FR2975185A1 - Procede de determination in vitro de la presence d'une sclerose en plaques - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques chez un sujet, comprenant la détection de l'IL-29, du récepteur IL-28Rα et/ou de ITIFN-α dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet et la comparaison du niveau détecté avec celui d'un échantillon de référence. Elle concerne également l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un ou de plusieurs composé(s) capable(s) de détecter spécifiquement l'IL-29, le récepteur IL-28Rα, et/ou l'IFN-α, pour déterminer la présence d'une SEP, ainsi que des kits comprenant de tel(s) composé(s).
Description
La présente invention concerne le domaine médical, et notamment le diagnostic de la sclérose en plaques.
La sclérose en plaques (SEP) est une pathologie inflammatoire démyélinisante du système nerveux central touchant préférentiellement l'adulte jeune. L'étiologie de la SEP reste actuellement inconnue bien que l'existence de mécanismes autoimmuns soit largement admise. L'hypothèse d'une origine virale de la SEP est régulièrement avancée mais aucune preuve formelle n'a pu être apportée dans ce sens. Le plus souvent, cette maladie évolue initialement par poussées partiellement ou totalement régressives : on parle de forme rémittente de la SEP. Toutefois, chez environ un tiers des patients, une évolution lentement progressive fait suite à la phase rémittente et conduit à un handicap neurologique majeur : on parle de forme secondairement progressive. L'évolution bénigne des formes rémittentes de la SEP est possible (une seule poussée sans séquelles puis aucune autre manifestation) alors qu'elle est très rare dans les formes dites secondairement progressives. Par ailleurs, 10 à 15 % des patients développent une forme d'emblée progressive : on parle alors de SEP primitivement progressive. Il n'existe pas actuellement de marqueur sérique de la SEP. Lors des premières manifestations cliniques, et quelle que soit la forme clinique de SEP, le diagnostic de SEP repose sur une combinaison d'éléments cliniques (examen et anamnèse), radiologique (Imagerie par Résonance Magnétique) et biologique (identification d'un profil oligoclonal des immunoglobulines dans le liquide céphalo-rachidien). Toutefois, il est relativement fréquent qu'une incertitude diagnostique persiste, notamment dans les cas de SEP primitivement progressive. En effet, le début clinique de ces formes est généralement insidieux et les anomalies observées en imagerie cérébrale sont moins marquées que dans les formes rémittentes ou secondairement progressives. Les scores obtenus aux critères cliniques, biologiques et IRM de la SEP permettent de distinguer les SEP certaines, des SEP probables ou des SEP possibles. Cette incertitude diagnostique à une incidence importante sur la qualité de la prise en charge thérapeutique des patients à SEP probable ou possible.
Par ailleurs, le suivi thérapeutique des patients atteints de SEP est rendu difficile par l'absence de marqueur sérique permettant d'apprécier l'évolutivité ou l'activité de la maladie, à savoir la présence d'une SEP évolutive ou SEP active, c'est-à-dire d'une SEP qui nécessite un traitement de fond et/ou une surveillance étroite de l'évolution clinique et radiologique. Ainsi, chez les patients à SEP certaine, l'absence de marqueur signant la présence d'une SEP évolutive, limite les possibilités d'ajustement des traitements actuellement disponibles. En particulier, un marqueur sérique d'évolutivité serait un outil utile pour décider : i) de la mise en place ou de la poursuite de traitements de fonds aux effets secondaires importants (traitements immunosuppresseurs en particulier), ii) de la fréquence à laquelle le suivi clinique et radiologique doit être réalisé.
Il existe donc un réel besoin clinique de marqueur(s) sérique(s) permettant de déterminer la présence d'une SEP qui, éventuellement associés aux critères existants, permettraient d'établir : i) la présence d'une SEP de manière certaine, notamment chez les patients pour lesquels une SEP probable ou possible a été définie sur la base des critères radiologiques et/ou cliniques existants, ii) le caractère évolutif de la SEP chez des patients à SEP certaine.
Dans ce contexte, de nombreuses études ont tenté d'analyser la présence d'un ensemble de cytokines dans le sérum de patients SEP et de sujets contrôles présentant des pathologies neurologiques autres que la SEP. Jusqu'alors, aucune de ces études n'a permis d'identifier une cytokine ou un groupe de cytokines dont la présence dans le sang signerait la présence d'une SEP de manière certaine, dès la phase initiale de la maladie.
A ce jour, il n'existe donc pas de marqueur biologique sanguin pour déterminer la présence d'une sclérose en plaques de manière certaine, ni pour déterminer le caractère évolutif de cette maladie. C'est dans ce contexte que les inventeurs ont découvert ce qui fait l'objet de la présente invention.
Les Interférons (IFNs) jouent un rôle central dans les réponses
immunes innées et adaptatives. Ils sont regroupés au sein de trois grandes familles : les IFNs de type I, l'IFN de type II et les IFNs de types
III.
Les IFNs de type I (IFN-a et IFN-p) sont synthétisés par différents types cellulaires immuns (cellules dendritiques plasmacytoïdes essentiellement) ou non immuns (fibroblastes) en réponse notamment à toute infection virale induisant la stimulation de récepteurs TLR ("Toll-Like Receptot). Ces IFNs provoquent la synthèse d'un ensemble de molécules à activité antivirale parmi lesquelles les molécules IFI44 (interferoninduced protein 44), IRF-1 (interferon responsive factor 1), IRF9 (interferon responsive factor 9) et IFIT3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3).
L'IFN de type II correspond à I'IFN-y et est principalement synthétisé par les lymphocytes-T et les cellules NK ("Natural Ki/Id') au cours de pathologies inflammatoires, infectieuses ou néoplasiques. L'IFN-y est un puissant activateur macrophagique qui induit la synthèse de molécules pro-inflammatoires (chémokines, cytokines pro-inflammatoires) et de molécules de surface en rapport avec la présentation antigénique (molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, molécules de costimulation).
Les IFNs de type III, découverts au début des années 2000, regroupent 3 molécules qui sont : l'interféron-11 ou IL-29, l'interféron-22 ou IL-28a et l'interféron-23 ou IL-28b (Sheppard et al., 2003, Nat. Immuno., 4 :63-8). Ces trois molécules partagent un récepteur commun de structure dimérique formé par : i) la chaine beta du récepteur à l'IL-10 (IL-10Rp) et ii) une chaine alpha nommée IL-28Ra. Comme les IFNs de type I, les IFNs de type III sont principalement synthétisés en réponse à une infection virale et induisent la production de molécules à propriété anti-virale qui sont similairement induites par les interférons de type I et de type III. Par ailleurs, les IFNs de type III, et en particulier l'IL-29, exercent une activité pro-inflammatoire présentant des analogies avec celle de l'Interféron-y (Pekarek et al., 2007, Genes Immun., 8 : 177-80). L'expression du récepteur aux IFNs de type III a été mise en évidence dans différents types cellulaires immuns ou non immuns chez la souris et chez l'homme. Parmi ceux-ci, les neurones infectés, les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules épithéliales peuvent notamment être cités. Malgré son rôle important dans la réponse immune, peu de travaux ont étudié l'expression des IFNs de type III chez l'homme, sans doute en raison du faible nombre de kits commerciaux actuellement développés et de leur très récente mise sur le marché (kits disponibles depuis 2009). A la connaissance des inventeurs, l'existence d'une élévation sérique d'un IFN de type III au cours d'une pathologie humaine a été mise en évidence, par exemple dans le cas de l'IL-29, chez les patients présentant une allergie respiratoire (rhinite ou asthme), ou chez des patients souffrants de lupus érythémateux disséminé (LED).
Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques chez un sujet, comprenant, voire consistant en, les étapes suivantes :
a) détection d'un ou de plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi l'IL-29, le récepteur IL-28Ra et l'IFN-a, dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet,
b) comparer le niveau détecté avec celui d'un échantillon de référence ;
la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence étant associée à la présence d'une sclérose en plaques chez ledit sujet.
La mise en évidence d'une variation significative dans le niveau détecté d'au moins un des marqueurs de l'invention, à savoir l'IL-29, l'IL-28Ra et/ou l'IFN-a dans l'échantillon à tester permet de déterminer la présence d'une SEP chez un sujet, et en particulier la présence d'une SEP évolutive, c'est-à-dire d'en affirmer le caractère évolutif, à savoir la nécessité de la mise en place d'un traitement de fond et/ou de sa poursuite et/ou d'une surveillance étroite de révolution clinique et/ou radiologique.
Le procédé de l'invention permet en particulier de déterminer la présence d'une SEP chez un sujet dont on suppose qu'il est atteint de cette maladie sur la base du contexte clinique et/ou radiologique. Ce procédé permet donc tout particulièrement de confirmer un diagnostic encore incertain qui aurait été provisoirement établi en utilisant les données cliniques et/ou radiologiques, notamment dans le cas de SEP probable ou possible.
De plus, dans le cas de sujets ayant déjà eu des symptômes ou signes cliniques de la maladie, le procédé de l'invention permet également de confirmer la présence d'une SEP à caractère évolutif (SEP évolutive), c'est-à-dire d'une SEP qui nécessite la mise en place d'un traitement de fond et/ou d'un suivi clinique et/ou radiologique étroit.
Ainsi, l'expression « déterminer la présence d'une SEP » ou « présence d'une SEP » selon l'invention définit à la fois :
i) la mise en évidence d'une SEP de manière certaine (SEP certaine), et notamment chez les patients pour lesquels une SEP probable ou possible a été définie sur la base des critères radiologiques et/ou cliniques existants, et
ii) la mise en évidence du caractère évolutif de la SEP (SEP évolutive) chez des patients dont on sait déjà qu'ils sont atteints d'une SEP de manière certaine.
Par ailleurs, le procédé de l'invention permet de déterminer la présence d'une SEP chez un sujet quelque soit la forme de la maladie : rémittente, secondairement progressive ou primitivement progressive.
De la même manière, la détection d'une différence significative de niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP évolutive, et ce quelle que soit la forme de la maladie (rémittente, primitivement progressive ou secondairement progressive).
D'une manière générale, le procédé selon l'invention permet de déterminer la présence d'une SEP évolutive chez un sujet, même si celui- ci est déjà sous traitement de fond immunosuppresseur ou immunomodulateur.
De manière préférée, le procédé selon l'invention comprend, voire consiste en, la détection d'un ou de plusieurs marqueurs) choisi(s) parmi l'IL-29 et le récepteur IL-28Ra, de préférence la détection de l'IL-29.^ De manière encore plus préférée, le procédé selon l'invention comprend, voire consiste en, la détection de l'IL-29 dans l'échantillon à tester pour déterminer la présence d'une SEP chez un sujet, et de préférence la présence d'une SEP évolutive.
Dans le cadre de l'invention, la détection de l'IFN-a s'entend de n'importe quel sous-type d'IFN-a, en particulier de l'IFN-al à l'IFN-a13. Lorsque l'invention implique la détection de l'IFN-a, il s'agit de préférence de l'IFN-al.
Au sens de la présente invention, le terme « détection » ou « détecter» signifie une détection in vitro ou ex-vivo. Par ailleurs, ces termes entendent désigner à la fois la mise en évidence de la présence et/ou la quantification de ces marqueurs au niveau nucléique ou au niveau protéique, mais également au niveau de l'activité spécifique de ces marqueurs. A cet effet, toute méthode de détection et/ou de quantification bien connue de l'homme du métier peut être utilisée pour la mise en oeuvre de l'invention, que ce soit en rapport avec la détermination de la présence et/ou de l'expression et/ou de l'activité spécifique de ces marqueurs. En particulier, lorsque la détection et/ou la quantification de ces marqueurs est réalisée au niveau nucléique, et en particulier à partir d'ARN ou d'ADNc, celle-ci peut notamment être réalisée par analyse PCR, par hybridation micro-arrays ou Northern-blot. Lorsque la détection et/ou la quantification de ces marqueurs est réalisée au niveau protéique, les techniques standards telles que le Western-Blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, cytométrie de flux ou immunocytologie peuvent être utilisées. Lorsque c'est l'activité spécifique de ces marqueurs qui est mise en évidence et/ou quantifiée, celle-ci pourra par exemple être déterminée par analyse de la capacité de l'échantillon biologique testé à inhiber l'effet cytopathique exercé par un virus (par exemple le Vesicular Somatic Virus aussi nommé VSV) sur une lignée cellulaire humaine sensible à ce virus (par exemple la lignée cellulaire HEP2 dans le cas du virus VSV) tel que décrit par Olivier et al., 2009, J Immunol Methods, vol. 351, p.41-45.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la détection du ou des marqueurs est réalisée au niveau protéique, et en particulier à l'aide de la technique ELISA.
De manière particulièrement avantageuse, la présente invention concerne la détermination de la présence d'une SEP à l'aide du procédé de l'invention comprenant la détection de l'IL-29 dans l'échantillon à tester, et de préférence la détection au niveau protéique.
De manière encore plus préférée, la présente invention concerne un procédé de détermination in vitro de la présence d'une SEP chez un sujet comprenant la détection de l'IL-29 au niveau protéique dans l'échantillon à tester consistant en du sang, et en particulier du sérum, ou du liquide céphalo-rachidien.
Au sens de la présente invention, les termes et expressions « marqueur », « marqueur de l'invention » ou « marqueur d'intérêt » désigne tout matériel biologique qui correspond à la présence, l'expression et/ou l'activité de l'IL-29, de l'IL-28Ra et/ou de l'IFN-a. Ledit matériel biologique peut notamment consister en des protéines, de l'acide désoxyribonucléique (ADN) ou de l'acide ribonucléique (ARN), et notamment des ARN messagers.
Dans le cadre de l'invention, la détection du ou des marqueur(s) d'intérêt, IL-29, IL-28Ra et/ou IFN-a, entend concerner la détection du marqueur sous toutes ses formes de synthèse et/ou de maturation, que ce soit variant, précurseur, isoforme etc, du moment que ces formes sont
spécifiques du marqueur concerné correspondant, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent correspondre à un autre marqueur. Ainsi, pour la présente invention, le ou les « marqueur », « marqueur de l'invention » ou « marqueur d'intérêt » correspondent de préférence aux séquences de référence mentionnées ci-dessous, mais également à toute séquence qui correspond à une autre forme lors de la synthèse et/ou de la maturation du marqueur codé par ces séquences de références, telle que variant, précurseur, isoforme etc, tant que cette séquence est spécifique du marqueur en question.
Pour les différents marqueurs selon l'invention, les séquences nucléiques de référence sont les suivantes : -IL-29 : séquence de référence NCBI: NM_172140.1, -IL-28Ra : séquence de référence NCBI: NM_170743.2, et -IFN-a1 : séquence de référence NCBI: NM_024013.1.
S'agissant de l'IL-29 en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence nucléique qui présente plus de 86 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire la séquence nucléique de référence ci-dessus correspondant à l'IL-29, et de préférence qui présente une homologie d'au moins 90 %, d'au moins 95 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 avec cette séquence de référence. S'agissant de l'IFN-ai en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence nucléique qui présente plus de 65 °/o d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire la séquence nucléique de référence ci-dessus correspondant à l'IFN-al, et de préférence qui présente une homologie d'au moins 75 %, d'au moins 80 °/°, d'au moins 85 %, d'au moins 90 ou d'au moins 95 °/o avec cette séquence de référence. Pour les différents marqueurs selon l'invention, les séquences protéiques de référence sont les suivantes : -IL-29 : séquence de référence NCBI: NP_742152.1, -IL-28Ra : séquence de référence GenBank: AAI01409.1, et -IFN-ai : séquence de référence NCBI: NP_076918.1.
S'agissant de l'IL-29 en particulier, des exemples de « variant,
précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence protéique qui
présente plus de 95 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire la séquence protéique de référence ci-dessus
correspondant à l'IL-29, et de préférence qui présente une homologie
d'au moins 96 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99
avec cette séquence de référence.
S'agissant de l'IFN-ai en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence protéique qui présente plus de 87 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire la séquence nucléique de référence ci-dessus correspondant à l'IFN-ai, et de préférence qui présente une homologie d'au moins 90 %, d'au moins 95 %, d'au moins 98 °h, ou d'au moins 99 % avec cette séquence de référence.
S'agissant de 1'IL-28Ra en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence, nucléique ou protéique, qui présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire les séquences nucléique ou protéique de référence respectives ci-dessus correspondant à l'IL-28Ra, et de préférence qui présente une homologie d'au moins 95 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 % avec ces séquences de référence.
Le terme « homologie » se réfère à la similarité qui est calculée par alignement optimal entre deux séquences. La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus qui sont identiques ou qui diffèrent par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.
Le pourcentage d'homologie peut être calculé par l'homme du métier en utilisant les méthodes qui sont connues dans le domaine, et en particulier le programme informatique de comparaison de séquences tel 2975185 io que celui de la suite BLAST (Altschul et al., Nucleic Ac/cl Research, 1997, 25, 3389-3402). Au sens de la présente invention, on entend par « substitution conservative », toute substitution d'une base par une autre qui conduit à 5 l'obtention d'une protéine identique en séquence, en particulier du fait de la dégénérescence du code génétique, ou toute substitution d'un résidu par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge, polarité etc) qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine. 10 En plus de la détection d'un ou de plusieurs des marqueurs d'intérêt, le procédé de l'invention peut également comprendre la détection conjointe d'un ou de plusieurs autres marqueurs biologiques de la SEP, sans que cela ne soit pour autant nécessaire pour pouvoir déterminer la présence de la maladie dans le cadre de l'invention. Ainsi, le 15 procédé peut comprendre la détection conjointe d'un ou de plusieurs marqueurs d'intérêt selon l'invention avec un ou plusieurs autres marqueurs biologiques de la SEP connu(s) dans le domaine. Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon à tester », tout échantillon biologique susceptible de contenir le ou les 20 marqueurs à détecter et provenant du sujet ou du patient chez qui on souhaite déterminer la présence d'une sclérose en plaques. Par conséquent, l'échantillon biologique à tester utilisé dans le cadre du procédé selon l'invention peut être de différente nature. En particulier, l'échantillon biologique à tester est choisi parmi les fluides 25 biologiques tels que le sang, le sang total (tel que collecté de la voie veineuse, c'est-à-dire contenant les cellules blanches et rouges, les plaquettes et le plasma), le sérum, le plasma, l'urine, le liquide synovial, le liquide céphalo-rachidien, la lymphe, ainsi que les tissus tels que le tissu cérébral ou le tissu nerveux ou encore des cellules isolées à partir 30 d'un tel tissu, du moment qu'elles contiennent le ou les marqueurs d'intérêt. 2975185 Il De préférence, l'échantillon biologique à tester est choisi parmi le sang, et en particulier le sérum, et le liquide céphalo-rachidien.
Le niveau du ou des marqueurs qui est détecté dans l'échantillon biologique à tester est alors comparé à celui détecté dans un échantillon
5 de référence.
Dans le cadre de l'invention, l'échantillon de référence peut être tout échantillon biologique issu d'un sujet sain ou d'un pool de sujets sains, en particulier non atteint(s) ou suspecté(s) d'être atteint(s) de SEP. L'échantillon de référence peut également être issu du même sujet que
10 celui dont est issu l'échantillon à tester mais correspondre à un stade antérieur du suivi du patient. Par exemple, effectué lors d'un prélèvement précédent dans le cadre du suivi qui est mis en place pour le patient concerné.
L'échantillon de référence peut également être constitué par tout
15 échantillon, biologique ou non biologique, qui a été préalablement calibré pour contenir une valeur moyenne du ou des marqueur(s) à détecter qui correspond au niveau qui a été détecté sur un pool d'échantillons biologiques issus de sujets sains ou du même sujet mais correspondant à un stade antérieur. Ainsi, avant la détection du ou des marqueurs
20 proprement dite dans l'échantillon à tester, le procédé de l'invention peut comprendre l'obtention préalable de cette valeur moyenne, et à laquelle le niveau qui sera détecté dans l'échantillon à tester pourra être comparé afin de déterminer la présence d'une SEP selon l'invention.
Lorsqu'il est biologique, l'échantillon de référence peut être de
25 différentes natures et notamment choisi parmi les échantillons biologiques qui sont mentionnés ci-dessus concernant l'échantillon à tester (fluide, tissu, cellules, etc). De préférence, l'échantillon de référence qui est utilisé selon l'invention est un échantillon biologique de même nature (fluide, tissu, cellules etc) que celui de l'échantillon biologique à tester ou
30 d'une nature compatible pour constituer une référence quant à la détection des marqueurs à détecter.
En outre, les échantillons à tester et de référence qui sont comparés pour la détection des marqueurs sont de préférence issus de personnes ayant les mêmes caractéristiques ou une majorité de caractéristiques communes, notamment du même sexe et/ou d'un âge similaire ou identique et/ou de même origine ethnique.
Dans le cas de l'utilisation d'un échantillon de référence préalablement calibré comme indiqué ci-dessus, cet échantillon sera bien évidemment choisi en fonction du ou des marqueur(s) testé(s), c'est-à-dire que l'échantillon de référence sera calibré pour le ou les marqueur(s) que l'on cherche à détecter dans l'échantillon à tester.
Selon l'invention, la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté du ou des marqueurs d'intérêt dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence est associée la présence d'une sclérose en plaques, et permet ainsi de poser le diagnostic d'une SEP de manière certaine.
De manière préférée, cette différence permet d'affirmer le caractère évolutif de la maladie. Dans ce cas particulier, et en plus de ceux mentionnés ci-dessus, l'échantillon de référence peut également correspondre à celui de patients atteints de SEP jugée non-évolutive ou non-active.
La différence observée lors de la mise en oeuvre du procédé de l'invention peut être une augmentation. Dans le cadre de l'invention, une augmentation définit à la fois la détection d'un niveau significativement supérieur dans l'échantillon à tester par rapport à celui détecté dans l'échantillon de référence ou bien une présence dans l'échantillon à tester par rapport à une absence dans l'échantillon de référence.
La différence observée peut également être une diminution. Dans le cadre de l'invention, une diminution définit à la fois la détection d'un niveau significativement inférieur dans l'échantillon à tester par rapport à celui détecté dans l'échantillon de référence ou bien une absence dans l'échantillon à tester par rapport à une présence dans l'échantillon de référence.
Ainsi, et comme mentionné ci-dessus, la détection au sens de l'invention peut aussi bien revêtir un aspect qualitatif que quantitatif.
Cependant, il est à noter que l'absence de différence significative du niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence ne permet pas d'exclure l'existence d'une SEP, évolutive ou non chez le sujet testé.
Bien évidemment, l'absence d'un marqueur d'intérêt dans un des échantillons ou le niveau détecté dépendra de différents facteurs, et notamment de la technique de détection utilisée et de sa sensibilité, de la nature des échantillons analysés, du type de détection choisi (protéique, nucléique, activité, etc).
Dans le cadre de l'invention, un « niveau significativement inférieur ou supérieur » peut correspondre à l'absence de détection dans l'échantillon testé par comparaison à un niveau détectable dans l'échantillon de référence ou au contraire à l'absence de détection dans l'échantillon de référence par comparaison à un niveau détectable dans l'échantillon testé. Alternativement, un « niveau significativement inférieur ou supérieur » peut correspondre à un niveau inférieur ou supérieur d'environ un facteur 2 par rapport au niveau détecté dans l'échantillon de référence, de préférence inférieur ou supérieur d'environ un facteur 3 par rapport au niveau d'expression détecté dans l'échantillon de référence.
Selon une variante préférée de l'invention, la mise en évidence d'une augmentation du niveau d'IL-29 et/ou d'IFN-a dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP, et de préférence à la présence d'une SEP évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.
Selon une autre variante de la présente invention, la mise en évidence d'une diminution du niveau du récepteur IL-28Ra dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP, et de préférence à la présence d'une SEP évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.
Selon encore une autre variante, le procédé de l'invention peut être défini comme comprenant les étapes de détection de la présence ou de l'augmentation du niveau d'IL-29 et/ou d'IFN-a et/ou de détection de la diminution du niveau du récepteur IL-28Ra ou de son absence dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence, étant entendu que cette présence ou augmentation et/ou cette diminution ou absence est(sont) associée(s) à la présence d'une SEP, et de préférence à la présence d'une SEP évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.
Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci a pour objet l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un composé ou d'un réactif ou d'une pluralité de composés ou de réactifs capable(s) de détecter spécifiquement un ou plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi MI-29, le récepteur IL-28Ra, et l'IFN-a, pour déterminer la présence d'une SEP, et de préférence la présence d'une SEP évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.
Parmi les composés ou réactifs capable(s) de détecter spécifiquement un ou plusieurs des marqueurs sus-mentionnés, on peut notamment citer des anticorps spécifiques ou des fragments ou dérivés de ceux-ci, par exemple des anticorps « single chais » Sv, mais aussi des peptides ou encore des acides nucléiques ou des fragments de ceux-ci tels que des amorces (ou primer) ou couples d'amorces spécifiques qui détectent et/ou amplifient le gène correspondant au(x) marqueurs(s) choisi(s), des sondes, des constructions anti-sens, des ARNi, des ribozymes etc correspondant au(x) marqueurs(s) choisi(s).
Les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus concernant le procédé constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de cette utilisation.
Selon un dernier aspect, la présente invention a pour objet une trousse ou kit pour la détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques, et de préférence la présence d'une SEP évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé. Cette trousse comprend :
- un ou plusieurs composés ou réactifs capable(s) chacun de détecter spécifiquement un marqueur choisi(s) parmi l'IL-29, le récepteur IL-28Ra et l'IFN-a ,
- un échantillon témoin positif, et éventuellement
- un échantillon témoin négatif.
Les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus concernant le ou les composés ou réactifs capable(s) de détecter spécifiquement le ou les marqueur(s) d'intérêt constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de la trousse ou kit selon l'invention.
En particulier, le kit de l'invention contient au moins un composé ou réactif capable de détecter spécifiquement l'IL-29. II peut en outre contenir un composé capable de détecter spécifiquement l'IL-28Ra et/ou un composé capable de détecter spécifiquement l'IFN-a.
L'échantillon témoin positif est de préférence un échantillon biologique issu d'un patient ou d'un pool de patients atteints de SEP, et de préférence atteints de SEP de manière certaine. Il peut également correspondre à un échantillon biologique issu d'un ou de plusieurs patients atteints de SEP de manière certaine dont le caractère évolutif a été préalablement confirmé.
De même que pour l'échantillon de référence mentionné ci-dessus, l'échantillon témoin positif peut également être constitué par tout échantillon, biologique ou non biologique, qui a été préalablement calibré pour contenir une valeur moyenne du ou des marqueur(s) à détecter qui correspond au niveau moyen qui a été détecté sur un pool d'échantillons biologiques issus de patients atteints de SEP de manière certaine ou sur un pool d'échantillons biologiques issus de patients atteints de SEP de manière certaine dont le caractère évolutif a été préalablement confirmé.
L'échantillon témoin négatif est en particulier un échantillon qui ne contient pas le ou les marqueur(s) choisi(s), comme par exemple un échantillon de sujet sain, ou un échantillon, biologique ou non biologique, pour lequel la détection du ou des marqueur(s) choisi(s) est ou a été rendue impossible. Dans ce cas, la méthode utilisée pour empêcher la détection du ou des marqueur(s) d'intérêt dans l'échantillon témoin négatif sera adaptée à la méthode de détection utilisée pour l'échantillon à tester dans le cadre du procédé de l'invention. Par exemple, si le marqueur d'intérêt est détecté pour sa présence au niveau protéique, la méthode utilisée pour rendre impossible la détection dudit marqueur dans l'échantillon témoin négatif sera une méthode permettant d'empêcher la détection de la protéine en question, sans pour autant empêcher la présence du gène et/ou du messager codant cette protéine. De même, si le marqueur d'intérêt est détecté pour la mise en évidence de l'activité d'une protéine, alors la méthode utilisée pour rendre impossible la détection de l'activité de cette protéine dans l'échantillon témoin négatif sera une méthode permettant de rendre cette protéine inactive, sans pour autant empêcher l'expression du gène codant cette protéine et/ou la présence de la protéine elle-même tant que son activité est indétectable.
Les échantillons témoins positif et témoin négatif peuvent être de différentes natures. Sur ce point, les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus concernant la nature de l'échantillon à tester et de l'échantillon de référence constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant des échantillons témoins positif et témoin négatif contenus dans la trousse ou kit selon l'invention.
Le kit ou trousse de l'invention est un kit apte et destiné à la détermination de la présence d'une SEP selon l'invention. Ainsi, il peut en outre comprendre des instructions d'utilisation des différents constituants du kit ou de la trousse permettant de déterminer la présence d'une SEP selon l'invention, et de préférence d'une SEP évolutive. Cette trousse permet donc de déterminer la présence d'une SEP et de préférence la présence d'une SEP évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.
En particulier, ces instructions indiquent dans quelle mesure la détection du ou des marqueur(s) concerné(s) permet d'établir la présence d'une SEP selon l'invention. De préférence ces instructions indiquent dans quelle mesure la mise en évidence d'une différence significative du niveau du ou des marqueur(s) détecté(s) dans l'échantillon à tester permet de conclure à la présence d'une SEP, et de préférence à la présence d'une SEP évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé, comme détaillé notamment ci-dessus concernant le procédé de l'invention.
Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention. Ces exemples se réfèrent à la figure 1 annexée qui représente les résultats du dosage par ELISA de l'IL-28a, dans le sérum (A) et de l'IL-29 dans le sérum (B) ou dans le liquide céphalo-rachidient (C) à partir de différents échantillons.
Analyse transcriptomique Afin d'identifier un marqueur sérique diagnostic de la SEP nous avons développé une approche originale qui consiste en l'analyse transcriptomique large (analyse par "Gene Arras') de macrophages dérivés du sang.
Deux groupes appariés en âge et en sexe ont été étudiés : - sujets sains (témoins ; n = 3),
- patients atteints de forme primitivement progressive de SEP prélevés au moment du diagnostic et ne suivant pas de traitement (patients SEP ; n =3)
D'après le suivi ultérieur des patients après les prélèvements, les patients SEP analysés dans cette étude présentent tous une forme jugée évolutive de la maladie car: i) le recours a un traitement immunosuppresseur a été nécessaire dans les 3 ans qui ont suivis le prélèvement, ii) la pente d'aggravation du handicap dans les 3 ans s'est avérée égale ou supérieure à celle attendue pour cette forme de SEP, sur la base des données épidémiologiques connues.
Les cellules mononucléées des patients et des sujets témoins ont été isolées sur gradient de ficoli et stockées à -80°C dans la collection "NeuroBioTec" du Centre de Ressources Biologiques des Hospices Civils de Lyon. Parmi les dizaines de prélèvements de cette nature stockés à NeuroBioTec, l'analyse rétrospective des dossiers cliniques a ensuite permis de sélectionner 3 patients atteints de formes primitivement progressive et dont l'évolution ultérieure attestait de l'évolutivité au moment du prélèvement.
Les cellules ont été ensuite décongelées et cultivées en présence de M-CSF ("macrophage colony-stimulating facto`) pendant 7 jours. Puis, les cellules surnageantes ont été éliminées, permettant ainsi d'obtenir une population de cellules adhérentes constituée à plus de 95% de macrophages (cette méthode de culture a été validée par immunomarquage d'au moins 10 cultures macrophagiques avec les anticorps anti-CD11b ou anti-CD68). Les ARNm totaux ont ensuite été extraits puis étudiés par la technique de "gene array' sur la plateforme d'analyse ProfileXpert (Plateforme de biologie moléculaire de l'Institut Fédératif des Neurosciences de Lyon). Le niveau d'expression de près de 30 000 gènes a ainsi pu être comparé entre les deux groupes.
Pour chaque comparaison, seuls les gènes exprimés dans l'ensemble des échantillons ont été pris en compte soit un total de près de 15 000 gènes. Une moyenne d'expression a été établie pour chaque gène, puis des comparaisons de moyennes ont été réalisées et seules les variations d'un facteur supérieur ou égal à 2 ont été retenues. Par ailleurs, dans chaque groupe étudié (Temoins vs SEP), les gènes pour lesquelles les valeurs inter-échantillons ont été jugées trop importantes ont été exclus de l'analyse (gènes pour lesquels le rapport de la moyenne des valeurs sur l'écart-type était supérieur ou égal à 2).
L'analyse comparative des résultats de gene array obtenus dans
les deux groupes a ainsi permis d'identifier 194 gènes différentiellement
exprimés d'un facteur au moins égal à 2 dont 154 gènes augmentés d'un
facteur au moins égal à 2 et 40 gènes diminués d'un facteur au moins égal à 2 chez les patients SEP par rapport aux témoins.
Parmi les 154 gènes augmentés d'un facteur au moins égal à 2, 15 sont des gènes immuns (le caractère immun de ces gènes a été établi sur la base de la littérature et du logiciel DAVID). De façon surprenante 4 des 15 gènes immuns surexprimés sont des gènes de réponse aux IFNs de type I ou III (ISG pour « Interferon Stimulated Genes »). Il s'agit par ordre décroissant d'expression différentielle de : IFI44 (interferon-induced protein 44)(7ième position/154, 1ière position/15 gènes immuns), IRF-1 (interferon regulatory factor 1)(9ie le position/154, 2ième position/15 gènes immuns), IFIT3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats)(17ième position/154, 41ème position/15 gènes immuns) et IRF-9 (interferon regulatory factor 9)(148ième position/154, 15ième position/15 gènes immuns) (Tableau 1).
Par ailleurs, parmi les 15 gènes immuns surexprimés, on trouve la présence d'un seul récepteur cytokinique : la chaîne alpha du récepteur à l'IL-10)(151ème position/154, 3ième position/15 gènes immuns). Il faut noter que la chaîne alpha du récepteur à l'IL-10 est spécifique au récepteur à l'IL-10 et est à distinguer de la chaîne beta du récepteur à l'IL-10 qui est partagée par plusieurs récepteurs cytokiniques (récepteur à l'IL-10, récepteur aux IFNs de type III et récepteur à l'IL-22 notamment). Bien que des gènes de réponse aux IFNs de type I ou III soient augmentés chez les patients SEP, les récepteurs aux IFN de type I, IFNAR1 (interferon alpha, beta and omega receptor 1) et IFNAR2 (interferon alpha, beta and omega receptor 2) ne figurent pas parmi les 154 gènes augmentés. En revanche, la chaine alpha du récepteur aux IFN de type III, l'IL28Ra, est l'un des 3 gènes immuns diminués chez les patients SEP par rapport aux sujets témoins (Tableau 1.). Ainsi, parmi les 40 gènes diminués d'un facteur au moins égal à 2 chez les patients SEP par rapport aux Témoins, on identifie 3 gènes immuns qui sont : la chaine alpha du récepteur aux IFN de type III (l'IL28Ra), la chaine beta du récepteur à la cytokine IL-17E (cytokine encore nommée IL-25) et l'intégrine CD61 (Tableau 1). Tableau 1 Dosages ELISA Une première série de dosages de l'IL-28 et de l'IL-29 a été 10 réalisée sur des prélèvements de sera congelés et conservés au sein de la collection "NeuroBioTec" du Centre de Ressources Biologiques des Hospices Civils de Lyon. Des kits commerciaux vendus par Biolegend (Ozyme) ont été utilisés pour doser l'IL-28a (IFN-12)( Ref kit : 435507) et l'IL-29 (IFN-a,l)(Ref Kit 435607). 15 Les sera dérivés des populations suivantes ont été analysées : - 10 sujets témoins sains (ou Tem) ; Rapport > 2 (gènes dont le niveau d'expression est augmenté d'un facteur au moins égal à 2) 154 gènes dont 15 gènes immuns incluant, par ordre décroissant d'expression différentielle : * IFI44 (7ième position/154, X 3,11) * IRF-1 (gième position/154, X 3,03) * IL-10R alpha (15ième position/154, X 2,81) * IFIT3 (17ième position/154, X 2,71) * IRF-9 (1481eme position/154, X 2,01) Rapport < 0,5 (gènes dont le niveau d'expression est diminué d'un facteur au moins égal à 2) 40 gènes dont 3 gènes immuns : * IL28-R alpha * IL-17E R * CD61 2975185 21' - 10 sujets atteints de glioblastome (tumeur maligne primitive du cerveau s'accompagnant d'une réaction inflammatoire) (ou GB) ;
- 19 patients atteints d'une forme primitivement progressive de SEP. Parmi les patients SEP, 17 patients étaient vierges de tout
5 traitement au moment du prélèvement et 2 autres étaient sous traitement (1 patient sous corticoïdes et 1 patient traité par immunosuppresseur).
Les résultats ont montré l'absence d'IL-28a détectable dans l'ensemble des sera dérivés de patients SEP ou de témoins sains. Dans le groupe glioblastome, 2 patients présentaient des taux détectables d'IL- 28, respectivement à 38,23 pg/ml et 18,25 pg/ml (Figure 1). L'IL-29 s'est révélée indétectable dans les groupes témoins sains et glioblastome alors que 4 patients SEP sur 19 ont présentés des taux de l'ordre de la centaine de pg/ml (190 pg/ml, 290 pg/ml, 396 pg/ml, 478 pg/ml)(Figure 1). L'un de ces 4 patients était sous traitement immunosuppresseur au moment du prélèvement et un autre avait suivi un traitement immunosuppresseur dans les 2 ans précédant le prélèvement.
Par conséquent, ces résultats montrent que : i) l'IL-29, mais pas l'IL-28a, est un marqueur sérique diagnostic de la SEP chez un sujet, ii) l'IL-29, mais pas l'IL-28a, est un marqueur d'évolutivité de la SEP, détectable chez des patients SEP qui suivent ou qui ont suivi un traitement de fond par immunosuppresseurs
Dans une deuxième série de dosages, seule l'IL-29 a été analysée. Des liquides céphalorachidiens (LCR) congelés et stockés à "NeuroBioTec" ont été testés.
Ces LCR dérivaient de :
- 10 patients SEP à forme primitivement progressive (ou SEP PP) ne suivant pas de traitement au moment du prélèvement,
- 10 patients SEP à forme rémittente (ou SEP RR) ne suivant pas de traitement au moment du prélèvement, et - 20 patients témoins (sujets présentant des pathologies du système nerveux central autres que la SEP, telles que démence, migraine, troubles fonctionnels...)(ou Tem).
Les résultats ont montrés que l'IL-29 était indétectable dans les LCR de l'ensemble des sujets témoins. En revanche, 5 patients SEP sur 20 (3 formes progressives et 2 formes rémittentes) présentaient des taux détectables d'IL-29 (125 pg/mI, 69,38 pg/ml, 65,11 pg/ml, 99,88 pg/ml et 66,54 pg/ml)(Figure 1). Ces résultats montrent donc que le dosage d'IL-29 dans le LCR est un marqueur diagnostic de la SEP. En conclusion, l'ensemble de ces résultats démontrent que l'IL-29 mais pas l'IL28a est détectable dans le sérum ou le LCR de patients SEP non traités (8 patients sur 37 patients non traités au moment du prélèvement)(21 %). Par ailleurs, l'IL-29 n'est pas détectable dans le sérum ou le LCR de sujets témoins (sujets sains, sujets présentant des pathologies du système nerveux central autre que la SEP, n = 40). Le dosage d'IL-29 dans le sang ou le LCR peut donc être utilisé comme marqueur diagnostic de la SEP. L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.
Claims (10)
- REVENDICATIONS1. Procédé de détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques chez un sujet, comprenant, voire consistant en, les étapes suivantes : a) détection d'un ou de plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi l'IL-29, le récepteur IL-28Ra et l'IFN-a, dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet, b) comparer le niveau détecté avec celui d'un échantillon de référence ; la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence étant associée à la présence d'une sclérose en plaques chez ledit sujet.
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la détection d'un ou de plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi I'IL-29 et le récepteur IL-28Ra, de préférence de l'IL-29.
- 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique à tester est choisi parmi le sang et le liquide céphalo-rachidien.
- 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon de référence est un échantillon biologique issu d'un sujet sain ou d'un pool de sujets sains.
- 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mise en évidence d'une augmentation du niveau d'IL-29 et/ou d'IFN-a dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP, et de préférence d'une SEP évolutive.
- 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la mise en évidence d'une diminution du niveau du récepteur IL-28Ra dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP, et de préférence d'une SEP évolutive.
- 7. Utilisation in vitro ou ex vivo d'un composé ou d'un réactif ou d'une pluralité de composés ou de réactifs capable(s) de détecter spécifiquement un ou plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi I'IL-29, le récepteur IL-28Ra et l'IFN-a , pour déterminer la présence d'une SEP.
- 8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit ou lesdits composé(s) ou réactif(s) est(sont) choisi(s) parmi des anticorps spécifiques ou des fragments ou dérivés de ceux-ci, des peptides ou des acides nucléiques ou des fragments de ceux-ci.
- 9. Trousse ou kit pour la détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques, comprenant : -un ou plusieurs composés ou réactifs capable(s) chacun de détecter spécifiquement un marqueur choisi(s) parmi 11L-29, le récepteur IL- 28Ra et l'IFN-a, - un échantillon témoin positif, et éventuellement -un échantillon témoin négatif.
- 10. Kit selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'échantillon témoin positif est un échantillon biologique issu d'un patient ou d'un pool de patients atteints de SEP.
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Effective date: 20150130 |