CN104672318A - 一种肽链第43位赖氨酸定点突变为亮氨酸的人白介素-29变异体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人白细胞介素-29(hIL-29)第43位赖氨酸定点突变为亮氨酸的重组变异体(rhIL-29M)及其制备方法，属于生物技术领域。本发明具体方法为：1)设计合成IL-29变异体的特异性引物及突变引物；2)用特异性引物及突变引物对hIL-29编码基因第127、128位碱基进行定点突变；3)构建含hIL-29变异体编码基因的重组真核表达载体，转化毕赤酵母，获得重组酵母工程菌；4)用含1％(v/v)甲醇的培养液诱导培养酵母工程菌；5)用SP-Sepharose Fast Flow层析柱从培养液上清纯化hIL-29变异体。本发明构建的重组酵母工程菌可高密度发酵并表达肽链第43位赖氨酸突变为亮氨酸的rhIL-29变异体，适用于工业化制备rhIL-29变异体。

Description

一种肽链第43位赖氨酸定点突变为亮氨酸的人白介素-29变异体
技术领域
本发明提供了一种肽链中第43位赖氨酸定点突变为亮氨酸的人白细胞介素-29变异体(IL-29mut43)及其制备方法。属于生物技术领域。
背景技术
人白细胞介素-29(interleukin 29，hIL-29)是Kotenko等和Sheppard等两个研究小组于2003年共同发现的，它与IL-28A和IL-28B共同属于III型干扰素，也分别被称为：IFN-λ1，-λ2和-λ3。
IL-29的受体是异二聚体复合物，复合物由配体结合链IFN-λR1(也称为IL-28R)，以及辅助链IL-10R2组成；IFN-λR1以及与其相互作用的IL-10R2是信号转导所必需的，其中IFN-λR1提供许多结合能。
IL-29与I型干扰素共享JAK-STAT(Janus kinase-signal transducer of transcription)信号传导途径。因此IL-29与I型干扰素具有相似的生物学性质，如抗病毒、抗增殖、抗肿瘤以及免疫调节等效应。IL-29通过结合异二聚体受体复合物IFN-λR1和IL-10R2，激活JAK-STAT信号转导途径，从而促进干扰素刺激基因表达，干扰素刺激基因是一些与抗病毒表型相关的基因，包括OAS1，MX1和IRF7等。这些基因所表达的蛋白质调节干扰素诱导的抗病毒活性。
hIL-29的空间结构与IL-28B(IFN-λ3)的晶体结构相似性很高，而且两者结合相同的细胞受体，且IL-28B的抗病毒活性高于hIL-29，因此以IL-28B的晶体结构与野生型hIL-29进行同源建模，确定关键氨基酸的位点。通过计算机计算氨基酸置换后结合自由能差，确定氨基酸种类。计算发现IL-29肽链第43位赖氨酸位定点突变为亮氨酸时，变异体与受体结合自由能低于野生型IL-29与受体结合的自由能(结合自由能越低结合越稳定)。因此对hIL-29的第43位进行定点突变。
发明内容
本发明提供了一种肽链中第43位赖氨酸定点突变为亮氨酸的人白细胞介素-29变异体(hIL-29mut43)及其制备方法。本发明包括以下几方面：
(1)本发明提供了一种肽链中第43位氨基酸经人工定点突变的重组人白细胞介素-29变异体(rhIL-29mut43)，该变异体的肽链第43位氨基酸由碱性的赖氨酸定点突变为中性的亮氨酸，如序列表的SEQ ID NO：1所示。
(2)本发明提供了一种表达rhIL-29mut43的重组真核表达质粒，该质粒是将本发明所述的编码hIL-29mut43的DNA序列(序列表的SEQ ID NO：2)与真核表达质粒pPIC9KM(购自Invitrogen公司，经本实验室改造并已申请专利，申请号为：201110410391.0)重组获得的，该重组真核表达质粒为pPIC9KM-rhIL-29mut43，如图1；该重组质粒表达的产物是肽链中第43位赖氨酸定点突变为亮氨酸的rhIL-29mut43(SEQ ID NO：1)；而且本发明将pPIC9KM的α因子的限制性内切酶识别位点Xho I识别位点CTCGAG和蛋白酶Kex2的识别位点GAGAAAAGA，通过PCR的方法引入编码hIL-29mut43的DNA序列的氨基端，使该重组真核表达质粒表达的rhIL-29mut43的肽链不会因引入限制性内切酶位点而增加额外的氨基酸残基。
(3)本发明提供一种表达rhIL-29mut43的重组酵母工程菌pPIC9KM-rhIL-29mut43/GS115，该工程菌是将重组真核表达质粒pPIC9KM-rhIL-29mut43转化毕赤酵母GS115(源于Invitrogen公司)所获得。pPIC9KM中的信号肽基因序列与hIL-29变异体编码基因均已整合到该工程菌的基因组中，因此该工程菌可分泌性表达hIL-29变异体至培养液中。
(4)本发明提供一种制备hIL-29变异体的方法，该方法包括以下步骤：
①用液体培养基BMMY培养重组酵母工程菌，于培养液中添加1％(v/v)甲醇诱导重组酵母工程菌分泌表达hIL-29变异体；
②离心除去菌体，收集发酵液上清；
③先经过硫酸铵沉淀，然后透析除盐处理发酵液上清，之后用阳离子交换层析柱分离纯化，分管收集洗脱液；
④SDS-PAGE和Western Blot分析鉴定纯化后rhIL-29mut43的活性。
附图说明
图1：重组质粒pPIC9KM-rhIL-29mut43的构建示意图
图2：hIL-29mut43变异体编码基因的PCR扩增结果
图3：rhIL-29mut43变异体的SDS-PAGE结果
图4：rhIL-29mut43变异体的Western Blot结果
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
以下实施例中所有培养基都是按照毕赤酵母表达手册(Invitrogen公司)的配方进行配制；
实施例一hIL-29mut43变异体编码基因的克隆
1.引物的设计与合成
以hIL-29基因序列为模板，参照pPIC9KM的信号肽序列，通过Oligo 7软件设计扩增编码hIL-29成熟肽cDNA的特异性上、下游引物及突变引物：
上游引物为：5’-CTCGAGAAAAGAGGCCCTGTCCCCACTTCC-3’，在5’加入Xho I限制性酶切位点CTCGAG和蛋白酶Kex2的识别位点GAGAAAAGA(下划线表示)；
下游引物为：5’-GCGGCCGCTCAGGTGGACTCAGGGTGG-3’，在5’加入Not I限制性酶切位点GCGGCCGC(下划线表示)；
突变引物为：5’-CAGTTTTTCAGCAGGAGTGAC-3’，(下划线表示突变位点)将突变引物中第13、14位碱基设计为A、G，使该碱基组成的密码子由AAG突变为CTG，该密码子编码的氨基酸则由赖氨酸(Lys)突变为亮氨酸(Leu)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.hIL-29mut43变异体编码基因的克隆
第一轮PCR以pPIC9KM-rhIL-29质粒为模板，以上游引物和突变引物来扩增，反应条件如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。10℃保温。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，按照胶回收试剂盒说明书(大连Takara公司)回收目的片段；第二轮PCR以pPIC9KM-rhIL-29质粒为模板，以第一轮割胶回收产物和反向引物作为引物，反应条件同第一轮PCR。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照胶回收试剂盒说明书(大连Takara公司)回收目的片段。两轮PCR结果如图2所示(泳道1是第一轮PCR产物，泳道2是第二轮PCR产物)。
实施例二rhIL-29mut43重组真核表达质粒的构建
将回收的目的片段与pUCm-T(BBI公司)于16℃连接过夜，化学法转化E.coli JM109感受态细胞，然后涂布于预先涂有X-gal和IPTG的氨苄抗性琼脂平板，蓝白斑筛选阳性转化子。挑选白斑进行菌液PCR，正确的送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序(命名为pUCm-T-rhIL-29mut43)。测序结果如SEQ ID NO：2所示。测序结果与Gene Bank中hIL-29的基因序列比对，结果表明重组质粒pUCm-T-rhIL-29mut43中目的基因第127位碱基A突变成C，第128位碱基A突变成T，则该碱基组成的密码子由AAG突变为CTG，该密码子编码的氨基酸则由赖氨酸(Lys)突变为亮氨酸(Leu)，如SEQ ID NO：1所示，与预期设计一致。将测序正确的pUCm-T-rhIL-29mut43及pPIC9KM质粒经Xho I和Not I双酶切，割胶回收并连接，转化JM109感受态细，菌液PCR正确的送上海生工测序(命名为pPIC9KM-rhIL-29mut43)。测序结果表明pPIC9KM-rhIL-29mut43中目的基因与pUCm-T-rhIL-29mut43中的一致。
实施例三 重组真核表达质粒pPIC9KM-rhIL-29mut43转化毕赤酵母GS115及高拷贝重组工程菌的筛选
鉴定正确的抽提重组质粒pPIC9KM-rhIL-29mut43并用Sal I线性化，按照毕赤酵母表达手册(Invitrogen公司)的方法电转化毕赤酵母GS115，转化液涂布于组氨酸缺陷型的MD平板。30℃培养2～3可见相应菌落。
用灭菌牙签将生长旺盛的菌株接种到含2.0mg/mL G418的YPD筛选平板上，30℃培养2-3天；用灭菌牙签从含2.0mg/mL G418的YPD筛选平板上挑取生长旺盛的菌株，接种到含4.0mg/mL G418的YPD筛选平板上，30℃培养2-3天。即可得到高拷贝重组菌株pPIC9KM-rhIL-29mut43/GS115。
实施例四重组蛋白rhIL-29mut43的表达、纯化及鉴定
筛选得到的高拷贝重组菌株，经菌液PCR鉴定正确的进行发酵。先将菌株接种到种子培养基BMGY，在30℃、220r/min下培养24h；然后沉降2h，弃上清，用诱导培养基BMMY重悬细胞，在30℃、220r/min下继续培养72h，且于转换培养基后的0h、24h、48h时刻分别添加1％的甲醇，进行甲醇诱导表达。
将发酵液离心收集上清，取20μL上样进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示，在约23KDa处可见明显的单一目的蛋白条带，与理论值相符。用羊抗人IL-29多克隆抗体(美国R&D公司)进行Western-Blot鉴定，结果如图4所示，在约23KDa处有蛋白条带，可知重组蛋白rhIL-29mut43与羊抗人IL-29抗体特异性结合，说明重组蛋白rhIL-29mut43有活性。
将发酵液上清经过硫酸铵沉淀、透析之后，经过SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱(Φ16mm×200mm)进一步纯化。纯化产物再进行SDS-PAGE和Western-Blot鉴定。

Claims (4)

1.一种肽链第43位赖氨酸定点突变为亮氨酸的人白介素-29变异体，其特征在于所述的hIL-29变异体的肽链第43位氨基酸由碱性的赖氨酸(Lys)突变为中性的亮氨酸(Leu)，如序列表中的SEQ ID NO：1所示。
2.一种编码权利要求1所述的hIL-29变异体的DNA序列，其特征在于该DNA序列中第127位碱基A(腺嘌呤)经人工定点突变为C(胞嘧啶)，第128位碱基A(腺嘌呤)经人工定点突变为T(胸腺嘧啶)，由突变碱基组成的密码子由AAG突变为CTG，如序列表中的SEQ IDNO：2所示。
3.一种表达肽链第43位Lys突变为Leu的重组hIL-29变异体的重组真核表达质粒，其特征在于该重组真核表达质粒中插入了权利要求2所述的经人工定点突变的编码hIL-29变异体的DNA序列。
4.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述的重组毕赤酵母染色体中整合有权利要求3所述的经人工定点突变的编码hIL-29变异体的DNA序列。
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