IL-28B, Zcyto24 und Zcyto25 die ISRE-Signalisierung in humanen mit ISRE-Luciferase transfektierten HepG2-Leberzellen induziert. Tabelle 13: Faltinduktion der Zytokin-abhängigen ISRE-Signalisierung in HepG2-Zellen

Zytokin Faltanweisung

IL-28A 5,6

IL-29 4

IL-28B 5,8

Zcyto24 4,7

Zcyto25 3

HuIFN-a2a 5,8
Beispiel 22
Antivirale IL-29-Aktivität im Vergleich zu IFNα in HepG2-Zellen
Ein antiviraler Assay wurde für EMCV (American Type Culture Collection # VR-129B, Manassas, VA) mit Humanzellen (Familletti, P., et al., Methods Enzym. 78: 387–394, 1981) angepasst. Die Zellen wurden mit Zytokinen plattiert und 24 Stunden vor der Aussetzung an EMCV mit einer Multiplizität der Infektion von 0,1 bis 1 inkubiert. Die Zellen wurden durch Farbstoffaufnahme-Bioassay 24 Stunden nach der Infektion auf ihre Lebensfähigkeit analysiert (Berg, K., et al., Apmis 98: 156–162, 1990). Den Zielzellen wurde MTT zugegeben und sie wurden bei 37°C 2 Stunden inkubiert. Es wurde eine Solubilisierungslösung zugegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert, worauf eine optische Dichte von 570 nm bestimmt wurde. OD570 ist direkt proportional zur antiviralen Aktivität.
Die Ergebnisse zeigen die antivirale Aktivität nach Prüfung der IL-29 und IFN mit HepG2-Zellen: IL-29, IFN-β und IFNα-2a wurden vor der EMCV-Infektion und dem Farbstoffaufnahme-Assay mit verschiedenen Konzentrationen zu den HepG2-Zellen gegeben. Die mittlere und Standardabweisung der OD570 von den Dreifach-Wells wurde in einem Plot erfasst. OD570 ist direkt proportional zur antiviralen Aktivität. Für IL-29 betrug der EC50 0,60 ng/ml; für IFN-α2a betrug der EC50 0,57 ng/ml und für IFN-β betrug der EC50 0,46 ng/ml.
Beispiel 23
IL-28RA-mRNA-Expression in Leber- und Lymphozytenteilsätzen
Für die weitere Untersuchung der mRNA-Verteilung für IL-28RA wurde unter Verwendung des SDS 7900HT Systems (Applied Biosystems, CA, USA) eine semiquantitative RT-PCR durchgeführt. Die One-step-RT-PCR wurde unter Verwendung von 100 ng Gesamt-RNA je Probe und genspezifischen Primern durchgeführt. Für jeden Primer wurde unter Verwendung der Bjab RNA eine Standardkurve generiert und alle Probenwerte wurden auf HPRT normalisiert. Die normalisierten Ergebnisse sind in den Tabellen 14–17 zusammengefasst. Die normalisierten Werte für IFNAR2 und CRF2-4 sind ebenfalls gezeigt.

Tabelle 14: B- und T-Zellen exprimieren signifikante Konzentrationen der IL-28RA-mRNA. Bei den in dendritischen Zellen beobachteten geringen Konzentrationen handelt es sich hauptsächlich um Monozyten. Tabelle 14

Zelle/Gewebe	IL-28RA	IFNAR2	CRF2-4
Dendritische Zellen unstim	,04	5,9	9,8
Dendritische Zellen + IFNg	,07	3,6	4,3
Dendritische Zellen	,16	7,85	3,9
CD14+ mit LPS/IFNg stimuliert	,13	12	27
CD14+ Monozyten ruhend	,12	1 I	15,4
Hu CD14+ inakt.	4,2	noch nicht bestimmt	noch nicht bestimmt
Hu CD14+ 1 μg/ml LPS akt.	2,3	noch nicht bestimmt	noch nicht bestimmt
H. entzündete Mandel	3	12,4	9,5
H. B-Zellen + PMA/Iono 4 + 24 h	3,6	1,3	1,4
Hu CD19+ ruhend	6,2	noch nicht bestimmt	noch nicht bestimmt
Hu CD19+ 4 h PMA/Iono	10,6	noch nicht bestimmt	noch nicht bestimmt
Hu CD19+ 24 h akt. PMA/Iono	3,7	noch nicht bestimmt	noch nicht bestimmt
IgD+ B-Zellen	6,47	13,15	6,42
IgM+ B-Zellen	9,06	15,4	2,18
IgD– B-Zellen	5,66	2,86	6,76
NK-Zellen + PMA/Iono	0	6,7	2,9
Hu CD3+ inaktiviert	2,1	noch nicht bestimmt	noch nicht bestimmt
CD4+ ruhend	,9	8,5	29.1
CD4+ unstim 18 h	1,6	8,4	13,2
CD4+ + Poly I/C	2,2	4,5	5,1
CD4+ + PMA/Iono	,3	1,8	,9
CD3 neg ruhend	1,6	7,3	46
CD4 neg unstim 18 h	2,4	13,2	16,8
CD3 neg + Poly I/C 18 h	5,7	7	30,2
CD3 neg + LPS 18 h	3,1	11,9	28,2
CD8+ unstim 18h	1,8	4,9	13,1
CD8+ stimul. mit PMA/Ion 18 h	,3	,6	1,1

Wie in Tabelle 14 gezeigt sind bei normalem Lebergewebe und aus der Leber gewonnenen Zelllinien wesentliche Konzentrationen von IL-28RA- und CRF2-4-mRNA vorhanden. Tabelle 15

Zelle/Gewebe	IL-28RA	IFNAR2	CRF2-4
HepG2	1,6	3,56	2,1
HepG2 UGAR 5/10/02	1,1	1,2	2,7
HepG2, CGAT HKES081501C	4,3	2,1	6
HuH7 5/10/02	1,63	16	2
HuH7 Hepatom – CGAT	4,2	7,2	3,1
Leber, normal – CGAT #HXYZ020801K	11,7	3,2	8,4
Leber, NAT – Normales daneben liegendes Gewebe	4,5	4,9	7,7
Leber, NAT – Normales daneben liegendes Gewebe	2,2	6,3	10,4
Hep SMVC Hep. Vene	0	1,4	6,5
Hep SMCA Hep. Arterie	0	2,1	7,5
Hep. Fibro	0	2,9	6,2
Hep. Karz.	3,8	2,9	5,8
Adenokarz.-Leber	8,3	4,2	10,5
SK-Hep-1 Adenokarz. Leber	‚1	1,3	2,5
AsPC-1 Hu. Pankreatisches Adenokarz.	,7	,8	1,3
Hu. Hep. Stellatumzellen	,025	4,4	9,7

Wie in Tabelle 15 gezeigt enthalten die primären Atemwegsepithelzellen reichliche Konzentrationen von IL-28RA- und CRF2-4. Tabelle 16

Zelle/Gewebe	IL-28RA	IFNAR2	CRF2-4
U87MG – Gliom	0	,66	,99
NHBE unstim	1,9	1,7	8,8
NHBE + TNF-alpha	2,2	5,7	4,6
NHBE + Poly I/C	1,8	unbestimmt	unbestimmt
Kleine Atemwegsepithelzellen	3,9	3,3	27,8
NHLF – Normale humane Lungenfibroblaste	0	unbestimmt	unbestimmt

Wie in Tabelle 16 gezeigt ist IL-28RA in normalen und erkrankten Leberproben vorhanden mit erhöhter Expression in Gewebe von Proben, die mit Hepatitis C und Hepatitis B infiziert sind. Tabelle 17

Zelle/Gewebe	IL-28RA	CRF2-4	IFNAR2
Leber mit Koagulationsnekrose	8,87	15,12	1,72
Leber mit Autoimmun-Hepatitis	6,46	8,90	3,07
Neonatale Hepatitis	6,29	12,46	6,16
Endstadium-Lebererkrankung	4,79	17,05	10,58
Fulminantes Leberversagen	1,90	14,20	7,69
Fulminantes Leberversagen	2,52	11,25	8,84
Zirrhose, primär biliär	4,64	12,03	3,62
Zirrhose alkoholisch (Laennec)	4,17	8,30	4,14
Zirrhose, kryptogen	4,84	7,13	5,06
Hepatitis C+, mit Zirrhose	3,64	7,99	6,62
Hepatitis C+	6,32	11.29	7,43
Fulminante Hepatitis sekundär zur Hep A	8,94	21,63	8,48
Hepatitis C+	7,69	15,88	8,05
Hepatitis B+	1,61	12,79	6,93
Normale Leber	8,76	5,42	3,78
Normale Leber	1,46	4,13	4,83
Leber NAT	3,61	5,43	6,42
Leber NAT	1,97	10,37	6,31
Hu Fötusleber	1,07	4,87	3,98
Hepatozelluläres Karzinom	3,58	3,80	3,22
Adenokarzinom Leber	8,30	10,48	4,17
Hep. SMVC, hep. Vene	0,00	6,46	1,45
Hep SMCA Hep. Arterie	0,00	7,55	2,10
Hep. Fibroblast	0,00	6,20	2,94
HuH7 Hepatom	4,20	3,05	7,24
HepG2 Hepatozelluläres Karzinom	3,40	5,98	2,11
SK-Hep-1 Adenokarz. Leber	0,03	2,53	1,30
HepG2 Unstim	2,06	2,98	2,28
HepG2 + Zcyto21	2,28	3,01	2,53
HepG2 + IFNα	2,61	3,05	3,00
Normale weibliche Leber – abgebaut	1,38	6,45	4,57
Normale Leber – abgebaut	1,93	4,99	6,25
Normale Leber – abgebaut	2,41	2,32	2,75
Kranke Leber – abgebaut	2,33	3,00	6,04
Primäre Hepatozyten von Clonetics	9,13	7,97	13,30

Wie in den Tabellen 18–22 gezeigt ist IL-28RA in normalen B-Zellen, B-Lymphom-Zelllinien, T-Zellen, T-Lymphom-Zelllinien (Jurkat), normalen und transformierten Lymphozyten (B-Zellen und T-Zellen) und normalen humanen Monozyten erkennbar. Tabelle 18

	HPRT Mittel	IL-28RA Mittel	IL-28RA Norm	IFNAR2	IFNR2 Norm	CRF2-4	CRF2-4 Norm
CD 14+ 24h unstim Nr. A38	13,1	68,9	5,2	92,3	7,0	199,8	15,2
CD 14+ 24h stim Nr. A38	6,9	7,6	1,1	219,5	31,8	276,6	40,1
CD 14+ 24 h unstim Nr. A112	17,5	40,6	2,3	163,8	9,4	239,7	13,7
CD 14+ 24h stim Nr. A112	11,8	6,4	0,5	264,6	22,4	266,9	22,6
CD 14+ ruhend Nr. X	32,0	164,2	5,1	1279,7	39,9	699,9	21,8
CD 14+ + LPS Nr. X	21,4	40,8	1,9	338,2	15,8	518,0	24,2
CD 14+ 24 h unstim Nr. A39	26,3	86,8	3,3	297,4	11,3	480,6	18,3
CD 14+ 24 h stim Nr. A39	16,6	12,5	0,8	210,0	12,7	406,4	24,5
HL60 ruhend	161,2	0,2	0,0	214,2	1,3	264,0	1,6
HL60 + PMA	23,6	2,8	0,1	372,5	15,8	397,5	16,8
U937 ruhend	246,7	0,0	0,0	449,4	1,8	362,5	1,5
U937 + PMA	222,7	0,0	0,0	379,2	1,7	475,9	2,1
Jurkat ruhend	241,7	103,0	0,4	327,7	1,4	36,1	0,1
Jurkat aktiviert	130,7	143,2	1,1
Colo205	88,8	43,5	0,5
HT-29	26,5	30,5	1,2

Tabelle 19

	HPRT SD	IL-28RA SD
Mono 24 h unstim Nr. A38	0,6	2,4
Mono 24 h stim Nr. A38	0,7	0,2
Mono 24 h unstim Nr. A112	2,0	0,7
Mono 24 h stim Nr. A112	0,3	0,1
Mono ruhend Nr. X	5,7	2,2
Mono + LPS Nr. X	0,5	1,0
Mono 24 h unstim Nr. A39	0,7	0,8
Mono 24 h stim Nr. A39	0,1	0,7
HL60 ruhend	19,7	0,1
HL60 + PMA	0,7	0,4
U937 ruhend	7,4	0,0
U937 + PMA	7,1	0,0
Jurkat ruhend	3,7	1,1
Jurkat aktiviert	2,4	1,8
Colo205	1,9	0,7
HT-29	2,3	1,7

Tabelle 20

	Mittlere Hprt	Mittlere IFNAR2	Mittlere IL-28RA	Mittlere CRF
CD3+/CD4+ 0	10,1	85,9	9,0	294,6
CD4/CD3+ Unstim 18 h	12,9	108,7	20,3	170,4
CD4+/CD3+ + Poly I/C 18 h	24,1	108,5	52,1	121,8
CD4+/CD3+ + PMA/Iono 18 h	47,8	83,7	16,5	40,8
CD3 neg 0	15,4	111,7	24,8	706,1
CD4 neg unstim 18 h	15,7	206,6	37,5	263,0
CD3 neg + Poly I/C 18 h	9,6	67,0	54,7	289,5
CD3 neg + LPS 18 h	14,5	173,2	44,6	409,3
CD8+ Unstim. 18 h	6,1	29,7	11,1	79,9
CD8+ + PMA/Iono 18 h	78,4	47,6	26,1	85,5
12.8.1 – NHBE Unstim	47,4	81,1	76,5	415,6
12.8.2 – NHBE + TNF-alpha	42,3	238,8	127,7	193,9
SAEC	15,3	49,9	63,6	426,0

Tabelle 21

	IL-28RA Norm	CRF Norm	IFNAR2 Norm	IL-28RA SD	CRF SD	IFNAR2 SD
CD3+/CD4+ 0	0,9	29,1	8,5	0,1	1,6	0,4
CD4/CD3+ Unstim 18 h	1,6	13,2	8,4	0,2	1,6	1,4
CD4+/CD3+ + Poly I/C 18 h	2,2	5,1	4,5	0,1	0,3	0,5
CD4+/CD3+ + PMA/Iono 18 h	0,3	0,9	1,8	0,0	0,1	0,3
CD3 neg 0	1,6	46,0	7,3	0,2	4,7	1,3
CD4 neg unstim 18 h	2,4	16,8	13,2	0,4	2,7	2,3
CD3 neg + Poly I/C 18 h	5,7	30,2	7,0	0,3	1,7	0,8
CD3 neg + LPS 18 h	3,1	28,2	11,9	0,4	5,4	2,9
CD8+ Unstim. 18 h	1,8	13,1	4,9	0,1	1,1	0,3
CD8+ + PMA/Iono 18 h	0,3	1,1	0,6	0,0	0,1	0,0
12.8.1 – NHBE Unstim	1,6	8,8	1,7	0,1	0,4	0,1
12.8.2 – NHBE + TNF-alpha	3,0	4,6	5,7	0,1	0,1	0,1
SAEC	4,1	27,8	3,3	0,2	1,1	0,3

Tabelle 22

	SD Hprt	SD IFNAR2	SD IL-28RA	SD CRF
CD3+/CD4+ 0	0,3	3,5	0,6	12,8
CD4/CD3+ Unstim 18 h	1,4	13,7	1,1	8,5
CD4+/CD3+ + Poly I/C 18 h	1,3	9,8	1,6	3,4
CD4+/CD3+ + PMA/Iono 18 h	4,0	10,3	0,7	3,7
CD3 neg 0	1,4	16,6	1,6	28,6
CD3 neg unstim 18 h	2,4	16,2	2,7	12,6
CD3 neg + Poly I/C 18 h	0,5	7,0	1,0	8,3
CD3 neg + LPS 18 h	1,0	39,8	5,6	73,6
CD8+ Unstim. 18 h	0,2	1,6	0,5	6,1
CD8+ + PMA/Iono 18 h	1,3	1,7	0,2	8,1
12.8.1 – NHBE Unstim	2,4	5,6	2,7	2,8
12.8.2 – NHBE + TNF-alpha	0,5	3,4	3,5	3,4
SAEC	0,5	4,8	1,8	9,9

Beispiel 24
Maus-IL-28 hat keine Auswirkung auf die Daudi-Zellproliferation
Humane Daudi-Zellen wurden in RPMI + 10% FBS zu 50.000 Zellen/ml suspendiert und 5000 Zellen wurden in einer 96-Well-Platte plattiert. IL-29-CEE (IL-29 konjugiert mit Glu-Tag), IFN-γ oder IFN-α2α wurden in 2-fachen seriellen Verdünnungen in jedes Well gegeben. IL-29-CEE wurde in einem Konzentrationsbereich von 1000 ng/ml bis 0,5 ng/ml verwendet. IFN-γ wurde in einem Konzentrationsbereich von 125 ng/ml bis 0,06 ng/ml verwendet. IFN-α2a wurde in einem Konzentrationsbereich von 62 ng/ml bis 0,03 ng/ml verwendet. Die Zellen wurden 72 Stunden bei 37°C inkubiert und nach 72 Stunden wurde Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL, USA) in einer Menge von 20 μl/Well zugegeben. Die Platten wurden erneut bei 37°C, 5% CO für 24 Stunden inkubiert. Die Platten wurden auf dem Fmax^TM Plattenleser (Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA) unter Verwendung des SoftMax^TM Pro-Programms bei Wellenlängen von 544 (Erregung) und 590 (Emission) abgelesen. Alamar Blue liefert eine fluorometrische Ablesung basierend auf der metabolischen Zellaktivität und ist somit eine direkte Messung der Zellproliferation im Vergleich zu einer negativen Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass IL-29-CEE im Gegensatz zu IFN-α2a keine signifikante Auswirkung auf die Proliferation von Daudi-Zellen hat.
Beispiel 25
Maus-IL-28 hat keine antiproliferative Auswirkung auf Maus-B-Zellen
Maus-B-Zellen wurden aus 2 Balb/C-Milzen (7 Monate alt) durch Depletierung der CD43+ Zellen unter Verwendung von MACS-Magnet-Beads isoliert. Die aufgereinigten B-Zellen wurden in vitro mit LPS, Anti-IgM oder Anti-CD40 monoklonalen Antikörpern gezüchtet. Zu den Kulturen wurde Maus-IL-28 oder Maus-IFNα gegeben, nach 48 Stunden wurde ³H-Thymidin zugegeben und die ³H-Thymidin-Integration wurde nach 72 Stunden gemessen.
IFNα zu 10 ng/ml hemmte die ³H-Thymidin-Integration durch entweder mit LPS oder Anti-IgM stimulierte Maus-B-Zellen. Maus-IL-28 verursachte jedoch bei keiner der geprüften Konzentrationen, einschließlich 1000 ng/ml eine Hemmung der ³H-Thymidin-Integration. Im Gegenteil, sowohl mIFNα als auch Maus-IL-28 erhöhten die ³H-Thymidin-Integration durch die mit Anti-CD40-MAb stimulierten Maus-B-Zellen.
Diese Daten zeigen, dass Maus-IL-28 im Gegensatz zum IFNα keine antiproliferative Aktivität aufweist, auch nicht bei hohen Konzentrationen. Des Weiteren verbessert Zcyto24 die Proliferation in Gegenwart von Anti-CD40 MAb. Die Ergebnisse zeigen, dass sich Maus-IL-28 vom IFN-alpha unterscheidet, indem Maus-IL-28 keine antiproliferative Aktivität bei Maus-B-Zellen aufweist, auch nicht bei hohen Konzentrationen. Des Weiteren verbessert Maus-IL-28 die Proliferation in Gegenwart von Anti-CD40 monoklonalen Antikörpern.
Beispiel 26
Knochenmarkexpansionsassay
Frische humane mononukleare Knochenmarkzellen (Poietic Technologies, Gaithersburg, Md.) wurden für 2 Stunden in αMEM, 10% FBS, 50 Micromolar-β-mercaptoethanol, 2 ng/ml FLT3L bei 37°C an Kunststoff gebunden. Nicht-adhärente Zellen wurden dann zu 25.000 bis 45.000 Zellen/Well (96-Well-Gewebekulturplatten) in αMEM, 10% FBS, 50 Micromolar-β-mercaptoethanol, 2 ng/ml FLT3L in Gegenwart oder Abwesenheit von 1000 ng/ml IL-29-CEE, 100 ng/ml IL-29-CEE, 10 ng/ml IL-29-CEE, 100 ng/ml IFN-α2a, 10 ng/ml IFN-α2a oder 1 ng/ml IFN-α2a plattiert. Diese Zellen wurden mit verschiedenen Zytokinen inkubiert, um auf Expansion oder Differenzierung der hämatopoetischen Zellen vom Knochenmark zu prüfen (20 ng/ml IL-2, 2 ng/ml IL-3, 20 ng/ml IL-4, 20 ng/ml IL-5, 20 ng/ml IL-7, 20 ng/ml IL-10, 20 ng/ml IL-12, 20 ng/ml IL-15, 10 ng/ml IL-21 oder ohne Zugabe von Zytokinen). Nach 8 bis 12 Tagen wurde Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL, USA) in einer Menge von 20 μl/Well zugegeben. Die Platten wurden erneut bei 37°C, 5% CO für 24 Stunden inkubiert. Die Platten wurden auf dem Fmax^TM Plattenleser (Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA) unter Verwendung des SoftMax^TM Pro-Programms bei Wellenlängen von 544 (Erregung) und 590 (Emission) abgelesen. Alamar Blue liefert eine fluourometrische Ablesung basierend auf der metabolischen Zellaktivität und ist somit eine direkte Messung der Zellproliferation im Vergleich zu einer negativen Kontrolle.
IFN-α2a verursachte unter allen geprüften Bedingungen eine signifikante Hemmung der Knochenmarkexpansion. Im Gegensatz dazu hatte IL-29 keine signifikante Auswirkung auf die Expansion der Knochenmarkzellen in Gegenwart von IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-21 oder ohne Zugabe von Zytokinen. Eine geringe Hemmung der Knochenmarkzellenexpansion wurde in Gegenwart von IL-2 oder IL-15 beobachtet.
Beispiel 27
Hemmung der IL-28- und IL-29-Signalisierung mit löslichem Rezeptor (ZcytoR19/CRF2-4)
A. Signaltransduktionsreporter-Assay
Ein Signaltransduktionsreporterassay kann verwendet werden, um die Inhibitormerkmale der homodimeren Zcytor19-Fc4 und heterodimeren Zcytor19-Fc/CRF2-4-Fc löslichen Rezeptoren auf die Zcyto20-, Zcyto21- und Zcyto24-Signalisierung aufzuzeigen. Humane embryonale Nierenzellen (HEK), die den Zcytor19-Rezeptor überexprimieren, werden mit einem Reporterplasmid transfektiert, das ein die Transkription eines Luciferase-Reportergens steuerndes Interferonstimuliertes-Reaktionselement (ISRE) enthält. Eine Luciferaseaktivität nach Stimulation der transfektierten Zellen mit Liganden (einschließlich Zcyto20 (SEQ ID-NR:2), Zcyto21 (SEQ ID-NR:4), Zcyto24 (SEQ ID-NR:8)) reflektiert die Interaktion des Liganden mit dem löslichen Rezeptor.
B. Zelltransfektionen
HEK-293-Zellen., die Zcytor19 überexprimieren, wurden wie folgt transfektiert: 700.000 293-Zellen/Well (6-Well-Platten) wurden etwa 18 Stunden vor der Transfektion in 2 Milliliter DMEM + 10% fetales Rinderserum plattiert. Pro Well wurden 1 μg pISRE-Luciferase-DNA (Stratagene), 1 μg pIRES2-EGFP DNA (Clontech) zu 6 μl Fugene 6-Reagenz (Roche Biochemicals) in eine Gesamtmenge von 100 μl DMEM zugegeben. Dieses Transfektionsgemisch wurde 30 Minuten später zu den vorher plattierten 293-Zellen gegeben. Vierundzwanzig Stunden später wurden die transfektierten Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA aus der Platte entfernt und zu etwa 25.000 Zellen/Well in 96-Well-Mikrotiterplatten erneut plattiert. Etwa 18 Stunden vor der Ligandstimulation wurde das Medium gewechselt zu DMEM + 0,5% FBS.
C. Signaltransduktionsreporter-Assays
Die Signaltransduktionsreporter-Assays wurden wie folgt durchgeführt: Nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C in DMEM + 0,5% FBS wurden die transfektierten Zellen mit 10 ng/ml Zcyto20, Zcyto21 oder Zcyto24 und 10 μg/ml der folgenden löslichen Rezeptoren stimuliert: humaner Zcytor19-Fc homodimer, humaner Zcytor19-Fc/humaner CRF2-4-Fc heterodimer, humaner CRF2-4-Fc homodimer, muriner Zcytor19-Ig homodimer. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Zellen lysiert und die relativen Lichteinheiten (RLU) wurden nach Zugabe eines Luciferasesubstrats auf einem Luminometer gemessen. Die gewonnenen Ergebnisse sind als prozentuale Hemmung der ligandinduzierten Signalisierung in Gegenwart des löslichen Rezeptors relativ zur Signalisierung in Gegenwart von nur PBS dargestellt.
Tabelle 23 zeigt, dass der humane Zcytor19-Fc/humane CRF2-4 heterodimere lösliche Rezeptor fähig ist zur Hemmung von Zcyto20-, Zcyto21- und Zcyto24-induzierter Signalisierung zwischen 16% und 45% der Kontrolle. Der humane Zcytor19-Fc homodimere lösliche Rezeptor ist auch fähig, die Zcyto21-induzierte Signalisierung um 45% zu hemmen. Mit den homodimeren löslichen Rezeptoren huCRF2-4-Fc oder muZcytor19-Ig wurden keine signifikanten Wirkungen beobachtet. Tabelle 23: Prozentuale Hemmung der ligandinduzierten Interferon-Stimulierten-Reaktionselement(ISRE)-Signalisierung durch lösliche Rezeptoren

Ligand HuZcytor19-Fc/huCRF2-4-Fc HuZcytor19-Fc HuCRF2-4-Fc MuZcytor19-Ig

Zcyto20 16% 92% 80% 91%

Zcyto21 16% 45% 79% 103%

Zcyto24 47% 90% 82% 89%
Beispiel 28
IL-28 und IL-29 hemmen HIV-Replikation in frischen humanen PBMC
Human-Immunodeficiency-Virus (HIV) ist ein pathogenes Retrovirus, das Zellen des Immunsystems infiziert. CD4-T-Zellen und Monozyten sind die primär infizierten Zelltypen. Zur Prüfung der Fähigkeit von IL-28 und IL-29 zur Hemmung der HIV-Replikation in vitro wurden PBMC von normalen Spender in Gegenwart von IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG mit dem HIV-Virus infiziert.
Frische humane periphere mononukleare Zellen (PBMC) wurden aus Vollblut isoliert, das von gescreenten HIV- und HBV-seronegativen Spender gewonnen. Die peripheren Blutzellen wurden pelletiert, 2- bis 3-mal durch niedertourige Zentrifugation gewaschen und in PBS resuspendiert, um kontaminierende Thrombozyten zu entfernen. Die gewaschenen Blutzellen wurden 1:1 verdünnt mit Dulbecco phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) und auf 14 ml Lymphocyte Separation Medium ((LSM; cellgro^TM von Mediatech, Inc. Herndon, VA, USA) mit einer Dichte von 1,078 +/– 0,002 g/ml) in einem 50-ml-Zentrifugierröhrchen geschichtet und 30 Minuten bei 600 × G zentrifugiert. Die PBMC-Banden wurden vorsichtig von der resultierenden Schnittfläche aspiriert und anschließend 2-mal durch niedertourige Zentrifugation in PBS gewaschen. Nach der letzten Wäsche wurden die Zellen durch Trypan-Blau-Exklusion gezählt und dann zu 1 × 10 Zellen/ml resuspendiert in RPMI 1640, ergänzt mit 15% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 4 μg/ml PHA-P. Die Zellen wurden 48–72 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die PBMC zentrifugiert und resuspendiert in RPMI 1640 mit 15% FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 10 μg/ml Gentamycin und 20 U/ml rekombinante humane IL-2. Die PBMC wurden in einer Konzentration von 1–2 × 10⁶ Zellen/ml im Medium erhalten mit Mediumwechsel zweimal pro Woche bis zur Verwendung im Assayprotokoll. Die Monozyten wurden aufgrund der Adhärenz an die Gewebekulturflasche aus der Kultur depletiert.
Für den Standard-PBMC-Assay wurden PHA-P-stimulierte Zellen von mindestens zwei normalen Spender gepoolt, in frischem Medium verdünnt auf eine Endkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml und in die inneren Wells einer 96-Well-Platte mit rundem Boden zu 50 μl/Well (5 × 10⁴ Zellen/Well) plattiert. Die Testverdünnungen wurden mit einer 2-fachen Konzentration in Mikrotiterröhrchen präpariert und 100 μl der Konzentration wurden in einem Standardformat in die entsprechenden Wells platziert. IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG wurden in Konzentrationen von 0–10 μg/ml zugegeben, gewöhnlich in 1/2 Log-Verdünnungen. 50 μl einer vorbestimmten Verdünnung des Virusbestands wurde in jedes Test-Well gegeben (endg. MOI 0,1). Wells mit nur Zellen und Virus wurden als Viruskontrolle verwendet. Separate Platten wurden auf identische Weise ohne Virus präpariert für die Verwendung in Arzneistoff- Zytotoxizitätsuntersuchungen mit einem MTS-Assaysystem. Die PBMC-Kulturen wurden sieben nach der Infektion aufbewahrt und dann wurden die zellfreien Überstandproben gewonnen und auf Umkehrtranskriptase-Aktivität und p24-Antigenkonzentrationen analysiert.
Eine Reduzierung in der Umkehrtranskriptase-Aktivität oder in den p24-Antigenkonzentrationen mit IL-28, IL-29 and MetIL-29C172S-PEG wären Indikatoren für eine antivirale Aktivität. Das Ergebnis würde aufzeigen, dass IL-28 und IL-29 therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von HIV und AIDS haben könnten.
Beispiel 29
IL-28 und IL-29 hemmen GBV-Replikation in Leberzellen von Marmoset-Affen
Das HCV ist ein RNA-Virus aus der Flaviviridae-Familie. Da in Ex-vivo- oder In-vitro-Kulturen keine zufriedenstellende Replikation des HCV möglich ist, gibt es keine ausreichenden Systeme für die In-vitro-Untersuchung der HCV-Aktivität von Molekülen. Das GB-Virus B (GBV-B) ist ein attraktives Surrogatmodell für die Verwendung bei der Entwicklung von Anti-HCV-Antiviruswirkstoffen, da es eine relativ hohe Sequenzidentität mit dem HCV aufweist und ein hepatotropes Virus ist. Bis dato kann das Virus nur in den primären Hepatozyten bestimmter nicht-menschlicher Primaten gezüchtet werden. Das wird erreicht, indem die Hepatozyten entweder in vitro isoliert und mit dem GBV-B infiziert werden, oder durch Isolation der Hepatozyten aus den mit GBV-B-infizierten Marmoset-Affen und ihre direkte Verwendung mit antiviralen Verbindungen.
Die Wirkungen von IL-28, IL-29 and MetIL-29C172S-PEG werden analysiert auf GBV-B extrazelluläre RNA-Produktion durch TaqMan RT-PCR und untersucht auf Zytotoxizität durch CellTiter96^® Reagenz (Promega, Madison, WI, USA) mit sechs Halb-Log-Verdünnungen von IL-28, IL-29 oder MetIL-29C1725-PEG-Polypeptid 3X. Unbehandelte Kulturen dienen als Zell- und Viruskontrollen. Sowohl RIBAVIRIN^® (200 μg/ml mit höchster Testkonzentration) und IFN-α (5000 IU/ml mit höchster Testkonzentration) sind als positive Kontrollverbindungen enthalten. Primäre Hepatozytenkulturen werden isoliert und auf collagenbeschichteten Platten plattiert. Am nächsten Tag werden die Kulturen mit den Testproben (IL-28, IL-29, MetIL- 29C172S-PEG, IFN-α oder RIBAVIRIN^®) 24 Stunden lang behandelt, bevor sie an GBV-B ausgesetzt werden, oder sie werden direkt mit den Testproben behandelt, wenn in vivo infizierte Hepatozyten verwendet wurden. Die Testproben und das Medium werden am nächsten Tag zugegeben und drei Tage später ausgetauscht. Drei bis vier Tage später (am Tag 6–7 nach der Testprobenzugabe) wird der Überstand abgeschöpft und die Zellzahlen werden mit dem CellTiter96^® quantifiziert. Virale RNA wird aus dem Überstand extrahiert und mit einem quanhitativen TaqMan RT-PCR-Assay mit dreifachen Replikaten quantifiziert, wozu eine in vitro transkribierte RNA mit dem RT-PCR-Ziel als Standard verwendet wird. Der Mittelwert der Replikatproben wird berechnet. Die Hemmung der Virusproduktion wird durch Plotting der mittleren RNA und der Zellzahlwerte aus den Dreifachproben relativ zu den unbehandelten Virus- und Zellkontrollen beurteilt. Die inhibitorische Konzentration des Arzneimittels, die 50% Hemmung der GBV-B-RNA-Produktion (IC50) ergibt und die toxische Konzentration, die zur Destruktion von 50% der Zellzahlen relativ zur den Kontrollwerten (TC50) führt, werden durch Interpolation der mit den Daten erzeugten Kurven berechnet.
Die Inhibition der GBV-B-RNA-Produktion durch IL-28 und 29 ist ein Indikator für die antiviralen Merkmale von IL-28 und IL-29 bei diesem Hepatitis-C-ähnlichen Virus auf Hepatozyten, das primäre Organ der Hepatitis-C-Infektion und die positiven Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL-28 oder IL-29 für die Behandlung von HCV-Infektionen in Menschen nützlich sein kann.
Beispiel 30
IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG hemmen die HBV-Replikation in WT10-Zellen
Chronische Hepatitis B (HBV) ist eine der häufigsten und schwersten Virusinfektionen bei Menschen und sie gehört zur Familie der Hepadnaviridae-Viren. Zur Prüfung der antiviralen Aktivitäten von IL-28 und IL-29 gegen HBV wurden IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG in einem In-vitro-Infektionssystem unter Verwendung einer Variante der humanen Leberzelllinie HepG2 gegen HBV getestet. IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG hemmten die virale Replikation in diesem System, was auf einen therapeutischen Nutzen für die Behandlung des HBV in Menschen hinweist.
WT10-Zellen sind ein Derivat der humanen Leberzelllinie HepG2 2.2.15. WT10-Zellen werden stabil mit dem HBV-Genom transfektiert, wodurch eine stabile Expression der HBV-Transkripte in die Zelllinie ermöglicht wird (Fu and Cheng, Antimicrobial Agents Chemother. 44(12):3402–3407, 2000). Im WT10-Assay werden das Arzneimittel und eine 3TC-Konteolle mit je fünf Konzentrationen und Verdünnungen in einer Halb-Log-Serie analysiert. Die Endpunkte sind TaqMan PCR für extrazelluläre HBV DNA (IC50) und Zellzahlen unter Verwendung des CellTiter96 Reagenz (TC50). Der Assay ist ähnlich dem von Korba et al. Antiviral Res. 15(3):217–228, 1991 und Korba et al., Antiviral Res. 19(1):55–70, 1992, beschriebenen Assay. Kurz gefasst: Die WT10-Zellen werden in 96-Well-Mikrotiterplatten plattiert. Nach 16–24 Stunden wird die konfluente Monoschicht der HepG2-2.2.15-Zellen gewaschen und das Medium wird gegen ein komplettes Medium ausgetauscht, das verschiedene Konzentrationen von 3X-Testproben enthält. 3TC wird als positive Kontrolle verwendet, während das Medium alleine als negative Kontrolle zu den Zellen gegeben wird (Virus-Kontrolle, VC). Drei Tage später wird das Kulturmedium gegen frisches Medium ausgetauscht, das die entsprechend verdünnten Testproben enthält. Sechs Tage nach der ersten Zugabe der Testverbindung wird der Zellkulturüberstand abgeschöpft, mit Pronase und DNAse behandelt und in einem quantitativen Echtzeit-TaqMan PCR-Assay verwendet. Die PCR-amplifizierte HBV-DNA wird in Echtzeit erkannt durch Monitorerhöhungen in den Fluoreszenzsignalen, die aus der exonukleolytischen Degradation eines gelöschten Fluoreszenzsondenmoleküls, das an die amplifizierte HBV-DNA hybridisiert, resultieren. Für jede PCR-Amplifikation wird unter Verwendung von Verdünnungen der aufgereinigten HBV-DNA simultan eine Kurve generiert. Antivirale Aktivität wird aus der Reduzierung in HBV-DNA-Konzentrationen (IC₅₀) berechnet. Ein Farbstoffaufnahme-Assay wird eingesetzt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen, und diese Messung wird zur Berechnung der Toxizität (TC₅₀) verwendet. Der therapeutische Index (TI) wird als TC₅₀/IC₅₀ berechnet.
IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG hemmten die HepB-Virusreplikation in WT10-Zellen mit einem IC50 von < 0,032 μg/ml. Dies zeigt die antivirale Aktivität von IL-28 und IL-29 gegen HBV, das in Leberzelllinien gewachsen ist, und liefert den Nachweis eines therapeutischen Nutzens für die Behandlung von HBV in menschlichen Patienten.
Beispiel 31
IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG hemmen die BVDV-Replikation in Rindernierenzellen
Das HCV ist ein RNA-Virus aus der Flaviviridae-Familie. Andere Viren dieser Familie sind das Bovine-Viral-Diarrhoe-Virus (BVDV) und das Gelbfiebervirus (YFV). Da in Ex-vivo- oder In-vitro-Kulturen keine zufriedenstellende Replikation des HCV möglich ist, gibt es keine ausreichenden Systeme für die In-vitro-Untersuchung der Anti-HCV-Aktivität. BVDV- und YFV-Assays werden als Surrogatviren für HCV verwendet, um die antiviralen Aktivitäten gegen die Flavivirida-Virenfamilie zu testen.
Die antiviralen Wirkungen von IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG wurden in Assays mit Inhibition der zytopathischen Wirkung (CPE-Assays) beurteilt. In diesem Assay wurde unter Verwendung von Madin-Darby-Rindernierenzellen (MDBK) der Zelltod nach Infektion mit zytopathischem BVDV-Virus gemessen und die Inhibition des Zelltods durch Zugabe von IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG beurteilt. Die MDBK-Zellen wurden in Dulbecco Modified Essential Medium (DMEM), das Phenol-Rot mit 10% Pferdeserum, 1% Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin enthielt, propagiert. CPE-Inhibitionsassays wurden in dem DMEM ohne Phenol-Rot mit 2% FBS, 1% Glutamin und 1% Pen-Strep durchgeführt. Am Tag vor den Assays wurden die Zellen trypsinisiert (1% Trypsin-EDTA), gewaschen, gezählt und zu 10⁴ Zellen/Well in 96-Well BioCoat^® Platten mit flachem Boden (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) in einem Volumen von 100 μl/Well plattiert. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und prätitrierte Aliquoten des Virus wurden zu den Zellen gegeben. Die Virusmenge entsprach der maximalen Verdünnung, die eine komplette Zellabtötung (> 80%) zum Zeitpunkt der maximalen CPE-Entwicklung (Tag 7 für BVDV) ergeben würde. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung eines CellTiter96^® Reagenz (Promega) gemäß Herstellerprotokoll und unter Verwendung eines Vmax-Plattenlesers (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bestimmt. Die Testproben wurden in je sechs Konzentrationen geprüft mit Verdünnung in Assaymedium in einer Halb-Log-Serie. IFNα und RIBAVIRIN^® wurden als positive Kontrollen verwendet. Die Testprobe wurde zum Zeitpunkt der Virusinfektion zugegeben. Die durchschnittlichen Hintergrund- und farbkorrigierten Probendaten für die prozentuale CPE-Reduzierung und prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen bei jeder Konzentration wurden relativ zu den Kontrollen bestimmt und der IC₅₀ wurde relativ zum TC₅₀ berechnet.
IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG hemmen den durch BVDV in MDBK-Rindernierenzellen induzierten Zelltod. Durch IL-28 inhibierter Zelltod mit einem IC₅₀ von 0,02 μg/ml, durch IL-29 inhibierter Zelltod mit einem IC₅₀ von 0,19 μg/ml und durch MetIL-29C172S-PEG inhibierter Zelltod mit einem IC₅₀ von 0,45 μg/ml. Damit ist nachgewiesen, dass IL-28 und IL-29 eine antivirale Aktivität gegen die Flavivirida-Virenfamilie aufweisen.
Beispiel 32
Induzierung von Interferon-Stimulierten Genen durch IL-28 und IL-29
A. Humane Periphere Mononukleare Blutzellen

Frisch isolierte humane periphere mononukleare Blutzellen wurden in Gegenwart von IL-29 (20 ng/ml), IFNα2a (2 ng/ml) (PBL Biomedical Labs, Piscataway, NJ, USA) oder nur Medium gezüchtet. Die Zellen wurden 6, 24, 48 oder 72 Stunden lang inkubiert und die Gesamt-RNA wurde isoliert und mit RNase-freier DNase behandelt. 100 ng Gesamt-RNA wurde als Vorlage für eine One-Step Semi-Quantitative RT-PCR^® verwendet, wozu Taqman One-Step RT-PCR Master Mix^® Reagenzien und genspezifische Primer laut Herstellerempfehlungen eingesetzt wurden. (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA). Die Ergebnisse wurden auf HPRT normalisiert und sind als Faltinduktion über die Nur-Medium-Kontrolle für jeden Zeitpunkt dargestellt. Tabelle 24 zeigt, dass IL-29 die Interferon-stimulierte Genexpression in humanen periphereren mononuklearen Blutzellen an allen geprüften Zeitpunkten induziert. Tabelle 24

	MxA Faltinduktion	Pkr Faltinduktion	OAD Faltinduktion
6 h IL29	3,1	2,1	2,5
6 h IFNα2a	17,2	9,6	16,2

24 h IL29	19,2	5,0	8,8
24 h IFNα2a	57,2	9,4	22,3

48 h IL29	7,9	3,5	3,3
48 h IFNα2a	18,1	5,0	17,3

72 h IL29	9,4	3,7	9,6
72 h IFNα2a	29,9	6,4	47,3

B. Aktivierte Humane T-Zellen

Humane T-Zellen wurden durch negative Selektion aus frisch geernteten periphereren mononuklearen Blutzellen isoliert, wozu das Pan T-cell Isolation^® Kit gemäß Herstelleranweisungen (Miltenyi, Auburn, CA, USA) verwendet wurde. Anschließend wurden die T-Zellen aktiviert und 5 Tage lang mit plattengebundenem Anti-CD3, löslichem Anti-CD28 (0,5 μg/ml), (Pharmingen, San Diego, CA, USA) und Interleukin 2 (IL-2; 100 U/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) expandiert, gewaschen und dann weitere 5 Tage mit IL-2 expandiert. Nach der Aktivierung und Expansion wurden die Zellen für 3, 6 oder 18 Stunden mit IL-28A (20 ng/ml), IL-29 (20 ng/ml) oder nur Medium stimuliert Die Gesamt-RNA wurde isoliert und mit RNase-freier DNase behandelt. One-Step Semi-Quantitative RT-PCR^® wurde wie im obigen Beispiel beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf HPRT normalisiert und sind als Faltinduktion über die Nur-Medium-Kontrolle für jeden Zeitpunkt dargestellt. Tabelle 25 zeigt, dass IL-28 und IL-29 die Interferon-stimulierte Genexpression in aktivierten humanen T-Zellen an allen geprüften Zeitpunkten induziert. Tabelle 25

	MxA Faltinduktion	Pkr Faltinduktion	CAD Faltinduktion
Spender Nr. 1 3 h IL28	5,2	2,8	4,8
Spender Nr. 1 3 h IL29	5,0	3,5	6,0
Spender Nr. 1 6 h IL28	5,5	2,2	3,0
Spender Nr. 1 6 h IL29	6,4	2,2	3,7
Spender Nr. 1 18 h IL28	4,6	4,8	4,0
Spender Nr. 1 18 h IL29	5,0	3,8	4,1

Spender Nr. 2 3 h IL28	5,7	2,2	3,5
Spender Nr. 2 3 h IL29	6,2	2,8	4,7
Spender Nr. 2 6 h IL28	7,3	1,9	4,4
Spender Nr. 2 6 h IL29	8,7	2,6	4,9
Spender Nr. 2 18 h IL28	4,7	2,3	3,6
Spender Nr. 2 18 h IL29	4,9	2,1	3,8

C. Primäre Human Hepatozyten

Frisch isolierte humane Hepatozyten von zwei separaten Spender (Cambrex, Baltimore, MD, USA und CellzDirect, Tucson, AZ, USA) wurden mit IL-28A (50 ng/ml), IL-29 (50 ng/ml), IFNα-2a (50 ng/ml) oder nur Medium für 24 Stunden stimuliert. Nach der Stimulation wurde die Gesamt-RNA isoliert und mit RNase-freier DNase behandelt. One-Step Semi-Quantitative RT-PCR wurde wie im obigen Beispiel beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf HPRT normalisiert und sind als Faltinduktion über die Nur-Medium-Kontrolle für jeden Zeitpunkt dargestellt. Tabelle 26 zeigt, dass IL-28 und IL-29 die Interferon-stimulierte Genexpression in primären humanen Hepatozyten nach 24-stündiger Stimulation induziert. Tabelle 26

	MxA Faltinduktion	Pkr Faltinduktion	OAD Faltinduktion
Spender Nr. 1 IL28	31,4	6,4	30,4
Spender Nr. 1 IL29	31,8	5,2	27,8
Spender Nr. 1 IFNα2a	63,4	8,2	66,7
Spender Nr. 2 IL28	41,7	4,2	24,3
Spender Nr. 2 IL29	44,8	5,2	25,2
Spender Nr. 2 IFNα2a	53,2	4,8	38,3

D. HepG2 und HuH7: Humane Leberhepatom-Zelllinien

HepG2- und HuH7-Zellen (ATCC-NR. 8065, Manassas, VA, USA) wurden mit IL-28A (10 ng/ml), IL-29 (10 ng/ml), IFNα2a (10 ng/ml), IFNB (1 ng/ml) (PBL Biomedical, Piscataway, NJ, USA) oder nur Medium für 24 bis 48 Stunden stimuliert. In einer separaten Kultur wurden HepG2-Zellen wie oben beschrieben mit 20 ng/ml MetIL-29C172S-PEG oder MetIL-29-PEG stimuliert. Die Gesamt-RNA wurde isoliert und mit RNase-freier DNase behandelt. 100 ng Gesamt-RNA wurde als Vorlage für die vorher beschriebene One-Step Semi-Quantitative RT-PCR verwendet. Die Ergebnisse wurden auf HPRT normalisiert und sind als Faltinduktion über die Nur-Medium-Kontrolle für jeden Zeitpunkt dargestellt. Tabelle 27 zeigt, dass IL-28 und IL 29 die ISG-Expression in HepG2- und HuH7-Leberhepatom-Zelllinien nach 24 und 48 Stunden induzieren. Tabelle 27

	MxA Faltinduktion	Pkr Faltinduktion	OAD Faltinduktion
HepG2 24 h IL28	12,4	0,7	3,3
HepG2 24 h IL29	36,6	2,2	6,4
HepG2 24 h IFNα2a	12,2	1,9	3,2
HepG2 24 h IFNβ	93,6	3,9	19,0
HepG2 48 h IL28	2,7	0,9	1,1
HepG2 48 h IL29	27,2	2,1	5,3
HepG2 48 h IFNα2a	2,5	0,9	1,2
HepG2 48 h IFNβ	15,9	1,8	3,3

HuH7 24 h IL28	132,5	5,4	52,6
HuH7 24 h IL29	220,2	7,0	116,6
HuH7 24 h IFNα2a	157,0	5,7	67,0
HuH7 24 h IFNβ	279,8	5,6	151,8
HuH7 48 h IL28	25,6	3,4	10,3
HuH7 48 h IL29	143,5	7,4	60,3
HuH7 48 h IFNα2a	91,3	5,8	32,3
HuH7 48 h IFNβ	65,0	4,2	35,7

Tabelle 28

	MxA Faltinduktion	OAD Faltinduktion	Pkr Faltinduktion
MetIL-29-PEG	36,7	6,9	2,2
MetIL-29C172S-PEG	46,1	8,9	2,8

Die gezeigten Daten gelten für 20 ng/ml der metIL-29-PEG- und metIL-29C172S-PEG-Versionen des IL-29 nach 24 Stunden Züchtung.
Die gezeigten Daten sind auf HPRT normalisiert und sind als Faltinduktion über unstimulierten Zellen dargestellt.
Beispiel 33
Antivirale Aktivität von IL-28 und IL-29 im HCV-Replikon-System
Die Fähigkeit von antiviralen Arzneimitteln zur Hemmung der HCV-Replikation kann mit dem HCV-Replikon-System in vitro geprüft werden. Das Replikon-System umfasst die humane Hepatomzelllinie Huh7, die mit subgenomen RNA-Replikonen transfektiert wurde, welche die konstitutive Replikation der HCV-genomen RNA steuern (Blight, K.J. et al. Science 290:1972–1974, 2000). Die Behandlung der Replikon-Klone mit IFNα zu 10 IU/ml reduziert die Menge der HCV-RNA um 85% im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzelllinien. Die Fähigkeit von IL-28A und IL-29, die Menge der durch die Replicon-Klone produzierte HCV RNA in 72 Stunden zu reduzieren, zeigt, dass der durch die IL-28A/IL-29- Behandlung in den Huh7-Zellen hervorgerufene antivirale Zustand für die Hemmung der HCV-Replikon-Replikation wirksam ist und deshalb höchstwahrscheinlich auch wirksam für die Inhibition der HCV-Replikation ist.
Die Fähigkeit von IL-28A und IL-29 zur Hemmung der HCV-Replikation wird unter folgenden Bedingungen mit einem Bayer Branched Chain DNA Kit bestimmt:

1. IL28 alleine mit steigenden Konzentrationen (6)* bis zu 1,0 μg/ml
2. IL29 alleine mit steigenden Konzentrationen (6)* bis zu 1,0 μg/ml
3. PEGIL29 alleine mit steigenden Konzentrationen (6)* bis zu 1,0 μg/ml
4. IFNα2A alleine zu 0,3, 1,0 und 3,0 IU/ml
5. Ribavirin alleine.

Die positive Kontrolle ist IFNα und die negative Kontrolle ist Ribavirin.
Die Zellen werden nach 72 Stunden mit Alomar Blau gefärbt, um die Lebensfähigkeit zu beurteilen.

*Die Konzentrationen für Bedingungen 1–3 sind: 1,0 μg/ml, 0,32 μg/ml, 0,10 μg/ml, 0,032 μg/ml, 0,010 μg/ml, 0,0032 μg/ml.

Der Replikon-Klon (BB7) wird 1 × pro Tag in 3 aufeinanderfolgenden Tagen mit den oben aufgeführten Dosiskonzentrationen behandelt. Die Gesamt-HCV-RNA wird nach 72 Stunden gemessen.
Beispiel 34
IL-28 und IL-29 haben eine antivirale Aktivität gegen pathogene Viren

Für die In-vitro-Analyse der antiviralen Aktivität von IL-28 und IL-29 gegen ein Panel pathogener Viren, einschließlich u. a. Adenovirus, Parainfluenzavirus. Respiratory Syncytial Virus, Rhinovirus, Coxsackievirus, Influenzavirus, Vacciniavirus, West-Nil-Virus, Denguevirus, Venezuelanisches Pferde-Encephalitis- Virus, Pichindevirus und Poliovirus werden zwei Methoden eingesetzt. Ein Methode ist die Hemmung der durch das Virus induzierten zytopathischen Wirkung (Cythopathic Effect, CPE), welche durch visuelle (mikroskopische Untersuchung der Zellen bestimmt wird, und die zweite Methode ist die Bestimmung der Erhöhung der neutralen roten (NR) Farbstoffaufnahme in den Zellen. Bei der CPE-Hemmungsmethode werden sieben Konzentrationen des Testarzneistoffes (Log10-Verdünnungen wie 1000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 μg/ml) in 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden, welche die Wirtszellen enthalten, gegen jedes Virus evaluiert. Die Verbindungen werden 24 Stunden vor dem Virus zugegeben und je nach Virusart mit einer Konzentration von ca. 5 bis 100 infektiösen Zellkulturdosen pro Well verwendet; das entspricht einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01, bis 0,0001 infektiösen Partikeln pro Zelle. Die Ablesung der Tests erfolgt nach der Inkubation bei 37°C für einen vorgegebenen Zeitraum, der ausreicht, um die Entwicklung einer ausreichenden viralen zytopathischen Wirkung zu ermöglichen. Im NR-Farbstoffaufnahme-Assay wird Farbstoff (0,34% Konzentration im Medium) zu dem gleichen Satz Mikrotiterplatten zugegeben, der für die visuelle Bewertung verwendet wurde. Nach 2 Stunden wird die Farbintensität des absorbierten und anschließend aus den Zellen eluierten Farbstoffes unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes (Autoreader) bestimmt. Die antivirale Aktivität wird als die 50% wirksame (virushemmende) Konzentration (EC50) ausgedrückt und in einem Plot als Vergleich zwischen Verbindungskonzentration und prozentualer Hemmung auf Semilogarithmischem Kurvenschreiberpapier dargestellt. Die EC50/IC50-Daten können in bestimmten Fällen durch eine entsprechende Regressionsanalysis-Software ermittelt werden. Generell sind die durch NR-Assay bestimmten EC50-Werte um das Zwei- bis Vierfache höher als die mit der CPE-Methode erhaltenen Werte. Tabelle 29: Visueller Assay

Virus	Zelllinie	Arzneistoff	EC50 Visuell	IC₅₀ Visuell	SI Visuell (IC50/EC50)
Adenovirus	A549	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Adenovirus	A549	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Adenovirus	A549	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Parainfluenza-Virus	MA-104	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Parainfluenza-Virus	MA-104	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Parainfluenza-Virus	MA-104	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Respiratory Syncytial Virus	MA-104	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Respiratory Syncytial Virus	MA-104	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Respiratory Syncytial Virus	MA-104	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Rhino 2	KB	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Rhino 2	KB	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Rhino 2	KB	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Rhino 9	HeLa	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Rhino 9	HeLa	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Rhino 9	HeLa	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Coxsackie B4-Virus	KB	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Coxsackie B4-Virus	KB	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Coxsackie B4-Virus	KB	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Influenza (Typ A [H3N2])	Maden-Darby Hundeniere	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Influenza (Typ A [H3N2])	Maden-Darby Hundeniere	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Influenza (Typ A [H3N2])	Maden-Darby Hundeniere	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Influenza (Typ A [H3N2])	Vero	IL-28A	0,1 μg/ml	> 10 μg/ml	> 100
Influenza (Typ A [H3N2])	Vero	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Influenza (Typ A [H3N2])	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	0,045 μg/ml	> 10 μg/ml	> 222
Vaccinia-Virus	Vero	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Vaccinia-Virus	Vero	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Vaccinia-Virus	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
West-Nil-Virus	Vero	IL-28A	0,00001 μg/ml	> 10 μg/ml	> 1.000.000
West-Nil-Virus	Vero	IL-29	0,000032 μg/ml	> 10 μg/ml	> 300.000
West-Nil-Virus	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	0,001 μg/ml	> 10 μg/ml	> 10.000
Dengue-Virus	Vero	IL-28A	0,01 μg/ml	> 10 μg/ml	> 1000
Dengue-Virus	Vero	IL-29	0,032 μg/ml	> 10 μg/ml	> 312
Dengue-Virus	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	0,0075 μg/ml	> 10 μg/ml	> 1330
Venez. Pferde-Encephalitis-Virus	Vero	IL-28A	0,01 μg/ml	> 10 μg/ml	> 1000
Venez. Pferde-Encephalitis-Virus	Vero	IL-29	0,012 μg/ml	> 10 μg/ml	> 833
Venez. Pferde-Encephalitis-Virus	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	0,0065 μg/ml	> 10 μg/ml	> 1538
Pichinde-Virus	BSC-1	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Pichinde-Virus	BSC-1	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Pichinde-Virus	BSC-1	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Poliovirus	Vero	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Poliovirus	Vero	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Poliovirus	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0

Tabelle 30: Neutral-Rot-Assay

Virus	Zelllinie	Arzneistoff	EC50 NR	IC50 NR	SI NR (IC5/EC50)
Adenovirus	A549	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Adenovirus	A549	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Adenovirus	A549	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Parainfluenza-Virus	MA-104	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Parainfluenza-Virus	MA-104	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Parainfluenza-Virus	MA-104	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Respiratory Syncytial Virus	MA-104	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Respiratory Syncytial Virus	MA-104	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Respiratory Syncytial Virus	MA-104	MetIL-29 C172S-PEG	5,47 μg/ml	> 10 μg/ml	> 2
Rhino 2	KB	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Rhino 2	KB	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Rhino 2	KB	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Rhino 9	HeLa	IL-28A	1,726 μg/ml	> 10 μg/ml	> 6
Rhino 9	HeLa	IL-29	0,982 μg/ml	> 10 μg/ml	> 10
Rhino 9	HeLa	MetIL-29 C172S-PEG	2,051 μg/ml	> 10 μg/ml	> 5
Coxsackie B4Virus	KB	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Coxsackie B4-Virus	KB	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Coxsackie B4-Virus	KB	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Influenza (Typ A [H3N2])	Maden-Darby Hundeniere	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Influenza (Typ A [H3N2])	Maden-Darby Hundeniere	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Influenza (Typ A [H3N2])	Maden-Darby Hundeniere	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Influenza (Typ A [H3N2])	Vero	IL-28A	0,25 μg/ml	> 10 μg/ml	> 40
Influenza (Typ A [H3N2])	Veto	IL-29	2 μg/ml	> 10 μg/ml	> 5
Influenza (Typ A [H3N2])	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	1,4 μg/ml	> 10 μg/ml	> 7
Vaccinia-Virus	Vero	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Vaccinia-Virus	Veto	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Vaccinia-Virus	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
West-Nil-Virus	Veto	IL-28A	0,0001 μg/ml	> 10 μg/ml	> 100.000
West-Nil-Virus	Veto	IL-29	0,00025 μg/ml	> 10 μg/ml	> 40.000
West-Nil-Virus	Veto	MetIL-29 C172S-PEG	0,00037 μg/ml	> 10 μg/ml	> 27.000
Dengue-Virus	Veto	IL-28A	0,1 μg/ml	> 10 μg/ml	> 100
Dengue-Virus	Veto	IL-29	0,05 μg/ml	> 10 μg/ml	> 200
Dengue-Virus	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	0,06 μg/ml	> 10 μg/ml	> 166
Venez. Pferde-Encephalitis-Virus	Veto	IL-28A	0,035 μg/ml	> 10 μg/ml	> 286
Venez. Pferde-Encephalitis-Virus	Vero	IL-29	0,05 μg/ml	> 10 μg/ml	> 200
Venez. Pferde-Encephalitis-Virus	Vero	MetIL-29 C172S-PEG	0,02 μg/ml	> 10 μg/ml	> 500
Pichinde-Virus	BSC-1	IL-28A	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Pichinde-Virus	BSC-1	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Pichinde-Virus	BSC-1	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Poliovirus	Veto	IL-28A	> 1,672 μg/ml	> 10 μg/ml	> 6
Poliovirus	Veto	IL-29	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0
Poliovirus	Veto	MetIL-29 C172S-PEG	> 10 μg/ml	> 10 μg/ml	0

Beispiel 35
IL-28-, IL-29-, metIL-29-PEG- und metIL-29C172S-PEG-stimulierte ISG-Induktion in der Mausleberzelllinie AML-12
Interferon-stimulierte Gene (ISG) sind Gene, die durch Typ-I-Interferone (IFN) und auch durch die Moleküle der IL-28- und IL-29-Familie induziert werden, das darauf hin deutet, dass IFN und IL-28 und IL-29 ähnliche, zur antiviralen Aktivität führende Signalwege induzieren. Humane Typ-I-IFN (IFNα 1–4 und IFNβ) zeigen wenig oder keine Aktivität bei Mauszellen, was auf eine mangelnde Spezieskreuzreaktivität zurückgeführt wird. Um zu prüfen, ob humane IL-28 und IL-29 auf Mauszellen wirken, wurde die ISG-Induktion bei humanen IL-28 und IL-29 evaluiert, wozu Echtzeit-PCR an der aus Mausleber gewonnenen AML-12-Zelllinie eingesetzt wurde.
Die AML-12-Zellen wurden in 6-Well-Platten in komplettem DMEM-Medium mit einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/Well plattiert. Vierundzwanzig Stunden nach der Plattierung der Zellen wurden humane IL-28 und IL-29 in einer Konzentration von 20 ng/ml der Kultur zugegeben. Als Kontrolle wurden die Zellen entweder mit Maus-IFN-alpha stimuliert (positive Kontrolle) oder nicht stimuliert (negative Kontrolle). Die Zellen wurden nach 8, 24, 48 und 72 Stunden nach Zugabe des aus CHO gewonnenen humanen IL-28A (SEQ ID-NR:2) oder IL-29 (SEQ ID-NR:4) geerntet. Die RNA wurde unter Verwendung des RNAEasy-Kit^® (Qiagen, Valencia, CA, USA) aus den Zellpellets isoliert. Die RNA wurde mit DNase (Millipore, Billerica, MA, USA) behandelt, um die RNA von jeglichen kontaminierenden DNA zu befreien. Die cDNA wurde mit einem Perkin-Elmer RT Mix generiert. Die ISG-Geninduktion wurde durch Echtzeit-PCR evaluiert, wozu Maus-OAS-, Pkr- und Mx1-spezifische Primer und Sonden verwendet wurden. Zum Erhalt von quanhitativen Daten wurde die HPRT-Echtzeit-PCR mit ISG-PCR dupliziert. Es wurde eine Standardkurve erstellt, wobei bekannte Mengen von RNA aus IFN-stimulierten Maus-PBL verwendet wurden. Alle Daten werden als Expression relativ zur internen HPRT-Expression dargestellt.
Humane IL-28A und IL-29 stimulierten die ISG-Induktion in der Maus-Hepatozytenzelllinie AML-12 und es wurde nachgewiesen, dass die IL-28/29-Proteinfamilie im Gegensatz uz den Typ-I-INF eine Spezieskreuzreaktivität aufweist. Tabelle 31

Stimulation OAS PkR Mx1

Keine 0,001 0,001 0,001

Humanes IL-28 0,04 0,02 0,06

Humanes IL-29 0,04 0,02 0,07

Maus-IL-28 0,04 0,02 0,08

Maus-IFNα 0,02 0,02 0,01
Alle aufgeführten Daten wurden als Faltung relativ zur HPRT-Genexpression in ng der OAS-mRNA ausgedrückt. = normalisierter Wert der OAS-mRNA-Menge relativ ng der HPRT-mRNA zur internen Haushaltungs-Gen, HPRT Als Beispiel sind die Daten für den 48-Stunden-Zeitpunkt gezeigt. Tabelle 32 AML12

Mx1 Faltinduktion OAS Faltinduktion Pkr Faltinduktion

MetIL-29-PEG 728 614 8

MetIL-29C172S-PEG 761 657 8
Die Zellen wurden mit 20 ng/ml metIL-29-PEG- und metIL-29C172S-PEG 24 Stunden stimuliert.
Die gezeigten Daten sind auf HPRT normalisiert und sind als Faltinduktion über unstimulierten Zellen dargestellt.
Beispiel 36
ISG werden effizient in die Milzen von transgenen Mäusen, die humanes IL-29 exprimieren, induziert
Es wurden transgene (Tg) Mäuse generiert, die humanes IL-29 unter der Kontrolle des Eu-lck-Promoters exprimieren. Zur Untersuchung, ob IL-29 in vivo eine biologische Aktivität in Mäusen hat, wurde die Expression der ISG durch Echtzeit-PCR in den Milzen der Eu-lck-IL-29 transgenen Mäuse analysiert.
Unter Verwendung eines Konstruktes, das humanes Il-29-Gen unter der Kontrolle des Eu-lck-Promoters exprimiert, wurden transgene Mäuse (C3H/C57BL/6) generiert. Dieser Promoter ist in T-Zellen und B-Zellen aktiv. Die transgenen Mäuse und ihre nicht-transgenen Wurfgenossen (n = 2/gp) wurden im Alter von etwa 10 Wochen geopfert. Die Milzen der Mäuse wurden isoliert. Die RNA wurde unter Verwendung des RNAEasy-Kit^® (Qiagen) aus den Zellpellets isoliert. Die RNA wurde mit DNase behandelt, um die RNA von jeglichen kontaminierenden DNA zu befreien. Die cDNA wurde mit einem Perkin-Elmer RT^® Mix generiert. Die ISG-Geninduktion wurde durch Echtzeit-PCR evaluiert, wozu Maus-OAS-, Pkr- und Mx1-spezifische Primer und Sonden (5' FAM, 3' NFQ) verwendet wurden. Zum Erhalt von quantitativen Daten wurde die HPRT-Echtzeit-PCR mit ISG-PCR dupliziert. Es wurde eine Standardkurve erstellt, wobei bekannte Mengen von IFN-stimulierten Maus-PBL verwendet wurden. Alle Daten werden als Expression relativ zur internen HPRT-Expression dargestellt.
Die aus den IL-29-Tg-Mäusen isolierten Milzen zeigten eine hohe Induktion von ISG OAS, Pkr und Mx1 im Vergleich zu den als Kontrolle verwendeten Nicht-Tg-Wurfgenossen, was darauf hin deutet, dass humanes IL-29 in vivo in Mäusen biologisch aktiv ist. Tabelle 33

Mäuse OAS PkR Mx1

Nicht-Tg 4,5 4,5 3,5

IL-29 Tg 12 8 21
Alle Daten werden als Faltexpression relativ zur HPRT-Genexpression dargestellt. Es wird dir durchschnittliche Expression in zwei Mäusen gezeigt.
Beispiel 37
Humanes IL-28- und IL-29-Protein induziert die ISG-Genexpression in Leber, Milz und Blut von Mäusen
Zur Bestimmung, ob humanes IL-28 und IL-29 Interferon-stimulierte Gene in vivo induziert, wurde aus CHO gewonnenes humanes IL-28A- und IL-29-Protein in die Mäuse injiziert. Zusätzlich wurde aus IL-29 gewonnenes E. coli in In-vivo-Assays wie oben beschrieben geprüft, wozu MetIL-29C172S-PEG und MetIL-29-PEG verwendet wurden. Die ISG-Gen-Induktion in Blut, Milz und Leber der Mäuse wurde zu verschiedenen Zeitpunkten und verschiedenen Dosiskonzentrationen gemessen.
Die C57BL/6-Mäuse wurden intraperitoneal oder intravenös mit einer Reihe von Dosen (10 μg–250 μg) des aus CHO gewonnenen human IL-28A und IL-29 oder MetIL-29C172S-PEG und MetIL-29C16-C113-PEG injiziert. Die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten (1 Std.–48 Std.) geopfert. Die Milzen und Lebern wurden aus den Mäusen isoliert und die RNA wurde isoliert. Die RNA wurde auch aus den Blutzellen isoliert. Die Zellen wurden pelletiert und die RNA wurde unter Verwendung des RNAEasy-Kit^® (Qiagen) aus den Zellpellets isoliert. Die RNA wurde mit DNase (Amicon) behandelt, um die RNA von jeglichen kontaminierenden DNA zu befreien. Die cDNA wurde mit einem Perkin-Elmer RT^® Mix (Perkin-Elmer) generiert. Die ISG-Geninduktion wurde durch Echtzeit-PCR gemessen, wozu Maus-OAS-, Pkr- und Mx1-spezifische Primer und Sonden verwendet wurden. Zum Erhalt von quantitativen Daten wurde die HPRT-Echtzeit-PCR mit ISG-PCR dupliziert. Es wurde eine Standardkurve berechnet, wobei bekannte Mengen von IFN-stimulierten Maus-PBL verwendet wurden. Alle Daten werden als Expression relativ zur internen HPRT-Expression dargestellt.

Durch humanes IL-29 induzierte ISG-Genexpression (OAS, Pkr, Mx1) in Leber, Milz und Blut von Mäusen in dosisabhängiger Weise. Die Expression der ISG erreichte zwischen 1 und 6 Stunden nach der Injektion Spitzenwerte und wurde bis zu 48 Stunden über den Werten der Kontrollmäuse aufrechterhalten. Bei diesem Experiment induzierte das humane IL-28A keine ISG-Genexpression. Tabelle 34

Injektion	OAS – 1 h	OAS – 6 h	OAS – 24 h	OAS – 48 h
Keine – Leber	1,6	1,6	1,6	1,6
IL-29 Leber	2,5	4	2,5	2,8
Keine – Milz	1,8	1,8	1,8	1,8
IL-29 – Milz	4	6	3,2	3,2
Keine – Blut	5	5	5	5
IL-29 Blut	12	18	11	10

Die Ergebnisse werden als Faltexpression relativ zur HPRT-Genexpression dargestellt. Es wird ein Probendatensatz für IL-29-induzierte OAS in Leber nach einmaliger intravenöser Injektion von 250 μg gezeigt. Die gezeigten Daten entsprechen der durchschnittlichen Expression von 5 verschiedenen Tieren/Gruppe. Tabelle 35

Injektion	OAS (24 h)
Keine	1,8
IL-29 10 μg	3,7
IL-29 50 μg	4,2
IL-29 250 μg	6

Tabelle 36

	MetIL-29-PEG				MetIL-29C172S-PEG				Naiv

	3 h	6 h	12 h	24 h	3 h	6 h	12 h	24 h	24 h
PkR	18,24	13,93	4,99	3,77	5,29	5,65	3,79	3,55	3,70
OAS	91,29	65,93	54,04	20,81	13,42	13,02	10,54	8,72	6,60
Mx1	537,51	124,99	33,58	35,82	27,89	29,34	16,61	0,00	10,98

Die Mäuse erhielten eine intravenöse Injektion von 100 μg Proteinen. Die gezeigten Daten sind die Faltexpression über der HPRT-Expression von der Mauslebern. Ähnliche Daten wurden aus Blut und Milzen der Mäuse gewonnen.
Beispiel 38
IL-28 und IL-29 induzierten ISG-Protein in Mäusen
Zur Analyse der Wirkung von humanem IL-28 und IL-29 auf die Induktion von ISO-Protein (OAS), wurden Serum und Plasma von mit IL-28 und IL-29 behandelten Mäusen auf OAS-Aktivität untersucht.
C57BL/6-Mäuse erhielten intravenöse Injektionen von PBS oder humanem IL-28 oder IL-29 in einer Reihe von Konzentrationen (10 μg–250 μg). Serum und Plasma wurden zu verschiedenen Zeitpunkten aus den Mäusen isoliert und die OAS-Aktivität wurden unter Verwendung des OAS Radioimmunoassay (RIA) Kit von Eiken Chemicals (Tokio, Japan) gemessen.
Durch IL-28 und IL-29 induzierte OAS-Aktivität im Serum und Plasma der Mäuse zeigte, dass diese Proteine in vivo biologisch aktiv sind. Tabelle 37

Injektion OAS – 1 h OAS – 6 h OAS – 24 h OAS – 48 h

Keine 80 80 80 80

R-29 80 80 180 200
Die OAS-Aktivität wird als pmol/dl des Plasmas für eine Einzelkonzentration (250 μg) des humanen IL-29 dargestellt.
Beispiel 39
IL-28 und IL-29 hemmen Adenovirale Pathologie in Mäusen
Zur Untersuchung der antiviralen Aktivitäten von IL-28 und IL-29 gegen Viren, die die Leber infizieren, wurden die Testproben in Mäusen gegen infektiöse adenovirale Vektoren, die ein internes grün fluoreszierendes Protein(GFP)-Gen exprimieren getestet. Nach intravenöser Injektion ist die Leber das primäre Ziel diese Viren für die Genexpression. Die Adenoviren sind replikationsdefizient, verursachen jedoch Leberschäden aufgrund von inflammatorischem Zellinfiltrat, das durch Messung der Serumkonzentrationen von Leberenzymen wie AST und ALT oder durch direkte Untersuchung der Leberpathologie überwacht werden kann.
C57B1/6-Mäuse erhielten drei Tage lang einmal täglich intraperitoneale Injektionen von 50 μg Maus-IL-28 (Zcyto24 aus SEQ ID-NR:8) oder metIL-29C172S-PEG. Die Kontrolltiere erhielten PBS-Injektionen. Eine Stunde nach der 3. Dosis wurde den Mäusen über eine intravenöse Schwanzinjektion ein Einzelbolus des adenoviralen Vektors, AdGFP (1 × 10⁹ Plaque-bildende Einheiten (pfu)) verabreicht. Im Anschluss daran erhielten die Mäuse jeden zweiten Tag eine weitere Dosis PBS, Maus-IL-28 oder metIL-29C172S-PEG für 4 weitere Dosen (insgesamt 7 Dosen). Eine Stunde nach der letzten Dosis PBS, Maus-IL-28 oder metIL-29C172S-PEG wurden die Mäuse terminal entblutet und geopfert. Serum und Lebergewebe wurden analysiert. Das Serum wurde auf AST- und ALT-Leberenzyme analysiert. Die Leber wurde isoliert und auf GFP-Expression und Histologie analysiert. Für die Histologie wurden die Leberproben in Formalin fixiert und nach H&E-Färbung in Paraffin eingebettet. Behandlungsverblindete Leberschnitte wurden unter einem Lichtmikroskop untersucht. Veränderungen wurden aufgezeichnet und auf einer Skala bewertet, die zur Messung der Leberpathologie und Inflammation bestimmt ist.
Maus-IL-28- und -IL-29 hemmte die adenovirale Infektion und Genexpression laut Leberfluoreszenzmessung. Die mit PBS behandelten Mäuse (n = 8) hatten eine durchschnittliche relative Leberfluoreszenz von 52,4 (arbiträre Einheiten). Im Gegensatz dazu hatten die mit IL-28 behandelten Mäuse (n = 8) relative Leberfluoreszenz von 34,5 und die mit IL-29 behandelten Mäuse (n = 8) hatten eine relative Leberfluoreszenz von 38,9. Eine Reduzierung in der adenoviralen Infektion und Genexpression führte zu einer reduzierten Leberpathologie laut Messung der ALT- und AST-Serumkonzentrationen und Histologie. Die mit PBS behandelten Mäuse (n = 8) hatten einen durchschnittlichen Serum-AST von 234 U/l (Einheiten/Liter) und einen durchschnittlichen Serum-ALT von 250 U/l. Im Gegensatz dazu hatten die mit IL-28 behandelten Mäuse (n = 8) einen durchschnittlichen Serum-AST von 193 U/l und einen durchschnittlichen Serum-ALT von 216 U/l, und die mit IL-29 behandelten Mäuse (n = 8) und einen durchschnittlichen Serum-AST von 162 U/l und einen durchschnittlichen Serum-ALT von 184 U/l. Des Weiteren zeigte die Leberhistologie, dass die mit Maus-IL-28- oder -IL-29 behandelten Mäuse niedrigere Leberentzündungsscores hatten als die mit PBS behandelte Gruppe. Die Lebern aus der IL-29-Gruppe zeigten auch weniger Proliferation der sinusoidalen Zellen, weniger mitotische Figuren und weniger Veränderungen in den Hepatozyten (z. B. Vacuolation, Gegenwart mehrerer Zellkerne, vergrößerte Hepatozyten) als die PBS-Gruppe. Diese Daten zeigen, dass Maus-IL-28 und -IL-29 antivirale Eigenschaften gegen einen lebertrophen Virus haben.
Beispiel 40
LCMV-Modelle
Lymphozytische Choriomeningitisvirus-(LCMV)-Infektionen in Mäusen sind ein ausgezeichnetes Modell für akute und chronische Infektionen. Diese Modelle werden verwendet, um die Wirkung der Zytokine auf die antivirale Immunantwort zu evaluieren und um zu bestimmen, welche und die Wirkungen IL-28 und IL-29 auf die Virusbelastung und die antivirale Immunantwort haben. Die folgenden zwei Modelle werden verwendet: LCMV Armstrong (akute) Infektion und LCMV Klon 13 (chronische) Infektion. (Siehe z. B. Wherry et al., J. Virol. 77:4911–4927, 2003; Blattman et al., Nature Med. 9(5):540–547, 2003; Hoffman et al., J. Immunol. 170:1339–1353, 2003.) Es gibt drei Stufen der CD8-T-Zellentwicklung bei der Reaktion auf das Virus: 1) Expansion, 2) Kontraktion und 3) Memory (akutes Modell). IL-28 oder IL-29 wird in jeder Stufe für akute und chronische Modelle injiziert. Im chronischen Modell wird IL-28 oder IL-29 60 Tage nach der Infektion injiziert, um die Wirkung von IL-28 oder IL-29 auf die persistierende Virusbelastung zu beurteilen. Beim akuten und chronischen Modell wird IL-28 oder IL-29 injiziert und die Virusbelastung in Blut, Milz und Leber untersucht. Andere Parameters, die untersucht werden können, sind u. a.: Tetramerfärbung durch Flutung zur Zählung der Anzahl von LCMV-spezifischen CD8+ T-Zellen; die Fähigkeit der Tetramer + Zellen zur Produktion von Zytokinen nach Stimulation mit ihrem kognaten LCMV-Antigen; und die Fähigkeit der LCMV-spezifischen CD8+ T-Zellen zur Proliferation als Reaktion auf ihr kognates LCMV-Antigen. LCMV-spezifische T-Zellen werden durch Flusszytometrie phänotypisiert, um den Aktivierungs- und Differenzierungszustand der Zellen zu beurteilen. Auch die Fähigkeit der LCMV-spezifischen CTL zur Lyse von Zielzellen, die ihr kognates LCMV-Antigen tragen, wird untersucht. Die Anzahl und Funktion der LCMV-spezifischen CD4+ T-Zellen wird ebenfalls beurteilt.
Eine Reduzierung der Virenbelastung nach der Behandlung mit IL-28 oder IL-29 wird bestimmt. Eine Reduzierung der Virenbelastung von 50% in irgendeinem Organ, vor allem in der Leber, wäre signifikant. Für die mit IL-28 oder IL-29 behandelten Mäuse wäre auch ein Anstieg von 20% in den Tetramer-positiven T-Zellen, die proliferieren, Zytokine erzeugen oder einen reifen Phänotyp zeigen, im Vergleich zu unbehandelten Mäusen signifikant.
Eine Reduzierung der Virusbelastung nach IL-28- oder IL-29-Injektion ist auf eine effektivere Kontrolle der Virusinfektion zurückzuführen, vor allem im chronischen Modell, wo im unbehandelten Zustand die Virustiter für einen langen Zeitraum erhöht bleiben. Eine zweifache Reduzierung im Virustiter relativ zu den unbehandelten Mäusen wird als signifikant betrachtet.
Beispiel 41
Influenza-Modell einer akuten Virusinfektion
A. Vorläufiges Experiment zur Untersuchung der antiviralen Aktivität
Zur Bestimmung der antiviralen Aktivität von IL-28 oder IL-29 bei akuter Infektion durch das Influenzavirus wird eine In-vivo-Untersuchung unter Verwendung von mit Influenza infizierten c57B1/6-Mäusen nach folgendem Protokoll durchgeführt:
Tiere: 6 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Charles River) mit 148 Mäusen, 30 pro Gruppe.
Gruppen:

(1) Absolute Kontrolle (nicht infiziert) in paralleler Ausführung für Antikörpertiter und Histopathologie (2 Tiere pro Gruppe)
(2) Träger (intraperitoneal) Kochsalzlösung
(3) Amantadin (positive Kontrolle) 10 mg/Tag über 5 Tage (per os) beginnend 2 Stunden vor der Infektion
(4) Mit IL-28 oder IL-29 behandelt (5 μg, intraperitoneal, beginnend 2 Stunden nach der Infektion)
(5) IL-28 oder IL-29 (25 μg, intraperitoneal, beginnend 2 Stunden nach der Infektion)
(6) IL-28 oder IL-29 (125 μg, intraperitoneal, beginnend 2 Stunden nach der Infektion)

Tag 0 – Außer den Tieren für die absolute Kontrolle sind alle Tiere mit dem Influenzavirus infiziert Für Virenbelastung (10 bei LD50) Für Immunologieabarbeitung (LD30)
Tag 0–9 – tägliche Injektionen von IL-28 oder IL-29 (intraperitoneal) Aufzeichnung des Körpergewichts und Allgemeinzustands (3-mal pro Woche)
Tag 3 – Opferung von 8 Tieren pro Gruppe Virusbelastung in rechter Lunge (TCID50) Histopathologie in linker Lunge Blutprobe für Antikörpertitration
Tag 10 – Opferung aller überlebenden Tiere und Gewinnung der Blutproben für Antikörpertitration, Isolierung der Lungenlymphozyten (4 Pools von 3) für direkten CTL-Assay (in allen 5 Gruppen) und quantitative Immunophänotypisierung für folgende Marker: CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD8/CD11b, CD8/CD44/CD62L, CD3/DX5, GR-1/F480 und CD19.

Studie Nr. 2
Eine Untersuchung der Wirksamkeit von IL-28 oder IL-29 in C57B1/6-Mäusen, die mit Maus-adaptiertem Virus infiziert sind, wurde unter Verwendung von 8 Wochen alten weiblichen C57B1/6-Mäusen (Charles River) durchgeführt.

Gruppe 1: Träger (intraperitoneal)
Gruppe 2: Positive Kontrolle: Neutralisierender Anti-Influenza-Antikörper (Ziegen-Anti-Influenza-A/USSR (H1N1) (Chemicon International, Temecula, CA, USA); 40 μg/Maus 2 h und 4 h nach der Infektion (10 μl intranasal)
Gruppe 3: IL-28 oder IL-29 (5 μg, intraperitoneal)
Gruppe 4: IL-28 oder IL-29 (25 μg, intraperitoneal)
Gruppe 5: IL-28 oder IL-29 (125 μg, intraperitoneal)

Following-Life-Beobachtungen und immunologische Abarbeitungen werden vorbereitet:

Tag 0 – alle Tiere werden mit Influenzavirus infiziert (Dosis wurde in Experiment 2 bestimmt)
Tag 0–9 – tägliche Injektionen von IL-28 oder IL-29 (intraperitoneal) Aufzeichnung des Körpergewichts und Allgemeinzustands jeden zweiten Tag
Tag 10 – Opferung der überlebenden Tiere und Durchführung eines Virus-Assay zur Bestimmung der Virusbelastung in der Lunge.

Isolierung der Lungenlymphozyten (für direkten CTL-Assay in den Lungen unter Verwendung von EL-4 as Ziele und verschiedene E:T-Verhältnisse (basierend auf den besten Ergebnissen aus den Experimenten 1 und 2).
Tetramerfärbung: Die Anzahl von CD8+ T-Zellen, die an MHC-Klasse-I-Tetramer binden, die das Influenza-A-Nukleoprotein-(NP)-Epitop enthalten, werden unter Verwendung von Komplexen der MHC-Klasse I mit viralen Peptiden beurteilt: FLU-NP_366-374/D^b (ASNENMETM), (LMCV-Peptid/D^b).
Quantitative Immunphänotypisierung von: CD8, Tetramer, intrazelluläre IFNγ, NK1.1, CD8, Tetramer, CD62L, CD44, CD3(+ oder –), NK1.1(+), intrazelluläre IFNγ, CD4, CD8, NK1.1, DX5, CD3 (+ oder –), NK1.1, DX5, Tetramer, Einfarbige Proben für die Zytometereinstellung.
Überlebens-/Re-Challenge-Studie

Tag 30: Überlebensstudie mit Mäusen, die 9 Tage lang mit verschiedenen Dosen IL-28 oder IL-29 behandelt wurden oder mit positiver Anti-Influenza-Antikörperkontrolle. Körpergewicht und Antikörperproduktion in einzelnen Serumproben (Gesamt, IgG1, IgG2a, IgG2b) werden gemessen.

Re-Challenge-Studie:

Tag 0: Beide Gruppen werden mit A/PR-Virus (1LD30) infiziert.
Gruppe 6 wird nicht behandelt.
Gruppe 7 wird 9 Tage mit 125 μg IL-28 oder IL-29 behandelt.
Tag 30: Überlebensstudie
Körpergewicht und Antikörperproduktion in einzelnen Serumproben (Gesamt, IgG1, IgG2a, IgG2b) werden gemessen.
Tag 60: Re-Challenge-Studie
Überlegende in jeder Gruppe werden in 2 Untergruppen eingeteilt
Gruppe 6A und 7A werden erneut mit A/PR-Virus (1 LD30) infiziert.
Gruppe 6B und 7B werden erneut mit A/PR-Virus (1 LD30) infiziert.

Beide Gruppen werden nachverfolgt und ein Opferungstag wird festgelegt. Körpergewicht und Antikörperproduktion in einzelnen Serumproben (Gesamt, IgG1, IgG2a, IgG2b) werden gemessen.
Beispiel 42
IL-28 und IL-29 haben in vivo eine antivirale Aktivität gegen Hepatitis-B-Virus (HBV)
Ein transgenes Mausmodell (Guidotti et al., J. Virology 69:6158–6169, 1995) unterstützt die Replikation hoher Konzentrationen von infektiösem HBV und wurde als chemotherapeutisches Modell für die HBV-Infektion verwendet. Transgene Mäuse werden mit antiviralen Arzneimitteln behandelt und nach der Behandlung werden die Konzentrationen der HBV-DNA- und -RNA in der transgenen Mausleber und im Serum gemessen. HBV-Proteinkonzentrationen können im Anschluss an die Behandlung auch im transgenen Mausserum gemessen werden. Dieses Modell wurde für die Beurteilung der Wirksamkeit von Lamivudin und IFN-α bei der Senkung der HBV-Virustiter verwendet.
HBV-TG-Mäuse (männlich) erhalten jeden zweiten Tag für 14 Tage (insgesamt 8 Dosen) intraperitoneale Injektionen von 2,5, 25 oder 250 μg IL-28 oder IL-29. Die Mäuse werden am Tag der Behandlung (Tag 0) und am Tag 7 zur Serumgewinnung entblutet. Eine Stunde nach der letzten Dosis IL-29 erfolgt eine terminale Entblutung und die Mäuse werden geopfert. Serum und Leber werden auf Leber-HBV-DNA, Leber-HBV-RNA, Serum-HBV-DNA, Leber-HBc, Serum-Hbe und Serum-HBs analysiert.
Eine Reduzierung in Leber-HBV-DNA, Leber-HBV RNA, Serum-HBV-DNA, Leber-HBc, Serum-Hbe oder Serum-HBs als Reaktion auf IL-28 oder IL-29 reflektiert eine antivirale Aktivität dieser Verbindungen gegen HBV.
Beispiel 43
IL-28 und IL-29 hemmen die humane Herbesvirus-8 (HHV-8) Replikation in BCBL-1-Zellen
Die antiviralen Aktivitäten von IL-28 und IL-29 gegen HHV-8 wurden in einem In-vitro-Infektionssystem unter Verwendung einer B-lymphoiden Zelllinie, BCBL-1, geprüft.
Im HHV-8-Assay wurden die Testverbindung und eine Ganciclovir-Kontrolle mit je fünf Konzentrationen und Verdünnung in Halb-Log-Serie analysiert. Die Endpunkte sind TaqMan PCR für extrazelluläre HHV-8-DNA (IC50) und Zellzahlen unter Verwendung des CellTiter96^® Reagenz (TC50; Promega, Madison, WI, USA). Kurz gefasst: Die BCBL-1-Zellen wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten plattiert. Nach 16–24 Stunden wurden die Zellen gewaschen und das Medium wird gegen ein komplettes Medium ausgetauscht, das verschiedene Konzentrationen der Testverbindungen (3×) enthielt. Ganciclovir wurde als positive Kontrolle verwendet, während das Medium alleine als negative Kontrolle (Virus-Kontrolle, VC) verwendet wurde. Drei Tage später wurde das Kulturmedium gegen frisches Medium ausgetauscht, das die entsprechend verdünnten Testverbindungen enthielt. Sechs Tage nach der ersten Verabreichung der Testverbindung wurde der Zellkulturüberstand abgeschöpft, mit Pronase und DNAse behandelt und in einem quantitativen Echtzeit-TaqMan PCR-Assay verwendet. Die PCR-amplifizierte HHV-8-DNA wurde in Echtzeit erkannt durch Monitorerhöhungen in den Fluoreszenzsignalen, die aus der exonukleolytischen Degradation eines gelöschten Fluoreszenzsondenmoleküls, das an die amplifizierte HHV-8-DNA hybridisiert, resultierten. Für jede PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung von Verdünnungen der aufgereinigten HHV-8-DNA simultan eine Kurve generiert. Antivirale Aktivität wurde aus der Reduzierung in HHV-8-DNA-Konzentrationen (IC₅₀) berechnet. Ein neuer Farbstoffaufnahme-Assay wurde eingesetzt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen, und diese Messung wurde zur Berechnung der Toxizität (TC₅₀) verwendet. Der therapeutische Index (TI) wird als TC₅₀/IC₅₀ berechnet.
IL-28 und IL-29 hemmen die HHV-8-Virusreplikation in BCBL-1-Zellen. IL-28 hatte einen IC₅₀ von 1 μg/ml und einen TC₅₀ von > 10 μg/ml (TI > 10). IL-29 hatte einen IC₅₀ von 6,5 μg/ml und einen TC₅₀ von > 10 μg/ml (TI > 1,85). MetIL-29C172S-PEG hatte einen IC₅₀ von 0,14 μg/ml und einen TC₅₀ von > 10 μg/ml (TI > 100).
Beispiel 44
IL-28 und IL-29 haben eine antivirale Aktivität gegen Epstein Barr Virus (EBV)
Die antiviralen Aktivitäten von IL-28 und IL-29 gegen EBV wurden in einem In-vitro-Infektionssystem unter Verwendung einer B-lymphoiden Zelllinie, P3HR-1, geprüft. Im EBV-Assay wurden die Testverbindung und eine Kontrolle mit je fünf Konzentrationen und Verdünnung in Halb-Log-Serie analysiert. Die Endpunkte sind TaqMan PCR für extrazelluläre EBV-DNA (IC50) und Zellzahlen unter Verwendung des CellTiter96^® Reagenz (TC50, Promega). Kurz gefasst: Die P3HR-1-Zellen werden in 96-Well-Mikrotiterplatten plattiert. Nach 16–24 Stunden werden die Zellen gewaschen und das Medium wird gegen ein komplettes Medium ausgetauscht, das verschiedene Konzentrationen der Testverbindungen (3×) enthielt. Zusätzlich wird eine positive Kontrolle verwendet, während das Medium alleine als negative Kontrolle zu den Zellen gegeben wird (Virus-Kontrolle, VC). Drei Tage später wird das Kulturmedium gegen frisches Medium ausgetauscht, das die entsprechend verdünnte Testverbindung enthält. Sechs Tage nach der ersten Verabreichung der Testverbindung wird der Zellkulturüberstand abgeschöpft, mit Pronase und DNAse behandelt und in einem quantitativen Echtzeit-TaqMan PCR-Assay verwendet. Die PCR-amplifizierte EBV-DNA wird in Echtzeit erkannt durch Monitorerhöhungen in den Fluoreszenzsignalen, die aus der exonukleolytischen Degradation eines gelöschten Fluoreszenzsondenmoleküls, das an die amplifizierte EBV-DNA hybridisiert, resultieren. Für jede PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung von Verdünnungen der aufgereinigten EBV-DNA simultan eine Kurve generiert. Antivirale Aktivität wird aus der Reduzierung in EBV-DNA-Konzentrationen (IC₅₀) berechnet. Ein neuer Farbstoffaufnahme-Assay wurde eingesetzt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen, und diese Messung wurde zur Berechnung der Toxizität (TC₅₀) verwendet. Der therapeutische Index (TI) wird als TC₅₀/IC₅₀ berechnet.
Beispiel 45
IL-28 und IL-29 haben eine antivirale Aktivität gegen Herpes Simplex Virus-2 (HSV-2)
Die antiviralen Aktivitäten von IL-28 und IL-29 gegen HSV-2 wurden in einem In-vitro-Infektionssystem unter Verwendung von Verozellen geprüft. Die antiviralen Wirkungen von IL-28 und IL-29 wurden in Assays mit Inhibition der zytopathischen Wirkung (CPE-Assays) beurteilt. Bei diesem Assay werden Verozellen durch das zytopathische HSV-2-Virus abgetötet und die Zellabtötung wird durch IL-28 und IL-29 gehemmt. Die Verozellen werden in Dulbecco Modified Essential Medium (DMEM), das Phenol-Rot mit 10% Pferdeserum, 1% Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin enthält, propagiert, während die CPE-Inhibitionsassays in DMEM ohne Phenol-Rot mit 2% FBS, 1% Glutamin und 1% Pen-Strep durchgeführt werden. Am Tag vor den Assays wurden die Zellen trypsinisiert (1% Trypsin-EDTA), gewaschen, gezählt und zu 10⁴ Zellen/Well in 96-Well BioCoat^® Platten mit flachem Boden (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) in einem Volumen von 100 μl/Well plattiert. Am nächsten Morgen wird das Medium entfernt und prätitrierte Aliquoten des Virus wurden zu den Zellen gegeben. Die Virusmenge entspricht der maximalen Verdünnung, die eine komplette Zellabtötung (> 80%) zum Zeitpunkt der maximalen CPE-Entwicklung ergeben würde. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird unter Verwendung eines CellTiter96^® Reagenz (Promega) gemäß Herstellerprotokoll und unter Verwendung eines Vmax-Plattenlesers (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bestimmt. Die Verbindungen werden in je sechs Konzentrationen geprüft mit Verdünnung in Assaymedium in einer Halb-Log-Serie. Acyclovir wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Verbindungen werden zum Zeitpunkt der Virusinfektion zugegeben. Die durchschnittlichen Hintergrund- und farbkorrigierten Probendaten für die prozentuale CPE-Reduzierung und prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen bei jeder Konzentration werden relativ zu den Kontrollen bestimmt und der IC₅₀ wurde relativ zum TC₅₀ berechnet.
IL-28, IL-29 und MetIL-29C172S-PEG hemmten den Zelltod (IC₅₀ of > 10 ug/ml) in diesem Assay nicht. Es zeigte sich keine antivirale Aktivität des IFN-alpha in diesem Assay. SEQUENZAUFFÜHRUNG

Claims

Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid anti-Hepatitis-Aktivität aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid anti-Hepatitis-B-Aktivität aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid anti-Hepatitis-C-Aktivität aufweist.
Isoliertes Polynukleotid, kodierend für ein Polypeptid, wobei das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 5, wobei das kodierte Polypeptid anti-Hepatitis-B-Aktivität aufweist.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 5, wobei das kodierte Polypeptid anti-Hepatitis-C-Aktivität aufweist.
Expressionsvektor, umfassend die folgenden operabel verknüpften Elemente: einen Transkriptionspromotor; ein DNA-Segment, kodierend für ein Polypeptid nach Anspruch 1; und einen Transkriptionsterminator.
Kultivierte Zelle, in die ein Expressionsvektor nach Anspruch 8 eingeführt wurde, wobei die Zelle das Polypeptid exprimiert, das durch das DNA-Segment kodiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend: Kultivieren einer Zelle, in die ein Expressionsvektor nach Anspruch 8 eingeführt wurde, wobei die Zelle das Polypeptid exprimiert, das durch das DNA-Segment kodiert wird, und Gewinnung des exprimierten Polypeptids.
Antikörper oder Antikörperfragment, der/das spezifisch an ein Polypeptid nach Anspruch 1 bindet.
Antikörper nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem polyklonalen Antikörper, einem monoklonalen Maus-Antikörper, einem humanisierten Antikörper, der von einem monoklonalen Maus-Antikörper abstammt, einem Antikörperfragment, einem neutralisierenden Antikörper und einem humanen monoklonalen Antikörper.
Antikörperfragment nach Anspruch 11, wobei das Antikörperfragment ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv, und minimaler Erkennungseinheit.
Anti-idiotypischer Antikörper, umfassend einen anti-idiotypischen Antikörper, der spezifisch an den Antikörper nach Anspruch 11 bindet.
Formulierung, umfassend ein isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 27, 29, 40, 41, 83, 85, 87, 89, 95, 97, 103, 105, 111, 113, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 und 161 und ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel.
Kit, umfassend die Formulierung nach Anspruch 15.